Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421

Summary

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

Abstract

השכבה החיצונית של המוח הקטן גרגיר (EGL) היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח, ומודל מצוין לחקר התפשטות והבחנה עצביות. בנוסף, שינויים אבולוציוניים של יכולת שגשוגה היו אחראים להרחבה הדרמטית של גודל המוח הקטן באמניוטים, מה שהופך את המוח הקטן מודל מצוין ללימודי Evo-Devo של מוח החוליות. תאים המרכיבים את EGL, אבות גרגיר המוח הקטן, גם מייצגים תא משמעותי ממוצא למדולובלסטומה, גידול העצבי בילדים הנפוץ ביותר. בעקבות הגברה מעבר, מבשרי גרגיר להעביר רדיאלית לשכבת גרגרים הפנימית של המוח הקטן שבו הם מייצגים את האוכלוסייה העצבית הגדולה ביותר במוח של היונקים הבוגר. בחומוס, השיא של התפשטות EGL מתרחש לקראת סוף השבוע של הריון השני. על מנת למקד את השינוי גנטי לשכבה זו בהשיא של שגשוג, שפיתחנו שיטה למניפולציה גנטית דרך electroporation vivo לשעבר של פרוסות המוח הקטן מעובר חומוס עוברי יום 14. שיטה זו משחזרת כמה היבטים חשובים של in vivo פיתוח נוירון גרגיר ויהיה שימושי ביצירת הבנה מעמיקה של התפשטות תאי גרגיר המוח הקטן ובידול, ולכן פיתוח של המוח הקטן, אבולוציה ומחלה.

Introduction

המוח הקטן יושב בקצה הקדמי של המוח האחורי, והוא אחראי לאינטגרציה של עיבוד חושי ומוטורי במוח הבוגר, כמו גם ויסות תהליכים קוגניטיביים גבוהים יותר 1. ביונקים וציפורים, ברשותה מורפולוגיה משוכללת וfoliated בכבדות, מוצר של הגברה מעבר הנרחבת של אבות במהלך פיתוח שמייצר יותר ממחצית תאי העצב במוח הבוגר. המוח הקטן היה נושא של לימודים לneurobiologists במשך מאות שנים ובעידן המולקולרי כמו כן זכה לתשומת לב משמעותית. זה מתייחס לא רק לביולוגיה מעניינת מיסודה, אלא גם לעובדה שהוא מעורב בכבדות במחלות של בני אדם כוללים הפרעות גנטיות התפתחותיים כגון הפרעות ספקטרום האוטיסטי 2 והבולטת ביותר בסרטן במוח הקטן, מדולובלסטומה 3, המהווה את המוח בילדים הנפוץ ביותר גידול. חשוב לציין, זה מערכת מודל מצוינת בתוך "שich ללמוד הקצאת גורל וneurogenesis במהלך התפתחות מוח 4. בשנים האחרונות, יש לו גם הוקם כמערכת מודל למחקר ההשוואתי של התפתחות המוח, בשל המגוון העצום של צורות המוח הקטן ראו על פני תולדות הגזע חוליות 5-10.

המוח הקטן מתפתח ממחצית הגב של 1 rhombomere במוח האחורי והתפתחותית 11 מורכב משתי אוכלוסיות עיקריות אב, שפת rhombic ואזור חדרית. שפת rhombic משתרעת סביב אזור הגב של neuroepithelium של המוח האחורי בגבול עם צלחת הגג. זה הוא מקום הולדתו של הנוירונים מעוררים glutamatergic של המוח הקטן 12-14. אזור חדרית מוליד נוירונים המעכבים GABAergic המוח הקטן, בולט ביותר נוירונים פורקינג הגדולים 14,15. בהמשך פיתוח (מיום העוברי על 13.5 בעכבר; E6 בחומוס 16), ProGen glutamatergicitors להעביר בעקיפין משפת rhombic וליצור שכבת pial של אבות: אזור אב המשני נקרא השכבה החיצונית גרגיר (EGL). זה שכבה זו שעוברת הגברה המעבר הנרחבת שמובילה למספרים של נוירונים גרגיר הענק שנמצאו במוח הבוגר.

הפצת נשק בEGL נקשר ארוכה למיקום תת-pial שנובע מהגירה משיקה משפת rhombic 17, עם המעבר ליציאת מחזור התא והתמיינות עצבית של אבות להיות קשורה עם יציאתם מהשכבה החיצונית EGL למרכז EGL 18. הגירה משיקה נרחבת של תאי גרגיר לאחר mitotic בציר המדיאלי-רוחב מתרחשת באמצע וEGL הפנימי 19, לפני הגירת רדיאלי סופית לשכבה הפנימית של גרגיר קליפת המוח הקטן הבוגרת. הגירה של תאים משפת rhombic על פני השטח של המוח הקטן תלויה באיתות CXCL12 מפיא 20-22 23-25. מסקרן, מחקרים מיקרוסקופיים אלקטרונים 17 הראו כי תאי EGL עם מורפולוגיה שגשוג לשמור על קשר pial, מקשר התנהגות תא עם יכולת שגשוג באופן המזכיר את האבות הבסיסיים של קליפת המוח היונקים 26. הדבר בא לידי ביטוי בריבוד האמור של EGL לשלוש בתת-השכבות שמוגדרים על ידי סביבה תאית שונה ובו יש לי מבשרי גרגיר ביטוי גנים שונים חתימות 18.

התפשטות של אבות בoEGL מתרחשת בהתפלגות נורמלית של גדלי שיבוט כזה שכאשר אבותיהם בנפרד כותרת גנטית בסוף ההתפתחות עוברית בעכבר, הם להצמיח ממוצע חציון של 250-500 גר 'postmitoticנוירונים ranule 27,28. הפצת הנשק תלויה באיתות שהשש mitogenic מבסיס תאי פורקינג '29-32. היכולת להגיב שלשש הוכחה להיות תלוי לחלוטין על ביטוי אוטונומי תא של גורם שעתוק Atoh1, הן במבחנה 33 וin vivo 34,35. כמו כן, יציאת מחזור התא והתמיינות הוכחה להיות תלוי בביטוי של גורם השעתוק במורד הזרם NeuroD1 36, שעשוי מדכאים ישירים של Atoh1 37.

למרות התקדמות זו, וקידום רב בפענוח הבסיס הביולוגי של תא יציאת מחזור תא 38-42, המנגנון הבסיסי המולקולרי (ים) שעומד בבסיס ההחלטה ליציאה ממחזור התא ולעבור מאב לנוירון הבחנה, ו הגירה הנלווית postmitotic משיקה בEGL הפנימי, כמו גם את המתג מאוחר יותרלהגירה רדיאלי, יישאר חלקי הבין. זה הוא בגלל חוסר היכולת להשתלט הניסיונית של EGL במידה רבה: זה מאוחר פיתוח, וקשה למקד גנטי שכן רב מאותו המקור עצבי המולקולות חיוניות גם קודם לכן בחייו של מבשרי גרגיר בשפת rhombic. כדי להתגבר על בעיה זו, מחברים רבים פיתחו in vivo וelectroporation vivo לשעבר כשיטת למקד המוח הקטן שלאחר הלידה במכרסמים 43-48. הנה, אנחנו חלוצים שימוש electroporation vivo לשעבר בחומוס ללמוד EGL, המייצג את היתרונות משמעותיים במונחים של עלות ונוחות. השיטה של electroporation והתרבות הפרוסה vivo לשעבר של רקמת המוח הקטן אפרוח שלנו משתמשת ברקמה גזור מיום עוברי 14 אפרוחים בשיא התפשטות EGL. שיטה זו מאפשרת מיקוד גנטי של EGL עצמאי של שפת rhombic ויהיה להגדיר את הבמה לנתיחה גנטית של המעבר מגרגיראב לנוירון גרגיר postmitotic במוח הקטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הניסויים בוצעו עם בהתאם לקינגס קולג 'לונדון, בריטניה והנחיות הטיפול בבעלי החיים של משרד הפנים הבריטיים.

1. Dissection של E14 מוח קטן

  1. דגירה ביצי תרנגולת המופרת חום ב 38 מעלות צלזיוס ליום עוברי 14.
  2. המספריים ביצה באמצעות לערוף עוברים אפרוח באוב ולהסיר את הראש לצלחת פטרי המכילה קרח הקר PBS (איור 1 א).
  3. בעזרת מלקחיים סטנדרטיים, לעשות חתכים מאחורי כל עין לאורך כל הדרך הרקמות, הסרת העיניים ולסת עליונה. לעשות חתך שני לאורך כל דרך לוע הסרת הלסת התחתונה (איור 1).
  4. בעזרת מלקחיים סטנדרטיים, להסיר את כל העור מפני שטח של גולגולת על ידי קילוף אותו (איור 1 ג) ולהסיר עצמות קדמיות והקודקודית, חושף מוח.
  5. מהיבט הגחון, להסיר סחוס בלוע וmesenchyme עזר.
  6. מהיבט גב, זהירly להסיר גב mesenchyme לטיפול לוקח למוח האחורי שלא לפגוע פיא, ומוח הנפרד שלם (איור 1D).
  7. לעשות חתך לאורך כל הדרך רקמת המוח התיכון ובין המוח האחורי ומוח אחורי הנפרד כולל המוח הקטן (איור 1E).
  8. על ידי ביצוע חתכים לאורך כל דרך הרקמה בשני צמתים לרוחב של המוח הקטן וצלחת עלאר של המוח האחורי, להסיר כל המוח הקטן, תוך הקפדה על השמירה על שלמות פיא ברחבי נתיחה (איור 1F). הסר את מקלעת דמית העין ויוצרים (איור 1G).
  9. הזז את המוח הקטן גזור לתוך קר כקרח HBSS.

2. פורסים תרבות של E14 מוח קטן

  1. העבר את כל המוח הקטן לפלטפורמה סטרילי של רקמות ופר בעזרת מרית או פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם הקצה לחתוך להרחיב את הצמצם. הסר נוזל עודף באמצעות פיפטה.
  2. חותך כל המוח הקטן כל בtהוא נדרש התמצאות בעובי 300 מיקרומטר באמצעות מסוק הרקמות משובצים מהירויות חיתוך ב 50% מהמקסימום. שלמות רקמה נשמרה בקלות בסעיף sagittal; עם זאת, נטייה היא גם שיקול חשוב לניתוח תא (תא דנדריטים פורקינג הם sagittally מיושרים, ואילו אקסונים תא גרגיר לרוץ רוחבי, ניצב למישור של הדנדריטים תא פורקינג ').
  3. בעזרת פיפטה פסטר 3 מיליליטר, לכסות את המוח הקטן הפרוס בקרח HBSS הקר.
  4. העבר את הפרוסות בHBSS לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה HBSS הטרי קר כקרח בעזרת פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם קצה לחתוך.
  5. תחת מיקרוסקופ לנתח מואר עם מקור אור סיבים אופטי, להבטיח הפרדת פרוסות בודדות באמצעות מלקחיים שען. לזהות פרוסות להיות electroporated, המבוסס על שלמות הרקמות שלהם ומיקום Medio-צדדי.
    הערה: כל נתיחה מהעובר דרך לחתוך דגירה במדיום התרבות לוקחת upo בהתאם סביב 10-20 דקותניסיון n. לבצע ניתוחים אחד בכל פעם, כדי להבטיח cerebella שמבלה זמן מינימאלי בין עריפת הראש והתרבות לשעבר vivo.

3. Electroporation של פרוסות

  1. לבנות תא electroporation ידי תיקון האנודה של electroporator לבסיס של צלחת פטרי 60 מ"מ עם סרט בידוד. להוסיף כ 1 מיליליטר של HBSS כדי לכסות את האלקטרודה.
  2. מניחים להוסיף 0.4 מיקרומטר תרבות על גבי האלקטרודה המכוסה בHBSS. לאפשר את הכנס התרבות לנוח על האלקטרודה לוודא תמיד יש קשר בין ההוספה ואלקטרודה.
    הערה: בהתקנה זו, להכניס התרבות עם פרוסות ינוחו על פני השטח של הפתרון, שמירה על המעגל אבל מאפשר מיקוד המרחבי של הקתודה.
  3. פרוסות העברה מזוהות (עד חמש לכל הכנס תרבות) על הוספת התרבות באמצעות פיפטה פסטר 3 מיליליטר עם הקצה לחתוך. נפרד ומאפשר להתיישב על הוספת התרבות בsagittאוריינטצית אל.
  4. בעזרת פיפטה, להסיר HBSS העודף, כך שפרוסות כבר לא טובלים בפתרון.
  5. באמצעות קצה P10 פיפטה, DNA פיפטה (בריכוז של 1 מיקרוגרם / μl) מדולל עם 20% ירוקים מהר על פני השטח של אזור מיקוד של הפרוסה. 20% ירוקים מהיר מבטיחים פתרון ה- DNA צמיג ומונעים להחריד פיזור רחב של DNA. להוסיף כ 5 DNA μl פתרון ירוק מהיר / לכל פרוסה (איור 2).
  6. מניחים את הקתודה מעל רצוי רקמות ממוקדות וelectroporate עם 3 x 10 V, 10 פעימות משך msec. יש להימנע ממגע ישיר של הקתודה עם הרקמה. במקום זאת, לנצל את מתח של נוזל משטח לשמור מוליכות (מקום הקתודה הקרובה לרקמה ככל האפשר מבלי לגעת ברקמה).
  7. חזור על משלוח DNA וelectroporation לאזורים מרובים של EGL על כל פרוסה המוח הקטן בודדת כרצויה.
  8. עם השלמת electroporation, inse תרבות העברהRT 30 מ"מ צלחת פטרי.
  9. לכל תרבות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום התרבות המחומם מראש (Basal נשר בינוני, 0.5% (w / v) D - (+) - גלוקוז, 1% תוספת B27, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) מתחת להוספת התרבות כך שהוספת התרבות היא במגע עם מדיום, אבל פרוסות לא טובלת בזה.
  10. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס / 6% CO 2 עד 3 ימים. להחליף את כל מדיום התרבות כל שעות 24 עם מדיום מראש חימם טרי.
  11. בעקבות התרבות, לתקן פרוסות בתרבות מוסיפה לשעה 1 בparaformaldehyde 4% (או O / N ב 4 ° C) בצלחת 30 מ"מ טרי ללא תקשורת ותרבות.

4. הדמיה של המוח הקטן Slices

  1. בעקבות קיבעון, לשטוף פרוסות 3 פעמים במשך 5 דקות בPBS.
  2. באמצעות סכין גילוח, לנתח כל פרוסה המוח הקטן electroporated ותרבותי מלהכניס התרבות על ידי חיתוך סביב פרוסה והסרת פרוסה והאזור של הכנס הוא דבקו. לַעֲשׂוֹתלא תנסה להסיר פרוסה מהמשטח להכניס התרבות.
  3. פרוסות הר בכ 1 מיליליטר של מדיום הרכבה המכיל DAPI (אם רוצה) תחת טיפול לוקח coverslip לא להכניס בועות, ותמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal לייזר סריקה.
    הערה: יכולים להיות מגוונים פרמטרים הדמיה על פי המבנים electroporated, ולפי שיקול דעתו של המשתמש הבודד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג באמצעות electroporation פרוסה ותרבות של המוח הקטן מחומוס יום 14 עוברי. הנתיחה של המוח הקטן מודגמת באיור 1 ותא electroporation הקים מוצג באיור 2. אנחנו מראים שזה אפשרי לelectroporate והצלחת פרוסות המוח הקטן תרבות, אשר שומרות על המבנה שלהם ומורפולוגיות סלולריות במבחנה (איור 3 א). electroporation הממוקד לfolia פרט מושגת בקלות (איור 3). אנחנו בהצלחה electroporate מספר פלסמידים שונים לתוך תאי EGL ולהראות שזה אפשרי אני) לתייג תאים עם כתב בונה להתבונן בהתנהגות שלהם (איור 3 ג), ii) כדי לבדוק אזורים הגנומי אפשריים עבור פונקציונליות בתאי המוח הקטן (איור 3D ), ושלישי) כדי לתפעל גנטיתאים בEGL ידי misexpressing חלבונים של עניין (איור 3E). בנוסף, מניפולציות תרופתיות על פרוסות electroporated אפשריות (תוצאות לא מוצגות). לאחר culturing ניתן לבצע בדיקת רקמות נוספות כגון מבחני אימונוהיסטוכימיה או התפשטות (איור 3F). אנו מבצעים ניתוח בריאות רקמה על ידי calbindin וimmunostaining PH3 ומראים כי שלמות רקמות נשמרת לפחות 3 div אחרי התרבות (איור 4). תוצאות אלו מראות כי EGL הוא כעת מבנה נגיש ומניפולציות בקלות שניתן לבחון באופן מלא וגנטי שינה במערכת מודל חומוס.

איור 1
Dissection איור 1. של המוח הקטן מעובר חומוס E14. () לערוף את האפרוח בביצה ולהסיר את int הראשצלחת פטרי עם PBS OA הקר כקרח. הסר את הלסת ועיניים על ידי ביצוע חתך מאחורי העיניים והלוע (קו מקווקו) נמוכות יותר. (ב) הסר את העור מפני שטח של הגולגולת. (ג) הסר את חזיתי ועצמות הקודקודית ו( ד ') להסיר את המוח מmesenchyme והסחוס המקיף אותו. (ה) תחת מיקרוסקופ לנתח לזהות את מיקומו של המוח הקטן בקצה האחורי של המוח. לחתוך בין המוח התיכון והמוח האחורי (קווים מקווקווים) ליישאר עם המוח הקטן והמוח האחורי הגחון. (F) ודאו חתכים בצמתים לרוחב (peduncles) של המוח הקטן כדי להפריד את המוח הקטן מ( הקו המקווקו) המוח האחורי. (G) הסר את מקלעת דמית העין (הכוכבית) מהצד הגחוני של המוח הקטן עד שאתה נשאר עם המוח הקטן שלם לגמרי עם פיא המצורף. העבר את המוח הקטן לHBSS קר כקרח לפני הכנת פרוסות עם chopp רקמהאה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תא electroporation להגדיר. (א) תמונה של חדר electroporation מחוייט. התא מורכב מהאנודה של electroporator ממוקם באופן מאובטח על בסיס צלחת פטרי 60 מ"מ. המנה מכילה כ 1 מיליליטר של HBSS כדי לכסות את האלקטרודה. הכנס התרבות צריך לנוח על האלקטרודה עם קשר מתמיד בין ההוספה ואלקטרודה, שמירה על המעגל אבל מאפשר מיקוד המרחבי של הקתודה, שהופעלה על ידי יד. (ב) תמונה של פרוסות שelectroporated. פרוסות מכוסות הפתרון הירוק DNA / מהיר. פרוסות electroporated כרצוןד: electroporation יכול להיות ממוקד לfolium אחד או מספר מיקומים. לאחר electroporation להוסיף ממוקם בצלחת פטרי 30 מ"מ עם מדיום מראש חימם תרבות ותרבותי בחממה. 1. האנודה 2. צלחת פטרי קתודת 3. הכנס תרבות 4. עם מיקרוסקופ לנתח 1 מיליליטר HBSS 5. 6. פרוסות בודדות ממסוק רקמת פתרון ה- DNA 7. עם צבע ירוק מהיר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דְמוּת.

איור 3
איור 3. נציגי תוצאות. (א) תמונה בהגדלה נמוכה של electroporation שליטה של פלסמיד קידוד RFP לEGL במקומות מרובים. הרקמה שומרת את המבנה שלה ותאי electroporated גלויים לעין בשכבה עבה subpial של המוח הקטן. (ב)דוגמא של electroporation ממוקד עם פלסמיד GFP שליטה. Folium הממוקד הוא מסומן בכוכבית. בר סולם AB = 500 מיקרומטר. (ג) דוגמא שבה GFP מבנה קידוד מונע על ידי משפר Atoh1 כבר electroporated לEGL. הביטוי של Atoh1 מגדיר מבשרי תא גרגיר בתוך EGL. מורפולוגיות תא שונות נראות בבירור בdiv 3 והתנהגות תא יכולה להיות במעקב. (ד) דוגמא לתיוג הבא electroporation של מבנה המכיל אלמנט משוער שימור קידוד-עישון (CNE) של גן NeuroD1 הנהיגה GFP. CNE מדווח על פעילות בתאים הצפויים מבוסס על ביטוי אנדוגני NeuroD1 מציע תפקיד פעיל של CNE זה בפיתוח. ביטוי NeuroD1 בקורלציה עם החניכה של התמיינות תאי גרגר. (ה) דוגמא שבה הרקמה ניתן מניפולציות גנטית על ידי misexpression של חלבון NeuroD1 ושינוי בbehav תא גרגירניתן לצפות iour. (F) דוגמא שבה רקמת electroporated (לשלוט פלסמיד GFP) יכולה להיות קבועה ומוכתמת עבור סמנים של תאים מתרבים, כגון H3 phosphohistone (PH3). CF בר סולם = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. שלמות רקמות ושגשוג בתרבות. (- C) Calbindin צביעה של רקמת המוח הקטן E14 electroporated עם פלסמיד GFP שליטה ב1-3 ימים במבחנה (div). צביעת Calbindin מראה כי שלמות רקמה נשמר בתרבות לפחות 3 div. שכבת תאי פורקינג 'אינה מהווה monolayer בשלב זה בהתפתחות אפרוח אבל ברור שהוא ראה ויוצר שכבה מתחת לEGL בי תאי גרגיר (ירוק) נמצאים. הכתמה (ד) Phosphohistone H3 (PH3) על רקמת המוח הקטן בתרבית למשך 2 div. צביעת PH3 גלויה בEGL (חיצים), אלא גם באזורים אחרים של המוח קטן (ראשי חץ). צביעה זו היא נציג של כל השלבים בתרבות שנבדקו (1-3 div). הספירה = 50μm בר סולם אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול דיווח כאן מתאר שיטה לנתח, electroporating וculturing פרוסות של המוח הקטן יום 14 עוברי מהחומוס. פרוטוקול זה מאפשר מיקוד של electroporation לאזורים קטנים מוקד של EGL, כוללים מיקוד מבודד של אונות המוח הקטן בודדות. הוא מאפשר ניתוח והדמיה גנטיים ברזולוציה גבוהה ונוחות, ובמחיר נמוך בהשוואה לטכניקות הוקמו במכרסמים 43-47. ניתוח כזה הוא אינו אפשרי כיום בvivo עקב תקופה הממושכת התפתחותית הזמן, המחסור באפשרויות מיקוד גנטי EGL ספציפי בעכבר, והאחידות של מנגנונים מולקולריים בין שפת rhombic וEGL, מה שאומר ששינויים שעשויים להשפיע על EGL ביולוגיה לעתים קרובות לא יכולה להיות מנותחת שכן הם משפיעים neurogenesis שפת rhombic ולבטל היווצרות EGL 49. המערכת שלנו ובכך מייצגת התקדמות משמעותית במונחים של מיקוד הנדסה גנטית לים EGLpecifically, ואנו צופים שזה יהיה ישים למינים אחרים מעבר לחומוס שאולי עניין השוואתי, כגון יונקים שאינם מודל וזוחלים.

בביצוע טכניקת electroporation התרבות הפרוסה, מספר השיקולים הטכניים הם בעל חשיבות עליונה. ראשית, על חוסנו של פרוסות לשרוד בתרבות ללא מצד האחד עובר מוות תאי נרחב או על השלמות המבנית לאבד אחרת מגביל את העובי של פרוסת 300 מיקרומטר בידיים שלנו. שיקול שני חשוב הוא הצמיגות של פתרון ה- DNA, אשר מבטיח electroporation של ה- DNA בריכוזים שאינם גבוהים מספיק כדי לגרום לרמות גלויות או רלוונטיות של הנדסה גנטית. בelectroporation האוב של פתרונות DNA שהוחדרו לתוך המוח האחורי העוברי המוקדם, ריכוזים של צבע ירוק המהיר של כ 1% אופייניים. עם זאת, בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל בריכוזים של ירוק המהיר של 20%. הדבר מבטיח מספיק מולפתרון ה- DNA cous כדי למנוע פיזור של ה- DNA הבא pipetting אבל לפני electroporation, אבל מספיק לדלל אחד לתווך הולכה חשמלית יעילה.

בנוסף לשיקולים הטכניים האלה, שצפינו כי התנהגות שגשוג שאנו רואים vivo לשעבר אינו תואם במדויק שחזו ממחקרי in vivo ככל הנראה בשל יושרת pial שמופרת על ידי הכנת הרקמה. בתנאים כאלה, כאשר מבנה ביטוי של GFP הוא electroporated, חלק גדול מתאי electroporated נראה שעזב את מחזור התא לאחר יום אחד בלבד של התרבות כמו להישפט על ידי צביעת PH3 (איור 3F). זה אינו תואם את ההתנהגות צפויה EGL שגשוג, שבו ריבוי של שיבוטים בשני עכבר וחומוס משתרע על פני פרק זמן גדול 27. המשמעות שפיא מודולציה התפשטות נתמכת על ידי התצפית שכאשר אנו electroporate CONSTRUC כתבלא עם ביטוי NeuroD1 אלמנט הרגולציה נהיגה של ה- GFP כל תאי electroporated להביע GFP לאחר יום אחד בתרבות (איור 3D). בvivo, מבנה זה משקף ביטוי NeuroD1 אנדוגני בסימון תאים של EGL הפנימי שלאחר mitotic 36,37, בעוד באורך מלא NeuroD1 מספיק כדי לנהוג התמיינות תאים (3E איור). הדבר מצביע על כך בתנאים מסוימים, יכולת השגשוג של תאים לא תישמר כפי שהיא בEGL החיצוני בשלבים מקבילים בvivo. צביעת PH3 עם זאת מציעה כי יש הרבה של הפצה בתרבות, לעתים קרובות מקומי לאזור EGL (איור 4D). התפשטות נרחבת מחוץ לEGL מציינת אולי משופרת gliogenesis או התפשטות של מבשרי Pax2 GABAergic בחומר לבן. המשמעות היא שהפרשנות של כל הליך ניסויי תצטרך לקחת בחשבון את proliferativ מעלדואר התנהגות, העובדה שתאי פורקינג לא יוצרים monolayer עד E18 בחומוס ושהתפתחות תקינה עלולה לסכן לאחר הכנת פרוסה (למשל, בשל חוסר אינטראקציה עם טיפוס סיבים וכו ')

למרות מגבלות אלה, הפרוטוקול שלנו, מהווה צעד משמעותי קדימה ביחס ללימוד היבטים רבים של ביולוגיה של תא גרגר. היתרון המכריע של מה שמאפשר מרחב ובזמן תיוג ספציפי של EGL להבדיל משפת rhombic יקל בדיקות מרובות של שני הביולוגיה של התא של אבות גרגיר והרגולציה הגנטית שבבסיסו באופן שלא ניתן בהווה in vivo. הטכניקה שלנו בחומוס תשלים פרוטוקולים קיימים vivo לשעבר תרבות וelectroporation במכרסמים 43-48 ונושאת את היתרונות רבים בעלויות ונוחות הקשורים לאפרוח. בנוסף, הוא מייצג התקדמות משמעותית על פניטכניקות קיימות של אבות גרגיר culturing 39. למרות שזה ישלים ולא להחליף האחרון, הפרוטוקול שלנו יפתח את השליטה של ​​בידול נוירון גרגיר למגוון רחב של טיפולים ותרופות למגוון של מניפולציות גנטיות אוטונומיות סלולריים, כי הם אפשריים בחומוס. זה מספק בסיס לבחינה בביולוגיה של תא גרגר בפירוט חסר תקדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

השיטה המוצגת במאמר זה נבעה מממומנת על ידי BB BBSRC / עבודת I021507 / 1 (TB, RJTW) ומלגת לימודי דוקטורט MRC (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
  2. Becker, E. B., Stoodley, C. J. Autism spectrum disorder and the cerebellum. International Review of Neurobiology. 113, 1-34 (2013).
  3. Hatten, M. E., Roussel, M. F. Development and cancer of the cerebellum. Trends in Neurosciences. 34, 134-142 (2011).
  4. Butts, T., Green, M. J., Wingate, R. J. Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain. Development. 141, 4031-4041 (2014).
  5. Rodriguez-Moldes, I., et al. Development of the cerebellar body in sharks: spatiotemporal relations of Pax6 expression, cell proliferation and differentiation. Neuroscience Letters. 432, 105-110 (2008).
  6. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 29, 6142-6153 (2009).
  7. Chaplin, N., Tendeng, C., Wingate, R. J. Absence of an external germinal layer in zebrafish and shark reveals a distinct, anamniote ground plan of cerebellum development. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 3048-3057 (2010).
  8. Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
  9. Butts, T., Modrell, M. S., Baker, C. V., Wingate, R. J. The evolution of the vertebrate cerebellum: absence of a proliferative external granule layer in a non-teleost ray-finned fish. Evolution & Development. 16, 92-100 (2014).
  10. Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M., Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development. 133, 1811-1821 (2006).
  11. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development. 126, 4395-4404 (1999).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  14. Yamada, M., et al. Specification of spatial identities of cerebellar neuron progenitors by ptf1a and atoh1 for proper production of GABAergic and glutamatergic neurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 4786-4800 (2014).
  15. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  16. Wilson, L. J., Wingate, R. J. Temporal identity transition in the avian cerebellar rhombic lip. Developmental Biology. 297, 508-521 (2006).
  17. Hausmann, B., Sievers, J. Cerebellar external granule cells are attached to the basal lamina from the onset of migration up to the end of their proliferative activity. The Journal of Comparative Neurology. 241, 50-62 (1985).
  18. Xenaki, D., et al. F3/contactin and TAG1 play antagonistic roles in the regulation of sonic hedgehog-induced cerebellar granule neuron progenitor proliferation. Development. 138, 519-529 (2011).
  19. Komuro, H., Yacubova, E., Yacubova, E., Rakic, P. Mode and tempo of tangential cell migration in the cerebellar external granular layer. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 527-540 (2001).
  20. Klein, R. S., et al. SDF-1 alpha induces chemotaxis and enhances Sonic hedgehog-induced proliferation of cerebellar granule cells. Development. 128, 1971-1981 (2001).
  21. Zhu, Y., et al. Role of the chemokine SDF-1 as the meningeal attractant for embryonic cerebellar neurons. Nature Neuroscience. 5, 719-720 (2002).
  22. Hagihara, K., et al. Shp2 acts downstream of SDF-1alpha/CXCR4 in guiding granule cell migration during cerebellar development. Developmental Biology. 334, 276-284 (2009).
  23. Borrell, V., Marin, O. Meninges control tangential migration of hem-derived Cajal-Retzius cells via CXCL12/CXCR4 signaling. Nature Neuroscience. 9, 1284-1293 (2006).
  24. Paredes, M. F., Li, G., Berger, O., Baraban, S. C., Pleasure, S. J. Stromal-derived factor-1 (CXCL12) regulates laminar position of Cajal-Retzius cells in normal and dysplastic brains. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 9404-9412 (2006).
  25. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 1613-1624 (2008).
  26. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  27. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 2301-2312 (2008).
  28. Legue, E., Riedel, E., Joyner, A. L. Clonal analysis reveals granule cell behaviors and compartmentalization that determine the folded morphology of the cerebellum. Development. 142, 1661-1671 (2015).
  29. Dahmane, N., Ruizi Altaba,, A, Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  30. Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Current Biology : CB. 9, 445-448 (1999).
  31. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
  32. Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270, 393-410 (2004).
  33. Zhao, H., Ayrault, O., Zindy, F., Kim, J. H., Roussel, M. F. Post-transcriptional down-regulation of Atoh1/Math1 by bone morphogenic proteins suppresses medulloblastoma development. Genes & Development. 22, 722-727 (2008).
  34. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  35. Klisch, T. J., et al. In vivo Atoh1 targetome reveals how a proneural transcription factor regulates cerebellar development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3288-3293 (2011).
  36. Miyata, T., Maeda, T., Lee, J. E. NeuroD is required for differentiation of the granule cells in the cerebellum and hippocampus. Genes & Development. 13, 1647-1652 (1999).
  37. Butts, T., Hanzel, M., Wingate, R. J. Transit amplification in the amniote cerebellum evolved via a heterochronic shift in NeuroD1 expression. Development. 141, 2791-2795 (2014).
  38. Rios, I., Alvarez-Rodriguez, R., Marti, E., Pons, S. Bmp2 antagonizes sonic hedgehog-mediated proliferation of cerebellar granule neurones through Smad5 signalling. Development. 131, 3159-3168 (2004).
  39. Anne, S. L., et al. WNT3 inhibits cerebellar granule neuron progenitor proliferation and medulloblastoma formation via MAPK activation. PloS One. 8, e81769 (2013).
  40. Chedotal, A. Should I stay or should I go? Becoming a granule cell. Trends in Neurosciences. 33, 163-172 (2010).
  41. Penas, C., et al. Casein Kinase 1delta Is an APC/C(Cdh1) Substrate that Regulates Cerebellar Granule Cell Neurogenesis. Cell Reports. 11, 249-260 (2015).
  42. Penas, C., et al. GSK3 inhibitors stabilize Wee1 and reduce cerebellar granule cell progenitor proliferation. Cell Cycle. 14, 417-424 (2015).
  43. Yang, Z. J., et al. Novel strategy to study gene expression and function in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience Methods. 132, 149-160 (2004).
  44. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nature Neuroscience. 10, 559-567 (2007).
  45. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 16182-16187 (2007).
  46. Famulski, J. K., et al. Siah regulation of Pard3A controls neuronal cell adhesion during germinal zone exit. Science. 330, 1834-1838 (2010).
  47. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. 14, 973-983 (2011).
  48. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. , (2014).
  49. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 106 המוח הקטן פיתוח חומוס שכבה חיצונית גרגיר תרבות הפרוסה תאי גרגיר תאי פורקינג ' electroporation.
<em>אקס</em> תרבות <em>Vivo</em> של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter