Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية. هنا، نقدم بروتوكول لاستهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة في ذروة انتشار استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للوثقافة شرائح للدماغ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج.

Abstract

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ (EGL) هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية، ونموذجا ممتازا لدراسة انتشار الخلايا العصبية والتمايز. وبالإضافة إلى ذلك، كانت التعديلات التطورية للقدرة التكاثري من المسؤول عن التوسع الكبير في حجم المخيخ في amniotes، مما يجعل من المخيخ نموذجا ممتازا للدراسات ايفو-DEVO من الدماغ الفقاريات. الخلايا المكونة للEGL، الأسلاف الحبيبية للدماغ، كما تمثل خلية كبيرة من أصل لنخاعي، ورم الخلايا العصبية لدى الأطفال الأكثر انتشارا. بعد التضخيم العبور، السلائف الحبيبية تهاجر شعاعيا في الطبقة الحبيبية الداخلية من المخيخ حيث أنهم يمثلون أكبر عدد من الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات ناضجة. في الفرخ، وذروة EGL الانتشار يحدث في نهاية الأسبوع الثاني من الحمل. من أجل استهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة فيذروة الانتشار، قمنا بتطوير طريقة للتلاعب الجيني من خلال خارج الجسم الحي Electroporation للشرائح المخيخ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج. هذه الطريقة يلخص عدة جوانب هامة من الجسم الحي في الحبيبية تطوير الخلايا العصبية، وسوف يكون من المفيد في خلق فهم شامل للدماغ تكاثر الخلايا الحبيبية والتمايز، وبالتالي التنمية المخيخ، وتطور والمرض.

Introduction

المخيخ يجلس في نهاية الأمامي من الدماغ المؤخر وهي المسؤولة عن دمج المعالجة الحسية والحركية في الدماغ ناضجة وكذلك تنظم العمليات العقلية العليا 1. في الثدييات والطيور، وأنها تمتلك التشكل تفصيلا ورقي بشكل كبير، وهو منتج من التضخيم عبور واسعة من الأسلاف خلال التنمية التي تنتج أكثر من نصف الخلايا العصبية في الدماغ الكبار. وكان المخيخ موضوع دراسة للبيولوجيا عصبية لعدة قرون، في عهد الجزيئي تلقت أيضا اهتماما كبيرا. ويتصل هذا ليس فقط لوظائفه الحيوية للاهتمام في حد ذاتها، ولكن أيضا إلى حقيقة أنه متورط بشكل كبير في الأمراض التي تصيب البشر بما في ذلك اضطرابات وراثية التنموية مثل اضطرابات طيف التوحد 2 وأبرزها سرطان المخيخ، نخاعي 3، الذي هو الدماغ عند الأطفال الأكثر انتشارا ورم. الأهم من ذلك، هو نظام نموذجا ممتازا ضمن ملحقالتراث الثقافي غير المادي لدراسة تخصيص مصير وتكوين الخلايا العصبية أثناء نمو المخ 4. في السنوات الأخيرة، كما ثبت كنظام نموذج لدراسة مقارنة لنمو الدماغ، وذلك بسبب التنوع الهائل في أشكال المخيخ ينظر عبر نسالة الفقاريات 10/05.

المخيخ يتطور من نصف ظهري من قسيم معيني 1 في الدماغ المؤخر 11 وتنمويا ويتكون من اثنين من السكان السلف الأساسي، الشفة المعينية ومنطقة البطين. الشفة المعينية تمتد في جميع أنحاء المنطقة الظهرية من الظهارة العصبية من الدماغ المؤخر على الحدود مع لوحة السقف. ومن مهد الخلايا العصبية مثير glutamatergic من المخيخ 12-14. في منطقة البطين يثير في GABAergic الخلايا العصبية للدماغ المثبطة، أبرزها الخلايا العصبية الكبيرة العصبية 14،15. في وقت لاحق في التنمية (من نحو يوم الجنينية 13.5 في الماوس؛ E6 في فرخ 16)، glutamatergic PROGENitors الهجرة بشكل طفيف من الشفة المعينية وتشكل طبقة حنوني من الأسلاف: تسمى منطقة السلف الثانوية الطبقة الحبيبية الخارجية (EGL). ومن هذه الطبقة التي يخضع التضخيم العبور الواسع النطاق الذي يؤدي إلى أعداد هائلة من الخلايا العصبية الحبيبية وجدت في الدماغ ناضجة.

منذ فترة طويلة ارتبط انتشار في EGL إلى الموقع الفرعي حنوني الذي ينتج عن الهجرة عرضية من المعينية شفة 17، مع التحول إلى خروج دورة الخلية وتمايز الخلايا العصبية الأسلاف ارتباطهم خروجهم من طبقة EGL الخارجية في منتصف EGL 18. الهجرة عرضية واسعة من الخلايا الحبيبية بعد الإنقسامية في محور وسطي الجانبي يحدث في الوسط والداخلي جي 19، قبل الهجرة النهائية شعاعي في الطبقة الحبيبية الداخلية للقشرة المخ ناضجة. هجرة الخلايا من الشفة المعينية على سطح المخيخ تعتمد على CXCL12 إشارات من الحنون 20-22 23-25. يثير الاهتمام والفضول، واقترح الإلكترون الدراسات المجهرية 17 أن الخلايا EGL مع التشكل التكاثري البقاء على اتصال حنوني، وربط سلوك الخلية مع القدرة على التكاثر بطريقة تذكرنا الأسلاف القاعدية من القشرة الثدييات 26. وينعكس هذا في الطبقات المذكور من EGL إلى ثلاث طبقات فرعية التي تم تعريفها من قبل بيئات خارج الخلية المتميزة والتي لها السلائف الحبيبية متميزة التعبير الجيني التواقيع 18.

انتشار الأسلاف في oEGL يحدث مع التوزيع الطبيعي للأحجام استنساخ بحيث عندما يتم بشكل فردي وصفت الأسلاف وراثيا في نهاية التطور الجنيني في الماوس، فإنها تؤدي إلى معدل متوسط ​​250-500 ز تالية للتفتلالخلايا العصبية ranule 27،28. انتشار يعتمد على مولد للتفتل يشير SHH من الخلايا العصبية الكامنة وراء العصبية 29-32. وقد تبين القدرة على الرد على SHH أن تعتمد كليا على الخلية التعبير المستقل للعامل النسخ Atoh1، سواء في المختبر 33 والمجراة 34،35. وبالمثل، فقد تبين خروج دورة الخلية والتمايز أن تعتمد على التعبير عن عامل النسخ المصب NeuroD1 36، والتي من المحتمل أن يكون كاظمة مباشر من Atoh1 37.

وعلى الرغم من هذا التقدم، والتقدم الكبير في فك رموز أساس بيولوجي خلية من دورة الخلية خروج 38-42، الآلية الجزيئية الأساسية (ق) التي تكمن وراء قرار الخروج من دورة الخلية والانتقال من السلف إلى الخلايا العصبية التفريق، و يرتبط الهجرة عرضية تالية للتفتل في EGL الداخلي فضلا عن التبديل لاحقإلى الهجرة شعاعي، لا تزال غير مفهومة تماما. هذا هو إلى حد كبير بسبب استعصاء التجريبي للEGL: فوات النامية، ويصعب استهداف وراثيا منذ العديد من نفس الجزيئات العصبية هي أيضا في الحياة السلائف الحبيبية في وقت سابق حاسمة في الشفة المعينية. للتغلب على هذه المشكلة، وقد وضعت العديد من الكتاب في الجسم الحي وخارج الحي Electroporation للكوسيلة لاستهداف المخيخ ما بعد الولادة في القوارض 43-48. هنا، نحن الرواد في استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للفي فرخ لدراسة EGL، التي تمثل مزايا كبيرة من حيث التكلفة والراحة. لدينا طريقة Electroporation للوخارج الحي ثقافة شريحة من نسيج دماغ الفرخ يستخدم تشريح الأنسجة الجنينية من يوم 14 الكتاكيت في ذروة EGL الانتشار. هذا الأسلوب يسمح الاستهداف الجيني للEGL بشكل مستقل من الشفة المعينية وسوف يمهد الطريق لتشريح الجيني للانتقال من الحبيبيةالسلف لتالية للتفتل الخلايا العصبية الحبيبية في المخيخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التجارب مع فقا لكينجز كوليدج لندن، المملكة المتحدة والمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان UK زارة الداخلية.

1. تشريح E14 المخيخ

  1. احتضان البيض البني الدجاج المخصب "في 38 ° C إلى يوم الجنينية 14.
  2. باستخدام مقص البيض قطع رأس الفرخ الجنين في البيضة وإزالة الرأس إلى طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة PBS (الشكل 1A).
  3. باستخدام ملقط القياسية، وجعل الشقوق وراء كل عين على طول الطريق من خلال الأنسجة، وإزالة العين والفك العلوي. جعل الشق الثاني على طول الطريق من خلال البلعوم إزالة الفك السفلي (الشكل 1B).
  4. باستخدام ملقط القياسية، وإزالة كل الجلد من سطح الجمجمة عن طريق تقشير بعيدا (الشكل 1C) وإزالة أمامي والجداري العظام، وكشف الدماغ.
  5. من الناحية البطنية، وإزالة الغضروف البلعوم واللحمة المتوسطة مساعدة.
  6. من الناحية الظهرية، حذرالاي إزالة اللحمة المتوسطة ظهري إلى الدماغ المؤخر مع الحرص على عدم الاضرار الحنون، ودماغ كامل منفصل (1D الشكل).
  7. جعل شق كل وسيلة من خلال الأنسجة بين الدماغ المتوسط ​​والدماغ المؤخر والدماغ المؤخر منفصل بما في ذلك المخيخ (الشكل 1E).
  8. عن طريق شقوق على طول الطريق من خلال الأنسجة في كل التقاطعات الجانبية من المخيخ وصفيحة الجناحية من الدماغ المؤخر، وإزالة المخيخ بأكمله، مع الحرص على الحفاظ على سلامة الحنون في جميع أنحاء تشريح (الشكل 1F). إزالة تشكيل الضفيرة المشيمية (الشكل 1G).
  9. نقل المخيخ تشريح في الجليد الباردة HBSS.

2. من الثقافة شريحة E14 المخيخ

  1. نقل المخيخ كله إلى منصة معقمة من الأنسجة المروحية باستخدام ملعقة أو ماصة باستير 3 مل مع طرف قطع لتوسيع الفتحة. إزالة السائل الزائد باستخدام ماصة.
  2. قطع المخيخ كله كله في تيكان المطلوب التوجه في 300 ميكرون سمك باستخدام المروحية الأنسجة مع مجموعة سرعة القطع بنسبة 50٪ من الحد الأقصى. هو الحفاظ على سلامة الأنسجة الأكثر سهولة في مقطع سهمي. ومع ذلك، التوجه هو أيضا من الاعتبارات المهمة لتحليل الخلية (يتم محاذاة التشعبات الخلية العصبية sagittally، في حين محاور الخلايا الحبيبية تشغيل مستعرض، عمودي على الطائرة من التشعبات الخلية العصبية).
  3. باستخدام 3 مل ماصة باستير، تغطية المخيخ شرائح في الجليد HBSS الباردة.
  4. نقل الشرائح في HBSS إلى 60 مم طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة HBSS الطازجة باستخدام ماصة باستير 3 مل مع خفض الحافة.
  5. تحت المجهر تشريح مضيئة مع مصدر ضوء الألياف البصرية، وضمان الفصل بين شرائح الفردية باستخدام ملقط ساعاتي. تحديد شرائح ليتم electroporated، استنادا إلى سلامة الأنسجة وموقف ميديو الاطراف.
    ملاحظة: كل من تشريح الجنين من خلال لشريحة الحضانة في مستنبت يستغرق حوالي 10-20 دقيقة حسب UPOن الخبرة. أداء تشريح في وقت واحد لضمان أن مخيخات تنفق الحد الأدنى مقدار الوقت بين قطع الرأس والثقافة خارج الحي.

3. Electroporation للمن شرائح

  1. بناء دائرة Electroporation للعن طريق تحديد الأنود من electroporator إلى قاعدة 60 مم طبق بتري مع الشريط العازل. إضافة حوالي 1 مل من HBSS لتغطية القطب.
  2. وضع إدراج 0.4 ميكرومتر الثقافة على رأس القطب المشمولة في HBSS. السماح للإدراج الثقافة للراحة على القطب التأكد من عدم والاتصال دائما بين إدراج والقطب.
    ملاحظة: في هذا الإعداد، وإدراج الثقافة مع شرائح الراحة على سطح من الحل، والحفاظ على الدوائر ولكن يسمح الاستهداف المكاني للالكاثود.
  3. نقل شرائح محددة (ما يصل الى خمسة في إدراج الثقافة) على إدراج الثقافة باستخدام 3 مل ماصة باستير مع خفض الحافة. منفصلة والسماح لتسوية على إدراج الثقافة في sagittآل التوجه.
  4. باستخدام ماصة، وإزالة الزائد HBSS بحيث شرائح لم تعد استحم في الحل.
  5. باستخدام ماصة طرف P10، DNA ماصة (بتركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر) المخفف مع الأخضر سريع 20٪ على سطح المنطقة المستهدفة من شريحة. 20٪ الأخضر سريع يضمن حل DNA لزج ويمنع مانع تشتت واسعة من DNA. إضافة ما يقرب من 5 DNA ميكرولتر / حل سريع الخضراء على كل شريحة (الشكل 2B).
  6. وضع القطب السالب على الأنسجة المستهدفة المطلوب وelectroporate مع 3 × 10 V، 10 البقول مدة ميللي ثانية. تجنب الاتصال المباشر من القطب السالب مع الأنسجة. بدلا من ذلك، والاستفادة من التوتر السطحي للسائل للحفاظ على تصرف (وضع الكاثود أقرب إلى الأنسجة ممكن دون لمس الواقع الأنسجة).
  7. كرر تسليم DNA و electroporation إلى مناطق متعددة من EGL على كل شريحة المخيخ الفردية كما تريد.
  8. عند الانتهاء من Electroporation لل، ثقافة نقل INSEغ إلى 30 مم طبق بتري.
  9. إلى كل ثقافة، إضافة 1 مل من قبل تحسنت مستنبت (بصل متوسطة النسر، 0.5٪ (ث / ت) D - (+) - الجلوكوز، 1٪ B27 ملحق، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) تحت إدراج الثقافة بحيث إدراج الثقافة في اتصال مع المتوسط، ولكن لم يتم استحم شرائح في ذلك.
  10. احتضان الثقافات في 37 ° C / 6 CO 2٪ لمدة تصل إلى 3 أيام. استبدال كافة مستنبت كل 24 ساعة مع الطازجة المتوسطة قبل تحسنت.
  11. وعقب الثقافة، وتحديد شرائح على ثقافة إدراج لمدة 1 ساعة في 4٪ امتصاص العرق (أو O / N عند 4 درجات مئوية) في 30 ملم طبق جديد مع عدم وجود وسائل الإعلام الثقافة.

4. التصوير من مخيخي شرائح

  1. بعد التثبيت، وغسل شرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
  2. باستخدام شفرة حلاقة، تشريح كل شريحة المخيخ electroporated ومثقف من إدراج الثقافة عن طريق خفض حول شريحة وإزالة شريحة ومنطقة إدراج يتم الالتزام فيها. فعللا تحاول إزالة شريحة من السطح إدراج الثقافة.
  3. جبل شرائح في حوالي 1 مل من تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي (إذا رغبت) تحت ساترة مع الحرص على عدم إدخال فقاعات، والصورة باستخدام ليزر المسح المجهري متحد البؤر.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف المعلمات التصوير وفقا ليبني electroporated، وبناء على السلطة التقديرية للمستخدم فردي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام Electroporation للشريحة وثقافة المخيخ من الجنينية يوم 14 فرخ. ويوضح تشريح المخيخ في الشكل 1 ويظهر غرفة Electroporation للاقامة في الشكل 2. نظهر أنه من الممكن electroporate وبنجاح شرائح المخيخ الثقافة، التي تحتفظ هيكلها والأشكال التضاريسية الخلوية في المختبر (الشكل 3A). ويتحقق Electroporation للتستهدف الورقات الفردية بسهولة (الشكل 3B). نجحنا في electroporate عدد من البلازميدات مختلفة في الخلايا EGL وتبين أنه من الممكن ط) لتسمية الخلايا مع مراسل يبني لمراقبة سلوكهم (الشكل 3C)، والثاني) لاختبار المناطق الجينومية الممكنة حصول على وظائف في خلايا المخيخ (الشكل 3D )، والثالث) لمعالجة وراثيا لالخلايا في EGL التي كتبها misexpressing البروتينات من الفائدة (الشكل 3E). بالإضافة إلى ذلك، التلاعب الدوائية على شرائح electroporated ممكنة (النتائج غير معروضة). بعد زراعة فمن الممكن لإجراء تحليل الأنسجة إضافية مثل المناعية أو انتشار المقايسات (الشكل 3F). نحن لتحليل صحة الأنسجة عن طريق calbindin وPH3 المناعية وتبين أن سلامة الأنسجة والمحافظة لا يقل عن 3 شعبة بعد ثقافة (الشكل 4). وتبين هذه النتائج أن EGL هو الآن بنية الوصول إليها والتلاعب بها بسهولة التي يمكن دراستها بشكل كامل وتغيير في نظام نموذجي كتكوت وراثيا.

الشكل 1
الشكل 1. تشريح المخيخ من E14 افراخ الدجاج. (A) قطع رأس الفرخ في البيضة وإزالة الباحث الرأسطبق بتري الزراعة العضوية مع PBS الجليد الباردة. إزالة الفك السفلي والعين عن طريق شق وراء العينين والبلعوم (خط متقطع). (B) إزالة الجلد من سطح الجمجمة. (C) إزالة أمامي والعظام الجدارية و(D) إزالة الدماغ من اللحمة المتوسطة والغضاريف المحيطة به. (E) تحت المجهر تشريح تحديد موقع المخيخ في نهاية الخلفي من الدماغ. قطع بين الدماغ المتوسط ​​والدماغ المؤخر (الخطوط المتقطعة) أن تترك مع المخيخ والدماغ المؤخر بطني. (F) جعل شقوق في التقاطعات الجانبية (السويقتين) من المخيخ لفصل المخيخ من الدماغ المؤخر (خط متقطع). (G) إزالة الضفيرة المشيمية (النجمة) من الجانب البطني من المخيخ حتى يتم ترك مع المخيخ سليمة كله مع الحنون المرفقة. نقل المخيخ في الجليد الباردة HBSS قبل إعداد شرائح مع تشوب الأنسجةإيه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. غرفة Electroporation للاقامة. (A) صورة للغرفة Electroporation للصنع حسب الطلب. وتتكون الغرفة من أنود من electroporator وضعها بشكل آمن على قاعدة 60 مم طبق بتري. الطبق يحتوي على حوالي 1 مل من HBSS لتغطية القطب. ينبغي أن تقوم على إدراج الثقافة في القطب مع اتصال دائم بين إدراج والقطب، والحفاظ على الدوائر ولكن يسمح الاستهداف المكاني للالكاثود، الذي يتم التلاعب باليد. (B) صورة للشرائح التي electroporated. وتغطي شرائح مع الحمض النووي / حل سريع الخضراء. وelectroporated شرائح حيث الرغبةد: يمكن استهداف Electroporation لللfolium واحد أو مواقع متعددة. بعد Electroporation لليوضع إدراج في 30 مم طبق بتري مع ما قبل تحسنت المتوسطة الثقافة والمثقف في الحاضنة. 1. الأنود 2. طبق بتري الكاثود 3. الثقافة إدراج 4. مع 1 مل HBSS 5. تشريح المجهر 6. شرائح فردية من المروحية الأنسجة 7. حل الحمض النووي مع صبغة خضراء سريع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل (3)
الشكل 3. ممثل النتائج. (A) صورة التكبير منخفضة من Electroporation للسيطرة الترميز البلازميد RFP في EGL في مواقع متعددة. الأنسجة تحتفظ هيكلها والخلايا electroporated واضحة للعيان في طبقة تحت الحنون سميكة من المخيخ. (ب)مثال على Electroporation للاستهداف مع البلازميد السيطرة GFP. يشار إلى folium المستهدفة من قبل النجمة. شريط النطاق AB = 500 ميكرون. (C) مثال حيث تم electroporated لبناء ترميز GFP مدفوعا محسن Atoh1 في EGL. التعبير عن Atoh1 يعرف السلائف الخلية الحبيبية داخل EGL. الأشكال التضاريسية الخلايا المختلفة هي واضحة للعيان في 3 شعبة ويمكن رصد سلوك الخلية. (D) مثال من العلامات التالية في Electroporation لللبناء يحتوي على الحفظ العنصر المفترض غير المشفر (CNE) من الجين NeuroD1 القيادة GFP. تقارير CNE النشاط في خلايا المتوقع استنادا الذاتية NeuroD1 التعبير يدل على الدور النشط هذا CNE في التنمية. NeuroD1 التعبير يرتبط مع بدء تمايز الخلايا الحبيبية. (E) مثال حيث الأنسجة يمكن التلاعب بها وراثيا عن طريق misexpression من البروتين NeuroD1 وتغيير في الحبيبية الخلية behavويمكن ملاحظة iour. (F) مثال حيث الأنسجة electroporated (السيطرة GFP البلازميد) يمكن ان تكون ثابتة وملطخة للعلامات من الخلايا المتكاثرة، مثل H3 phosphohistone (PH3). مقياس شريط CF = 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. الأنسجة النزاهة والانتشار في الثقافة. (A - C) Calbindin تلطيخ E14 أنسجة دماغ electroporated مع البلازميد السيطرة GFP في 1-3 أيام في المختبر (شعبة). يظهر Calbindin تلطيخ أن سلامة الأنسجة والمحافظة في الثقافة لا يقل عن 3 شعبة. لا تشكل طبقة الخلايا العصبية أحادي الطبقة في هذه المرحلة من تطور الفرخ ولكن يرى بوضوح أنها تشكل طبقة تحتEGL حيث توجد الخلايا الحبيبية (الخضراء). (D) Phosphohistone H3 (PH3) تلطيخ على أنسجة دماغ تربيتها لمدة 2 شعبة. PH3 تلطيخ مرئيا في EGL (الأسهم)، ولكن أيضا في مناطق أخرى المخيخ (السهام). هذا هو تلطيخ ممثلة لجميع المراحل في الثقافة فحص (1-3 شعبة). شريط النطاق AD = 50μm الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول ذكرت هنا يصف طريقة لتشريح، electroporating وزراعة شرائح من الجنينية يوم 14 المخيخ من الفرخ. هذا البروتوكول يتيح استهداف Electroporation لللمناطق محورية صغيرة من EGL، بما في ذلك استهداف معزولة من فصوص المخيخ الفردية. فإنه يتيح التحليل الجيني والتصوير بدقة عالية والراحة، وبتكلفة منخفضة بالمقارنة مع تقنيات أنشئت في القوارض 43-47. هذا التحليل غير ممكن في الوقت الراهن في الجسم الحي بسبب الفترة الممتدة التنموية الوقت، وندرة إمكانيات الاستهداف الجيني EGL محددة في الماوس، والقواسم المشتركة من الآليات الجزيئية بين الشفة المعينية وEGL، وهو ما يعني أن التعديلات التي قد تؤثر EGL علم الأحياء في كثير من الأحيان لا يمكن تحليلها لأنها تؤثر المعينية الشفة تكوين الخلايا العصبية وإلغاء تشكيل EGL 49. وبالتالي نظامنا يمثل تقدما كبيرا من حيث استهداف التعديل الوراثي للEGL الصورةpecifically، ونتوقع أنها ستكون ينطبق على الأنواع الأخرى وراء فرخ أنه ربما من مصلحة المقارنة، مثل الثدييات غير النموذجية والزواحف.

في أداء تقنية Electroporation للثقافة شريحة، عددا من الاعتبارات التقنية لها أهمية قصوى. أولا، متانة شرائح البقاء على قيد الحياة في الثقافة دون من ناحية تمر موت الخلايا واسع أو على السلامة الهيكلية الأخرى فقدان يحد من سمك شريحة إلى 300 ميكرومتر في أيدينا. وهناك اعتبار هام آخر هو اللزوجة من الحل DNA، والتي تضمن Electroporation للمن الحمض النووي في تركيزات مرتفعة بما يكفي للحث على مستويات مرئية أو ذات الصلة من التعديل الوراثي. في Electroporation للفي البيضة من الحلول DNA حقنها في الدماغ المؤخر الجنينية في وقت مبكر، وتركيزات صبغة خضراء سريع من 1٪ تقريبا هي نموذجية. ومع ذلك، في بروتوكول لدينا، ونحن عادة استخدام تركيزات الأخضر سريع من 20٪. وهذا يضمن بما فيه الكفاية VISالحل DNA الآكلة لمنع تشتت DNA التالية pipetting لولكن قبل Electroporation لل، ولكن تمييع بما فيه الكفاية واحد للتوسط التوصيل الكهربائي كفاءة.

وبالإضافة إلى هذه الاعتبارات الفنية، لاحظنا أن السلوك التكاثري التي نلاحظها خارج الحي لا بالتحديد المباراة التي توقع من في الدراسات المجراة ربما يرجع إلى سلامة حنوني التي تعطلت بسبب إعداد الأنسجة. في ظل هذه الظروف، عندما يتم electroporated لبناء GFP التعبير، ويبدو أن نسبة كبيرة من الخلايا electroporated غادروا دورة الخلية بعد يوم واحد فقط من الثقافة كما تقرره PH3 تلطيخ (الشكل 3F). هذا لا ترتبط المتوقع EGL السلوك التكاثري، حيث انتشار الحيوانات المستنسخة في كل من الفأر وفرخ يمتد على مدى فترة زمنية كبيرة (27). يتم اعتماد الإيحاء بأن الحنون ينظم انتشار عن طريق الملاحظة أننا عندما electroporate على CONSTRUC مراسلر مع NeuroD1 العنصر التنظيمي التعبير الدافعة للGFP جميع الخلايا electroporated تعبر عن GFP بعد يوم واحد في ثقافة (الشكل 3D). في الجسم الحي، وهذا يعكس التركيبة التعبير NeuroD1 الذاتية في الاحتفال خلايا EGL الداخلية التي هي في مرحلة ما بعد الإنقسامية 36،37، بينما كامل طول NeuroD1 يكفي لدفع تمايز الخلايا (الشكل 3E). وهذا يشير إلى أنه في ظل ظروف معينة، والقدرة التكاثري من الخلايا قد لا يتم الإبقاء كما هو الحال في EGL الخارجي في مراحل ما يعادلها في الجسم الحي. ومع ذلك PH3 تلطيخ لا تشير إلى أن هناك الكثير من الانتشار في الثقافة، في كثير من الأحيان مترجمة إلى منطقة EGL (الشكل 4D). انتشار واسع خارج EGL يشير ربما تعزيز gliogenesis أو انتشار السلائف Pax2 GABAergic في المادة البيضاء. وهذا يعني أن تفسير أي إجراء التجارب سوف تضطر إلى اتخاذ بعين الاعتبار proliferativ أعلاهالسلوك الإلكترونية، وحقيقة أن الخلايا العصبية لا تشكل أحادي الطبقة حتى E18 في الفرخ وأن التطور الطبيعي قد يؤثر سلبا بعد إعداد شريحة (على سبيل المثال، وذلك بسبب عدم وجود تفاعل مع صعود الألياف الخ)

على الرغم من هذه القيود، ويمثل بروتوكول لدينا خطوة هامة إلى الأمام فيما يتعلق بدراسة العديد من جوانب بيولوجيا الخلايا الحبيبية. فإن ميزة حاسمة لتمكين مكانيا وزمانيا وضع العلامات المحددة للEGL تمييزا لها عن الشفة المعينية تسهيل امتحانات متعددة من كل من بيولوجيا الخلايا من الأسلاف الحبيبية والتنظيم الجيني التي تقوم عليها بطريقة غير ممكن في الوقت الحاضر في الجسم الحي. وأسلوبنا في فرخ تكمل فيفو السابقين الثقافة و electroporation البروتوكولات الموجودة في القوارض 43-48 ويحمل مزايا كبيرة في التكلفة والراحة التي ترتبط مع الفرخ. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمثل تقدما كبيرا خلالالتقنيات الموجودة الأسلاف زراعة الحبيبية 39. في حين أنه سوف تكمل بدلا من استبدال هذا الأخير، فإن لدينا بروتوكول تفتح سيطرة الحبيبية الخلايا العصبية التمايز إلى مجموعة واسعة من العلاجات الدوائية وتنوع الخلايا التلاعب الجيني الحكم الذاتي التي يمكن تحقيقها في الفرخ. فهي توفر أساسا لدراسة بيولوجيا الخلايا الحبيبية بتفاصيل غير مسبوقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشأ الطريقة المعروضة في هذه المقالة عن العمل الممول من BBSRC BB / I021507 / 1 (TB، RJTW) وstudentship الدكتوراه MRC (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
  2. Becker, E. B., Stoodley, C. J. Autism spectrum disorder and the cerebellum. International Review of Neurobiology. 113, 1-34 (2013).
  3. Hatten, M. E., Roussel, M. F. Development and cancer of the cerebellum. Trends in Neurosciences. 34, 134-142 (2011).
  4. Butts, T., Green, M. J., Wingate, R. J. Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain. Development. 141, 4031-4041 (2014).
  5. Rodriguez-Moldes, I., et al. Development of the cerebellar body in sharks: spatiotemporal relations of Pax6 expression, cell proliferation and differentiation. Neuroscience Letters. 432, 105-110 (2008).
  6. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 29, 6142-6153 (2009).
  7. Chaplin, N., Tendeng, C., Wingate, R. J. Absence of an external germinal layer in zebrafish and shark reveals a distinct, anamniote ground plan of cerebellum development. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 3048-3057 (2010).
  8. Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
  9. Butts, T., Modrell, M. S., Baker, C. V., Wingate, R. J. The evolution of the vertebrate cerebellum: absence of a proliferative external granule layer in a non-teleost ray-finned fish. Evolution & Development. 16, 92-100 (2014).
  10. Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M., Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development. 133, 1811-1821 (2006).
  11. Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development. 126, 4395-4404 (1999).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  14. Yamada, M., et al. Specification of spatial identities of cerebellar neuron progenitors by ptf1a and atoh1 for proper production of GABAergic and glutamatergic neurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 4786-4800 (2014).
  15. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
  16. Wilson, L. J., Wingate, R. J. Temporal identity transition in the avian cerebellar rhombic lip. Developmental Biology. 297, 508-521 (2006).
  17. Hausmann, B., Sievers, J. Cerebellar external granule cells are attached to the basal lamina from the onset of migration up to the end of their proliferative activity. The Journal of Comparative Neurology. 241, 50-62 (1985).
  18. Xenaki, D., et al. F3/contactin and TAG1 play antagonistic roles in the regulation of sonic hedgehog-induced cerebellar granule neuron progenitor proliferation. Development. 138, 519-529 (2011).
  19. Komuro, H., Yacubova, E., Yacubova, E., Rakic, P. Mode and tempo of tangential cell migration in the cerebellar external granular layer. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 527-540 (2001).
  20. Klein, R. S., et al. SDF-1 alpha induces chemotaxis and enhances Sonic hedgehog-induced proliferation of cerebellar granule cells. Development. 128, 1971-1981 (2001).
  21. Zhu, Y., et al. Role of the chemokine SDF-1 as the meningeal attractant for embryonic cerebellar neurons. Nature Neuroscience. 5, 719-720 (2002).
  22. Hagihara, K., et al. Shp2 acts downstream of SDF-1alpha/CXCR4 in guiding granule cell migration during cerebellar development. Developmental Biology. 334, 276-284 (2009).
  23. Borrell, V., Marin, O. Meninges control tangential migration of hem-derived Cajal-Retzius cells via CXCL12/CXCR4 signaling. Nature Neuroscience. 9, 1284-1293 (2006).
  24. Paredes, M. F., Li, G., Berger, O., Baraban, S. C., Pleasure, S. J. Stromal-derived factor-1 (CXCL12) regulates laminar position of Cajal-Retzius cells in normal and dysplastic brains. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 9404-9412 (2006).
  25. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 1613-1624 (2008).
  26. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  27. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 2301-2312 (2008).
  28. Legue, E., Riedel, E., Joyner, A. L. Clonal analysis reveals granule cell behaviors and compartmentalization that determine the folded morphology of the cerebellum. Development. 142, 1661-1671 (2015).
  29. Dahmane, N., Ruizi Altaba,, A, Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  30. Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Current Biology : CB. 9, 445-448 (1999).
  31. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
  32. Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270, 393-410 (2004).
  33. Zhao, H., Ayrault, O., Zindy, F., Kim, J. H., Roussel, M. F. Post-transcriptional down-regulation of Atoh1/Math1 by bone morphogenic proteins suppresses medulloblastoma development. Genes & Development. 22, 722-727 (2008).
  34. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  35. Klisch, T. J., et al. In vivo Atoh1 targetome reveals how a proneural transcription factor regulates cerebellar development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3288-3293 (2011).
  36. Miyata, T., Maeda, T., Lee, J. E. NeuroD is required for differentiation of the granule cells in the cerebellum and hippocampus. Genes & Development. 13, 1647-1652 (1999).
  37. Butts, T., Hanzel, M., Wingate, R. J. Transit amplification in the amniote cerebellum evolved via a heterochronic shift in NeuroD1 expression. Development. 141, 2791-2795 (2014).
  38. Rios, I., Alvarez-Rodriguez, R., Marti, E., Pons, S. Bmp2 antagonizes sonic hedgehog-mediated proliferation of cerebellar granule neurones through Smad5 signalling. Development. 131, 3159-3168 (2004).
  39. Anne, S. L., et al. WNT3 inhibits cerebellar granule neuron progenitor proliferation and medulloblastoma formation via MAPK activation. PloS One. 8, e81769 (2013).
  40. Chedotal, A. Should I stay or should I go? Becoming a granule cell. Trends in Neurosciences. 33, 163-172 (2010).
  41. Penas, C., et al. Casein Kinase 1delta Is an APC/C(Cdh1) Substrate that Regulates Cerebellar Granule Cell Neurogenesis. Cell Reports. 11, 249-260 (2015).
  42. Penas, C., et al. GSK3 inhibitors stabilize Wee1 and reduce cerebellar granule cell progenitor proliferation. Cell Cycle. 14, 417-424 (2015).
  43. Yang, Z. J., et al. Novel strategy to study gene expression and function in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience Methods. 132, 149-160 (2004).
  44. Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nature Neuroscience. 10, 559-567 (2007).
  45. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 16182-16187 (2007).
  46. Famulski, J. K., et al. Siah regulation of Pard3A controls neuronal cell adhesion during germinal zone exit. Science. 330, 1834-1838 (2010).
  47. Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. 14, 973-983 (2011).
  48. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. , (2014).
  49. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 106، المخيخ والتنمية والحمص، وطبقة الحبيبية الخارجية والثقافة شريحة، الخلايا الحبيبية، الخلايا العصبية، Electroporation لل.
<em>فيفو السابقين الثقافة</em> من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanzel, M., Wingate, R. J. T.,… More

Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter