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Developmental Biology

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Abstract

La couche externe de granules cérébelleux (EGL) est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement, et un excellent modèle pour l'étude de la prolifération et de la différenciation neuronale. En outre, les modifications évolutives de sa capacité proliférative ont été responsables de l'expansion spectaculaire de la taille du cervelet dans les amniotes, rendant le cervelet un excellent modèle pour les études évo-dévo du cerveau des vertébrés. Les cellules constitutives de l'EGL, progéniteurs granulaires du cervelet, représentent également une cellule d'origine significatif pour le médulloblastome, la tumeur pédiatrique neuronale la plus répandue. Après un transit amplification, précurseurs granules migrent radialement dans la couche granulaire interne du cervelet où ils représentent la plus grande population de neurones dans le cerveau des mammifères mature. En poussin, le pic d'EGL prolifération se produit vers la fin de la deuxième semaine de gestation. Afin de cibler la modification génétique de cette couche aule pic de la prolifération, nous avons développé une méthode de manipulation génétique par électroporation ex vivo de tranches de cervelet de jour embryonnaire 14 embryons de poulet. Ce procédé reprend plusieurs aspects importants de granule développement in vivo de neurones et sera utile pour générer une compréhension approfondie de la prolifération des cellules du cervelet de granulés et de la différenciation, et donc du développement de cervelet, l'évolution et la maladie.

Introduction

Le cervelet se trouve à l'extrémité antérieure du cerveau postérieur et est responsable de l'intégration du traitement sensoriel et moteur dans le cerveau mature ainsi que la régulation des processus cognitifs supérieurs 1. Chez les mammifères et les oiseaux, il possède une morphologie complexe et est fortement feuilleté, un produit de grande amplification des progéniteurs de transit au cours du développement, qui produit plus de la moitié des neurones dans le cerveau adulte. Le cervelet a été un sujet d'étude pour les neurobiologistes pour des siècles et dans l'ère moléculaire a également reçu beaucoup d'attention. Cela concerne non seulement à sa biologie intrinsèquement intéressante, mais aussi au fait qu'il est fortement impliqué dans les maladies humaines, y compris les troubles génétiques de développement tels que les troubles du spectre autistique 2 et plus en évidence le cancer du cervelet, médulloblastome 3, qui est le cerveau pédiatrique la plus répandue tumeur. Surtout, il est un excellent système de modèle au sein de which pour étudier la répartition de sort et la neurogenèse au cours du développement du cerveau 4. Au cours des dernières années, il a également été établi comme un système modèle pour l'étude comparative du développement du cerveau, en raison de la grande diversité des formes cérébelleux vu à travers la phylogénie des vertébrés 5-10.

Le cervelet se développe à partir de la moitié dorsale de rhombomère 1 dans le cerveau postérieur et de développement 11 est constitué de deux populations de cellules progénitrices primaires, la lèvre rhombique et la zone ventriculaire. La lèvre rhombique étend autour de la région dorsale de la neuroépithélium du cerveau postérieur à la frontière avec la plaque de toit. Il est le lieu de naissance des neurones excitateurs glutamatergiques du cervelet 12-14. La zone ventriculaire donne lieu à des neurones inhibiteurs GABAergiques cérébelleux, le plus en évidence les grands neurones de Purkinje 14,15. Plus tard dans le développement (d'environ jour embryonnaire 13,5 chez la souris; e6 en poussin 16), glutamatergique Progenvisi- migrer tangentiellement à partir de la lèvre rhombique et forment une couche piale progéniteurs: une zone de progéniteur secondaire appelée la couche de granulés externe (EGL). Il est de cette couche qui subit l'amplification très étendue de transit qui conduit à le grand nombre de neurones granulaires présents dans le cerveau mature.

Prolifération dans le EGL a longtemps été associé à l'emplacement du sous-pial qui résulte de la migration tangentielle à partir de la lèvre rhombique 17, avec le commutateur de sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale de progéniteurs étant associée à leur sortie de la couche EGL extérieur dans le milieu EGL 18. La migration tangentielle étendue de cellules granulaires post-mitotiques dans l'axe médio-latérale se produit dans la moyenne et interne EGL 19, avant la migration radiale finale dans la couche intérieure de granules du cortex cérébelleux mature. Migration de cellules de la lèvre rhombique sur la surface du cervelet dépend signalisation CXCL12 de la pie-20-22 23-25. Curieusement, études au microscope électronique 17 ont suggéré que les cellules EGL avec une morphologie proliférative maintenir le contact pial, reliant le comportement des cellules avec une capacité de prolifération d'une manière qui rappelle les progéniteurs basales du cortex des mammifères 26. Ceci se reflète dans la stratification précitée de la EGL en trois sous-couches qui sont définies par des environnements extracellulaires distinctes et où granulés précurseurs ont l'expression du gène 18 signatures distinctes.

Prolifération des progéniteurs dans la oEGL se produit avec une distribution normale des tailles de clones de sorte que lorsque les progéniteurs sont génétiquement marquées individuellement à la fin du développement embryonnaire chez la souris, ils donnent lieu à une moyenne médiane de 250 à 500 g postmitotiqueneurones ranule 27,28. Prolifération dépend de signalisation SHH mitogénique sous-jacents neurones de Purkinje 29-32. La capacité à répondre à SHH a été montré pour être entièrement dépendant de cellule autonome expression du facteur de transcription Atoh1, à la fois in vitro et in vivo 33 34,35. De même, la sortie du cycle cellulaire et de la différenciation a été démontré que l'expression dépendant du facteur de transcription en aval NeuroD1 36, ce qui est probablement un répresseur directe de Atoh1 37.

Malgré ces progrès, et le progrès considérable à déchiffrer la base biologique de la cellule de sortie du cycle cellulaire 38-42, le mécanisme moléculaire fondamentale (s) qui sous-tendent la décision de quitter le cycle cellulaire et la transition d'un ancêtre à un neurone de différenciation, et la la migration tangentielle postmitotique associé dans le EGL intérieure ainsi que l'interrupteur tardà la migration radiale, restent mal compris. Ceci est dans une large mesure en raison de l'intransigeance de l'EGL expérimentale: il est tard en développement et difficiles à cibler génétiquement puisque bon nombre des mêmes molécules neurogènes sont également cruciales tôt dans la vie des précurseurs de granulés à la lèvre rhombique. Pour surmonter ce problème, de nombreux auteurs ont développé in vivo et ex vivo électroporation comme une méthode pour cibler le cervelet postnatale chez les rongeurs 43-48. Ici, nous Pioneer l'utilisation des ex vivo électroporation dans poussin pour étudier le EGL, ce qui représente des avantages considérables en termes de coût et de commodité. Notre méthode d'électroporation et ex vivo tranche culture de tissu cérébelleux poussin utilise le tissu disséqué jour embryonnaire 14 poussins au sommet de EGL prolifération. Cette méthode permet le ciblage génétique de l'EGL indépendamment de la lèvre rhombique et préparera le terrain pour la dissection génétique de la transition de granuleprogéniteur de neurone post-mitotiques granule dans le cervelet.

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Protocol

Remarque: Toutes les expériences ont été réalisées avec conformément au King College de Londres, Royaume-Uni et les lignes directrices de soins aux animaux UK Home Office.

1. Dissection de e14 Cerebellum

  1. Incuber les oeufs bruns de poule fertilisés à 38 ° C à jour embryonnaire 14.
  2. L'aide de ciseaux d'œufs décapitent embryon de poulet in ovo et retirer la tête d'une boîte de Pétri contenant de la glace froide PBS (figure 1A).
  3. En utilisant des pinces standard, faire des incisions derrière chaque oeil tout le chemin à travers le tissu, la suppression des yeux et de la mâchoire supérieure. Ajouter un deuxième incision tout le chemin à travers le pharynx enlever la mâchoire inférieure (figure 1B).
  4. En utilisant des pinces standard, retirer toute la peau de la surface du crâne par éplucher loin (figure 1C) et retirer frontales et pariétales os, révélant cerveau.
  5. Du point de vue ventrale, retirez pharyngée cartilage et mésenchyme auxiliaire.
  6. Du point de vue dorsale, attentionLy supprimer mésenchyme dorsale du cerveau postérieur en prenant soin de ne pas endommager Pia, et tout le cerveau séparé (figure 1D).
  7. Assurez incision tout le chemin à travers le tissu entre mésencéphale et du cerveau postérieur et cerveau postérieur séparé comprenant cervelet (figure 1E).
  8. En faisant des incisions tout le chemin à travers le tissu à deux jonctions latérales du cervelet et de la plaque alaire du cerveau postérieur, retirez toute cervelet, en prenant soin de maintenir l'intégrité de la pie au long de la dissection (figure 1F). Retirez le plexus choroïde de formation (figure 1G).
  9. Déplacez le cervelet disséqué dans glacée HBSS.

2. Tranche Culture de e14 Cerebellum

  1. Transférer toute cervelet à la plate-forme stérile d'un tissu Chopper aide d'une spatule ou d'un 3 ml pipette Pasteur avec le bout coupé pour élargir l'ouverture. Retirer l'excès de liquide à l'aide d'une pipette.
  2. Couper toute entière cervelet en til nécessaire orientation à 300 um d'épaisseur en utilisant le broyeur de tissu ensemble avec une vitesse de coupe à 50% du maximum. L'intégrité des tissus est plus facilement conservé dans la section sagittale; Toutefois, l'orientation est également un facteur important pour l'analyse de cellule (dendrites des cellules de Purkinje sont sagittale alignés, tandis que les axones des cellules granulaires courent transversalement, perpendiculairement au plan de dendrites des cellules de Purkinje).
  3. Utilisation d'un 3 ml pipette Pasteur, couvrir le cervelet en tranches dans la glace HBSS froid.
  4. Transférer les tranches dans un plat HBSS à 60 mm Petri contenant de la glace froide HBSS frais en utilisant un 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe.
  5. Sous un microscope de dissection éclairé par une source de lumière de fibre optique, assurer la séparation des tranches individuelles aide de pinces horloger. Identifier les tranches à électroporation, en fonction de leur intégrité des tissus et la position médio-latérale.
    Remarque: Chaque dissection de l'embryon grâce à trancher incubation dans un milieu de culture prend environ 10-20 min selon upon expérience. Effectuer dissections un à la fois pour assurer que cerebella passer un minimum de temps entre la décapitation et la culture ex vivo.

3. L'électroporation de tranches

  1. Construction d'une chambre d'électroporation en fixant l'anode d'un électroporateur à la base d'une boîte de Petri de 60 mm avec du ruban isolant. Ajouter environ 1 ml de HBSS pour couvrir l'électrode.
  2. Placer un insert de 0,4 um de la culture au-dessus de l'électrode couvert dans du HBSS. Permettre à l'insert de culture de se reposer sur l'électrode en vous assurant qu'il est toujours un contact entre l'insert et l'électrode.
    Remarque: Dans cette configuration, l'insert de culture avec les tranches reposera sur la surface de la solution, le maintien du circuit, mais permettant un ciblage spatial de la cathode.
  3. Tranches de transfert identifiés (jusqu'à cinq par insert de culture) sur insert de culture en utilisant 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe. Indépendante et laisser reposer sur insert de culture dans un sagittorientation al.
  4. En utilisant une pipette, éliminer l'excès de HBSS sorte que les tranches ne sont plus baignés dans une solution.
  5. En utilisant une pointe de pipette P10, de l'ADN de pipette (à une concentration de 1 ug / ul), dilué avec 20% de vert rapide sur la surface de la région cible d'une tranche. 20% de vert rapide assure solution d'ADN visqueux et empêche prohibitif grande dispersion de l'ADN. Ajouter la solution verte d'environ 5 ul d'ADN / rapide à chaque tranche (figure 2B).
  6. Placez la cathode sur tissu ciblé souhaité et l'électroporation avec 3 x 10 V, 10 impulsions de msec. Eviter le contact direct de la cathode avec le tissu. Au lieu de cela, profiter de la tension de surface du liquide pour maintenir la conductance (placer la cathode au plus près du tissu que possible sans le toucher du tissu).
  7. Répétez la livraison de l'ADN et l'électroporation à plusieurs régions de EGL sur chaque tranche cérébelleuse individu comme souhaité.
  8. À la fin de l'électroporation, la culture de transfert Insert à 30 mm boîte de Petri.
  9. Pour chaque culture, ajouter 1 ml de milieu de culture préchauffé (Basal Medium aigle, 0,5% (p / v) D - (+) - glucose, supplément de B27 1%, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine) en dessous de l'insert de culture de telle sorte que l'insert de culture est en contact avec le milieu, mais des tranches ne sont pas baigné en elle.
  10. Incuber les cultures à 37 ° C / 6% de CO2 pendant jusqu'à 3 jours. Remplacez tout le milieu de culture tous les 24 heures avec un milieu préchauffé frais.
  11. Après la culture, de fixer des tranches sur la culture insère pendant 1 h à 4% de paraformaldéhyde (ou O / N à 4 ° C) dans un plat frais de 30 mm sans les milieux de culture.

4. Imagerie de cervelet tranches

  1. Après la fixation, laver tranches 3 fois pendant 5 min dans du PBS.
  2. En utilisant une lame de rasoir, disséquer chaque tranche cérébelleuse électroporation et cultivée de l'insert de culture en coupant autour de la tranche et en supprimant la tranche et la région de l'insert, il est respecté. Fairepas tenter de retirer une tranche de la surface de l'insert de la culture.
  3. Tranches de montage dans environ 1 ml de milieu de montage contenant DAPI (si désiré) sous une lamelle en prenant soin de ne pas introduire de bulles, et de l'image en utilisant le laser-microscopie confocale à balayage.
    Remarque: des paramètres d'images peuvent être modifiées selon les constructions électroporation, et à la discrétion de l'utilisateur individuel.

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Representative Results

Cette section présente des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant tranche électroporation et la culture du cervelet jour embryonnaire 14 poussin. La dissection du cervelet est illustré sur la Figure 1 et la chambre d'électroporation mis en place est représenté sur la Figure 2. On montre qu'il est possible pour l'électroporation et avec succès la culture des tranches de cervelet, qui conservent leur structure et morphologies cellulaires in vitro (figure 3A). Électroporation ciblée à folia individuels est facile à réaliser (figure 3B). Nous électroporer avec succès un certain nombre de différents plasmides dans les cellules EGL et montrons qu'il est possible i) pour marquer les cellules avec le journaliste construit pour observer leur comportement (figure 3C), ii) de tester régions génomiques possibles pour la fonctionnalité dans les cellules du cervelet (Figure 3D ), et iii) pour manipuler génétiquement lacellules dans le EGL par misexpressing protéines d'intérêt (figure 3E). En outre, les manipulations pharmacologiques sur des tranches électroporées sont possibles (résultats non montrés). Après la culture, il est possible d'effectuer l'analyse des tissus supplémentaires, telles que des dosages immunohistochimiques ou prolifération (Figure 3F). Nous effectuons une analyse de la santé des tissus par calbindine et PH3 immunocoloration et montrons que l'intégrité des tissus est maintenue pendant au moins 3 div après culture (Figure 4). Ces résultats démontrent que le EGL est maintenant une structure accessible et facile à manipuler qui peut être entièrement examinée et génétiquement modifiée dans le système de modèle de poussin.

Figure 1
Figure 1. Dissection du cervelet de E14 embryons de poulet. (A) décapiter le poussin dans l'œuf et retirez le int têteoa plat de Pétri avec PBS glacé. Retirez la mâchoire inférieure et les yeux en faisant incision derrière les yeux et le pharynx (ligne pointillée). (B) Retirer la peau de la surface du crâne. (C) Retirer l'os frontal et pariétal et (D) retirer le cerveau du mésenchyme et de cartilage entourant. (E) Sous un microscope à dissection identifier l'emplacement du cervelet à l'extrémité postérieure du cerveau. Couper entre le mésencéphale et le cerveau postérieur (lignes pointillées) à gauche avec le cervelet et le cerveau postérieur ventral. (F) Faire des incisions au niveau des jonctions latérales (les pédoncules du cervelet) pour séparer le cervelet de cerveau postérieur (ligne pointillée). (G) Retirer le plexus choroïde (astérisque) à partir de la face ventrale du cervelet jusqu'à ce que vous êtes de gauche avec toute une cervelet intacte avec la pie-joint. Transférez le cervelet dans glacée HBSS avant de préparer tranches avec un chopp de tissuser. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. La chambre d'électroporation mis en place. (A) Une photo de la chambre d'électroporation sur mesure. La chambre se compose d'une anode d'un électroporateur placé en toute sécurité, sur la base d'une boîte de Petri de 60 mm. Le plat contient environ 1 ml de HBSS pour couvrir l'électrode. L'insert de culture doit reposer sur l'électrode avec un contact constant entre la pièce et l'électrode, le maintien du circuit, mais permettant un ciblage spatial de la cathode, qui est manipulé à la main. (B) Une image de tranches étant électroporation. Les tranches sont couverts avec le / la solution vert rapide de l'ADN. Les tranches sont électroporation que le désird: électroporation peut être ciblée sur un folium ou plusieurs emplacements. Après électroporation de l'insert est placé dans une boîte de Petri de 30 mm avec un milieu de culture préchauffé et mis en culture dans l'incubateur. 1. L'anode 2. Le plat cathode 3. Culture insert 4. Petri avec 1 ml de HBSS 5. dissection microscope 6. tranches individuelles de tissue chopper de solution 7. ADN avec un colorant vert rapide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Les résultats représentatifs. (A) Une faible image d'agrandissement d'une électroporation de commande d'un plasmide codant de DP dans le EGL à plusieurs endroits. Le tissu conserve sa structure et de cellules électroporées sont clairement visibles dans une épaisse couche subpial du cervelet. (B) Uneexemple d'une électroporation ciblée avec un plasmide contrôle de la GFP. Le folium ciblé est indiqué par un astérisque. La barre d'échelle AB = 500 um. (C) Un exemple où une construction codant pour GFP entraînée par un activateur Atoh1 a été électroporé dans la EGL. L'expression de Atoh1 définit précurseurs de cellules au sein du granule EGL. Différentes morphologies cellulaires sont clairement visibles à 3 div et le comportement des cellules peuvent être surveillés. (D) Un exemple de marquage suivant l'électroporation d'une construction contenant un élément putatif conservée non codante (CNE) de l'entraînement NeuroD1 gène GFP. Le CNE signale une activité dans les cellules attendus sur la base de l'expression endogène NeuroD1 suggérant un rôle actif de ce CNE dans le développement. NeuroD1 expression est corrélée à l'initiation de la différenciation des cellules granulaires. (E) Un exemple où le tissu peut être génétiquement manipulé par une mauvaise expression de protéine NeuroD1 et un changement de cellule granule Behavportement peut être observée. (F) Un exemple où le tissu électroporé (GFP contrôler plasmide) peut être fixé et coloré pour les marqueurs de cellules en prolifération, telles que phosphohistone H3 (PH3). Barre d'échelle CF = 50 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. intégrité des tissus et la prolifération dans la culture. (A - C) Calbindin coloration des tissus E14 cérébelleuse électroporation avec un plasmide contrôle de la GFP à 1-3 jours in vitro (DIV). Calbindin coloration montre que l'intégrité du tissu est maintenu en culture pendant au moins 3 div. La couche de cellules de Purkinje ne forme pas une monocouche, à ce stade dans le développement de poussin mais il est clairement visible à former une couche en dessous de laEGL où se trouvent les cellules granulaires (vert). (D) phosphohistone H3 (PH3) coloration sur le tissu cérébelleux en culture pendant 2 div. PH3 coloration est visible dans les EGL (flèches), mais aussi dans d'autres régions du cervelet (pointes de flèche). Cette coloration est représentatif de toutes les étapes de la culture examinés (1-3 div). La barre d'échelle = 50 microns AD S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour disséquer, électroporation et la culture tranches de jour embryonnaire 14 cervelet du poussin. Ce protocole permet le ciblage de l'électroporation aux petites régions focales de l'EGL, y compris le ciblage isolé de lobes cérébelleux individuels. Il permet l'analyse génétique et de l'imagerie à haute résolution et de commodité, et à un faible coût par rapport à des techniques établies chez les rongeurs 43-47. Cette analyse est actuellement pas possible in vivo en raison de la longue période de développement de temps, le manque de possibilités de ciblage génétique EGL-spécifiques chez la souris, et la communauté des mécanismes moléculaires entre la lèvre rhombique et l'EGL, ce qui signifie que des modifications qui peuvent affecter EGL la biologie souvent ne peut pas être analysé car elles affectent losange lèvre neurogenèse et abrogent formation EGL 49. Notre système représente donc une avancée majeure en termes de ciblage modification génétique à l'EGL specifically, et nous prévoyons qu'elle sera applicable à d'autres espèces au-delà du poussin que peut-être d'intérêt comparatif, tels que les mammifères non-modèles et les reptiles.

En exécution de la technique d'électroporation de la culture de la tranche, un certain nombre de considérations techniques sont primordiales. Tout d'abord, la robustesse des tranches de survivre dans la culture sans une part de subir d'importants mort cellulaire ou de l'autre intégrité structurelle perdre limite l'épaisseur de la tranche à 300 um dans nos mains. Une deuxième considération importante est la viscosité de la solution d'ADN, ce qui assure l'électroporation de l'ADN à des concentrations qui sont suffisamment élevés pour induire des niveaux visibles ou pertinentes de modification génétique. En électroporation in ovo de solutions d'ADN injectés dans le cerveau postérieur embryonnaire précoce, les concentrations de colorant vert rapide d'environ 1% sont typiques. Cependant, dans notre protocole, nous utilisons généralement des concentrations de vert rapide de 20%. Ceci assure une vis suffisammentsolution d'ADN cous d'empêcher la dispersion de l'ADN suivant la pipette mais avant l'électroporation, mais une diluer suffisamment pour médier une conduction électrique efficace.

En plus de ces considérations techniques, nous avons observé que le comportement de prolifération que nous observons ex vivo ne correspond pas précisément celle prédite à partir des études in vivo, due sans doute à l'intégrité pial étant perturbé par la préparation de tissu. Dans ces conditions, quand un produit d'assemblage d'expression de la GFP est une électroporation, une grande proportion de cellules électroporées semblent avoir quitté le cycle cellulaire après un jour de culture à en juger par la coloration PH3 (figure 3F). Cela ne correspond pas avec le comportement attendu EGL proliférative, où la prolifération de clones dans la souris et le poussin étend sur une grande période de temps 27. L'implication que la pie-prolifération module est pris en charge par l'observation que lorsque nous électroporer une construc rapporteurt NeuroD1 avec un élément de régulation dirigeant l'expression de GFP toutes les cellules électroporées expriment la GFP après un jour de culture (Figure 3D). In vivo, cette construction miroirs expression NeuroD1 endogène dans les cellules du EGL interne qui sont post-mitotique 36,37 marquage, tout en longueur NeuroD1 est suffisante pour entraîner la différenciation cellulaire (Figure 3E). Ceci suggère que, dans certaines conditions, la capacité de prolifération des cellules ne peut être maintenu tel quel dans le EGL externe aux étapes équivalentes in vivo. PH3 coloration ne suggère cependant que il ya beaucoup de la prolifération dans la culture, souvent localisée à la zone EGL (figure 4D). Prolifération étendue en dehors de la EGL indique éventuellement renforcée gliogénèse ou la prolifération des précurseurs Pax2 GABAergiques dans la matière blanche. L'implication est que l'interprétation de toute procédure expérimentale devra prendre le compte de la de proliferativ ci-dessuse comportement, le fait que les cellules de Purkinje ne forment pas une monocouche jusqu'à E18 en poussin et que le développement normal peut être compromise après la préparation de la tranche (par exemple, en raison du manque d'interaction avec les fibres d'escalade, etc.)

Malgré ces limites, notre protocole représente une étape importante dans le cadre de l'étude de nombreux aspects de la biologie des cellules granulaires. L'avantage essentiel de permettre spatialement et temporellement étiquetage spécifique de l'EGL comme distincte de la lèvre rhombique facilitera plusieurs examens de la fois la biologie cellulaire des progéniteurs granules et de la régulation génétique qui sous-tend d'une manière qui ne soit pas possible à l'heure actuelle in vivo. Notre technique de poussin complétera culture ex vivo et l'électroporation protocoles existants chez les rongeurs 43-48 et porte les avantages considérables de coût et de commodité qui sont associés avec le poussin. De plus, il représente une avancée significative par rapport àles techniques existantes de mise en culture des progéniteurs de granulés 39. Bien qu'il viendra compléter plutôt que remplacer celui-ci, notre protocole ouvrira la contrôle de la différenciation granule de neurone à une grande variété de traitements pharmaceutiques et à la diversité des cellules manipulations génétiques autonomes qui sont possibles dans le poussin. Il fournit une base pour l'examen de granules biologie cellulaire en détail sans précédent.

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Acknowledgments

La méthode présentée dans cet article est née de travaux financés par le BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) et une bourse d'études de doctorat MRC (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

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References

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