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Developmental Biology

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421
Automatic Translation
1, 1, 2
1MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Abstract

A camada externa de grânulo cerebelar (EGL) é o local de maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento, e um excelente modelo para estudar a proliferação e diferenciação neuronal. Além disso, as modificações evolutivas da sua capacidade proliferativa ter sido responsável pela dramática expansão do tamanho do cerebelo nas amniotes, tornando o cerebelo um excelente modelo para estudos evo-devo do cérebro dos vertebrados. As células constituintes da EGL, progenitores de grânulos de cerebelo, também representam um celular significativa de origem para meduloblastoma, o tumor neuronal pediátrica mais prevalente. A seguir à amplificação de trânsito, os precursores de grânulos migrar radialmente para dentro da camada granular interna do cerebelo, onde eles representam a maior população de neurónios no cérebro de mamíferos madura. Em pintainho, o pico de proliferação EGL ocorre no final da segunda semana de gestação. A fim de direccionar a modificação genética para esta camada emo pico de proliferação, temos desenvolvido um método para a manipulação genética ex vivo através de electroporação de fatias do cerebelo a partir do Dia 14 embriões de pintos embrionários. Este método recapitula vários aspectos importantes da in vivo de grânulos desenvolvimento neuronal e será útil para gerar uma compreensão completa da proliferação de células granulares do cerebelo e diferenciação, e, portanto, do desenvolvimento do cerebelo, e a evolução da doença.

Introduction

O cerebelo fica no final anterior da parte posterior do cérebro e é responsável pela integração do processamento sensorial e motor no cérebro maduro, bem como regulando processos cognitivos superiores 1. Nos mamíferos e aves, que possui uma morfologia elaborada e é fortemente foliados, um produto de grande amplificação trânsito de progenitores durante o desenvolvimento, que produz mais de metade dos neurónios no cérebro adulto. O cerebelo tem sido um tema de estudo para os neurobiólogos durante séculos e na era molecular recebeu igualmente uma atenção significativa. Isto diz respeito não só à sua biologia inerentemente interessante, mas também ao fato de que ele é fortemente implicado na doença humana, incluindo doenças genéticas de desenvolvimento, como transtornos do espectro do autismo 2 e mais proeminente o câncer cerebelar, meduloblastoma 3, que é o cérebro pediátrico mais prevalente tumor. Importante, é um excelente sistema de modelo dentro which para estudar alocação destino e neurogênese durante o desenvolvimento cerebral 4. Nos últimos anos, foi também estabelecida como um sistema modelo para o estudo comparativo de desenvolvimento do cérebro, devido à grande diversidade de formas de cerebelo visto do outro lado da filogenia vertebrado 5-10.

O cerebelo desenvolve a partir da metade dorsal da rhombomere 1 no cérebro posterior 11 e desenvolvente é composta de duas populações progenitoras primárias, o lábio rômbica e da zona ventricular. O lábio rhombic se estende em torno da região dorsal do neuroepitélio da hindbrain na fronteira com a placa de telhado. É o berço dos neurônios excitatórios glutamatérgicos do cerebelo 12-14. A zona ventricular dá origem a neurônios do cerebelo GABAérgicos inibitórios, o mais proeminente os neurônios de Purkinje grandes 14,15. Mais tarde, em desenvolvimento (de cerca dia embrionário 13,5 em rato; e6 em pinto 16), Progen glutamatergicitors migrar tangencialmente a partir do lábio rômbica e formar uma camada de células progenitoras pial: uma zona secundária chamada de progenitor a camada externa de grânulo (EGL). É esta camada que sofre a grande amplificação de trânsito que leva para o grande número de neurônios granulares encontrados no cérebro maduro.

Proliferação na EGL tem sido ligada à localização sub-pial que resulta da migração tangencial do lábio rômbico 17, com o interruptor para sair do ciclo celular e diferenciação neuronal de células progenitoras estarem associados com a sua saída a partir da camada exterior EGL para o meio EGL 18. Migração tangencial extensivo de células granulares pós-mitóticas no eixo lateral-medial ocorre no médio e interno EGL 19, antes da migração radial final para a camada de grânulos interior do córtex cerebelar maduro. A migração de células a partir do lábio rômbico sobre a superfície do cerebelo é dependente da sinalização da CXCL12 Pia 20-22 23-25. Curiosamente, elétrons estudos microscópicos 17 sugeriram que as células EGL com uma morfologia proliferativa manter contato pial, ligando o comportamento das células com capacidade proliferativa de uma forma que lembra os progenitores basais do córtex dos mamíferos 26. Isso se reflete na estratificação acima mencionado da EGL em três subcamadas que são definidas por ambientes extracelulares distintas e onde os precursores granulares têm expressão genética distinta assinaturas 18.

A proliferação de células progenitoras no oEGL ocorre com uma distribuição normal de tamanhos de clones de tal modo que quando são individualmente progenitores geneticamente marcado no final do desenvolvimento embrionário no ratinho, o que dá origem a uma média de 250-500 g mediana pós-mitóticoneurônios ranule 27,28. Proliferação é dependente de sinalização mitogénica de SHH subjacente Purkinje neurônios 29-32. A capacidade de responder a Shh foi demonstrado ser totalmente dependente de célula expressão autónoma do factor de transcrição Atoh1, tanto in vitro e in vivo 33 34,35. Da mesma forma, sair do ciclo celular e diferenciação tem sido mostrado para ser dependentes da expressão do factor de transcrição a jusante NeuroD1 36, o qual é provável que um repressor directo da Atoh1 37.

Apesar deste progresso, e avanço considerável em decifrar a base biológica do ciclo celular de células de saída 38-42, o mecanismo molecular fundamental (s) que estão subjacentes à decisão de sair do ciclo celular e para a transição de um progenitor para um neurónio de diferenciação, e a migração tangencial pós-mitótico associado na EGL interior, bem como o interruptor mais tardea migração radial, permanecem completamente compreendida. Isto é, em grande medida devido ao intractability experimental da EGL: é manifestação tardia, e difícil de atingir uma vez que geneticamente muitas das mesmas moléculas neurogénicos também são cruciais no início da vida de precursores de grânulos no lábio rômbico. Para superar este problema, vários autores desenvolveram in vivo e ex vivo, electroporação, como um método para direccionar o cerebelo pós-natal em roedores 43-48. Aqui, nós caminho o uso de electroporação em ex vivo para estudar o pintainho EGL, o que representa consideráveis ​​vantagens em termos de custo e comodidade. Nosso método de eletroporação e ex vivo cultura fatia de tecido cerebelar pintainho utiliza tecido dissecado a partir do dia embrionário 14 pintos no pico da proliferação EGL. Este método permite a segmentação genética da EGL independentemente do lábio rhombic e irá definir o cenário para a análise genética da transição do grânuloprogenitoras para neurónios de grânulos pós-mitótico no cerebelo.

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Protocol

Nota: Todas as experiências foram realizadas com acordo de Kings College London, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office.

1. Dissecção da e14 Cerebelo

  1. Incubar ovos de galinha fertilizados marrom a 38 ° C para o dia 14 embrionário.
  2. Usando uma tesoura de ovos decapitam embrião de galinha in ovo e remover a cabeça para uma placa de Petri contendo PBS gelado (Figura 1A).
  3. Utilizando uma pinça standard, fazer incisões atrás de cada olho todo o caminho através do tecido, remover os olhos e maxilar superior. Adicione uma segunda incisão todo o caminho através da faringe remoção do maxilar inferior (Figura 1B).
  4. Utilizando uma pinça padrão, retire toda a pele da superfície do crânio por descascar-lo fora (Figura 1C) e remover os ossos frontal e parietal, revelando cérebro.
  5. De um aspecto ventral, remover cartilagem faríngea e mesenchyme auxiliar.
  6. De um aspecto dorsal, cuidadosaly remover mesênquima dorsal para o hindbrain tomando cuidado para não danificar pia, eo cérebro inteiro em separado (Figura 1D).
  7. Faça incisão todo o caminho através do tecido entre mesencéfalo e rombencéfalo e hindbrain separada, incluindo cerebelo (Figura 1E).
  8. Ao fazer incisões todo o caminho através do tecido em ambas as junções laterais do cerebelo e placa alar do cérebro posterior, retire cerebelo inteiro, tendo o cuidado de manter a integridade da pia em todo dissecção (Figura 1F). Remover o plexo coróide de conformação (Figura 1G).
  9. Mova o cerebelo dissecados em gelo frio HBSS.

2. Fatia Cultura da e14 Cerebelo

  1. Transferir todo o cerebelo para a plataforma de um tecido estéril Chopper utilizando uma espátula ou uma pipeta de Pasteur de 3 ml com a ponta cortada para alargar a abertura. Remover o excesso de líquido, utilizando uma pipeta.
  2. Cortar em todo o cerebelo inteiro tele necessária orientação em 300 uM de espessura usando o cortador de tecido fixado com uma velocidade de corte de 50% do máximo. Integridade do tecido é mais facilmente preservados em corte sagital; No entanto, a orientação é também uma consideração importante para a análise de células (células de Purkinje são dendritos sagital alinhados, enquanto axónios de células granulares correr de forma transversal, perpendicular ao plano de dendrites de Purkinje).
  3. Usando um 3 ml Pasteur pipeta, cobrir o cerebelo cortado no gelo frio HBSS.
  4. Transfira as fatias em HBSS para um prato de 60 milímetros Petri contendo gelo fresco frio HBSS com uma pipeta Pasteur 3 ml com ponta de corte.
  5. Sob um microscópio de dissecação iluminado com uma fonte de luz de fibra óptica, garantir a separação de fatias individuais usando uma pinça relojoeiro. Identificar fatias para ser electroporado, com base na sua integridade do tecido ea posição medio-lateral.
    Nota: Cada dissecação de embriões através de cortar incubação em meio de cultura leva cerca de 10-20 minutos, dependendo upon experiência. Realizar dissecções um de cada vez para assegurar que cerebelos passar quantidade mínima de tempo entre a decapitação e cultura ex vivo.

3. Eletroporação de Slices

  1. Construir uma câmara de electroporação, pela fixação do ânodo de um electroporador à base de uma placa de Petri 60 mm, com fita de isolamento. Adicionar cerca de 1 ml de HBSS a cobrir o eléctrodo.
  2. Coloque uma inserção de cultura de 0,4 um no topo do eléctrodo coberto em HBSS. Permitir a inserção de cultura para descansar no eletrodo ter certeza que não é sempre contato entre a pastilha eo eletrodo.
    Nota: Nesta configuração, a inserção de cultura com as fatias repousará sobre a superfície da solução, mantendo-se o circuito, mas permitindo a selecção especial do cátodo.
  3. Transferência de fatias identificadas (até cinco por inserção de cultura) na inserção de cultura utilizando 3 ml pipeta Pasteur com a ponta cortada. Separado e deixa-se repousar para inserção da cultura em um sagittorientação ai.
  4. Usando uma pipeta, remover o excesso de HBSS a fim de que as fatias não são banhadas em solução.
  5. Utilizando uma ponta de pipeta P10, ADN pipeta (a uma concentração de 1 ug / uL), diluída com 20% de verde rápido através da superfície da região alvo de uma fatia. 20% verde rápido garante solução de ADN viscoso e evita proibitivamente grande dispersão de DNA. Adicionar cerca de 5 ul de ADN / rápido solução verde para cada fatia (Figura 2B).
  6. Coloque o cátodo sobre o tecido alvo desejado e electroporate com 3 x 10 V, 10 pulsos mseg de duração. Evitar o contacto directo do cátodo com o tecido. Em vez disso, tomar vantagem da tensão superficial do líquido para manter a condutância (o cátodo colocar o mais próximo possível do tecido quanto possível, sem realmente tocar no tecido).
  7. Repetir a entrega de ADN e electroporação que regiões múltiplas da EGL em cada fatia cerebelar indivíduo como desejado.
  8. Após a conclusão da eletroporação, cultura transferência inseRT a 30 mm numa caixa de Petri.
  9. Para cada cultura, adicionar 1 ml de meio de cultura pré-aquecido (Meio Basal de Eagle, 0,5% (w / v) de D - (+) - glucose, 1% de suplemento B27, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina) por baixo da inserção de cultura de tal modo que a inserção de cultura está em contacto com o meio, mas não fatias são banhadas nele.
  10. Incubar as culturas a 37 ° C / 6% de CO 2 durante 3 dias. Substituir todo o meio de cultura a cada 24 horas com meio fresco pré-aquecido.
  11. Após a cultura, em cultura de fatias de fixar insere durante 1 hora em 4% de paraformaldeído (ou O / N a 4 ° C) em 30 de um novo prato mm sem meios de cultura.

4. Criação de Imagens de Cerebelar Slices

  1. Após a fixação, as fatias lavar 3 vezes durante 5 min em PBS.
  2. Usando uma lâmina de barbear, dissecar cada fatia cerebelar electroporado e cultivados a partir da inserção de cultura, cortando ao redor da fatia e de retirar a fatia e região de inserção é respeitado. Faznão tente remover fatia a partir da superfície da lâmina de cultura.
  3. Fatias de montagem em cerca de 1 ml de meio de montagem contendo DAPI (se desejado) sob uma lamela tomando cuidado para não introduzir bolhas e imagem usando microscopia confocal de varredura a laser.
    Nota: Os parâmetros de imagem podem variar de acordo com as construções eletroporados, e ao critério do utilizador individual.

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Representative Results

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos utilizando eletroporação fatia e cultura de cerebelo de embrionário Dia 14 do pintinho. A dissecção do cerebelo é ilustrada na Figura 1 e a câmara de electroporação configuração é mostrado na Figura 2. Nós mostramos que é possível electroporate e com sucesso fatias de cerebelo de cultura, que retêm a sua estrutura e morfologias celulares in vitro (Figura 3A). Electroporação alvejado a Folia individuais é facilmente alcançada (Figura 3B). Nós electroporate com êxito um certo número de diferentes plasmídeos nas células EGL e mostram que é possível i) para marcar células com repórter constrói para observar o seu comportamento (Figura 3C), ii) para testar possíveis regiões genómicas para a funcionalidade em células cerebelares (Figura 3D ), e iii) para manipular geneticamente océlulas da EGL por misexpressing proteínas de interesse (Figura 3E). Além disso, as manipulações farmacológicas em fatias electroporadas são possíveis (resultados não mostrados). Após a cultura, é possível realizar a análise de tecidos adicionais, tais como imuno-histoquímica ou ensaios de proliferação (Figura 3F). Nós realizar a análise a saúde do tecido por calbindina e PH3 immunostaining e mostram que a integridade do tecido é mantido por pelo menos 3 div após cultura (Figura 4). Estes resultados demonstram que o EGL é agora uma estrutura acessíveis e facilmente manipulável, que pode ser completamente analisada e geneticamente alterada no sistema de modelo de pintainho.

figura 1
Figura 1. Dissecção do cerebelo a partir de embriões de galinha E14. (A) decapitar o pintainho no ovo e remover a cabeça intoa placa de Petri com PBS gelado. Remova o maxilar inferior e os olhos, fazendo incisão atrás dos olhos e da faringe (linha pontilhada). (B) Remover a pele a partir da superfície do crânio. (C) Retire a ossos frontal e parietal e (D) remover o cérebro do mesênquima e cartilagem ao redor dele. (E), sob um microscópio de dissecação identificar a localização do cerebelo na extremidade posterior do cérebro. Corte entre o mesencéfalo e do encéfalo posterior (linhas tracejadas) a ser deixada com o cerebelo e rombencéfalo ventral. (F) fazer incisões nas junções laterais (pedúnculos) do cerebelo para separar o cerebelo a partir da parte posterior do cérebro (linha a tracejado). (G) Remova o plexo coróide (asterisco) do lado ventral do cerebelo até que você é deixado com um cerebelo intacto todo com a pia em anexo. Transferir o cerebelo em gelo-frio HBSS antes de preparar fatias com um chopp tecidoer. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A câmara de eletroporação configurar. (A) A imagem da câmara de eletroporação feitos sob medida. A câmara é constituída por um ânodo de um electroporador colocado de forma segura sobre a base de uma placa de Petri de 60 mm. O prato contém cerca de 1 ml de HBSS a cobrir o eléctrodo. A inserção de cultura deve descansar sobre o eletrodo com contato constante entre a pastilha eo eletrodo, mantendo o circuito, mas permitindo a selecção especial do cátodo, que é manipulado com a mão. (B) Um retrato de fatias sendo electroporado. Fatias são cobertas com a solução / verde rápido DNA. As fatias são electroporado como desejod: eletroporação podem ser direcionados para uma camada fina ou vários locais. Após a electroporação a inserção é colocada num prato de Petri 30 mm, com meio de cultura pré-aquecido e cultivadas na incubadora. 1. O ânodo 2. A placa de Petri cátodo 3. Insira Cultura 4. com 1 ml de HBSS 5. microscópio de dissecação 6. fatias individuais de cortador de tecidos 7. solução de DNA com corante verde rápido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Os resultados representativos. (A) Uma imagem de baixa ampliação de um electroporação controlo de um plasmídeo que codifica para a RFP EGL em vários locais. O tecido mantém a sua estrutura e as células electroporadas são claramente visíveis em uma camada espessa subpial do cerebelo. (B) Umexemplo de um alvo de electroporação com um plasmídeo de controlo de GFP. O folium alvo é indicada por um asterisco. Barra de escala = AB 500 um. (C) Um exemplo onde uma construção que codifica a GFP conduzida pelo potenciador de um Atoh1 foi electroporado para a EGL. A expressão de Atoh1 define precursores de células de grânulos dentro da EGL. Vários morfologias celulares são claramente visíveis em 3 div e o comportamento das células pode ser monitorizada. (D) Um exemplo de etiquetagem após a electroporação de uma construção contendo um elemento putativo conservado não codificante (CNE) do gene GFP NeuroD1 condução. A CNE reporta atividade nas células esperados com base na expressão NeuroD1 endógena sugerindo um papel activo desta CNE em desenvolvimento. NeuroD1 expressão correlaciona-se com o início da diferenciação celular granular. (E) Um exemplo em que o tecido pode ser geneticamente manipulada por misexpression de proteína NeuroD1 e uma mudança no grânulo celular Behavtamento pode ser observada. (F) Um exemplo onde o tecido a electroporação (GFP controlar plasmídeo) podem ser fixadas e coradas para os marcadores de células em proliferação, tais como H3 phosphohistone (PH3). Scale bar CF = 50 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. A integridade do tecido e a proliferação na cultura. (A - C) Calbindina coloração de tecido cerebelar E14 electroporadas com um plasmídeo de controlo de GFP em 1-3 dias in vitro (div). Calbindina coloração mostra que a integridade do tecido é mantida em cultura durante pelo menos 3 div. A camada de células de Purkinje não formar uma monocamada neste estágio no desenvolvimento de pintainho, mas vê-se claramente a formação de uma camada por baixo daEGL onde células granulares (verde) estão localizados. (D) Phosphohistone H3 (PH3) coloração no tecido cerebelar cultivadas por 2 div. PH3 coloração é visível nas EGL (setas), mas também em outras regiões do cerebelo (pontas de seta). Esta coloração é representativa de todas as fases da cultura examinados (1-3 div). Barra de escala AD = 50 um favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo aqui relatado descreve um método para a dissecação, electroporating e cultura de fatias de embrionário do dia 14 a partir do cerebelo de pinto. Este protocolo permite a segmentação de eletroporação para pequenas regiões focais do EGL, incluindo isolado direcionamento dos lóbulos do cerebelo individuais. Ele permite a análise genética e de imagem com uma resolução elevada e conveniência, e de baixo custo em comparação com técnicas estabelecidas em roedores 43-47. Essa análise não é possível in vivo devido ao longo período de desenvolvimento tempo, a escassez de possibilidades EGL específicos de segmentação genética em rato e, a comunhão dos mecanismos moleculares entre o lábio rhombic eo EGL, o que significa que as alterações que podem afetar a EGL biologia freqüentemente não pode ser analisado, uma vez que afetam a neurogênese rhombic lábio e revogará formação EGL 49. Nosso sistema representa, portanto, um grande avanço em termos de segmentação modificação genética para a EGL specifically, e prevemos que será aplicável a outras espécies para além do que talvez pintainho comparativa de interesse, tais como mamíferos, répteis e não-modelo.

Ao realizar a técnica de eletroporação cultura fatia, uma série de considerações técnicas são fundamentais. Em primeiro lugar, a robustez das fatias em cultura para sobreviver sem por um lado, passando por uma extensa morte celular ou por outro perder integridade estrutural limita a espessura de fatia de 300 um nas nossas mãos. Uma segunda consideração importante é a viscosidade da solução de DNA, o que garante a electroporação de ADN, em concentrações que são suficientemente elevada para induzir níveis relevantes visíveis ou de modificação genética. In em electroporação in ovo de soluções de ADN injectados na parte posterior do cérebro embrionário inicial, as concentrações de corante verde rápido de cerca de 1% são típicos. No entanto, em nosso protocolo, que normalmente usam concentrações de verde rápido de 20%. Isto assegura uma vis suficientementesolução de ADN cous para impedir a dispersão do DNA após pipetagem mas antes de eletroporação, mas uma diluir suficientemente para mediar uma condução elétrica eficiente.

Para além destas considerações técnicas, observou-se que o comportamento proliferativo que observamos ex vivo não precisamente partida que previsto a partir de estudos in vivo, provavelmente devido a integridade pial sendo perturbada pela preparação do tecido. Sob tais condições, quando uma construção de expressão da GFP é a electroporação, uma grande proporção de células electroporadas parecem ter deixado o ciclo celular após apenas um dia de cultura, tal como avaliado por coloração com PH3 (Figura 3F). Isso não se correlacionam com o comportamento proliferativo EGL esperado, onde a proliferação de clones em ambos mouse e pintainho se estende ao longo de um grande período de tempo 27. A implicação de que a Pia modula a proliferação é suportada pela observação de que quando electroporate uma construc repórtert com um NeuroD1 elemento regulador expressão motriz da GFP todas as células electroporadas expressar GFP após um dia de cultura (Figura 3D). In vivo, esta construção espelha expressão NeuroD1 endógena na marcação de células da EGL interior que são pós-mitótico 36,37, enquanto o comprimento completo NeuroD1 é suficiente para dirigir a diferenciação celular (Figura 3E). Isto sugere que, sob certas condições, a capacidade proliferativa das células pode não ser mantida, uma vez que está na EGL exterior em fases equivalentes in vivo. PH3 coloração no entanto não sugerem que existe uma grande quantidade de proliferação em cultura, frequentemente se à zona da EGL (Figura 4D). Proliferação extensiva fora da EGL indica possivelmente reforçada gliogenesis ou proliferação de precursores Pax2 GABAérgicos na substância branca. A implicação é que a interpretação de qualquer procedimento experimental terá que levar em conta o acima do proliferativcomportamento de e, o facto das células de Purkinje não formam uma monocamada até E18, em que o pintainho e desenvolvimento normal pode ser comprometido após a preparação fatia (por exemplo, devido à falta de interacção com escalada fibras etc.)

Apesar dessas limitações, o nosso protocolo representa um significativo passo em frente em relação ao estudo de muitos aspectos da biologia de células granulares. A vantagem essencial para permitir a espacialmente e temporalmente rotulagem específica da EGL como distinto do lábio rhombic facilitará vários exames do tanto a biologia celular dos progenitores grânulo e a regulação genética subjacente lo de uma maneira que não é possível, neste momento in vivo. A nossa técnica de pintainho complementará cultura ex vivo e electroporação protocolos existentes em roedores 43-48 e transporta as vantagens consideráveis ​​em custo e comodidade que estão associados com o pintainho. Além disso, representa um avanço significativo sobretécnicas existentes de cultura de progenitores de grânulos 39. Enquanto isso irá complementar e não substituir o último, o nosso protocolo vai abrir o controle da diferenciação grânulo neurônio para uma ampla variedade de tratamentos farmacêuticos e à diversidade das manipulações genéticas autônomas celulares que são possíveis no pinto. Ele fornece uma base para o exame de biologia celular granular em detalhes sem precedentes.

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Acknowledgments

O método apresentado neste artigo surgiu de trabalho financiado pelo BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e uma bolsa de estudo de doutorado MRC (MH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
McIlwain tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Ltd Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco) Life Technologies 41010-026
L-glutamine Sigma G7513
penicillin/streptomycin Sigma P4333
0.4 μm culture insert Millipore PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator  Intracel 01-916-02 Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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<em>Ex</em> Cultura <em>Vivo</em> de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células
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Hanzel, M., Wingate, R. J. T., Butts, T. Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors. J. Vis. Exp. (106), e53421, doi:10.3791/53421 (2015).

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