Summary
Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.
Introduction
Son yıllarda, moleküler genetik ve genomik geniş bir araç, model türleri, Arabidopsis thaliana geliştirilmiştir. Bu teknoloji bitki gelişim nasıl düzenlendiğinin anlaşılması muazzam ilerleme kolaylaştırmıştır. Bir model olarak Arabidopsis kullanılarak incelenmiştir gelişim süreçleri arasında, çiçeklenme zamanında genetik kontrolü yaygın analiz edilmiştir. Bu çalışmalar, bitkiler gibi hormonlar ve bitki yaşı gibi endojen uyaranlara yanıt olarak çiçeklenme çok hassas zaman modüle olduğunu göstermiştir ve ayrıca mevsim 1 doğal döngüsü ile vakit çiçekli senkronize gibi fotoperiyot ve sıcaklık gibi çevresel sinyallere, 2. Çiçeklenme zamanında değişiklikler ile Arabidopsis mutantlar ün izolasyonu ve tanımlanması, endojen ve çevresel faktörlere yanıt olarak çiçeklenme süresini düzenleyen genlerin karmaşık bir ağ meydana çıkararak belirleyici olmuştur. Bu genetik devrelerdirÇiçeklenme anahtarları olarak hareket birkaç usta genlerin seviyesinde entegre ve çiçek inisiyasyon tam zamanlama çiçekli teşvik ve çiçek entegratör genlerinin 1,3 yukarısında işe faaliyetlerini bastırmak dengesine bağlıdır.
Genomik yaklaşımların son kullanımı ile destekli çiçekli başlama kontrolünde rolü için belirlenen genlerin fonksiyonel karakterizasyonu, çiçeklenme zamanında modülasyonu transkripsiyonel regülasyon merkezi rolünü ortaya koymuştur. Aslında, çiçekli kodlamak transkripsiyon usta genlerin çoğu 4 faktörleri. Buna ek olarak, kromatin remodeling protein komplekslerinin bir dizi çiçeklenme ana genlerin ekspresyonunu etkilemektedir. Gözlemlenmesi, değişen çiçeklenme defa izole Arabidopsis Bir dizi mutantlar kromatin değiştirici çeşitli kodlayan genlerinde mutasyon taşıyan ortaya çıktı. Histon olarak posttranslasyonel modifikasyonlar farklı kromatin remodelerse kuyrukları, DNA'ya göre nükleozom konumlandırmak ya da Arabidopsis'te 5,6 çiçeklenme uygun düzenlenmesi için histon varyantları gerekli kanonik histonları vardır alışverişi. Bu kromatin remodeling aktiviteleri arasında birikmesini veya örneğin belirli histon kalıntılarda asetilasyon veya metilasyon gibi kovalent modifikasyon çıkarılmasını katalizler. Bu histon işaretleri özellikle çiçekli genlerin transkripsiyonel aktivitesini düzenleyen diğer kromatin remodeling kompleksleri, transkripsiyon faktörlerini veya transkripsiyonel makine bileşenleri işe özel etkileyiciler tarafından tanınır.
Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) in vivo DNA-bağlanma ilgi duyulan proteinler için (Şekil 1) belirlenmesini sağlar. Bu prosedür, DNA çapraz bağlantı belirli kimyasalların yeteneği proteinleri yararlanır. Elde edilen DNA-protein kompleksleri daha sonra özel antikor aga kullanılarak immunopresipite edilebilirinst, transkripsiyon faktörleri, kromatin bağlayıcı proteinler ya da özel bir değişiklik ve heterolog epitopları tercih proteine bağlanmış (genel olarak "etiketi" olarak adlandırılır). Bu İmmüno-saflaştırılmış DNA, ilgi konusu özel dizilerin zenginleşmesine değerlendirmek için kantitatif PCR (qPCR) reaksiyonlarında şablon olarak kullanılabilir. Bu şekilde, transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgeleri ya da belirli genlerdeki histon işaretleri dağılımı 7,8 kurulabilir. Buna ek olarak, masif paralel sıralama sağlayan Yeni Nesil Dizileme (NGS) ile birlikte, ChIP teknoloji transkripsiyon faktörlerinin bağlanma siteleri yanı sıra histon modifikasyonları meydana çıkarıyor Epigenomik manzara genom kimlik mümkün kıldı. Ayrıca, gen ekspresyonunun eşzamanlı analiz transkripsiyonel düzenleyici bağlanması ya da belirli histon bakışı depozisyon transkripsiyonel Activi orantılı olduğunu izlenmesine olanak verirgenlerin 9 ty.
Arabidopsiste ChIP protokollerin kullanılması transkripsiyonel düzenleyiciler çeşitli kromatin çiçeklenme usta genlerinin organizasyonu ve nasıl bu yapısal değişiklikler gen ifadesini etkileyen 5,6 üzerindeki etkisini değerlendirmek izin verdi. Önceki sonuçlar KISA GÜN İÇİNDE Arabidopsis odağı ERKEN cIVATALAMA (EBS) bu gen gösterisinde çiçeklenme ve çiçeklenme FT ana geninin upregülasyonu bir ivme çiçeklenme ve mutantlar bir bastıncısı gibi hareket ettiğini gösterdi. Buna ek olarak, FT-kaybı fonksiyonu mutasyonları tamamen FT ebs mutantlar erken çiçeklenme ve EBS 10 çiçeklenme bu ana geninin bastırılması için gerekli olduğu gerekli olduğunu belirten ebs mutant bitkilerin erken çiçek açan fenotip bastırmak 11. EBS özellikle histon H3 di- bağlamak ve inci de trimethylated bir PHD içeren proteinini kodlayanFT 12 kromatin aracılı bastırılması olarak EBS için bir rolü olduğunu düşündürmektedir e lizin 4 Kalıntı (/ 3 H3K4me2). ChIP yaklaşımının kullanılması Arabidopsis PHD içeren protein EBS 10,11 ifadesini 12 bastırmak için çiçek entegratör gen FT düzenleyici bölgeleri bağlar olduğunu göstermiştir. ChIP teknolojisi kullanımı yoluyla elde edilen ek veriler bu proteinin Arabidopsis gelişmenin ilk aşamalarında çiçeklenme bu ana geninin kromatin histon asetilasyon, aktif transkripsiyon bir damgasını düşük seviyelerde, korumak için gerekli olduğunu göstermiştir. Birlikte genetik ve gen ifadesi verileri Bu gözlemler, bu Arabidopsis PHD içeren protein çiçek entegratör geninin FT 12 ifadesini modüle etmek suretiyle çiçeklenme zamanı ince ayar merkezi bir role sahip olduğunu göstermektedir. Burada sunulan çalışma histonlarının analizi için değil, aynı zamanda diğer için değil, sadece yararlı optimize edilmiş bir yöntem sağlarkromatin proteinleri ilişkili ve artan verimlilik ve deneysel süreyi azalttı. Ayrıca, bu rapor ChIP protokollerin kullanımı Arabidopsis çiçeklenme başlangıcı ile ilgili gen ifadesinin kontrolü etkisi bu kromatin aracılı mekanizmalar kromatin modifikasyonları değişiklikler ve bitki genlerinin transkripsiyonel devletler arasındaki ilişkiye yeni anlayışlar sağladı ve nasıl nasıl gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bitki Materyali 1. Çapraz (1 saat)
- Arabidopsis deneyi kullanılan satırları büyütün (- WT - yabani tip mutantlar karşı, ve / veya etiket ifade çizgilerin karşı ilgi protein etiketli sürümünü ifade çizgileri herhangi proteine erimiş değil) büyük Petri kapları üzerinde 12-18 gün (150 mm), MS-agar ortamı (1 L: 1x Murashige & Skoog tuzlan, 10 g sakroz, 0.5 g MES, pH 5.7 (KOH),% 1 agar) ile. Toprak ve vermikülit 1 karışımı: Alternatif olarak, 3 içeren tencere üzerinde bitkiler büyümek.
DİKKAT! Formaldehit, cilt ile temasında ve yutulduğunda, inhalasyon yoluyla toksik ve uygun kişisel koruyucu donanımları giyen bir kimyasal kaputu ele alınmalıdır. 1.2 Adımları - 1.6 davlumbaz altında yapılmalıdır. - Bir laboratuvar brülör ısıtmalı iğne ile 50 ml tüpler kapağındaki küçük delikler yapın. % 1 bir son konsantrasyona 1x PBS 40 mi tampon ekleme ve formaldehitin 1,08 mi (stok 37% szüm). Bu 50 ml tüpler içinde bitki maddesinin 1.5 g toplayın. Çapraz bağlama sırasında buz üzerinde tüpler tutun.
- Kapaklı 50 ml tüpler kapatın. Bir kurutucuda tüpleri yerleştirin ve vakum uygulanır. Vakum daha sonra, 10 dakika boyunca doku infiltrasyonu solüsyonu çalkalama önlemek için dikkatli bir şekilde vakum bırakın. Örneği karıştırın. İki kez tekrarlayın. Infiltrasyon sonra, bitki materyali gözlemlemek ve biraz saydam hale teyit ve tüp (Şekil 2) dibine batmaya eğilimindedir.
- 5 dakika boyunca vakum uygula 0.125 M bir son konsantrasyon elde etmek için 2 M Glisin 2,5 ml ilave edilir. Glisin formaldehid çapraz bağlanma yarışmalı bir inhibitörü olarak görev yapar.
- Kapaktaki delikleri kapalı 50 ml tüp tersini PBS formaldehit-glisin çözüm atın.
- Aşama 1.5'de tarif edildiği gibi, su ile yıkama çözeltisi atılması ile iki kez 1 x PBS ile ve bir kez küçük bitkileri durulayın. Bir kağıt havlu üzerinde kurutun ve sıvı nitroge dondurman.
Not: Dondurulmuş doku hafta içinde -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
Antikorların 2. Hazırlık (1 gün)
NOT: İmmünopresipitasyon için, bir protein ya da protein G, antikor ağır zincirinin sabit alanı için yüksek afinitesi olan bir bağlayıcı ile antikorlar ile konjuge manyetik boncuk kullanılması tavsiye edilir. DNA-protein kompleksleri, boncuklar-antikor konjugatları yüzeyine spesifik olmayan eklenebilir. Bu nedenle, bu spesifik olmayan bağlanma arka ölçmek için spesifik antikorlar olmayan kontroller gerçekleştirmek için gereklidir.
- Her bir immüno-çökeltme için, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde manyetik boncuk 15 ul hazırlar. Boncuk tanelerin miktarının, immüno-çökeltme ve ayrıca antikorlar üzerinde kullanılır kromatin miktarına bağlıdır.
- Tu kordonlara Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) seyreltme tamponu 1 ml ilave dönmesiyle karıştırın ve 1.5 mL bir mikrosantrfuj koyun yıkamakManyetik bir raf olması. Boncuklar mıknatıs eklemek izin yaklaşık 1 dakika bekleyin. Rafa hala 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler ile pipetleme süpernatant kaldırmak. İki kez tekrarlayın.
Not: boncuk ve antikor (Ab) ve bir ikinci antikor, sadece herhangi bir manyetik boncuk (No-Ab) kontrolü ile bir: İki immüno setleri ihtiyaç vardır her bitki soyundan için. - ChIP seyreltme tamponu 200 ul boncuk tekrar. (Tam seyreltme her Ab için farklıdır ve deneysel olarak optimize edilmesi gereken ya da ticari antikorların durumunda, üretici talimatları takip) her bitki soyundan hazırlanan iki tüpün birine özgü Ab gerekli miktarını ekleyin. Immunoprecipitation için bu örneği kullanın. Negatif kontrol olarak kullanılacak diğer bir tüp için spesifik IgG miktarını kullanın.
- Antikor boncuk eklemek izin 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin.
3. Kromatin Ekstraksiyon (4 saat)
Not: Bu adımda, çekirdekler ve tüm organellerin pelet olacaktır. EXB 1 yüksek yoğunluklu sağlamak ve organel yapısı aksamaması için yeterli sakaroz içerir.
NOT: EXB 2% 1 Triton X-100, açık kloroplastları daldı ve klorofil kaldırmak yardımcı içerir.
NOT: Bu adım örnek deterjan çıkarmadan yardımcı olur.
NOT: BuTampon çekirdekleri parçalanması ve kromatin serbest bırakmak için, SDS içerir.
DİKKAT! Ultrason cihazı ses geçirmez bir kabin içinde yer almayan durumunda sonication adımı sırasında kulak koruyucu ekipman giymek emin olun.
Önemli adım! Kromatin parçalanma ölçüde sonication donanımına bağlıdır. Sonikasyon koşulları uygun DNA boyutlarda zenginleştirme elde etmek için ayarlanmalıdır. GörmekKromatin parçalanma nasıl optimize bir örnek için Şekil 3.
Not: Örnekler dondurulmuş ve birkaç hafta -20 ° C'de saklanabilir.
İlgi Protein ve DNA Rescue 4. immünopresipitasyonu (1 gün, 3 saat)
- Aşama 2.2 'de tarif edildiği gibi, antikorun fazlasının ayrılması için fiş seyreltme tamponu 1 ml aşama 2,4 üç kez Ab ile kaplanmış boncuk yıkayın. ChIP seyreltme tamponu 200 ul içinde süspanse. İzole kromatin 50 ul ekleyin. 4 ° C'de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin.
NOT: dikkat yoğunluğu kontrolmicrovolume UV-Vis spektrofotometre içinde kromatin üzerinde. İzole kromatin 50 ul DNA fazla 10 ug içermelidir. - 4 ° C adımlar 4,2-4,5 işler için. Aşama 2.2 'de tarif edildiği gibi Düşük Tuz yıkama tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın.
- Yüksek tuz yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın.
- LiCİ Yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın.
- TE tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın. Son yıkamadan sonra, tam bir pipet ile aspirasyon yoluyla tüp içinde sol TE tampon kaldırmak için emin olun.
- GİRİŞ örnekleri (adım 3.9) çıkartın. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Transfer INPUT 5 ul ve ChIP örnekleri ile olduğu gibi devam ediyor. % 5 kenetleme iyon değişim reçinesi 200 ul ekleyerek çapraz bağlantıyı ters döndürecek ve her 2-3 dakikada çalkalama 95 ° C'de 10 dakika inkübe edilir. 30 saniye için 16,000 xg'de Spin ve dikkatli bir şekilde pipetle yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine süpernatant aktarın.
NOT: tra ikenters çapraz bağlamak için ditional metod, bu sebepten, bir protokolü gün daha kısa hale etkin decrosslinking ve 10 dakika DNA'nın elüsyonu sağlar NaCI, 95 ° C de bir kenetleme iyon reçinesi ile kuluçkalama ile O / N inkübasyon içerir. - Proteinaz K 2 ul (10 mg / ml) ilave edin ve 30 dakika proteinleri sindirimi ve DNA serbest bırakmak için 37 ° C'de inkübe edin.
- 10 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe ederek reaksiyonu durdurun.
- Hızla 30 saniye boyunca 16.000 xg'de spin ve pipetleme yeni bir tüp süpernatantı aktarın.
- DNA, standart DNA fragmanları saflaştırma kiti kullanılarak izole temizleyin.
NOT: Üreticinin talimatlarına göre hareket edin. - Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kiti DNA bağlanma sütun aktarın. Sütunun merkezine DNase içermeyen su 20 ul ilave edilmesi ve 60 saniye boyunca 16,000 x g'de eğirme ile saflaştırılmıştır DNA Zehir. Nokta durdurma: Örnekler birkaç hafta -80 ° C'de saklanabilir. 5. qPCR immünopresipitasyona DNA'daki Siteleri Bağlama Bolluk Ölçme (4 saat)
- 60 ° C'lik bir erime sıcaklığı (Tm) ve% 30 -80% bir GC içeriğine sahip ilgili genomik bölgelere tasarım primerleri. Kromatin sonikasyon ile parçalanır olarak, amplifiye edilen dizideki uzunluğu 150-200 nükleotidleri (Tablo 1) daha uzun olmamalıdır.
NOT: Primer tasarımı için yararlı bir araç Primer 3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Primer tasarımı için ek kurallar 14,15, önceki raporlarda 8 mevcuttur. - Primerlerin özgü olduğundan emin olmak için bir patlama programı kullanın (özellikle destekleyiciler dizilerinin bağlama benzer TF paylaşabilirsiniz) ve astar verimliliği usin testig giriş DNA (adım 4.9) suda 01:10 dilüsyonları. Genomun belirli bölgeleri diğerlerinden daha iyi saflaştırılmıştır edilecektir. Bu PCR primerleri tasarlamak ve seyreltilmiş giriş DNA onları kontrol etmek önemlidir.
- Her reaksiyon için bir PCR tüpü içinde su ve pipet ile seyreltilmiş DNA 5 ul saflaştırılmış DNA 1:10 seyreltin.
NOT: DNA, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler duvarları ekleyebileceğiniz gibi yalnızca gerektiğinde miktarını seyreltin. Çoklu çözülme-donma döngüleri ekli DNA moleküllerinin sayısını artırmak. Giriş, her primer çifti, büyütme için, Ab-Chip ve Resim-Ab ChIP analiz edilmesi yer alır. - PCR karışımı tamamlamak için, 1x nihai bir konsantrasyona kadar SYBR Green PCR ana karışımı ekleyin ve her bir primerden 0.5 uM. DNaz içermeyen su ile 20 ul kadar doldurun.
- SYBR Green PCR master mix üreticisinin talimatları takip ederek qPCR reaksiyonu gerçekleştirin.
- Kat zenginleştirme yöntemiyle veri analizi.
- QPCR reaksiyonundan sonra elde edilmiştir örnekler isimleri ve ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun.
- Her numune için, ham Ct değerine karşılık gelen hiçbir-Ab kontrolü için elde edilen ham Ct değeri çıkarılır. NOT: Bu matematiksel işlemden sonra, No-Ab numunesi için Ct değeri 0 eşit olur.
- Tabanı 2 ve adım 6.1.2 (Tablo 2) 'de elde edilen negatif geri kalanına eşit üs (güç) ile üs işlemiyle kat zenginleşme hesaplayın.
zenginleştirme kat = 2 - (Ct (örnek) - Ct (No-Ab))
NOT: Bu metho içinded ChIP-ed numunesinde belirli bir DNA fragmanı bolluğu Resim-Ab kontrol Bu fragmanın bolluk ile karşılaştırılır. Bu yöntemin varsayım plan sinyalinin seviyesinin farklı primer setleri, örnekler ve çoğaltma deneylerde tekrar olmasıdır. Ancak, bu'noise' sinyal seviyeleri primer setleri, örneklerin ve deneyler arasında değişir.
- Giriş yöntemi% oranında Veri analizi.
- Numuneler isimleri ve qPCR reaksiyonundan sonra kendileri için elde edilmiş ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun.
- Bir girdi olarak alınmıştır toplam ekstre kromatin fraksiyonu logaritma tabanı 2 değeri çıkartılarak giriş örnekleri için ham Ct değerlerini ayarlayın.
NOT: Toplam kromatin% 10, bu protokolde bir girdi olarak çekildiği gibi çıkarılır değer, 3.32 eşittir Bu protokolde. Log 2 (10) 3.32 eşittir. - 100 ile b üstel işlem değeri çarpılarak giriş% hesaplayınase 2 ve örnek (Tablo 3) ham Ct değerleri çıkarılır düzeltilmiş giriş değerleri geri kalanı eşit üs (gücü).
Girişinin% = 100 * 2 (düzeltilmiş girişi - Ct (örnek))
NOT: Bu prosedür ile toplam izole kromatin (giriş örnek) için ChIP-ed örneğindeki spesifik DNA bolluk arasındaki ilişki hesaplanır. Çip veri analizi ile ilgili daha fazla detay Haring ve arkadaşları. 8 bulunabilir.
Not: Çökelen kromatin izole edilmiş DNA birleşmesinden oluşan ilgilenilen proteine bağlanması ile toplam kromatin yonga-ed edilmiş olan DNA fragmanları belirlemek için analiz edilmesi yer alır.
6. Veri Analizi
NOT: ex arasındaChIP-verileri analiz yollarını ğu iki en yaygın kullanılmaktadır. Bunlardan ilki, aynı zamanda 'no-antikor kontrole göre' göreceli zenginleşme ',' arka plan üzerinde sinyal 'olarak adlandırılan veya kat zenginleştirme yöntemidir. İkinci yöntem "girdi%" olarak adlandırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sekiz temel adım büyüyen ve bitki malzemesi, kromatin çapraz bağlanması, kromatin izolasyon, kromatin parçalanması, DNA arasındaki komplekslerin seçici izolasyonu hasat içeren in vivo protein-DNA etkileşim tanımlanması için bu yonga protokolde saydı edilebilir immüno-protein sindirimi, DNA saflaştırma ve qPCR analizi (Şekil 1), ilgi konusu bir protein. ChIP protokolünde çok önemli bir aşaması, bir çapraz bağlanma reaksiyonunda DNA-protein etkileşimlerinin fiksasyondur. Tipik haliyle, formaldehit çapraz bağlantı tesisi çipte kullanılır. Formaldehit doku nüfuz eder ve DNA 1 6 NH 2 proteinlerinin grupları veya proteinler ve nükleotid arasında metilen köprüler oluşturur. In vivo nukleoprotein komplekslerinin etkili bir tespit formaldehit bitki çekirdekleri içinde kromatin ulaşır gerektirir ve bu bitki dokusu tamamen t batık esastırO formaldehit tampon immunoprecipitation sırasında protein-DNA kompleksleri etkin bir aşağı çekti emin olmak için. Arabidopsis yaprakları mum katmanlarında kaplıdır zor olduğunu hücrelere çapraz bağlayıcı madde penetransı. Buna ek olarak, trikomlar, bitki dokusunun içine girmesini formaldehid çözeltisi önlenmesi, yaprak yüzeyi üzerinde hava kabarcıklarının oluşumunu de destekler. Bu adım, vakum sabitleme çözeltisi içinde kabarcık oluşumunu önlemek ve tüm hücrelerin çekirdekleri formaldehit ve nüfuzu arttırır, örneklere uygulanır olarak, bu sınırlamayı aşmak için,. Verimli bir çapraz bağlama tedaviden sonra fideler, Şekil 2 ile ilgili gösterilmektedir.
ChIP protokolünde bir diğer önemli adım kromatin kesme olduğunu. Geniş kromatin fragmanları DNA sekansı, ilgi duyulan proteini bağlanma sitelerinin düşük çözünürlüklü eşleme neden olabilir. Buna karşılık, çok küçük parçaları verimli amplifikasyonu önleyebilirqPCR bağlı DNA. Ampirik deneyimlerine göre, ChIP analizi için en uygun kromatin boyutu aralığı. Laboratuvarda mevcut sonication cihazına bağlı olarak ayarlanacak olan kromatin uygun parçalanma elde etmek için 200 ve 600 bp ve koşullar arasında 3 göstermektedir Şekil gerekir Prosedür, DNA boyutları istenen aralığında maksimum zenginleştirme elde etmek için kromatin kesme optimize etmek. Sonikasyon önce, kromatin esas olarak çok büyük parçaları oluşur. Sonikasyon döngü sayısında artış kademeli 20-30 döngü (protokol bölümü 3,8 ve Şekil 3) sonra, 200-600 bp aralığında uygun zenginleştirme ulaşan, yonga numuneler DNA ortalama boyutunu azaltır.
Burada, çiçek entegratörü FT düzenleyici bölgelere bağlanma yerleri EBS proteininin tanımlanması ChIP tekniği yararlılığı bir örnek olarak gösterilmektedir. T EBS bağlanmasınınO FT lokusu nativ EBS promoteri (pEBS :: Myc'nin-EBS) kontrolü altında bir Myc'nin-EBS füzyon proteinini eksprese eden Arabidopsis hatları ile yonga deneyi yoluyla ortaya çıkarılmıştır. Bu yapıyı ifade EBS mutant bitkilerin yabani tip fenotip gösterdiği gibi EBS bu etiketli versiyonu tamamen işlevseldir. Genomik FT lokusundaki dört bölge EBS bağlanması için test edilmiştir; geninin dönüşümsel başlangıç sitesinin yaklaşık (FTII), iki (FTIV, FTVI) ve FT (FTVII) (Şekil 4A) birinci intronunda başka bir promotor bölgesinde bir. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, yonga sonuçlar EBS proteini FT 12 çiçek ana geninin transkripsiyonel başlangıç bölgesine yakın bir düzenleyici dizisi bağlanabildiği göstermektedir. Bundan başka, EBS proteini in vitro ve hda6, düzenlemeye dahil olan başka bir kromatin ilgili protein olarak histon deasetilaz in vivo hem de etkileşime girebilirArabidopsis 1 7 zaman çiçekli. FT genomik bölgenin histon asetilasyonu seviyeleri üzerindeki EBS olası etkilerini değerlendirmek amacıyla, yonga deneyleri lysines 9 ve 14 asetillenmiş histon H3 karşı yönlendirilen bir antikor kullanılarak gerçekleştirilmiştir, bir histon işareti transkripsiyonal olarak aktif kromatin ile ilişkili 1 2 . Ayrıca, bu veriler ChIP yaklaşımları bitki gelişim süreçleri transkripsiyonel regülasyonu modüle moleküler mekanizmaları ışık tutacak nasıl katkıda bulunabileceğini göstermektedir.
Kromatin Immunoprecipitation protokolü. ChIP Şekil 1. Şema yaygın bir kimyasal bileşiğin tespit proteinler ve DNA, arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılan bir tekniktir. Korunmuş etkileşimleri Kromatin çekirdekleri ve parçalanmış izole edilmiştir. Ilgi proteine karşı antikorlar kullanılarak,Biz ona bağlı DNA fragmanlarını seçebilirsiniz. Antikor, bir manyetik raf kullanarak hızlı ve basit bir izolasyonuna olanak manyetik boncuk konjuge edilir. Bir sonraki adımda, proteinler, proteinaz işlenerek çıkarılır ve DNA serbest bırakılır. Arıtılmış DNA fragmanları sonra göreceli bolluk ölçmek için QPCR reaksiyonlarında şablonlar olarak kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil formaldehid ile çapraz bağlandıktan sonra, bir doku 2. Örnek. Bilgisi vivo kompleksleri, DNA ve protein arasındaki etkileşimi incelemek için protokol birden fazla adımda yoluyla sağlam ve dayanıklı hale getirmek için sabit olması. Protokolün bu sürümünde, fiksasyon formaldehit tedavisi ile meydana gelir. Formaldehit thr Verimli penetrasyonough doku ChIP yönteminin başarısı için çok önemlidir. (A) bitki maddesi çözeltisinin yüzeyinde yüzen ve küçük hava kabarcıkları ile kaplıdır çapraz bağlama işleminden önce Yaprakların eksen dışı ve polar taraf yüzeylerinin farklı renklerdedir. Tespit edildikten sonra (B), fidanları gözle çözüm batırılmış edilmelidir biraz şeffaf, ve eşit çapraz çözeltisine batırılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ChIP analizi için sonikasyon koşullarının 3. Optimizasyonu. Kromatin sabit malzemeden izole Şekil son derece uzun kromatin boyutları (soldan ikinci satırı) temsil eden jel üstünde güçlü bir bant ile uzunlukları parçalarının geniş oluşur. Increa ilesonikasyon döngü sayısını şarkı, kromatin parçaları boyutlarda zirve küçük parçalara doğru kaydırılır. Gösterilen deneyde, optimum çevrim numaraları sonra 200 ila 600 bp arasında değişen optimum kromatin parçaları ChIP numunede daha bol, 20 ve 30 arasında değişmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. ChIP EBS FT bağlar ve mutasyonlar bu çiçek entegratör geninde histon H3 asetilasyonunun düzeyini değiştirmek EBS göstermek analizleri. Ekson temsil siyah kutuları ile FT (A) Genomik bölgesi. Bu çiçek entegratör geninin düzenleyici bölgeleri kapsayan dört fragmanları test edildi (griBelirli qPCR primerler tasarlayarak kutuları). (B) EBS transkripsiyon başlangıç bölgesine yakın bulunan FT IV bölgesi, bağlanır. Myc-EBS EBS Myc'nin etiketli versiyonu ifade mutant bitkiler EBS tekabül; Myc c-myc ekspres eden transgenik bitkilerdir bir Arabidopsis geni kaynaşmamış epitopa temsil eder. (C) ebs mutant bitkiler değerlendirilen dört FT bölgelerinde yabani tip Landsberg erecta (L er) 'den H3K9,14Ac yüksek bolluk görüntüler. Hata çubukları, standart sapmayı (B ve C) göstermektedir. Bitki Hücresinin daha önce yayınlanmış verilerden Modifiye 1 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Ileriye doğru | Ters | Bölge test |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Bu çalışmada kullanılan primerler Tablo 1..
| Örnek | Ham Ct Değerleri | Cı-Ct (No-Ab) | Katlama zenginleştirme 2 - (Ct (örnek) - Ct (No-Ab)) |
| Resim-Ab | 34.5 | 0 | 1 |
| Ab | -5.3 | 39.4 |
Resim-Ab numuneler için bir yöntem "Zenginleştirme katlayın". Ct değerleri çip veri analizi Tablo 2. Örnek Ab / manyetik boncuklara DNA Spesifik olmayan bağlanma kaynaklanan arka plan sinyalinin sinyalden temsil etmektedir. Bunlar Ct değerleri No-Ab ve Ab örnek Ct değerleri arasında 30. Fark 1'den yüksek olmalıdır aşmalıdır.
| Adım 1 - girişi ayarlayın | |||
| Düzeltilmiş girişi = Raw Ct (giriş) - 2 Log (toplam kromatin fraksiyonu) | |||
| Ham Ct | toplam kromatin giriş | 2 10 Log | |
| Giriş | 29.5 | % 10 | 3.32 |
| Düzeltilmiş girişi = 29,5-3,32 = 26.18 | |||
| Adım 2 - Giriş hesaplamalar% | |||
| Örnek | Ham Ct | Ct (düzeltilmiş giriş) -CT (örnek) | 2 Ct (düzeltilmiş giriş) -CT (örnek) *% 100 |
| Giriş | 26.18 | ||
| ChIP-Ab | 31,45 | -5,27 | 2.59 |
| Resim-Ab | 34.5 | -8,32 | 0.31 |
"% Girişinin" yöntemi ile çip veri analizi Tablo 3. Örnek. Girişler çekirdekleri izole edilmiş toplam çapraz bağlanmış kromatin temsil yüzden Ct değerleri, tüm primer çiftleri için eşit olmalıdır. Geleneksel olarak,% 5 ya da toplam kromatin 10% bir girdi olarak alınır. Interes proteini ya da etiketi karşı özel antikorlar ile kaplı değildir, boncuklar - Resim-Ab, bir negatif kontrol örneğinit. ChIP-Ab proteinin veya ilgili etiket karşı antikorlarla immüno-çökeltme sonrası numune için.
| PBS 10x |
| 1,3 M NaCl |
| 30 mM Na-2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Ekstraksiyon tamponu 1 (EXB 1) |
| 0,4 M sukroz |
| 10 mM Tris-HCI pH 8 |
| 10 mM MgC |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteaz inhibitörleri |
| Ekstraksiyon tamponu 2 (EXB 2) |
| 0,25 M sukroz |
| 10 mM Tris-HCI pH 8 |
| 10 mM MgCl2 |
| % 1 Triton X-100 </ td> |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteaz inhibitörleri |
| Ekstraksiyon tamponu 3 (EXB 3) |
| 1.7 M sükroz |
| 10 mM Tris-HCI pH 8 |
| % 0.15 Triton X-100 |
| 2 mM MgCl2 |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteaz inhibitörleri |
| Sonikasyon tamponu |
| 50 mM Tris-HCI pH 8 |
| 10 mM EDTA |
| % 1 SDS |
| Proteaz inhibitörleri |
| ChIP seyreltme tamponu |
| % 1.1 Triton X-100 |
| 1.2 mM EDTA |
| 16,7 mM Tris-HCI pH 8 |
| 167 mM NaCI |
| Proteaz inhibitörleri |
| Düşük tuzlu tampon |
| 150 mM NaCI |
| % 0.1 SDS |
| % 1 Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCI pH 8 |
| Yüksek tuz Yıkama tamponu |
| 500 mM NaCI |
| % 0.1 SDS |
| % 1 Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCI pH 8 |
| LiCİ Yıkama tamponu |
| 0,25 M LiCI |
| % 1 NP-40 |
| % 1 sodyum deoksikolat |
| 1 mM EDTA |
| 10 mM Tris-HCI pH 8 |
| 10 mM Tris-HCI pH 8 |
| 1 mM EDTA |
Tablo 4. Tampon kompozisyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan ChIP protokolü Arabidopsis bitkileri, in vivo proteinler ve özel DNA dizileri arasındaki etkileşimi analiz etmek için tekrarlanabilir ve güçlü bir tekniktir. Ilgi proteinlerin için bağlayıcı siteleri başarılı bir kimlik ilgili etkileşimler aslında yer alıyor bitki organları ya da gelişimsel aşamaları yeterli bir seçim gerektirir. Buna ek olarak, bitki malzemesinin, uygun bir tespit ve sonikasyon ile kromatin optimal kesme elde etmek için kritiktir. Seçilen protein / etiket etkin immüno-çökeltme için son derece spesifik antikorlar da gereklidir.
Bitkilerde ChIP yaklaşımların kullanılması, potansiyel olarak protokolde farklı adımlar engelleyebilir sekonder metabolitler ve hücre duvarlarının varlığı ile ilgili bazı zorluklar ile karşı karşıya. Ayrıca, bitki organları karmaşıklığı, genellikle birden fazla hücre türlerini içeren burada int DNA bağlayıcı proteinerest farklı şekilde mevcut veya etkin olabilir, bu metodolojinin kullanımı engellemiştir. O ChIP kullanmak en avantajlı mümkünse bu nedenle, ilgilenilen proteinin varlığı ve / veya faaliyeti zaten ortaya konmuştur homojen dokuları yaklaşır. Farklı dokuları içeren kompleks bitki materyalleri hücre tipleri aslında protein fonksiyonlarının bir seyreltme neden eğilimindedir. 2 0 kesit doku, bireysel doku ya da hücre tipinde çalışmalar için bitkilerde kullanılmaktadır. Bununla birlikte, son yıllarda, farklı yöntemler uygun fragmanlar bir dizi Arabidopsis 8 hücre türüne özgü kromatin izolasyonu (Örnek Sonuçlar bölümüne bakınız) geliştirilmiştir 7. Yukarıda ele alındığı gibi, büyük ölçüde, kullanılan spesifik koşullar ultrason ekipman bağlıdır Bu boyutu dağılımının elde etmek. Herhangi bir durumda, kromatin tercih çapraz bağlama ters önlemek için düşük bir sıcaklıkta tutulmalıdırısı ile sonikasyon sırasında oluşturulan. Seçim Sonication cihazı birlikte optimum parçalanma koşulları, ChIP analizi (Şekil 3) için gerekli olan tekrarlanabilirliği iyi bir seviyede, sağlamalıdır.
Başarılı ChIP deneylerinde diğer bir önemli faktör ilgili proteinin immüno-çökeltme için seçilen bir antikordur. Bitki transkripsiyon faktörlerine karşı yetiştirilen antikorlar, ChIP analizi için faydalı olabilir, ancak, Western blot deneylerinin kontrol antikorlar zorunlu olarak çip için geçerli değildir, çünkü bu sera iyice test edilmelidir. Buna ek olarak, farklı etiketler karşı ortaya antikorlar sıklıkla bu protokol için kullanılır. Özellikle etiketler, çeşitli tanıma ChIP dereceli antikorlar ticari olarak temin edilebilmektedir ve bunlar birçok labaratuvar test sahip olma avantajına sahiptir. Bu ticari antikorların kullanımı için dezavantajı ilgili protein, ilgili epitopa kaynaşmış olarak olmasıdırve transjenik çizgileri (Şekil 4B) olarak ifade edilmiştir. Bu durumda, bu kimerik protein Arabidopsis ilgi eden proteini kodlayan genin kusurlu bir genetik geçmişe füzyon proteinini taşıyan transjenik çizgileri üreten fonksiyonel olduğundan emin olmak için tavsiye edilir. Transgenik bitkilerde mutant hattının fenotipik anormalliklerin tamamlama füzyon proteini endojen protein normal aktivitesini muhafaza teyit edecektir. Transjenik kopyalama düzenleyicilerinden oluşan bağlanma yerlerini belirlemek için üretilen, bu kurucu güçlü promotörler (yukarıya bakınız) kullanımı ile ortaya çıkan problemlerin engellenmesi, etiketlenmiş proteinin ekspresyonunu tahrik etmek için endojen promotör kullanmak tercih edilir. Ayrıca sıklıkla ChIP kullanılan bu metilasyon veya belirli artıkların asetilasyonu histon translasyon sonrası modifikasyonlar için spesifik antikorlar yer alan genlerin Epigenomik manzara belirlemek için analizçiçeklenme zamanında kontrol (Şekil 4C) de dahil olmak üzere gelişme süreçlerinde, bir dizi düzenlemesi. Etiketleri karşı antikorların gelince, ChIP dereceli ticari antikorlar histon işaretleri durumunda tercih seçenektir.
Gen ifadesinin bağlanmış ChIP deneysel yaklaşımlar transkripsiyon faktörleri, kromatin remodeling proteinler ve histon modifikasyonları kovalent bitki biyolojik süreçler ve yanıtların düzenlenmesinde rol oynayan genlerin ifadesini modüle nasıl bilgimizi artırarak etkili olmuştur analizleri. Başlangıçta özellikle loci ya da gen bölgeleri kromatin bulunan proteinlerin etkileşimi analiz etmek için bir yöntem olarak geliştirilen, genomik kaynaklar ve NGS teknolojisinin patlama ChIP DNA-bağlayıcı proteinlerin gibi genom profil için güçlü bir araç haline gelmesine izin gelmiştir transkripsiyon faktörleri ya da tadil edilmiş histon ve histon türevleri gibi. ChIP-çip ve ChIP-seq yeni bir küresel Dimen sağlamıştırArabidopsis 2 5 kromatin proteinleri ve DNA arasındaki etkileşimlerin analizlere sion. ChIP-seq yaklaşımlar bu diziler prob kısıtlı sayıda içerdiğini göz önüne alındığında, melezleme dizileri dayalı ve bazı önyargı duyurdu olan ChIP-chip için seçim alternatifi olarak kabul edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
