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Biology

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석 Published: January 14, 2016 doi: 10.3791/53422

Summary

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

Introduction

최근 몇 년 동안, 분자 적 유전자 및 게놈 툴의 다양한 모델 종 애기 장대에서 개발되어왔다. 이 기술은 식물 개발을 규제하는 방법을 이해하는 엄청난 발전을 촉진했다. 모델로 애기 장대를 이용하여 연구 개발 과정 중, 꽃이 피는 시간의 유전 적 제어가 광범위하게 분석하고있다. 이 연구는 식물은 호르몬과 식물의 나이 내생 단서에 대한 응답으로 꽃을 매우 정밀하게 시간을 조절하는 것으로 나타났습니다, 또한 시즌 1의 자연주기와 시간을 꽃 동기화 등 광주 및 온도 등의 환경 신호에, 2. 개화시기의 변화와 애기 돌연변이의 분리 및 특성 규명은 내인성 및 환경 인자에 응답하여 개화시기를 조절하는 유전자의 복잡한 네트워크를 공개에서 결정되었다. 이 유전자 회로는꽃의 스위치로서 작용 몇 마스터 유전자 수준에서 통합 및 꽃 개시의 정확한 타이밍은 개화 촉진 및 꽃 적분기 유전자 1,3 상류 작업 활동을 억압의 균형에 의존한다.

게놈 접근의 최근 사용에 의해 원조 꽃 개시의 제어에서의 역할에 대해 확인 된 유전자의 기능적 특성은, 꽃이 피는 시간의 변조에 전사 조절의 중심 역할을 계시했다. 사실, 꽃 인코딩 전사 마스터 유전자의 대부분은 4 요인. 또한, 크로 마틴 리모델링 단백질 복합체의 수는 개화 마스터 유전자의 발현에 영향을 미친다. 자신의 변경된 꽃 시간 동안 고립 된 애기 장대 돌연변이 체의 수는 염색질 수정의 다양한 암호화하는 유전자의 돌연변이를 가지고 밝혀졌다. 히스톤의 번역 후 변형을 소개 다른 염색질 remodelers전자 꼬리는 DNA에 비해 뉴 클레오의 위치를 변경하거나 애기 5,6에서 꽃의 적절한 규제 히스톤 변형에 의해 필요한 표준 히스톤을하고 있습니다 교환한다. 이 크로 마틴 리모델링 활동 중 일부는 증착 또는 특정 히스톤 잔류 물에 아세틸 또는 메틸화와 같은 공유 수정의 제거를 촉진. 이러한 히스톤 마크는 특히 꽃 유전자의 전사 활성을 조절하는 다른 크로 마틴 리모델링 복합체, 전사 인자 또는 전사 기계의 구성 요소를 모집 전문 이펙터에 의해 인식됩니다.

염색질 면역 침전 (칩)는 생체 내 DNA 결합 관심의 단백질 사이트를 (그림 1)의 확인을 할 수 있습니다. 이 절차는 DNA에 크로스 링크에 특정 화학 물질의 기능의 단백질을 이용한다. 얻어진 DNA 단백질 복합체는 다음 AGA 특정 항체를 이용하여 면역 침전 될 수있다이달 전사 인자, 염색질 - 결합 단백질, 또는 특정 변형 및 이종 에피토프는 원하는 단백질을 부착 (일반적으로 "태그"라 함). 이러한 immunoprecipitates로부터 정제 DNA는 관심있는 특정 서열의 엔리치 평가하기 위해 정량적 PCR (qPCR에) 반응에서 주형으로서 사용될 수있다. 이러한 방식으로, 전사 인자의 결합 부위 또는 특정 유전자 히스톤 마크들의 분포는 7,8를 설립 할 수있다. 또한, 대규모 병렬 시퀀싱을 가능 차세대 시퀀싱 (NGS)와 결합 칩 기술은 전사 인자의 결합 부위뿐만 아니라 히스톤 변형 공개 에피 지노믹스 풍경 게놈 전체의 식별을 가능하게하고있다. 또한, 유전자 발현의 동시 분석을 전사 조절기의 결합 또는 특정 히스톤 마크 증착 activi 전사와 상관 관계가 어떻게 모니터링 허용유전자 (9)의 타이.

애기 장대의 칩 프로토콜의 사용은 전사 레귤레이터 다양한 염색질 개화 마스터 유전자의 조직 및 방법이 구조적 변화는 유전자 발현에 영향을 5,6에 미치는 영향을 평가할 수있다. 이전 결과 짧은 일 애기 궤적 조기 BOLTING (EBS)이이 유전자 쇼에서 꽃과 꽃 FT의 마스터 유전자의 상향 조절의 가속도를 꽃과 돌연변이의 억제 자 역할을 것을 보여 주었다. 또한, FT의 기능 상실 돌연변이는 완전히 FT는 EBS 돌연변이 조기 개화과 EBS 10 꽃이 마스터 유전자의 억제에 필요한 것으로 요구 된 것을 나타내는, EBS 돌연변이 식물의 개화 표현형을 억제 , 11. EBS는 특히 히스톤 H3의 디 바인딩과 일에 트라이 메틸화 수있는 PHD-포함하는 단백질을 암호화FT (12)의 크로 마틴 매개 억압에서 EBS의 역할을 제안하는 전자 라이신 4 잔류 물 (/ 3 H3K4me2). 칩 방식의 사용은 애기 PHD 함유 단백질 EBS 10,11는(12)을 억제하는 꽃 적분기 FT 유전자의 조절 영역을 결합하는 것을 보여 주었다. 칩 기술을 이용하여 만들어진 추가의 데이터는이 단백질이 애기 개발의 초기 단계에서 꽃이 마스터 유전자의 크로 마틴의 히스톤 아세틸 화, 활성화 된 전사의 특징 인 낮은 수준을 유지하기 위해 요구되는 것으로 나타났다. 함께 유전자 및 유전자 발현 데이터와 이러한 관찰은이 애기 PHD - 함유 단백질이 꽃 적분기 (12)의 FT 유전자 발현을 변조시킴으로써 개화시기의 미세 조정에 중심적인 역할을 가지고 있음을 보여준다. 여기에 제시된 작품은 히스톤의 분석뿐만 아니라 다른 용뿐만 아니라 유용한 최적화 된 방법을 제공염색질은 단백질 관련, 증가 된 효율 및 실험 시간을 단축. 또한,이 보고서 칩 프로토콜의 사용은 애기 장대의 개화의 발병에 유전자 발현 제어 충격이 염색질 - 중재 메커니즘 염색질 변형의 변화 및 ​​식물 유전자의 전사 상태 사이의 관계에 새로운 통찰력을 제공하는 방법과 어떻게 나타낸다.

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Protocol

식물 재료 1. 가교 (1 시간)

  1. 애기 실험에 사용 된 선 성장 (- WT - 야생형 돌연변이 대를, 및 / 또는 태그를 표현하는 라인 대 관심의 단백질의 태그 버전을 표현하는 라인은 어떤 단백질에 융합되지 않음) 큰 페트리 접시에 12-18일에 대한 (150mm) MS 한천 배지 (1 L : 무라 시게 및 1X 스쿡 염, 10g의 수 크로스, 0.5 g의 MES, pH가 5.7 (KOH), 1 % 아가)와. 토양과 지렁이의 1 혼합 : 또는 3을 포함하는 화분에 식물을 재배한다.
    주의! 포름 알데히드는 피부 접촉 및 삼키면, 흡입 독성, 그리고 적절한 개인 보호 장비를 착용 화학 후드에서 처리되어야합니다. 1.2 단계 - 1.6 흄 후드에서 수행되어야한다.
  2. 실험실 버너 가열 바늘 50 ㎖ 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 확인합니다. 1 %의 최종 농도로 1X PBS 40 ml를 첨가하고 완충 포름 알데히드 1.08 ㎖ (스톡 37 %의olution). 그 50 ㎖ 튜브에 식물 재료의 1.5 G를 수집합니다. 가교 동안 얼음에 튜브를 유지합니다.
  3. 뚜껑 50 ml의 튜브를 닫습니다. 데시 케이 터에 튜브를 삽입하고 진공을 적용합니다. 진공 상태를 10 분 동안 조직을 침투 용액을 휘젓는 않도록 조심스럽게 진공을 해제. 샘플을 섞는다. 두 번 반복합니다. 함침 후, 식물 재료를 관찰하고 약간 반투명하게 확인 및 튜브 (도 2)의 바닥에 가라하는 경향이있다.
  4. 5 분 동안 진공을 적용 M. 0.125의 최종 농도를 달성하기 위해 2 M 글리신 2.5를 가하여. 글리신은 포름 알데히드 가교 결합의 경쟁 억제제 역할을합니다.
  5. 뚜껑에 구멍이 폐쇄 된 50ml 튜브를 반전시킴으로써 PBS 알데히드 글리신 용액을 버린다.
  6. 단계 1.5에 기재된 바와 같이 물이 세정액을 버리고 1X PBS로 두 번으로 한번 묘목을 헹군다. 종이 수건을 건조 및 액체 nitroge에 동결엔.
    참고 : 냉동 조직 주 동안 -80 ° C에서 유지 될 수있다.

항체 2. 준비 (1 일)

참고 : 면역 들어, 단백질 G 또는 단백질 항체 중쇄의 불변 도메인에 대한 높은 선호도와 링커를 통해 항체가 결합 자석 구슬의 사용이 권장됩니다. DNA - 단백질 복합체가 비드 - 항체 복합체의 표면에 비특이적으로 부착 할 수있다. 그 때문에, 결합 비특이적 백그라운드를 정량화하는 특이 항체없이 제어를 수행 할 필요가있다.

  1. 각각의 면역 들어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 자석 구슬의 15 μl를 준비합니다. 비즈의 양은, 면역 침강과 같은 항체에 사용될 염색질의 양에 달려있다.
  2. TU를 구슬로 염색질 면역 침전 (칩) 희석액 1 ㎖를 추가 회전에 의해 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심을 배치, 세탁자기 랙에. 구슬 자석에 부착 있도록 약 1 분을 기다립니다. 랙에 여전히 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브, 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 두 번 반복합니다.
    참고 : 구슬과 항체 (AB) 및 제없이 항체 만 자기 구슬 (무 AB) 제어 한 두 가지 면역 세트가 필요한 각 공장 라인.
  3. 칩 희석액 200 μL의 비드를 재현 탁. (정확한 희석은 각 Ab의 다릅니다 실험적으로 최적화되어야하거나, 상업 항체의 경우에, 제조업 자의 지시에 따라) 각각의 식물 라인으로 작성된 두 개의 튜브 중 하나에 특정 Ab의 필요한 양을 추가한다. 면역이 샘플을 사용하십시오. 음성 대조군으로서 사용될 다른 튜브에 비특이적 IgG의 동일한 양을 추가한다.
  4. 항체가 구슬에 연결할 수 있도록 4 ° C에서 회전 바퀴에 O / N을 품어.

3. 염색질 추출 (4 시간)

  • 분말이 균일하고 밝은 녹색이 될 때까지 박격포와 유 봉을 사용하여 철저하게 액체 질소에 냉동 식물 재료를 갈기. 새로운 50 ML 튜브에 분말을 전송합니다.
  • 흄 후드에서 3.6, 작업 - 단계 3.2. 추출 버퍼 (1) 30 ㎖ (E × B 형 1)를 추가하고, 조직 분말을 담가 잘 섞는다. 이 단계에서 항상 4 ° C에서 샘플을 유지. 냉동 조직과 액체 질소 먹다 남은 음식은 버퍼가 정지하게됩니다. 튜브를 4 ~ 5 번 매 2 분을 반전시켜 완전히 고정 된 조직을 해동해야합니다.
  • 4 ° C에서 20 분 동안 1,000 XG에서 새로운 50 ML 튜브와 원심 분리기를에 22 ~ 25 μm의 기공 크기를 갖는 여과 조직을 통해 전달하여 슬러리의 선택을 취소합니다.
    주 :이 단계에서, 모든 핵 소기관 펠렛 것이다. E × B 형 (1)는 높은 밀도를 제공하고 소기관 구조의 붕괴를 방지하기에 충분한 수 크로즈를 포함한다.
  • 부드럽게 경사 분리하여 상층 액을 제거합니다. 이 역에서GE는, 약 2 ML의 녹색 펠렛을 관찰합니다.
  • E × B 형 5ml에 펠렛을 재현 탁 펠릿 2. 부유이 시점에서 어렵다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
    참고 : E × B 형이 1 % 트리톤 X-100이 열려 엽록체 버스트와 엽록소를 제거하는 데 도움이 포함되어 있습니다.
  • 추출 버퍼 3 (E × B 형 3) 300 μL에 펠렛을 재현 탁.
  • 깨끗한의 microfuge 관에서, E × B 형 3. 600 ㎕의 단계 3.6에서 재현 탁 펠렛을 가지고 신중하게 깨끗한 E × B 형 3의 상단에 레이어 추가합니다.
  • 4 ° C에서 16,000 XG에 1 시간 동안 스핀.
    참고 :이 단계는 샘플에서 세제를 제거하는 데 도움이됩니다.
  • 피펫으로 흡입하여 상층 액을 제거합니다. 천천히 초음파 효율에 영향을 미칠 수있는 기포 형성을 방지하기 위해 위아래로 피펫 팅에 의해 초음파 처리 완충액 300 μL의 핵 펠렛을 재현 탁. 조심스럽게 모든 서스펜션을 피펫 깨끗한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다.
    참고 :이버퍼는 핵을 용균과 염색질을 해제, SDS가 포함되어 있습니다.
  • 핵을 용균 무작위로 작은 조각으로 염색질을 전단 할 수있는 현탁액을 초음파 처리. (자료 / 시약의 표에 설명 사용할 수있는 초음파 장치에 대해 4 ° C에서 설정 30 초 ON / 30 초 OFF로 20 ~ 30 회)를 200-800 BP 사이의 조각이 풍부한 염색질을 렌더링 초음파 조건을 사용합니다. 초음파 염색질의 2 μL (그림 3)로드, 아가 로스 겔 (13)에 얻어진 DNA 단편의 전기 영동 분리에 의한 초음파의 효율성을 확인합니다.
    주의! 초음파 장치가 방음 캐비닛에 포함되지 않은 경우 초음파 단계에서 귀 보호 장비를 착용해야합니다.
    중요한 단계는! 염색질의 분열은 주로 초음파 장비에 따라 달라집니다. 초음파 처리 조건은 적절한 크기의 DNA 농축을 달성하도록 조정되어야한다. 만나다염색질 단편화를 최적화하는 방법의 예를 들면도 3.
  • 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 한 번 용액을 스핀. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 피펫으로 상층 액을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상청 1/10을 -20 ° C에서 입력 및 동결로 표시.
  • 0.1 %의 최종 농도 SDS를 희석 칩 희석 버퍼 염색질 10 배 희석.
    참고 : 시료는 냉동 및 몇 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
  • 관심의 단백질과 DNA의 구조 4. 면역 침전 (1 일, 3 시간)

    1. 단계 2.2에 기재된 바와 같이 항체의 잉여를 제거하는 칩 희석액의 1 ml의 단계에서 2.4 세 번 구간 코팅 비드를 세척 하였다. 칩 희석액 200 μL에 재현 탁. 고립 된 염색질의 50 μl를 추가합니다. 4 ° C에서 회전하는 바퀴에 O / N을 품어.
      주 : concentrati 확인microvolume UV - 마주 분광 광도계에서 염색질의에. 고립 된 염색질의 50 μL은 DNA의 10 μg의를 포함해야합니다.
    2. 4 ° C가 단계 4.2-4.5 작업. 단계 2.2에 설명 된대로 낮은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오.
    3. 높은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오.
    4. LiCl을 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오.
    5. TE 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 후, 완전히 피펫으로 흡입하여 튜브에 남아있는 TE 버퍼를 제거해야합니다.
    6. 입력 샘플 (단계 3.9)를 꺼냅니다. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송 입력의 5 μl를하고 칩 샘플로 계속합니다. 5 %의 킬 레이팅, 이온 교환 수지의 200 μl를 첨가하여 가교 역마다 2-3 분간 진탕 95 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 30 초 동안 16,000 XG에 스핀 다운 조심스럽게 피펫 팅하여 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다.
      참고 : TRA 동안반전 가교 ditional 방법 그러므로 프로토콜 일일 짧게 만드는 효율적인 decrosslinking 10 분간에 DNA 용출 허용 염화나트륨, 95 ° C에서 킬레이트 이온 수지와의 인큐베이션과 O / N 항온 처리를 포함한다.
    7. 프로 테이나 제 K의 2 μL (10 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 30 분간 단백질을 소화와 DNA를 분리하기 위해, 37 ℃에서 배양한다.
    8. 10 분 동안 95 ℃에서 배양하여 반응을 정지.
    9. 빠르게 30 초 동안 16,000 XG에 스핀과 피펫 팅하여 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
    10. DNA는 표준 DNA 단편을 정제 키트를 사용하여 분리 청소.
      참고 : 제조업체의 지침에 따라 진행합니다.
    11. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 키트에서 DNA 결합 열을 전송합니다. 컬럼의 중심으로의 DNase없는 물 20 μl를 첨가하고 60 초 동안 16,000 XG에서 회전시켜 DNA를 정제하여 용리. 포인트를 중지 샘플 몇 주 동안 -80 ° C에 저장 될 수있다.
    12. 5. qPCR에 의한 면역 DNA에 결합 부위의 풍요를 측정 (4 시간)

      참고 : 침전 된 염색질에서 분리 된 DNA는 인해 관심의 단백질에 결합으로, 총 염색질에서 칩 에드되었습니다하는 DNA 단편을 결정하기 위해 분석되어야한다.

      1. 60 ° C의 융점 (Tm)이 ​​30 % -80 %의 GC 함량을 갖는 관심 영역 게놈 디자인 프라이머. 염색질은 초음파 처리에 의해 단편화 된 바와 같이, 증폭 된 서열의 길이는 150-200 뉴클레오티드 (표 1) 이상이어야한다.
        참고 : 프라이머 디자인을위한 유용한 도구가 프라이머 3 프로그램 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 프라이머 디자인에 대한 추가 가이드 라인은 14, 15, 이전 보고서 8에서 사용할 수 있습니다.
      2. 프라이머가 특정되어 있는지 확인하기 위해 BLAST 프로그램을 사용하여 (특히 프로모터 시퀀스 결합 비슷한 TF를 공유 할 수 있습니다) 및 프라이머 효율 날기를 테스트g 입력 DNA (단계 4.9)의 1:10 희석 물. 게놈의 특정 영역은 다른 사람보다 더 정제 될 것입니다. 이는 PCR 프라이머를 설계하고, 입력 희석 DNA 그들을 체크하는 것이 중요하다.
      3. 각 PCR 반응 용 튜브에 피펫으로 물과 희석 DNA 5 μl를 정제 된 DNA 1:10 희석.
        주 : DNA는 1.5 ml의 마이크로 원심 관의 벽에 부착 할 수로서, 필요한 양만 희석. 여러 동결 해동 사이클 부착 DNA 분자의 수를 증가시킨다. 입력의 각 프라이머 쌍, 증폭를 들어, AB-칩과 무 Ab의 칩을 분석해야한다.
      4. PCR 믹스를 완료하기 위해, 1X의 최종 농도 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 추가하고, 각 프라이머의 0.5 μM. DNase의없는 물 20 μL까지 채 웁니다.
      5. SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스 제조업체의 지침에 따라 qPCR에 반응을 수행합니다.

      6. 데이터 분석

      참고 : 전 중칩 데이터를 분석하는 방법을 isting, 두 사람은 가장 일반적으로 사용된다. 그 중 첫 번째는 '노 항체 컨트롤을 기준으로' '상대 농축', '배경 위에 신호'또는로 명명 배 농축 방법이다. 두 번째 방법은 "입력 %"로 지정됩니다.

      1. 배 농축 방식에 의한 데이터 분석.
        1. qPCR의 반응 후의 된 샘플의 이름과 원시 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다.
        2. 각 샘플에 대해, 원시 형 Ct 값에서 대응하는 AB 급 제어 얻어진 원료 코네티컷 값을 뺀다. 참고 :이 수학 연산 한 후, 노 구간 샘플에 대한 코네티컷 값이 0과 동일합니다.
        3. 기본 2 단계 6.1.2 (표 2)에서 얻은 부정적인 나머지 동일한 지수 (전원)와 지수의 조작에 의해 배 농축을 계산합니다.
          농축 배 = 2 - (CT (샘플) - 코네티컷 (무 AB))
          참고 :이 운전 방식에서D 칩 에드 샘플에서 특정 DNA 단편의 풍부가 더-Ab의 제어에서이 조각의 풍요 로움과 비교된다. 이 방법의 가정은 배경 신호의 레벨이 다른 프라이머 세트, 샘플 및 복제 실험 간 재현성이라는 것이다. 그러나,이 'noise' 신호 레벨은 프라이머 세트, 샘플 및 실험 사이에서 변할 않는다.
      2. 입력 방법의 %의 데이터 분석.
        1. 샘플 이름과 qPCR에 반응 후에 얻어 된 원료 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다.
        2. 입력으로 하였다 염색질의 총 추출 분획으로부터 대수베이스 (2)의 값을 감산하여 입력 샘플들에 대한 원시 형 Ct 값을 조정한다.
          참고 : 전체 염색질의 10 %가이 프로토콜의 입력으로 하였다으로 감산 값이 3.32에 해당이 프로토콜에서. 로그인 2 (10) 3.32 같습니다.
        3. B (100)와 지수 연산의 값을 승산함으로써 입력의 %를 계산ASE (2) 및 시료 (표 3)의 원료 코네티컷 값으로부터 감산 조정 된 입력 값들의 나머지와 동일한 지수 (전력).
          입력의 % = 100 * 2 (조정 입력 - 코네티컷 (샘플))
          참고 :이 절차로, 총 격리 된 염색질 (입력 샘플)에 칩 에드 샘플의 특정 DNA 풍부 사이의 관계가 계산됩니다. 칩 데이터 분석에 대한 더 자세한 사항은 해링 등. 8에서 찾을 수 있습니다.

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    Representative Results

    여덟 가지 주요 단계는 성장하고 식물 재료, 염색질의 가교, 염색질 격리, 염색질의 분열, DNA와의 복합체의 선택적 분리의 수확을 포함 생체 내 단백질 DNA 상호 작용의 식별을 위해이 칩 프로토콜에 선출 될 수있다 면역 침전, 단백질 분해, DNA 정제와 qPCR의 분석 (도 1)에 의해 관심있는 단백질. 칩 프로토콜에서 중요한 단계는 가교 결합 반응에서 DNA - 단백질 상호 작용의 정착이다. 통상적으로, 포름 알데히드 가교 식물 칩에 사용된다. 포름 알데히드는 조직을 침투 DNA 1 6 NH 2 단백질의 그룹 또는 단백질, 뉴클레오티드 사이의 메틸렌 다리를 만듭니다. 생체 내에서 핵 단백질 복합체의 효율적인 정착 포름 알데히드 식물 핵 내의 염색질에 도달해야하고, 그 식물 조직이 완전히 잠기 t에서 필수적인그는 포름 알데히드 버퍼는 면역 중에 단백질-DNA 복합체가 효율적으로 내려 오게되어 있는지 확인합니다. 애기 잎 왁스 층으로 덮여 어려운 그 세포에 가교제의 침투. 또한, 상체 (trichome)는 식물 조직의 내부로부터 얻는 포름 알데히드 용액을 예방, 잎의 표면에 기포의 형성을 선호. 이 공정은 진공 고정 용액에 기포의 형성을 방지하고, 모든 셀의 핵으로 포름 알데히드의 침투 향상, 샘플에 적용에서, 이러한 한계를 극복한다. 효율적인 가교 치료 후 모종은 그림 2에 표시됩니다.

    칩 프로토콜의 또 다른 주요 단계는 염색질의 전단입니다. 염색질 큰 단편을 DNA 서열의 관심 단백질의 결합 부위의 낮은 해상도로 매핑 될 수 있습니다. 대조적으로, 매우 작은 단편의 효율적인 증폭을 방지 할 수있다qPCR에 의해 결합 된 DNA. 경험적 경험에 따르면 칩 분석 최적 염색질 ​​크기 범위. 실험실 가능한 초음파 장치에 따라 설정되어야 염색질의 적절한 분할을 달성하기 위해 200과 600 BP 및 조건 사이 (3)를 도시한다해야 절차는 DNA 크기의 소정 범위에서의 최대 농축을 달성하기 염색질 전단을 최적화한다. 초음파 전에 염색질은 주로 매우 큰 조각으로 구성되어 있습니다. 초음파의 사이클 수의 증가는 점진적으로 20 ~ 30 회 (프로토콜의 섹션 3.8 및도 3) 후 200-600 염기쌍의 범위 최적 농축 도달 칩 샘플의 DNA의 평균 크기를 감소시킨다.

    여기서, 꽃 적분기 FT의 조절 영역에 대한 결합 부위 EBS 단백질의 동정은 상기 칩 기술의 유용성의 예로서 도시된다. T로 EBS의 결합그 FT 궤적 EBS 네이티브 프로모터 (pEBS :: cMyc - EBS)의 제어하에 cMyc - EBS 융합 단백질을 발현 애기 라인 칩 분석을 통해 풀어졌다. 이 구조를 표현 EBS 돌연변이 식물의 야생형 표현형와 같이 EBS이 태그 버전은 완벽하게 작동합니다. 게놈 FT 궤적 내 4 개 지역은 EBS 결합에 대해 시험 하였다; 유전자 전사 시작 사이트 주위 (FTII), 두 (FTIV, FTVI) 및 FT (FTVII) (그림 4A)의 첫 번째 인트론에 또 하나의 프로모터 영역의 하나. 도 4b에 도시 된 바와 같이 칩 결과 EBS 단백질 FT 12 꽃의 마스터 유전자의 전사 개시 부위 부근에 조절 서열에 결합 할 수 있음을 입증한다. 또한, EBS 단백질은 시험 관내 및 hda6가, 조절에 관여 다른 염색질 관련 단백질과 같은 히스톤 데 아세틸 라제와 생체 내 상호 작용애기 장대 7 시간 꽃의. FT의 게놈 영역에서의 히스톤 아세틸 화 수준에 대한 EBS의 가능한 영향을 평가하기 위해 칩 분석법 라이신 9와 14에서 아세틸 화 히스톤 H3에 대해 지시 된 항체를 사용하여 수행하고, 히스톤 마크 전사적 활성 염색질과 상관 1 2 . 또한, 이러한 데이터는 칩의 접근 방식은 식물 발달 과정의 전사 조절을 조절하는 분자 메커니즘을 밝혀에 기여할 수있는 방법을 보여줍니다.

    그림 1
    염색질 면역 침전 프로토콜. 칩의도 1 방식은 일반적으로 화합물 고정 DNA와 단백질 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용되는 기술이다. 보존 상호 작용 염색질은 핵 및 조각에서 격리됩니다. 관심의 단백질에 대한 항체를 사용하여,우리는 첨부의 DNA 조각을 선택할 수 있습니다. 항체는 자기 랙을 사용하여 빠르고 간단하게 분리 가능 자석 구슬에 결합된다. 다음 단계에서, 단백질은 단백질 분해 효소 처리에 의해 제거하고, DNA가 해제된다. 정제 된 DNA 단편은 상대적인 풍요를 측정하는 qPCR의 반응에서 템플릿으로 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    도 포름 알데히드와 가교 후의 조직의 실시 예 2.이 생체 복합체에서 DNA와 단백질 사이의 상호 작용을 조사하기 위해,이 프로토콜의 여러 단계를 통해 안정적이고 견고하게 고정된다. 프로토콜의이 버전에서는 고정 포름 알데히드 처리에 의해 발생합니다. 포름 알데히드 THR의 효율적인 침투깨닫지 못하고 있거나 남의 조직 칩 방법의 성공에 매우 중요하다. (A) 식물 재료가 용액의 표면에 부유하고 작은 기포로 덮여 가교 공정 전에; 잎의 배축과 향축 표면은 색 다릅니다. 고정 후 (B)가, 묘목이 눈에 띄게 용액에 담가해야한다, 약간 투명하고 균일하게 가교 용액에 침지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    분석을위한 초음파 조건 3. 최적화. 염색질 고정 물질로부터 격리 그림은 매우 긴 염색질 크기 (왼쪽에서 두 번째 줄)를 나타내는 겔의 상단에 강한 밴드 길이 조각의 다양한 구성되어 있습니다. increa로초음파 횟수 노래 염색질 단편 크기의 피크는 더 작은 단편으로 시프트된다. 표시된 실험에서 최적의 사이클 번호는 그 후 200에서 600 BP에 이르기까지 최적의 염색질 조각 칩 샘플에 더 풍부, 20 및 30에 따라 다릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    그림 4. 칩은 EBS가 FT을 결합하여 돌연변이가이 꽃 통합 유전자의 히스톤 H3의 아세틸 화의 수준을 변경 EBS 쇼를 분석한다. 엑손을 대표하는 블랙 박스와 FT의 (A) 게놈 영역. 이 꽃 통합 유전자의 조절 영역에 걸쳐 네 개의 조각을 시험 하였다 (회색특정 qPCR에 프라이머를 설계하여 상자). (B) EBS는 전사 시작 부위에 가까운 위치 FT IV 영역은 결합한다. myc의-EBS는 EBS의 cMyc - 태그 버전을 표현하는 돌연변이 식물을 EBS에 해당; myc 유전자는 cMyc 발현 형질 전환 식물체가 어떤 아라비돕시스 유전자에 융합되지 에피토프 나타낸다. (C) EBS 돌연변이 식물이 평가 네 FT 지역에서 야생 유형에 Landsberg erecta (L 어)보다 H3K9,14Ac의 높은 풍요를 표시합니다. 오차 막대는 표준 편차 (B 및 C)를 보여줍니다. 식물 세포에서 이전에 게시 된 데이터에서 수정 1 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    앞으로 지역 테스트
    TCGTGCAAATGGATGGTTAG TTTTTTATAAACAAGCGGCC FT II
    TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC FT IV
    AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC TCCTGAGGTCTTCTCCACCA FT VI
    GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC ATTCCACAACAGAGATTCATCA FT VII

    본 연구에 사용 된 표 1 프라이머.

    견본 원시 코네티컷 값 CT-CT (노 Ab의 없음) 배 농축
    2 - (CT (샘플) - 코네티컷 (무 AB))
    노 Ab의하지 34.5 0 1
    AB -5.3 39.4

    노 구간 샘플 방법 "농축 배". 코네티컷 값으로 칩 데이터 분석의 표 2 예는 시종 / 자석 구슬에 DNA의 비특이적 결합에 의한 배경 신호를 나타냅니다. 이 코네티컷 값은 없음-Ab의 AB 형 샘플의 코네티컷 값 사이의 차이 (30)가 1 이상이어야한다 초과한다.

    1 단계 - 입력을 조정
    조정 입력 = 원시 코네티컷 (입력) - 2 로그 (총 염색질의 일부)
    원시 코네티컷 총 염색질에서 입력 2 (10) 로그
    입력 29.5 10 % 3.32
    조정 입력 = 29.5-3.32 = 26.18
    2 단계 - 입력 계산 %
    견본 원시 코네티컷 코네티컷 (조정 입력) -ct (샘플) 2 코네티컷 (조정 입력) -ct (샘플) * 100 %
    입력 26.18
    칩 Ab의 31.45 -5.27 2.59
    노 Ab의하지 34.5 -8.32 0.31

    "% 입력"방법에 의한 칩 데이터 분석의 예는 표 3. 입력은 핵으로부터 격리 총 가교 된 염색질을 나타내는 때문에 코네티컷 값은 모든 프라이머 쌍을위한 동일해야한다. 통상적으로, 5 % 또는 총 염색질의 10 %가 입력으로서 취해진 다. 가출의 단백질 또는 태그에 대해 특이적인 항체로 코팅되지 구슬 - 노 AB를 음성 대조군 샘플을 대표하지티. 칩 AB를 단백질 또는 관심의 태그에 대한 항체와 면역 침전 후 샘플을 의미합니다.

    TE 완충액
    PBS 10 배
    1.3 M의 NaCl
    30 mM의 나 2 HPO 4
    30 밀리미터의 NaH 2 PO 4
    pH가 7
    추출 버퍼 1 (E × B 형 1)
    0.4 M 자당
    10 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    10 밀리미터의 MgCl
    5 MM의 β - 머 캅토 에탄올
    단백질 분해 효소 억제제
    추출 버퍼 2 (E × B 형 2)
    0.25 M 자당
    10 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    10 밀리미터의 MgCl 2
    1 % 트리톤 X-100 </ TD>
    5 MM의 β - 머 캅토 에탄올
    단백질 분해 효소 억제제
    추출 버퍼 3 (E × B 형 3)
    1.7 M 자당
    10 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    0.15 % 트리톤 X-100
    2 밀리미터의 MgCl 2
    5 MM의 β - 머 캅토 에탄올
    단백질 분해 효소 억제제
    초음파 완충액
    50mM 트리스 - 염산 pH를 8
    10 mM의 EDTA
    1 % SDS
    단백질 분해 효소 억제제
    칩 희석 버퍼
    1.1 % 트리톤 X-100
    1.2 mM의 EDTA
    16.7 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    167 mM의 NaCl을
    단백질 분해 효소 억제제
    낮은 소금 버퍼
    150 mM의 NaCl을
    0.1 % SDS
    1 % 트리톤 X-100
    2 mM의 EDTA
    20 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    높은 소금 세척 버퍼
    500 mM의 NaCl을
    0.1 % SDS
    1 % 트리톤 X-100
    2 mM의 EDTA
    20 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    LiCl을 세척 버퍼
    0.25 M LiCl을
    1 % NP-40
    1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트
    1 mM의 EDTA
    10 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    10 mM 트리스 - 염산 pH를 8
    1 mM의 EDTA

    표 4. 버퍼 조성물.

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    Discussion

    여기에 설명 된 칩 프로토콜은 아라비돕시스 식물의 생체 내에서 단백질과 특정 DNA 서열 사이의 상호 작용을 분석 재현성 강력한 기술이다. 관심의 단백질 결합 부위의 성공적인 식별 관련 상호 작용이 실제로 일어나고있는 식물 기관 또는 발달 단계의 적절한 선택이 필요합니다. 또, 식물 재료의 적절한 고정 및 초음파 처리에 의해 최적의 염색질의 전단을 수득하는 것이 중요하다. 선택한 단백질 / 태그의 효율적인 면역에 매우 특이 항체는 필수적이다.

    식물 칩 방식의 사용은 잠재적으로 상이한 프로토콜 단계를 방해 할 수있는 이차 대사 산물 및 셀 벽의 존재와 관련된 어려움에 직면 해있다. 또한, 식물 기관의 복잡성은 종종 다수의 세포 유형을 함유 여기서 INT의 DNA 결합 단백질erest가 차등 존재하거나 활성화 할 수 있습니다,이 방법의 사용을 방해했다. 이 칩에 사용하는 것이 가장 바람직하다 가능한 그 이유로, 관심 단백질의 존재 및 / 또는 활성은 이미 입증되었다 균질 조직에 접근한다. 다른 조직을 함유 복합 식물 물질은 실제로 세포 유형의 기능의 단백질을 희석을 야기하는 경향이있다. 2 0 조직 절편 개별 조직 또는 세포 유형에 대한 연구 식물에서 사용되어왔다. 그러나, 최근 몇 년 동안, 다양한 절차 최적 단편의 범위 애기 8 세포 형 특정 염색질의 분리 (대표 결과 절 참조)에 대해 개발되어있다 (7). 상술 한 바와 같이, 사용 조건이 크게 특정 초음파 장비에 의존이 크기 분포를 달성했다. 어떤 경우에, 염색질은 선호 가교 반전을 방지하기 위해 저온에서 보관해야열에 의해 초음파 처리 중에 생성. 선택의 초음파 장치가 함께 최적 단편화 조건 칩 분석 (도 3)에 필수적인 재현성 좋은 레벨을 제공한다.

    성공적인 칩 실험의 또 다른 중요한 요소는 관심의 단백질의 면역 침전에 대하여 선택된 항체이다. 식물 전사 인자에 대해 제기 항체 칩 분석에 유용 할 수 있지만, 웨스턴 블롯 실험에서 확인 항체가 반드시 칩 유효하지 않기 때문에 이러한 혈청 철저하게 테스트해야합니다. 또한, 다른 태그에 대해 발생 된 항체는이 프로토콜에 자주 사용된다. 구체적으로는 태그의 종류를 인식 칩 등급 항체는 상업적으로 이용 가능하고, 그들은 여러 실험실에서 시험되어 이점이있다. 이러한 항체의 상업적 용도 단점은 관심있는 단백질 에피토프에 대응하는 융합되어야한다는 것이다형질 전환 라인 (그림 4B)로 표현. 이 경우, 키 메릭 단백질은 애기 우리에게 관심 단백질을 코딩하는 유전자가 결실 된 유전자 백그라운드로 융합 단백질을 함유 유전자 변형 라인을 생성하여 작동되도록하는 것이 바람직하다. 형질 전환 식물체에서의 라인 돌연변이 표현형 비정상 보완은 융합 단백질이 내인성 단백질의 정상적인 활성을 유지하고 있음을 확인한다. 형질 전환 계통이 전사 조절기의 결합 부위를 식별하기 위해 생성되는 경우,이 구성 적 강한 프로모터 (상기 참조)의 이용과 관련된 문제를 방지 태그로 단백질의 발현을 구동하는 내인성 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 자주 사용되는 칩 등 메틸화 또는 특정 잔기의 히스톤 아세틸 화와 같은 번역 후 변형에 대한 특이 항체가 관여하는 유전자의 에피 지노믹스 풍경을 결정하도록 분석개화시의 제어 (도 4C)을 포함하여 개발 프로세스의 개수의 조절. 태그에 대한 항체로서, 칩 등급 상업적인 항체는 히스톤 마크의 경우에 바람직한 선택이다.

    유전자 발현에 결합 칩 실험 방법은 전사 인자는 크로 마틴 리모델링 단백질 및 히스톤 공유 변형 식물 생물학적 과정과 반응의 조절에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 방법에 대한 우리의 지식을 증가시키는 수단이 있었다 분석한다. 초기 특정 유전자좌 또는 유전자 영역으로 염색질에 존재하는 단백질의 상호 작용을 분석하는 방법으로서 개발, 게놈 자원 및 NGS 기술의 버스트 칩은 DNA 결합 단백질 등의 게놈 전체 프로파일을위한 강력한 도구가 될 수있다 전사 인자 또는 수정 된 히스톤 및 히스톤 변형 등. 칩 - 칩 및 칩 서열은 새로운 글로벌 DIMEN를 제공하고 있습니다애기 장대 2 5 염색질 단백질과 DNA의 상호 작용의 분석에 시온. 칩 서열 방식은 이러한 배열은 프로브의 제한된 숫자를 포함 주어진, 하이브리드 어레이를 기반으로 약간의 편견을 소개한다 칩 - 칩에 선택의 대안으로 간주됩니다.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    MES Sigma M8250
    MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) Sigma M5524
    Formaldehyde 37%  Sigma F8775-25 Use under the fume hood
    Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack Roche 5892791001
    Bioruptor Standard sonication device Diagenode B01010002 (UCD200TO)
    Glycine Sigma 50046
    QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
    Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G Life Technologies 10003D/10001D Check manufacturer’s manual for antibody affinity
    Miracloth Merck Millipore 475855
    Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution Life Technologies 85112
    (mouse, rat, rabbit…)-IgG Diagenode C15400001, C15420001, C15410206
    Magnetic rack - DynaMag-2 Life Technologies 12321D
    H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium  Diagenode C15410200-10
    Chelex 100 Resin Bio-Rad 142-2832
    Proteinase K Life Technologies 17916
    Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 Millipore 05-724
    LightCycler 480 SYBR Green I Master Roche 4707516001

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    식물 생물학 문제 (107) 발달 생물학, 염색질 면역 (칩) 전사 조절 꽃 시간
    애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em
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    Komar, D. N., Mouriz, A., Jarillo,More

    Komar, D. N., Mouriz, A., Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo. J. Vis. Exp. (107), e53422, doi:10.3791/53422 (2016).

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