Summary
Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.
Introduction
Nos últimos anos, uma grande variedade de ferramentas genéticas, moleculares e genómicos foram desenvolvidos na Arabidopsis thaliana espécies modelo. Esta tecnologia tem facilitado enormemente o progresso na compreensão de como o desenvolvimento das plantas é regulamentada. Entre os processos de desenvolvimento de Arabidopsis utilizando estudadas como um modelo, o controlo genético do período de floração foi extensivamente analisado. Estes estudos têm mostrado que as plantas modular muito precisamente a época da floração em resposta a estímulos endógenos, tais como hormônios e da idade da planta, e também aos sinais ambientais, tais como fotoperíodo e temperatura que sincronizar o tempo de floração com o ciclo natural das estações 1, 2. O isolamento e caracterização de mutantes de Arabidopsis com alterações no tempo de floração tem sido determinante em revelar uma complexa rede de genes que regulam o tempo de floração em resposta a fatores endógenos e ambientais. Estes circuitos são genéticosintegrado no nível de alguns genes mestre que actuam como interruptores de floração, e o momento exacto do início floral depende do equilíbrio da floração promover e reprimir actividades que funcionam a montante dos genes integrador florais 1,3.
A caracterização funcional dos genes identificados pelo seu papel no controlo de início de floração, auxiliado pelo uso recente de abordagens genómicas, revelaram o papel central de regulação de transcrição na modulação do período de floração. Na verdade, muitos dos genes codificam mestre de floração fatores de transcrição 4. Além disso, um certo número de complexos de proteína de remodelação da cromatina influenciar a expressão de genes mestres de floração. Uma série de mutantes de Arabidopsis os isolados por seu tempo de floração alterado acabou por portadores de mutações em genes que codificam uma variedade de modificadores de cromatina. Diferentes empresas de reestruturação de cromatina que introduzem modificações pós-translacionais em Histone caudas, reposicionar nucleosomes relativos ao DNA ou trocar histonas canônicos por variantes de histonas são necessárias para a regulação da floração em Arabidopsis 5,6. Algumas destas actividades remodelação da cromatina catalisar a deposição ou a remoção de modificações covalentes, tais como a metilação ou acetilação de histonas em resíduos específicos. Estas marcas das histonas são especificamente reconhecidos pelos efectores especializados que recrutam outros complexos de remodelação da cromatina, factores de transcrição ou de componentes da maquinaria transcricional para regular a actividade transcricional de genes de floração.
Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP) permite a identificação de locais in vivo de proteínas de interesse de ligação de ADN (Figura 1). Este procedimento tira vantagem da capacidade de certos produtos químicos para reticular as proteínas para o ADN. Os complexos ADN-proteína resultante pode ser então imunoprecipitadas utilizando anticorpos específicos AGAfactores de transcrição inst, proteínas de ligação de cromatina, ou modificações particulares e epítopos heterólogos (vulgarmente referidos como "etiquetas") ligados à proteína de escolha. O ADN purificado a partir de imunoprecipitados destes pode ser utilizado como um molde em PCR (qPCR) para avaliar as reacções quantitativos para o enriquecimento de sequências particulares de interesse. Deste modo, os sítios de ligação de factores de transcrição ou a distribuição de sinais de histonas em genes particulares pode ser estabelecido 7,8. Além disso, combinado com Next Generation Sequencing (NGS) que permite enorme sequenciamento paralelo, a tecnologia de chip tornou possível a identificação de todo o genoma dos sítios de ligação de fatores de transcrição, bem como paisagens epigenômicos inauguração de modificações de histonas. Além disso, a análise simultânea da expressão de genes permite a monitorização como a ligação dos reguladores da transcrição ou a deposição de marcas particulares histona correlaciona com a transcrição activity 9 de genes.
O uso de protocolos chip no Arabidopsis permitiu avaliar o impacto que uma variedade de reguladores de transcrição têm sobre a organização da cromatina de genes mestres da floração e como essas mudanças estruturais influenciar a expressão do gene 5,6. Resultados anteriores mostraram que a Arabidopsis lócus florescimento precoce em suma DIAS (EBS) atua como um repressor da floração e mutantes neste show gene uma aceleração da floração e da sobre-regulação do gene mestre do FT floração. Além disso, a perda de função mutações no FT suprimir totalmente o fenótipo de floração precoce das plantas EBS mutantes, indicando que FT é necessário para a floração precoce de mutantes de EBS e que a EBS é necessária para a repressão de este gene mestre de floração 10 , 11. EBS codifica uma proteína contendo PHD que se pode ligar especificamente histona H3 trimetilada em di- e the 4 resíduo lisina (H3K4me2 / 3), sugerindo um papel para EBS na repressão mediada por cromatina de FT 12. A utilização da abordagem ChIP demonstrou que a Arabidopsis contendo PHD proteína EBS 10,11 liga regiões reguladoras do gene FT integrador floral para reprimir a sua expressão 12. Os dados adicionais obtidos através do uso de tecnologia de chip mostrou que esta proteína é necessária para manter baixos níveis de acetilação da histona, uma característica da transcrição activa, na cromatina deste gene mestre de floração durante as fases iniciais de desenvolvimento da Arabidopsis. Estas observações, em conjunto com dados de expressão genética do gene e, demonstram que este Arabidopsis PHD contendo a proteína tem um papel central na regulação fina da época de floração através da modulação da expressão do gene integrador floral FT 12. O trabalho aqui apresentado fornece um método optimizado útil não só para a análise das histonas, mas também para a outracromatina proteínas associadas, e com o aumento da eficiência e redução do tempo experimental. Além disso, este relatório ilustra como o uso de protocolos de chip tem fornecido novos insights sobre a relação entre as mudanças em modificações da cromatina e estados de transcrição de genes de plantas, e como esses mecanismos mediados por cromatina de impacto controle da expressão gênica no início do florescimento em Arabidopsis.
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Protocol
1. A reticulação do material vegetal (1 hr)
- Crescer as linhas de Arabidopsis utilizados no experimento (tipo selvagem - WT - contra os mutantes, e / ou linhas que expressam a versão marcado de sua proteína de interesse em relação linhas expressam o tag não fundida a qualquer proteína) durante 12-18 dias em grandes placas de Petri (150 mm) com meio MS-ágar (1 L: 1x Murashige & Skoog, 10 g de sacarose, 0,5 g de MES, pH 5,7 (KOH), 1% de agar). Alternativamente, cultivar plantas em vasos contendo 3: 1 mistura de solo e vermiculita.
CUIDADO! O formaldeído é tóxico por inalação, em contacto com a pele e em caso de ingestão, e deve ser tratado em uma capa química uso de equipamento de protecção individual adequado. Passos 1,2-1,6 deve ser realizada sob a coifa. - Adicione pequenos buracos na tampa dos tubos de 50 ml com uma agulha aquecida pelo queimador, de laboratório. Adicionar 40 ml de PBS 1x tampão e 1,08 ml de formaldeído até uma concentração final de 1% (Estoque 37% solution). Recolha de 1,5 g de material vegetal em esses tubos de 50 ml. Manter os tubos em gelo durante reticulação.
- Feche os tubos de 50 ml com tampa. Colocar os tubos em um exsicador e aplicar vácuo. Aspirador de infiltrar o tecido durante 10 min, em seguida, libertar o vácuo com cuidado, para evitar-se agitando a solução. Misturar a amostra. Repita duas vezes. Após a infiltração, observar o material de planta e confirmar que se torna ligeiramente translúcido e tendem a afundar para o fundo do tubo (Figura 2).
- Adicionar 2,5 ml de 2 M de glicina para atingir uma concentração final de 0,125 M. Aplicar vácuo durante 5 minutos. A glicina actua como um inibidor competitivo da reticulação de formaldeído.
- Descartar a solução de formaldeído-glicina PBS invertendo o tubo fechado 50 ml com buracos na tampa.
- Lavar as plântulas duas vezes com 1x PBS e uma vez com água descartando a solução de lavagem como descrito na etapa 1.5. Seque-os sobre uma toalha de papel e congelar em nitroge líquidon.
NOTA: tecido congelado pode ser mantida a -80 ° C durante semanas.
2. Preparação dos anticorpos (1 dia)
NOTA: Para a imunoprecipitação, recomenda-se a utilização de contas magnéticas conjugadas com anticorpos através de uma proteína G ou proteína A de ligação com elevada afinidade para o domínio constante da cadeia pesada de anticorpo. Os complexos DNA-proteína pode anexar inespecificamente à superfície dos grânulos de conjugados de anticorpos. Por essa razão, é necessário realizar os controlos sem anticorpos específicos para quantificar o fundo de ligação não-específica.
- Para cada imunoprecipitação, preparar 15 uL de pérolas magnéticas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A quantidade de pérolas depende da quantidade da cromatina utilizados para imunoprecipitação e também sobre os anticorpos.
- Para lavar, adicionar 1 ml de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) tampão de diluição às esferas, misture por rotação e coloque a 1,5 ml de microcentrífuga tuestar numa cremalheira magnética. Espere cerca de 1 min para deixar as contas anexar ao ímã. Com os 1,5 ml microtubos ainda no rack, remova o sobrenadante por pipetagem. Repita duas vezes.
NOTA: Para cada linha de plantas dois conjuntos de imunoprecipitação são necessários: um com as contas e anticorpo (Ab) e um segundo sem anticorpo (No-Ab) controle com apenas esferas magnéticas. - Ressuspender as pérolas em 200 ul de tampão de diluição de chip. Adicionar a quantidade necessária de Ab específico para um dos dois tubos preparados para cada linha de planta (a diluição exacta difere para cada Ab e tem de ser optimizada experimentalmente ou, no caso de anticorpos comerciais, siga as instruções do fabricante). Utilize essa amostra para imunoprecipitação. Adicionar a mesma quantidade de IgG inespecífica ao outro tubo, o qual será utilizado como controlo negativo.
- Incubar O / N numa roda rotativa, a 4 ° C para permitir que o anticorpo atribuem aos grânulos.
3. Extracção da cromatina (4 h)
NOTA: Neste passo, os núcleos e todos os organelos irá sedimentar. ExB 1 contém sacarose suficiente para proporcionar uma elevada densidade e impedir a ruptura da estrutura do organelo.
NOTA: ExB 2 contém 1% de Triton X-100 para ajudar a romper os cloroplastos aberto e remova clorofila.
NOTA: Este passo ajuda a remover o detergente a partir da amostra.
NOTA: Estetampão contém SDS, para lisar os núcleos e libertar a cromatina.
CUIDADO! Certifique-se de usar equipamento de proteção durante a etapa de ultra-sons no caso de o dispositivo de ultra-som não está contido em um armário à prova de som.
Passo crucial! A fragmentação da cromatina depende em grande parte do equipamento de sonicação. As condições de sonicação deve ser ajustado para alcançar enriquecimento nos tamanhos de ADN apropriadas. VejoFigura 3 para um exemplo de como optimizar a fragmentação da cromatina.
Nota: As amostras podem ser congeladas e armazenadas a -20 ° C durante várias semanas.
4. A imunoprecipitação da proteína de interesse e Salvamento de ADN (1 dia, 3 h)
- Lavam-se as contas revestidas com o Ab a partir do passo 2.4 três vezes com 1 ml de tampão de diluição de chip para remover o excesso de anticorpo, tal como descrito na etapa 2.2. Ressuspender em 200 ul de tampão de diluição de chip. Adicionar 50 ul de isolado da cromatina. Incubar O / N numa roda rotativa, a 4 ° C.
Nota: Verifique o concentratina da cromatina em microvolume UV-Vis. 50 ul de isolado de cromatina deve conter mais do que 10 ug de ADN. - Para obter as etapas de trabalho 4,2-4,5 em 4 ° C. Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem de baixo de sal como descrito no passo 2.2.
- Lave as contas uma vez em 1 ml de tampão de lavagem de alta sal.
- Lave as contas uma vez em 1 ml de tampão de lavagem de LiCl.
- Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão TE. Após a última lavagem, certifique-se de remover totalmente o tampão TE deixado no tubo por aspiração com uma pipeta.
- Retire as amostras de entrada (passo 3.9). Transferência de 5 ul da entrada para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e continuar como com as amostras de aparas. Inverta a reticulação por adição de 200 ul de resina de permuta iónica quelante 5%, e incubar durante 10 min a 95 ° C, agitando a cada 2-3 minutos. Girar a 16.000 xg durante 30 seg e transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga por pipetagem.
NOTA: Enquanto o tranal método para a reticulação envolve a reversão de uma incubação de S / N com NaCl, a incubação com uma resina quelante de iões a 95 ° C permite a decrosslinking eficiente e eluição de ADN em 10 min, portanto, fazendo com que o protocolo de um dia curto. - Adicionar 2 mL de proteinase K (10 mg / ml) e incubar a 37 ° C durante 30 min para digerir proteínas e libertar o ADN.
- Parar a reacção por incubação a 95 ° C durante 10 min.
- Rapidamente girar a 16.000 xg durante 30 seg e transferir o sobrenadante para um novo tubo por pipetagem.
- Limpar o ADN isolado utilizando um kit de purificação de fragmentos de ADN padrão.
NOTA: Proceda de acordo com as instruções do fabricante. - Transferir a coluna de ligação ao ADN a partir do kit para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml. Elui-se o ADN purificado por meio de adição de 20 ul de água isenta de ADNase para o centro da coluna e centrifugação a 16.000 xg durante 60 seg. Pare ponto: As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C durante várias semanas. 5. Medição Abundância de Sítios de Ligação do DNA imunoprecipitada por qPCR (4 horas)
- Iniciadores do projeto para as regiões genômicas de interesse com uma temperatura de fusão (Tm) de 60 ° C e um teor de GC de 30% -80%. Como cromatina é fragmentado por ultra-sons, o comprimento da sequência amplificada não deve ser mais longo do que os nucleótidos 150-200 (Tabela 1).
NOTA: Uma ferramenta útil para desenho de primers é o programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Directrizes adicionais para o projeto cartilha estão disponíveis em relatórios anteriores 8, 14,15. - Use um programa BLAST para se certificar de que os iniciadores são específicos (especialmente promotores podem compartilhar sequências de ligação TF similar) e testar a eficiência usin cartilhag diluições 1:10 em água o ADN de entrada (passo 4.9). Certas regiões do genoma será purificado melhor do que outros. É, portanto, importante para conceber iniciadores de PCR e verificá-los sobre o ADN de entrada diluída.
- Dilui-se o ADN purificado a 1:10 com água e Pipetar 5 ul de ADN diluído em um tubo de PCR de cada reacção.
NOTA: Diluir apenas a quantidade necessária, como o DNA pode anexar às paredes dos tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento aumentar o número de moléculas de DNA ligados. Para cada par de primers, amplificação na entrada, Ab-chip e No-Ab chip tem de ser analisada. - Para completar a mistura de PCR, adicionar SYBR Green PCR master mix para uma concentração final de 1x, e 0,5 uM de cada iniciador. Encha até 20 l com água livre de DNase.
- Realizar a reacção qPCR seguindo as instruções do fabricante master mix SYBR Green PCR.
- A análise dos dados por um método de enriquecimento de dobra.
- Crie uma planilha com amostras nomes e valores Ct matérias que tenham sido obtidas após reação qPCR.
- Para cada amostra, a partir de subtrair o seu valor de Ct em bruto o valor Ct em bruto obtido para o controlo n-Ab correspondente. NOTA: Após esta operação matemática, o valor de Ct para a amostra No-Ab será igual a 0.
- Calcule o enriquecimento vezes por operação de exponenciação com base 2 e expoente (poder) igual ao restante negativa obtida na etapa 6.1.2 (Tabela 2).
enriquecimento vezes = 2 - (Ct (amostra) - Ct (No-Ab))
NOTA: Neste metod a abundância de um fragmento de ADN específico na amostra ChIP-ED é comparada com a abundância deste fragmento no controlo n-Ab. A suposição de que este método é o nível de sinal de fundo é reprodutível entre diferentes conjuntos de iniciadores, amostras, e replicar experiências. No entanto, esta níveis de sinal'noise' variam entre conjuntos de iniciadores, exemplos e experiências.
- A análise dos dados pelos% do método de entrada.
- Crie uma planilha com amostras nomes e valores Ct matérias que têm sido obtidos por eles após a reação qPCR.
- Ajustar valores Ct-primas para amostras de entrada por subtracção de um valor de base de logaritmo de 2 a partir da fracção de cromatina total extraído que foi tomado como uma entrada.
NOTA: Neste protocolo o valor subtraído é igual a 3,32, como 10% do total de cromatina foi tomada como uma entrada neste protocolo. Log 2 (10) é igual a 3,32. - Calcular% de entrada multiplicando por 100 o valor da operação de exponenciação com base 2 e expoente (potência) igual ao restante de valores de entrada a partir dos valores ajustados subtraídos matérias-Ct da amostra (Tabela 3).
% De entrada = 100 * 2 (input ajustado - Ct (amostra))
NOTA: Com este procedimento, a relação entre a abundância de ADN específica na amostra ChIP-ed ao total isolado da cromatina (amostra de entrada) é calculado. Mais detalhes sobre a análise de dados do chip pode ser encontrado em Haring et ai. 8.
NOTA: O DNA isolado a partir da cromatina precipitado tem que ser analisados para determinar quais os fragmentos de ADN ter sido ChIP-Ed do total de cromatina, devido à sua ligação à proteína de interesse.
Análise 6. Dados
NOTA: Entre os exno existentes formas de analisar os dados dos chips, dois são mais comumente usados. O primeiro deles é o método de enriquecimento de dobra, também denominada como "enriquecimento relativo", "sinal sobre o fundo" ou "em relação ao controlo sem anticorpo. O segundo método é nomeado como "% de entrada".
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Representative Results
Oito etapas principais podem ser apontados neste protocolo chip para a identificação de in vivo as interações proteína-ADN, incluindo cultivo e colheita de material vegetal, cross-linking da cromatina, o isolamento da cromatina, fragmentação da cromatina, isolamento selectivo dos complexos entre DNA e a proteína de interesse por imunoprecipitação, a digestão de proteínas, purificação de DNA, análise e qPCR (Figura 1). Um passo essencial no protocolo de chip é a fixação das interacções ADN-proteína numa reacção de reticulação. Tipicamente, formaldeído reticulação é utilizado na fábrica de chips. Formaldeído penetra o tecido e cria pontes de metileno entre grupos NH2 de proteínas ou proteínas e nucleótidos no ADN 1 6. Uma fixação eficiente de complexos nucleoproteicos in vivo exige que o formaldeído atinge a cromatina dentro de núcleos vegetais, e é essencial que o tecido vegetal é inteiramente submerso no tele tampão de formaldeído para assegurar que, durante a imunoprecipitação dos complexos de ADN-proteína são eficazmente puxado para baixo. Folhas de Arabidopsis são cobertos em camadas de cera que dificulta a penetração do agente de reticulação dentro das células. Além disso, tricomas favorecer a formação de bolhas de ar na superfície das folhas, a prevenção da solução de formaldeído de ficar dentro do tecido da planta. Para superar esta limitação, neste passo de vácuo é aplicado às amostras, impedindo a formação de bolhas na solução de fixação e melhorar a penetração de formaldeído nos núcleos de todas as células. As plântulas após o tratamento de reticulação eficiente são mostrados na Figura 2.
Outro passo chave no protocolo chip é cromatina corte. Grandes fragmentos de cromatina pode resultar em baixa resolução de mapeamento dos locais de ligação da proteína de interesse na sequência de ADN. Em contraste, fragmentos muito pequenos pode evitar a amplificação eficiente deo DNA ligado por qPCR. De acordo com a experiência empírica, a gama de tamanho de cromatina adequados para a análise ChIP deve situar-se entre 200 e 600 pb, e as condições para realizar a fragmentação apropriada da cromatina têm de ser ajustados em função do dispositivo de ultra-sons disponíveis no laboratório. A Figura 3 ilustra o procedimento para optimizar cromatina cisalhamento para atingir o máximo de enriquecimento na gama de tamanhos de ADN desejado. Antes de sonicação, cromatina consiste principalmente de grandes fragmentos. Um aumento do número de ciclos de sonicação reduz progressivamente o tamanho médio do DNA em amostras de aparas, atingindo o enriquecimento óptimo na gama de 200-600 pb depois de 20-30 ciclos (ponto 3.8 do protocolo e Figura 3).
Aqui, a identificação dos sítios a regiões reguladoras do integrador floral FT ligação às proteínas EBS é mostrado como um exemplo da utilidade da técnica de chip. A ligação de EBS para tele FT lócus foi desvendado através de ensaios de chip com linhas de Arabidopsis expressando uma proteína de fusão cMyc-EBS sob o controlo do promotor nativo EBS (BPEs :: cMyc-EBS). Esta versão marcado de EBS é totalmente funcional como mostra o fenótipo de tipo selvagem da EBS plantas mutantes que expressam esta construção. Foram identificadas quatro regiões no locus genómico de FT foram testados quanto à ligação EBS; um na região promotora do gene (FTII), dois em torno do local de início da transcrição (FTIV, FTVI), e um outro no primeiro intrão de FT (FTVII) (Figura 4A). Como mostrado na Figura 4B, os resultados demonstram que o ChIP EBS proteína pode ligar-se uma sequência reguladora perto do local de início da transcrição do gene mestre de floração FT 12. Além disso, a proteína EBS pode interagir tanto in vitro e in vivo com histona desacetilases tais como hda6, outra proteína relacionada com a cromatina envolvidos na regulaçãoda floração tempo em Arabidopsis 1 7. A fim de avaliar a possível influência da EBS sobre os níveis de acetilação das histonas na região genômica de FT, ensaios ChIP foram realizadas utilizando um anticorpo dirigido contra histona H3 acetilada em lisinas 9 e 14, uma marca de histona correlacionada com transcriptionally cromatina ativa 1 2 . Além disso, estes dados ilustram como abordagens chip pode contribuir para lançar luz sobre os mecanismos moleculares que modulam a regulação da transcrição de processos de desenvolvimento da planta.
Figura 1. Esquema da imunoprecipitação da cromatina protocolo. Chip é uma técnica comumente usada para investigar as interações entre proteínas e DNA, fixos por um composto químico. Cromatina com interacções preservada é isolado a partir dos núcleos e fragmentado. Ao utilizar anticorpos contra a proteína de interesse,podemos selecionar fragmentos de DNA ligadas a ele. O anticorpo está conjugado com esferas magnéticas que permitem o isolamento rápido e simples usando uma cremalheira magnética. Na etapa seguinte, as proteínas são removidas por tratamento com proteinase e é libertado do ADN. Os fragmentos de ADN purificados são então usados como modelos em reações de qPCR para medir a sua abundância relativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplo de um tecido após a ligação cruzada com formaldeído. A fim de investigar interacções entre proteína e ADN, em complexos in vivo tem que ser fixada para torná-los estáveis e duráveis através dos vários passos do protocolo. Nesta versão do protocolo, a fixação ocorre por tratamento com formaldeído. Penetração eficiente de formaldeído thrOugh o tecido é crucial para o sucesso do método de chip. (A) antes do passo de reticulação, o material vegetal flutua na superfície da solução e é coberta com pequenas bolhas de ar; as superfícies abaxial e adaxial das folhas diferem na cor. (B) Após a fixação, as plântulas devem ser visivelmente embebido na solução, ligeiramente transparente, e uniformemente imersos na solução de reticulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Optimização das condições de sonicação para análise de chip. Cromatina isolada a partir de material fixo consiste em ampla gama de comprimentos de fragmentos com uma forte banda na superfície do gel, representando tamanhos cromatina extremamente longos (segunda linha do lado esquerdo). Com aumencante número de ciclos de sonicação, o pico da cromatina tamanhos fragmentos é deslocado para fragmentos menores. No experimento mostrado, os números ciclo óptimo variam entre 20 e 30 anos, após o qual os fragmentos de cromatina ótimas variando de 200 a 600 pb são mais abundantes na amostra de chip. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. ChIP análises mostram que a EBS se liga FT e EBS mutações alteram o nível de histona H3 acetilação neste gene integrador floral. (A) região do genoma do FT com caixas pretas representam exons. Quatro fragmentos abrangendo regiões reguladoras deste gene integrador florais foram testados (cinzentocaixas) por projetar primers específicos. qPCR (B) EBS se liga a região do FT IV, localizado perto do local de início da transcrição. Myc-EBS corresponde a EBS plantas mutantes expressando a versão cMyc marcadas da EBS; Myc indica plantas transgénicas que expressam o epitopo não cMyc fundida a qualquer gene de Arabidopsis. (C) EBS plantas mutantes exibir maior abundância de H3K9,14Ac de tipo selvagem Landsberg erecta (L er) em todas as quatro regiões FT avaliados. As barras de erro mostram o desvio padrão (B e C). Modificado de dados publicados anteriormente na célula vegetal 1 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Para a frente | Reverso | Região testado |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tabela 1. Iniciadores utilizados neste estudo.
| Amostra | Valores Raw Ct | Ct-Ct (No-Ab) | Enriquecimento Fold 2 - (Ct (amostra) - Ct (No-Ab)) |
| N-Ab | 34,5 | 0 | 1 |
| Ab | -5.3 | 39,4 |
Tabela 2. Exemplo de análise de dados do chip por um método de enriquecimento "dobra". Os valores Ct para Não-AB amostras representam o sinal de fundo causada por ligação inespecífica de DNA para as esferas magnéticas AB /. Estes valores Ct deve exceder 30. A diferença entre os valores de Ct de n-Ab e Ac amostra deve ser maior do que 1.
| Passo 1 - Ajuste a entrada | |||
| Entrada ajustado = Raw Ct (entrada) - Log 2 (fração de cromatina total) | |||
| Raw Ct | entrada de cromatina total de | Log 2 10 | |
| Entrada | 29,5 | 10% | 3.32 |
| Entrada ajustado = 29,5-3,32 = 26,18 | |||
| Passo 2 -% de cálculos de entrada | |||
| Amostra | Raw Ct | Ct (entrada ajustado) -Ct (amostra) | 2 Ct (entrada ajustado) -Ct (amostra) * 100% |
| Entrada | 26,18 | ||
| ChIP-Ab | 31,45 | -5,27 | 2.59 |
| N-Ab | 34,5 | -8,32 | 0,31 |
Tabela 3. Exemplo de análise de dados do chip por "% de entrada" método. As entradas representam a cromatina reticulado total isolado a partir de núcleos, de modo que os valores de Ct devem ser iguais para todos os pares de iniciadores. Convencionalmente, 5% ou 10% do total de cromatina é tomado como uma entrada. No-Ab representa uma amostra de controlo negativa - as pérolas não revestidas por anticorpos específicos contra a proteína ou tag de interest. ChIP-Ab representa a amostra, após a imunoprecipitação com os anticorpos contra a proteína ou etiqueta de interesse.
| PBS 10x |
| 1,3 M de NaCl |
| 30 mM de Na 2 HPO 4 |
| 30 mM de NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Tampão de extracção 1 (ExB 1) |
| 0,4 M de sacarose |
| 10 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| 10 mM de MgCl |
| 5 mM β-mercaptoetanol |
| Os inibidores de protease |
| Tampão de extracção 2 (ExB 2) |
| 0,25 M de sacarose |
| 10 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| 10 mM de MgCl2 |
| 1% de Triton X-100 </ td> |
| 5 mM β-mercaptoetanol |
| Os inibidores de protease |
| Tampão de extracção 3 (ExB 3) |
| 1,7 M de sacarose |
| 10 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| 0,15% de Triton X-100 |
| 2 mM de MgCl2 |
| 5 mM β-mercaptoetanol |
| Os inibidores de protease |
| Tampão de sonicação |
| 50 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| 10 mM de EDTA |
| SDS a 1% |
| Os inibidores de protease |
| Tampão de diluição ChIP |
| 1,1% de Triton X-100 |
| EDTA 1,2 mM |
| 16,7 mM Tris-HCl pH 8 |
| NaCl 167 mM |
| Os inibidores de protease |
| Tampão de sal Baixo |
| 150 mM de NaCl |
| 0,1% de SDS |
| 1% de Triton X-100 |
| 2 mM de EDTA |
| 20 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| Tampão de lavagem de alta Sal |
| 500 mM de NaCl |
| 0,1% de SDS |
| 1% de Triton X-100 |
| 2 mM de EDTA |
| 20 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| Tampão LiCl Wash |
| 0,25 M de LiCl |
| 1% de NP-40 |
| Desoxicolato de sódio a 1% |
| 1 mM de EDTA |
| 10 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| 10 mM de Tris-HCl a pH 8 |
| 1 mM de EDTA |
Tabela 4. composição do tampão.
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Discussion
O protocolo aqui descrito ChIP é uma técnica poderosa e reprodutível para analisar interacções entre proteínas e sequências específicas de ADN in vivo em plantas de Arabidopsis. A identificação bem sucedida de sítios de ligação para as proteínas de interesse requer uma seleção adequada de órgãos vegetais ou estágios de desenvolvimento, onde as interações relevantes estão realmente ocorrendo. Além disso, é essencial para se obter uma fixação adequada do material de planta e um corte óptimo da cromatina por sonicação. Anticorpos altamente específico para a imunoprecipitação eficaz de proteína / marca seleccionada também são essenciais.
O uso de abordagens chip em plantas enfrenta algumas dificuldades relacionadas com a presença de metabólitos secundários e paredes celulares que potencialmente podem interferir com diferentes etapas do protocolo. Além disso, a complexidade dos órgãos das plantas, contendo frequentemente vários tipos de células em que a proteína de ligação de ADN de interest pode ser diferencialmente presente ou ativo, têm impedido a utilização dessa metodologia. Por esse motivo, sempre que possível, é mais vantajoso utilizar em abordagens ChIP tecidos homogéneas em que a presença e / ou actividade da proteína de interesse já foram demonstrados. Materiais vegetais complexo contendo tecidos diferentes tendem a causar uma diluição dos tipos de células em que as funções da proteína realmente. Tecido de corte 2 0 têm sido utilizados em plantas para estudos em tecidos ou tipos celulares individuais. No entanto, durante os últimos anos, diversos procedimentos foram desenvolvidos para o isolamento de cromatina específico do tipo celular em Arabidopsis 8 para uma gama de fragmentos óptima (ver secção resultados representativos) 7. Como discutido acima, as condições para realizar esta distribuição de tamanho muito dependem do equipamento de ultra-som específico utilizado. Em qualquer caso, a cromatina deve ser mantida a baixa temperatura para impedir a inversão da reticulação favorecidapelo calor gerado durante a sonicação. O dispositivo de ultra-sons de escolha deve proporcionar um bom nível de reprodutibilidade, que em conjunto com as condições óptimas de fragmentação, é essencial para a análise de chip (Figura 3).
Outro factor chave no sucesso experiências ChIP o anticorpo é escolhido por imunoprecipitação da proteína de interesse. Os anticorpos produzidos contra os fatores de transcrição planta pode ser útil para a análise de chip, mas estes soros devem ser exaustivamente testados porque os anticorpos verificados em experimentos de Western blot não são necessariamente válidos para Chip. Além disso, os anticorpos produzidos contra diferentes marcas são frequentemente utilizadas para este protocolo. ChIP-anticorpos que reconhecem especificamente um grau de variedade de etiquetas estão disponíveis comercialmente, e tem a vantagem de que eles foram testados em vários laboratórios. A desvantagem para a utilização destes anticorpos comerciais é que a proteína de interesse tem de ser fundido com o correspondente epítopoe expressa em linhas transgénicas (Figura 4B). Neste caso, é aconselhável assegurar que a proteína quimérica é funcional por meio da geração de Arabidopsis linhas transgénicas que ostentam a proteína de fusão num fundo genético deficiente no gene que codifica a proteína de interesse. A complementação das anormalidades fenotípicas da linha mutante nas plantas transgénicas confirmará que a proteína de fusão retém a actividade normal da proteína endógena. Quando as linhas transgénicas são produzidas para identificar os locais de ligação dos reguladores de transcrição, é preferível utilizar o promotor endógeno de dirigir a expressão da proteína marcada, evitando os problemas associados com a utilização de promotores constitutivos fortes (ver acima). Os anticorpos específicos para modificações pós-traducionais de histonas como a metilação ou acetilação de resíduos específicos também são usados com freqüência em Chip análises para determinar as paisagens epigenômicos de genes envolvidos noregulação de um número de processos de desenvolvimento, incluindo o controlo da época de floração (Figura 4C). Tal como para os anticorpos contra a tag, anticorpos comerciais Chip-classe são a opção preferida no caso de marcas de histonas.
Abordagens experimentais ChIP acoplados a expressão do gene análises têm sido fundamentais para aumentar o nosso conhecimento sobre como fatores de transcrição, proteínas cromatina remodelação e modificações covalentes das histonas modular a expressão de genes envolvidos na regulação de processos biológicos vegetais e respostas. Inicialmente desenvolvido como um método para analisar a interação das proteínas presentes na cromatina com determinadas regiões loci ou de genes, a explosão de recursos genómicos e tecnologia NGS tem permitido chip para tornar-se uma ferramenta poderosa para a criação de perfis de todo o genoma de proteínas de ligação de ADN tais como fatores de transcrição ou histonas modificadas e variantes de histonas. ChIP-chip e chip-seq ter fornecido uma nova dimen mundialsion para as análises de interações entre proteínas e DNA de cromatina em Arabidopsis 2 5. Abordagens chip SEQ são considerados a alternativa de escolha para lascar-chip, que é baseado em matrizes de hibridação e introduz algumas polarização, dado que estas matrizes contêm um número limitado de sondas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
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