Summary
Иммунопреципитации хроматина является мощным средством для идентификации ДНК сайтов связывания белков Arabidopsis в естественных условиях. Это процедура включает в себя хроматина сшивание и фрагментации, иммунопреципитацию с селективными антител против белка интереса, и КПЦР анализ связанного ДНК. Мы опишем простой ChIP анализа, оптимизированный для Arabidopsis растений.
Introduction
В последние годы целый ряд генетических, молекулярных и геномных инструментов были разработаны в модельных видов Arabidopsis THALIANA. Эта технология способствовала чрезвычайно прогресс в понимании того, как развитие растений регулируется. Среди изучаемых процессов развития с помощью арабидопсиса в качестве модели, генетического контроля времени цветения широко проанализированы. Эти исследования показали, что растения модулировать очень точно время цветения в ответ на эндогенные сигналы, такие как гормоны и возраста растения, а также охраны окружающей среды сигналов, таких как фотопериода и температуры, которые синхронизируют цветущих время с естественным циклом времен года 1, 2. Выделение и характеристика мутантов Arabidopsis с изменениями в пору цветения был определяющим в раскрытии сложную сеть генов, которые регулируют время цветения в ответ на эндогенные и экологических факторов. Эти генетические схемы являютсяинтегрированы на уровне нескольких мастер-генов, которые действуют как переключатели цветения, а точные сроки начала цветочным зависит от баланса цветения поощрения и подавляя деятельность, которые работают вверх цветочных генов интеграторов 1,3.
Функциональная характеристика генов, идентифицированных за их роль в контроле цветения начала, опираясь на недавно использования геномных подходов, выявили центральную роль в регуляции транскрипции модуляции времени цветения. В самом деле, многие из мастер-генов цветения кодирования факторов транскрипции 4. Кроме того, ряд хроматина белковых комплексов влиять на экспрессию генов мастер цветения. Ряд Arabidopsis мутантов, выделенных для их измененной время цветения оказалось проводить мутации в генах, кодирующих различные модификаторы хроматина. Различные ремонтом хроматина, которые вводят посттрансляционные изменения в гистонае хвосты, изменить нуклеосом относительно ДНК или обменять канонические гистоны вариантами гистонов необходимы для надлежащего регулирования цветения Arabidopsis 5,6. Некоторые из этих хроматина деятельности ремоделирования катализировать осаждение или удаление ковалентных модификаций, таких как ацетилирование или метилирование гистонов в определенных остатков. Эти знаки гистонов специально признаны специализированных эффекторов, которые вербуют других хроматина комплексов, транскрипционные факторы или компоненты транскрипционного аппарата, чтобы регулировать транскрипционную активность генов цветения.
Иммунопреципитации хроматина (чип) позволяет идентифицировать в естественных условиях ДНК-сайтов связывания белков, представляющих интерес (рис 1). Эта процедура использует способности некоторых химических веществ для сшивания белков с ДНК. Полученные ДНК-белковые комплексы могут быть затем иммунопреципитировали с помощью специфических антител агаINST транскрипционные факторы, хроматин-связывающие белки, или конкретные модификации и гетерологичные эпитопы (как правило, называют "тегов"), присоединенный к белку выбора. ДНК очищают от этих иммуноосажденными может быть использован в качестве матрицы в ПЦР количественной (КПЦР) для оценки реакций для обогащения конкретных последовательностей, представляющих интерес. Таким образом, сайты связывания транскрипционных факторов или распределение гистоновых меток в определенных генов может быть установлено 7,8. Кроме того, в сочетании с нового поколения Секвенирование (NGS), что позволяет массовые параллельные последовательности, чип технология сделала возможным генома идентификации сайтов связывания транскрипционных факторов, а также открытие эпигеномном ландшафтов модификации гистонов. Кроме того, одновременный анализ экспрессии генов позволяет контролировать, как связывание транскрипционных регуляторов или отложение отдельных гистоновых меток коррелирует с транскрипционной деятельноти генов 9.
Использование протоколов чип в Arabidopsis позволило оценить влияние, которое различные транскрипционные регуляторы на организации хроматина мастер генов цветения и как эти структурные изменения влиять на экспрессию генов 5,6. Предыдущие результаты показали, что Arabidopsis локус РАНЬШЕ БОЛТЫ В короткие дни (EBS) действует как репрессор цветения и мутанты в этом гена шоу ускорение цветения и регуляция мастер гена цветения FT. Кроме того, с потерей функции мутации в FT полностью подавить раннее цветение фенотип EBS мутантных растений, что указывает FT требуется для преждевременного цветения EBS мутантов и что EBS является необходимым для подавления этого мастер гена цветения 10 11. EBS кодирует PHD-белок, содержащий, которые могут специфически связываться гистона H3 ди- и trimethylated в гое лизин 4 Остаток (H3K4me2 / 3), что свидетельствует о роли EBS в хроматина опосредованной репрессии FT 12. Использование подхода ChIP показали, что Arabidopsis PHD-белок, содержащий EBS 10,11 связывается регуляторных областей генов цветочной интегратор FT подавить выражение 12. Дополнительные данные, полученные путем использования чиповых технологий показали, что этот белок необходим для поддержания низких уровней ацетилирования гистонов, отличительной чертой активной транскрипции, в хроматина этого гена мастер цветения на начальных этапах развития Arabidopsis. Эти наблюдения, вместе с данными генетических и экспрессии гена, показывают, что это Arabidopsis PHD-содержащий белок играет центральную роль в тонкой настройке времени цветения путем модуляции экспрессии гена цветочные интегратора FT 12. Работа, представленная здесь обеспечивает оптимизированную метод полезен не только для анализа гистонов, но и для другойхроматина белков, ассоциированных и с повышенной эффективностью и уменьшить время эксперимента. Кроме того, в этом докладе показано, как использование протоколов чип новое понимание в отношениях между изменениями в модификации хроматина и транскрипционных состояний генов растений, и как эти хроматина опосредованной механизмов воздействия контроля экспрессии генов на возникновение цветения арабидопсиса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сшивание растительного материала (1 час)
- Расти Arabidopsis линии, используемые в эксперименте (дикого типа - WT - против мутантов, и / или линии, экспрессирующие с тегами версию своего белка интереса в сравнении с линий, выражающих тег не слит с любого белка) в течение 12-18 дней на больших чашках Петри (150 мм) с МС-агар (1 л: 1x Murashige & Скоог солей, 10 г сахарозы, 0,5 г MES, рН 5,7 (KOH), 1% агара). Кроме того, выращивать растения на горшках, содержащих 3: 1 смесь почвы и вермикулита.
ВНИМАНИЕ! Формальдегид токсичен при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании, и должны быть обработаны в химической капотом носить соответствующие средства индивидуальной защиты. Шаги 1.2 - 1.6 должны быть выполнены в соответствии с вытяжкой. - Сделать маленькие отверстия в крышке 50 мл пробирки с лабораторной горелки с подогревом иглы. Добавить 40 мл PBS буфера 1x и 1,08 мл формальдегида в конечной концентрации 1% (37% акций сспособность по). Соберите 1,5 г растительного сырья в этих 50 мл пробирки. Держите труб на льду во время сшивания.
- Закрыть 50 мл трубки с крышкой. Место труб в эксикаторе и применять вакуум. Вакуумный проникнуть в ткань в течение 10 мин, затем осторожно освободить вакуум, чтобы предотвратить вспенивание до раствора. Смешайте образец. Повторите дважды. После инфильтрации, наблюдать растительный материал и подтвердить, что он становится слегка прозрачным и, как правило, опускаются на дно пробирки (Рис.2).
- Добавить 2,5 мл 2 М глицин до конечной концентрации 0,125 М Применить вакуум в течение 5 мин. Глицин действует как конкурентный ингибитор формальдегида сшивки.
- Отменить формальдегида раствор глицина PBS путем инвертирования закрытой трубке 50 мл с отверстиями в крышке.
- Промыть ростки дважды 1x PBS и один раз водой отбрасывания моющий раствор, как описано на стадии 1.5. Высушите их на бумажное полотенце и заморозить в жидком nitrogeп.
Примечание: Замороженную ткань может храниться при -80 ° C в течение нескольких недель.
2. Подготовка антител (1 день)
Примечание: Для иммунопреципитации, использование магнитных шариков конъюгированных с антителами с помощью белка G или белком линкер с высоким сродством к константным доменом тяжелой цепи антитела рекомендуется. ДНК-белковые комплексы можно прикрепить к неспецифически поверхности шариков-конъюгатов антител. По этой причине, необходимо выполнить элементы управления без специфических антител для количественного определения неспецифического связывания фон.
- Для каждого иммунопреципитации, подготовить 15 мкл магнитных шариков в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Количество бисера зависит от количества хроматина, используемого для иммунопреципитации, а также на антитела.
- Для мытья, добавить 1 мл иммунопреципитации хроматина (чип) буфера для разведения с шариками, перемешать и поставить вращения микроцентрифужной 1,5 мл втбыть в магнитном стойки. Подождите около 1 мин, чтобы шарики приложить к магниту. С 1,5 мл микропробирок еще в стойке, удалить супернатант с помощью пипетки. Повторите дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой линии растений два комплекта иммунопреципитации необходимы: один с бисером и антител (Ab) и второй не антитела (No-Ab) контроля только с магнитных шариков. - Ресуспендируют бисером в 200 мкл буфера для разведения чип. Добавить требуемое количество конкретного Ab к одному из двух трубок, полученных для каждой линии растений (точное разбавление отличается для каждого Ab и должен быть оптимизирован экспериментально или, в случае коммерческих антител, следуя инструкциям производителя). Используйте этот образец для иммунопреципитации. Добавить такое же количество неспецифического IgG к другой трубе, которая будет использоваться в качестве отрицательного контроля.
- Инкубируйте O / N на вращающемся колесе при 4 ° С, чтобы антитело приложить к шарикам.
3. хроматина Добыча (4 ч)
Примечание: На этом этапе, ядра и все органеллы будет осаждения. ExB 1 содержит достаточное количество сахарозы, чтобы обеспечить высокую плотность и предотвращать нарушение структуры органелл.
ПРИМЕЧАНИЕ: ExB 2 содержит 1% Тритон Х-100, чтобы помочь разорвать хлоропласты открыть и снять хлорофилл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг поможет удаление моющего средства из образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: ЭтоБуфер содержит SDS, чтобы лизировать ядра и отпустите хроматина.
ВНИМАНИЕ! Убедитесь, что защита от износа оборудования уха во время стадии обработки ультразвуком в случае ультразвуковой прибор не содержится в звуконепроницаемой кабинета.
Решающий шаг! Фрагментации хроматина во многом зависит от обработки ультразвуком оборудования. Условия обработки ультразвуком должны быть скорректированы, чтобы достичь обогащения в соответствующих размеров ДНК. ВидетьРисунок 3 для примера о том, как оптимизировать фрагментацию хроматина.
Примечание: Образцы могут быть заморожены и хранили при -20 ° C в течение нескольких недель.
4. Иммунопреципитация интерес белка и спасания ДНК (1 день, 3 часа)
- Вымойте бисером покрытием с Ab с шага 2.4 в три раза с 1 мл буфера для разведения ChIP, чтобы удалить излишки антитела, как описано в шаге 2.2. Ресуспендируют в 200 мкл буфера для разведения чипе. Добавить 50 мкл изолированной хроматина. Инкубируйте O / N на вращающемся колесе при 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте Концентрацна хроматина в микрообъема UV-VIS спектрофотометр. 50 мкл выделенной хроматина должны содержать более 10 мкг ДНК. - Для этапах 4,2-4,5 работы в 4 ° C. Вымойте бисером дважды в 1 мл низким содержанием соли промывочного буфера, как описано в шаге 2.2.
- Вымойте бисером раз в 1 мл Высокая Солт промывочного буфера.
- Вымойте бисером раз в 1 мл LiCl промывочный буфер.
- Промыть шарики дважды в 1 мл ТЕ-буфера. После последней промывки, убедитесь, что полностью удалить буфер TE влево в трубке аспирации с помощью пипетки.
- Выньте образцы вход (шаг 3.9). Передача 5 мкл вход, к новым 1,5 мл микроцентрифужных трубки и продолжают, как с образцами чипе. Обратный сшивки путем добавления 200 мкл 5% смолой хелатирующего иона, и инкубируют в течение 10 мин при 95 ° С встряхивая каждые 2-3 мин. Спин вниз при 16000 мкг в течение 30 сек и тщательно передачи супернатант в новую пробирку микроцентрифужных с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как траНАЯ способ сшивания разворот включает в себя O / N инкубации с NaCl, инкубации с хелатирующим ионообменной смолы при 95 ° С позволяет эффективно decrosslinking и элюирование ДНК в 10 мин, поэтому делает протокол один день короче. - Добавьте 2 мкл протеиназы К (10 мг / мл) и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин, чтобы переварить белки и освободить ДНК.
- Остановка реакции путем инкубации при 95 ° С в течение 10 мин.
- Быстро спина при 16000 мкг в течение 30 сек и передавать супернатант в новую пробирку пипеткой.
- Очистка ДНК, выделенную с помощью стандартного ДНК-фрагментов набора для очистки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Действовать в соответствии с инструкциями изготовителя. - Передача связывания колонку ДНК из комплекта к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Элюции очищенной ДНК добавлением 20 мкл ДНКазы без воды в центре колонны и вращается со скоростью 16000 мкг в течение 60 сек. Остановка точку: Образцы могут храниться при температуре -80 ° С в течение нескольких недель. 5. Измерение Изобилие сайтов связывания в Иммунопреципитированные ДНК от кПЦР (4 ч)
- Дизайн праймеров для геномных областей, представляющих интерес с температурой плавления (Tm) 60 ° С, и содержание GC 30% -80%. В хроматин фрагментирован с помощью ультразвука, длина последовательности не усиленного должно быть больше, чем 150-200 нуклеотидов (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: полезный инструмент для проектирования грунтовка Грунтовка Программа 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Дополнительные руководящие принципы для дизайна грунтовки доступны в предыдущих докладах 8, 14,15. - Используйте программу BLAST, чтобы убедиться, что праймеры специфичны (особенно промоторы могут использовать аналогичные связывания ТФ последовательностей) и проверить USIN эффективности грунтовкиг 1:10 разведения в воде входного ДНК (шаг 4.9). Некоторые области генома будет очищен лучше, чем другие. Поэтому важно разработать ПЦР-праймеров и проверить их на разбавленную входного ДНК.
- Развести очищенную ДНК 1:10 водой и пипеткой 5 мкл разбавленного ДНК в ПЦР-пробирку для каждой реакции.
Примечание: Развести только количество, требуемое, а ДНК можно присоединить к стенкам 1,5 мл микроцентрифужных пробирках. Многократного оттаивания-замораживания циклов увеличить количество присоединенных молекул ДНК. Для каждого пары праймеров, усиления на входе, Аб-чип и нет-Ab чип должен быть проанализированы. - Для завершения смесь ПЦР, добавьте SYBR Green Master Mix ПЦР до конечной концентрации 1х и 0,5 мкМ каждого праймера. Заполните до 20 мкл с ДНКазы без воды.
- Выполните реакцию КПЦР, следуя инструкциям производителя мастер смеси SYBR Green ПЦР.
- Анализ данных по кратным методом обогащения.
- Создать таблицу с образцами имен и значений Ct сырья, которые были получены после реакции КПЦР.
- Для каждого образца, вычитают из его сырой значение КТ необработанное значение Ct, полученного по соответствующим контролем Нет-Ab. ПРИМЕЧАНИЕ: После этой математической операции, значение Ct для образца Нет-Ab будет равняться 0.
- Рассчитать кратное обогащение операции возведения в базе 2 и экспоненты (мощности), равную отрицательной остатка, полученного на стадии 6.1.2 (таблица 2).
кратное обогащение = 2 - (Ct (образец) - Ct (Нет-Ab))
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом метод обилие конкретного фрагмента ДНК в образце чип-е изд сравнивается с обилием этого фрагмента в управлении Нет-Ab. Предположение этого метода состоит в том, что уровень фонового сигнала воспроизводима между различными наборов праймеров, образцы, и репликации экспериментов. Тем не менее, это'noise' уровни сигналов действительно изменяются между наборами праймеров, образцов и экспериментов.
- Анализ данных по% от метода ввода.
- Создать таблицу с образцами имен и значений Ct сырья, которые были получены для них после реакции КПЦР.
- Отрегулируйте значения Ct сырье для входных выборок путем вычитания значения логарифма 2 от фракции всего добываемого хроматина, который был взят в качестве входных данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе вычитается величина равна 3.32, а был взят в качестве вклада в этом протоколе 10% от общего хроматина. Вход 2 (10) равна 3,32. - Рассчитать% ввода путем умножения на 100 значение работы возведения с база 2 и показатель (мощности) равна оставшейся части скорректированных значений входных вычитается из сырых значений Ct образца (Таблица 3).
В% от исходного = 100 * 2 (скорректированная вход - Ct (образец))
Примечание: С помощью этой процедуры, соотношение между специфической ДНК изобилии в образце чип-е изд к общему изолированные хроматина (входной выборки) рассчитывается. Более подробная информация о анализа данных чип может быть найден в Хэринга соавт. 8.
Примечание: ДНК, выделенную из осажденного хроматина должна быть проанализирована, чтобы определить, какие ДНК фрагменты были чип-е изд от общего хроматина, из-за его связывания с представляющим интерес белком.
Анализ 6. Данные
ПРИМЕЧАНИЕ: Среди эксстатки способы анализа Чип данные, два наиболее часто используемых. Первый из них является метод обогащения раза, также названный как «относительное обогащение», «сигнала над фоном" или "по сравнению с контролем не-антитела». Второй метод назван как "% ввода".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Восемь основных шагов можно выделить в этом протоколе чип для идентификации в естественных условиях взаимодействия белок-ДНК, в том числе растет и уборки растительного материала, сшивания хроматина, хроматина изоляции, фрагментации хроматина, селективного выделения комплексов между ДНК и интересующий белок иммунопреципитацией, переваривания белков, ДНК, очистки и анализа КПЦР (рис 1). Важнейшим шагом в протоколе чип фиксация ДНК-белковых взаимодействий в реакции сшивания. Как правило, формальдегид сшивка используется в растений чипе. Формальдегид проникает в ткань и создает метиленовых мостиков между NH 2 группами белков или белков и нуклеотидов в ДНК 1 6. Эффективный фиксация нуклеопротеидных комплексов в естественных условиях требует формальдегида достигает хроматина внутри ядра растений, и это очень важно, чтобы ткань растения полностью погружены в тон формальдегида буфер для того, чтобы во время иммунопреципитации комплексов белок-ДНК эффективно снесены. Arabidopsis листья покрыты воском слоев, которые труднее проницаемость сшивающего агента в клетки. Кроме того, Трихомы благоприятствуют образованию воздушных пузырьков на поверхности листьев, предотвращая раствор формальдегида не попала внутрь из растительной ткани. Чтобы преодолеть это ограничение, в этом шаге вакуум к образцам, предотвращая образование пузырьков в фиксирующем растворе и улучшения проникновения формальдегида в ядрах всех клеток. Саженцы после эффективного сшивающего лечения показаны на рисунке 2.
Другим ключевым шагом в протоколе чип хроматина стрижки. Большие фрагменты хроматина может привести к низкой отображения сайты связывания белка, представляющего интерес в последовательности ДНК разрешением. В противоположность этому, очень маленькие фрагменты могут предотвратить эффективное усилениесвязанный ДНК с помощью количественной ПЦР. По эмпирического опыта, оптимальный хроматина диапазон размеров для анализа чип должен быть между 200 и 600 п.о., а также условия для достижения соответствующего фрагментации хроматина должны быть установлены в зависимости от обработки ультразвуком устройства, доступного в лаборатории. 3 иллюстрирует Процедура оптимизации хроматина сдвиг для достижения максимального обогащения в нужном диапазоне размеров ДНК. Перед обработкой ультразвуком, хроматина в основном состоит из очень крупных фрагментов. Увеличение числа циклов обработки ультразвуком постепенно уменьшает средний размер ДНК в образцах чип, достигнув оптимального обогащения в диапазоне 200-600 б.п. из 20-30 циклов, после раздела 3.8 (протокола и рисунок 3).
Здесь идентификация EBS белка связывания для регуляторных областей цветочной интегратора FT показано в качестве примера полезности техники чипе. Связывание EBS Тон FT локус разгадали через ChIP анализов с Arabidopsis линий, выражающих CMYC-EBS слитый белок под контролем промотора родной EBS (УИБ :: CMYC-EBS). Это помечено версия EBS полностью функционален, как показано на дикого типа фенотипа EBS мутантных растений, экспрессирующих эту конструкцию. Четыре региона в рамках геномной FT локуса были протестированы на связывание EBS; один в промоторной области гена (FTII), два вокруг сайта инициации транскрипции (FTIV, FTVI), и еще один в первом интроне FT (FTVII) (фиг.4А). Как показано на фиг.4В, результаты показывают, что ChIP белок EBS может связываться регуляторную последовательность близко к сайт начала транскрипции мастер гена цветения FT 12. Кроме того, белок может взаимодействовать EBS как в пробирке и в естественных условиях с гистондезацетилаз, таких как HDA6, другой хроматина, связанных белка, участвующего в регуляциицветения время в Arabidopsis 1 7. Для того чтобы оценить возможное влияние EBS на уровни ацетилирования гистонов в геномной области FT, Чип анализы проводили с использованием антитела, направленные против гистона H3 ацетилированного, в лизина 9 и 14, гистонов знак коррелирует с транскрипционно активного хроматина 1 2 , Кроме того, эти данные показывают, как ChIP подходы могут способствовать, чтобы пролить свет на молекулярные механизмы, которые модулируют регуляции транскрипции растений процессов развития.
Рисунок 1. Схема хроматина Иммунопреципитация протокол. Чип техника широко используется для изучения взаимодействий между белками и ДНК, фиксированных с помощью химического соединения. Хроматина с сохранившимися взаимодействий изолирован от ядер и фрагментированной. При использовании антитела против белка, представляющего интерес,можно выбрать фрагменты ДНК, присоединенные к ней. Антитело конъюгируют с использованием магнитных шариков, которые позволяют быстро и просто выделение с помощью магнитной стойки. На следующем этапе, белки удаляются путем обработки протеиназой и ДНК высвобождается. Очищенные фрагменты ДНК затем использовали в качестве матриц в КПЦР реакции для оценки их относительной численности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Пример ткани после сшивания с формальдегидом. Для того чтобы исследовать взаимодействие между ДНК и белка, в естественных комплексов должны быть установлены, чтобы сделать их стабильный и прочный через несколько стадий протокола. В этой версии протокола, фиксация происходит с помощью обработки формальдегидом. Эффективное проникновение формальдегида Thrух ткань имеет решающее значение для успеха метода чип. (А) до сшивки растительный материал плавает на поверхности раствора и покрыта мелкими пузырьками воздуха; абаксиальной и адаксиальная поверхности листьев отличаются по цвету. (B) После фиксации, проростки должны быть явно замачивают в растворе, слегка прозрачный, и равномерно погружаются в сшивания решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. оптимизации условий ультразвуком в течение анализа чипа. Хроматина изолированы от фиксированной материала состоит из широкого спектра длин фрагментов с сильной полосы в верхней части геля, представляющего чрезвычайно длинные размеры хроматина (вторая строка слева). С increaпеть количество циклов обработки ультразвуком, пик хроматина фрагменты размеров сдвигается в сторону меньших фрагментов. В эксперименте, показанном оптимальные цифры цикла различаются между 20 и 30, после чего оптимальные хроматина фрагменты, начиная от 200 до 600 б.п., более богатые в образце чип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. чип анализы показывают, что EBS связывает FT и EBS мутации изменяют уровень ацетилирования гистонов H3 в этом цветочным гена интегратора. (А) геномная область FT с черных ящиков, представляющих экзонов. Четыре фрагменты, охватывающие регуляторные участки этого гена цветочным интегратора были испытаны (серыйящики) по разработке специфических праймеров КПЦР. (B), EBS связывает регион FT IV, расположенный рядом с сайтом начала транскрипции. Мус-EBS соответствует EBS мутантных растений выражения CMYC метками версию EBS; Мус обозначает трансгенные растения, экспрессирующие эпитоп CMYC не слит с любой гена Arabidopsis. (С) EBS мутантные растения демонстрируют более обилие H3K9,14Ac чем дикого типа Ландсберг Erecta (L ER) во всех четырех регионах ФТ начисленных. Столбики ошибок показывают стандартное отклонение (В и С). Измененный ранее опубликованных данных в ячейке завод 1 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Вперед | Задний ход | Регион испытания |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT В.И. |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Таблица 1. Праймеры, используемые в данном исследовании.
| Образец | Сырье Ct значения | Не Ct-Ct (No-Ab) | Кратное обогащение 2 - (Ct (образец) - Ct (Нет-Ab)) |
| Нет, Аб | 34,5 | 0 | 1 |
| Аб | -5.3 | 39,4 |
Таблица 2. Пример анализа данных чипа "кратное обогащение" метод. Ct значения для NO-Ab образцов представляют собой фоновый сигнал, вызванный неспецифическое связывание ДНК в магнитных шариков Ab /. Эти значения Ct должна превышать 30. Разница между значениями Ct Нет-Ab и образца Ab должна быть выше, чем 1.
| Шаг 1 - Настройка вход | |||
| Скорректированная вход = Ct сырье (вход) - Войти 2 (доля от общего хроматина) | |||
| Сырье Ct | вход от общего хроматина | Войти 2 10 | |
| Вход | 29,5 | 10% | 3.32 |
| Скорректированная вход = 29,5 - 3,32 = 26,18 | |||
| Шаг 2 -% входных расчетов | |||
| Образец | Сырье Ct | Ct (скорректированная вход) -ct (образец) | 2 Ct (скорректированная вход) -ct (образец) * 100% |
| Вход | 26.18 | ||
| Чип-Ab | 31.45 | -5,27 | 2.59 |
| Нет, Аб | 34,5 | -8,32 | 0.31 |
Таблица 3. Пример анализа данных ChIP методом «% ввода". Входы представляют общее сшитый хроматина, выделенного из ядер, так что значения Ct должны быть равными для всех пар праймеров. Обычно 5% или 10% от общего хроматина берется в качестве входных данных. Нет-нет Ab представляет собой отрицательную контрольную пробу - шарики не покрытые специфических антител против белка или теге Interesт. Чип Ab обозначает образца после иммунопреципитации с антителами против белка или теге интерес.
| PBS 10x |
| 1,3 М NaCl |
| 30 мМ Na 2 HPO 4 |
| 30 мМ NaH 2 PO 4 |
| рН 7 |
| Добыча буфера 1 (ExB 1) |
| 0,4 М сахарозы |
| РН 10 мМ Трис-HCl 8 |
| 10 мМ MgCl |
| 5 мм β-меркаптоэтанол |
| Ингибиторы протеазы |
| Добыча буфера 2 (ExB 2) |
| 0,25 М сахарозы |
| РН 10 мМ Трис-HCl 8 |
| 10 мМ MgCl 2 |
| 1% Тритон Х-100 </ TD> |
| 5 мм β-меркаптоэтанол |
| Ингибиторы протеазы |
| Добыча буфера 3 (ExB 3) |
| 1,7 М сахарозы |
| РН 10 мМ Трис-HCl 8 |
| 0,15% Тритон Х-100 |
| 2 мМ MgCl 2 |
| 5 мм β-меркаптоэтанол |
| Ингибиторы протеазы |
| Озвучивание буфер |
| РН 50 мМ Трис-HCl 8 |
| 10 мМ ЭДТА |
| 1% ДСН |
| Ингибиторы протеазы |
| Чип буфера для разведения |
| 1,1% Тритон Х-100 |
| 1,2 мМ ЭДТА |
| РН 16,7 мМ Трис-HCl 8 |
| 167 мМ NaCl, |
| Ингибиторы протеазы |
| Низкий буферной соли |
| 150 мМ NaCl, |
| 0,1% SDS |
| 1% Тритон Х-100 |
| 2 мМ ЭДТА |
| РН 20 мМ Трис-HCl 8 |
| Высокая Соль Стиральная буфер |
| 500 мМ NaCl, |
| 0,1% SDS |
| 1% Тритон Х-100 |
| 2 мМ ЭДТА |
| РН 20 мМ Трис-HCl 8 |
| LiCl промывочного буфера |
| М LiCl 0,25 |
| 1% NP-40 |
| 1% дезоксихолат натрия |
| 1 мМ ЭДТА |
| РН 10 мМ Трис-HCl 8 |
| РН 10 мМ Трис-HCl 8 |
| 1 мМ ЭДТА |
Таблица 4. Буфер состав.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол чип описано здесь является воспроизводимым и мощная техника анализа взаимодействий между белками и специфических последовательностей ДНК в естественных условиях в Arabidopsis растений. Успешной идентификации сайтов связывания для белков, представляющих интерес требует адекватного выбора органах растений или стадий развития, где соответствующие взаимодействия фактически происходит. Кроме того, очень важно, чтобы получить соответствующую фиксацию растительного материала и оптимальную резку хроматина с помощью ультразвука. Высоко специфические антитела для эффективного иммунопреципитацией выбранного белка / тега также имеют важное значение.
Применение чипа подходов в растениях сталкивается с некоторыми трудностями, связанными с наличием вторичных метаболитов и клеточных стенок, которые потенциально могут помешать различных этапов в протоколе. Кроме того, сложность органах растений, часто содержащие несколько типов клеток, где ДНК-связывающий белок Interest может быть дифференциально присутствовать или активно, препятствовали использованию этой методики. По этой причине, когда это возможно, это наиболее выгодно использовать чип подходы однородные ткани, где присутствие и / или активность белка интереса уже продемонстрировали. Сложные растительные материалы, содержащие различные ткани, как правило, вызывают разбавление типов клеток, где белок фактически функции. Ткань срезов 2 0 были использованы в установках для исследований в отдельных тканей или клеточных типов. Тем не менее, в последние годы, различные процедуры были разработаны для выделения сотового типа конкретных хроматина в Arabidopsis 8 до диапазона оптимальных фрагментов (см репрезентативные результаты раздел) 7. Как обсуждалось выше, условия для достижения этой гранулометрический состав в значительной степени зависит от конкретного используемого ультразвукового оборудования. В любом случае, хроматина должны храниться при низкой температуре, чтобы предотвратить разворот сшивания благоприятствованиятеплом, выделяемым в процессе обработки ультразвуком. Озвучивание устройство выбора должна обеспечивать хороший уровень воспроизводимости, которые вместе с оптимальными условиями фрагментации, имеет важное значение для анализа чип (рисунок 3).
Другим ключевым фактором в успешных экспериментов чип выбранный антитела для иммунопреципитации белка. Антитела, полученные против факторов транскрипции растений может быть полезным для анализа чип, но эти сыворотки должны быть тщательно проверены, поскольку антитела проверяются в западных экспериментов блот не обязательно справедливо для чипа. Кроме того, антитела, индуцированные против различных меток часто используются для этого протокола. Чип-класса антитела, специфически распознающие различные теги являются коммерчески доступными, и имеют то преимущество, что они были проверены в нескольких лабораториях. Недостатком для использования этих коммерческих антител является то, что представляющий интерес белок должен быть слит с соответствующим эпитопоми экспрессирована в трансгенные линии (фиг.4В). В этом случае желательно, чтобы гарантировать, что химерный белок является функциональным путем генерации трансгенных линий Arabidopsis, несущие слитый белок в генетический фон, дефицитного по гену, кодирующему наш интерес белок. Дополняемость фенотипических аномалий мутантной линии в трансгенных растениях подтвердит, что слитый белок сохраняет нормальную деятельность эндогенного белка. При трансгенные линии производятся для идентификации сайты связывания транскрипционных регуляторов, то предпочтительно использовать эндогенный промотор для управления экспрессией меченый белок, предотвращая проблемы, связанные с использованием составных сильных промоторов (смотри выше). Специфические антитела к посттрансляционных модификаций гистонов, такие как ацетилирование или метилирование специфических остатков также часто используются в микросхему анализ для определения эпигеномном ландшафты генов, вовлеченных врегулирование количества процессов развития, в том числе контроль времени цветения (фиг.4С). Что касается антител против тегов, чип-класса коммерческих антитела предпочтительным вариантом в случае гистоновых меток.
ChIP экспериментальные подходы, соединенные с экспрессии генов анализ играют важную роль в увеличении нашего знания о том, как факторы транскрипции, ремоделирования хроматина белки и модификации гистонов ковалентные модулировать экспрессию генов, участвующих в регуляции биологических процессов и реакций растений. Изначально разработанный как метод анализа взаимодействия белков, присутствующих в хроматина с конкретными локусов или генных регионах, взрыв геномных ресурсов и технологий NGS позволило чип, чтобы стать мощным инструментом для генома профилирования ДНК-связывающих белков, таких как факторы транскрипции или модифицированных вариантов гистонов и гистоновых. Чип-чип и чип-след предоставили новую глобальную DIMENСион анализов взаимодействий между белков хроматина и ДНК в Arabidopsis 2 5. Чип последующие подходы считаются альтернативой выбора чип-чип, который основан на гибридизации массивов и вводит некоторое смещение, учитывая, что эти массивы содержат ограниченное количество зондов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
