Summary
Inmunoprecipitación de la cromatina es una técnica poderosa para la identificación de ADN sitios de las proteínas de Arabidopsis unión in vivo. Este procedimiento incluye la cromatina entrecruzamiento y la fragmentación, inmunoprecipitación con anticuerpos selectivos contra la proteína de interés, y el análisis qPCR de ADN unido. Se describe un chip de ensayo sencilla optimizada para plantas de Arabidopsis.
Introduction
Durante los últimos años una amplia gama de herramientas genéticas, moleculares y genómicos se han desarrollado en la especie modelo Arabidopsis thaliana. Esta tecnología ha facilitado enormemente el progreso en la comprensión de cómo se regula el desarrollo de la planta. Entre los procesos de desarrollo estudiados usando Arabidopsis como modelo, el control genético de la época de floración ha sido ampliamente analizado. Estos estudios han demostrado que las plantas modulan de forma muy precisa el momento de la floración en respuesta a las señales endógenas como las hormonas y la edad de la planta, y también a las señales ambientales como el fotoperiodo y temperatura que sincronizar el tiempo de floración con el ciclo natural de las estaciones 1, 2. El aislamiento y caracterización de mutantes de Arabidopsis con alteraciones en el momento de la floración ha sido determinante en la revelación de una compleja red de genes que regulan el tiempo de floración en respuesta a factores endógenos y ambientales. Estos circuitos son genéticosintegrado a nivel de unos pocos genes maestros que actúan como interruptores de floración, y el momento exacto de la iniciación floral depende del equilibrio de la floración la promoción y la represión de las actividades que funcionan aguas arriba de los genes integradores florales 1,3.
La caracterización funcional de los genes identificados por su papel en el control de la iniciación de la floración, ayudado por el uso reciente de enfoques genómicos, han puesto de manifiesto el papel central de la regulación transcripcional en la modulación del tiempo de floración. De hecho, muchos de los genes maestros de la transcripción codifican factores de floración 4. Además, un número de complejos de proteínas remodelación de la cromatina influye en la expresión de genes maestros de floración. Un número de los mutantes de Arabidopsis aislados por su tiempo de floración alterado resultó para llevar a mutaciones en genes que codifican una variedad de modificadores de la cromatina. Diferentes remodeladores de cromatina que introducen modificaciones postraduccionales en histone colas, reposicionar nucleosomas en relación con el ADN o el intercambio de histonas canónicos por variantes de histonas son necesarios para la adecuada regulación de la floración en Arabidopsis 5,6. Algunas de estas actividades de remodelación de la cromatina catalizan la deposición o eliminación de modificaciones covalentes tales como acetilación o metilación de residuos de histonas específicas. Estas marcas histonas son reconocidos específicamente por efectores especializados que reclutan a otros complejos de remodelación de la cromatina, factores de transcripción o componentes de la maquinaria de transcripción para regular la actividad transcripcional de los genes de floración.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) permite la identificación de sitios in vivo para proteínas de interés de unión a ADN (Figura 1). Este procedimiento se aprovecha de la capacidad de ciertos productos químicos para reticular las proteínas al ADN. Los complejos ADN-proteína resultantes pueden ser luego immunoprecipitated utilizando anticuerpos específicos agafactores inst transcripción, proteínas de unión a la cromatina, o modificaciones particulares y epítopos heterólogos (comúnmente conocidos como "etiquetas") unidos a la proteína de elección. El ADN purificado a partir de estos inmunoprecipitados se puede utilizar como una plantilla en PCR (qPCR) para evaluar las reacciones cuantitativas para el enriquecimiento de secuencias particulares de interés. De esta manera, los sitios de unión de factores de transcripción o la distribución de marcas de histona en los genes particulares pueden establecerse 7,8. Además, combinado con Next Generation Sequencing (NGS), que permite la secuenciación masiva en paralelo, la tecnología chip ha hecho posible la identificación de todo el genoma de los sitios de unión de factores de transcripción, así como revelando paisajes epigenómicos de modificaciones de las histonas. Además, el análisis simultáneo de la expresión génica permite la monitorización cómo la unión de reguladores transcripcionales o la deposición de marcas de histona particulares se correlacionan con la transcripción activity de genes 9.
El uso de protocolos de chip en Arabidopsis ha permitido evaluar el impacto que una variedad de reguladores de la transcripción tiene en la organización de la cromatina de los maestros genes de floración y cómo estos cambios estructurales influyen en la expresión de genes 5,6. Los resultados anteriores demostraron que el locus de Arabidopsis EMPERNADO TEMPRANO EN DÍAS CORTOS (EBS) actúa como un represor de la floración y los mutantes en este espectáculo gen una aceleración de la floración y la regulación positiva del gen maestro de FT floración. Además, la pérdida de función de las mutaciones en FT suprimen completamente el fenotipo de floración temprana de las plantas mutantes EBS, lo que indica que FT se requiere para la floración prematura de mutantes EBS y que EBS es necesario para la represión de este gen maestro de la floración 10 , 11. EBS codifica una proteína que contiene PHD-que pueden unirse específicamente di- histona H3 y trimetilada in the lisina 4 residuo (H3K4me2 / 3), lo que sugiere un papel para EBS en la represión de la cromatina mediada por FT 12. El uso del enfoque chip demostró que la Arabidopsis contiene PHD-proteína EBS 10,11 une regiones reguladoras del gen floral FT integrador para reprimir su expresión 12. Los datos adicionales obtenidos a través del uso de la tecnología chip demostraron que esta proteína es necesaria para mantener bajos niveles de acetilación de histonas, un sello distintivo de la transcripción activa, en la cromatina de este gen maestro de floración durante las etapas iniciales del desarrollo de Arabidopsis. Estas observaciones, junto con los datos de expresión genética y el gen, demostrar que esta proteína contiene PHD-Arabidopsis tiene un papel central en el ajuste fino del tiempo de floración mediante la modulación de la expresión del gen integrador floral FT 12. El trabajo presentado aquí proporciona un método optimizado útil no sólo para el análisis de las histonas, sino también para otrocromatina proteínas asociadas, y con el aumento de la eficiencia y reduce el tiempo de experimentación. Además, este informe muestra cómo el uso de protocolos de chip ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la relación entre los cambios en la cromatina modificaciones y los estados de la transcripción de genes de plantas, y cómo estos mecanismos cromatina mediada de impacto control de la expresión génica en el inicio de la floración en Arabidopsis.
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Protocol
1. La reticulación del material vegetal (1 hora)
- Crecer las líneas de Arabidopsis utilizados en el experimento (de tipo salvaje - WT - frente a los mutantes, y / o líneas que expresan la versión etiquetada de su proteína de interés en comparación con las líneas que expresan la etiqueta no fusionados a cualquier proteína) durante 12-18 días en grandes placas de Petri (150 mm) con medio MS-agar (1 L: Sales de Murashige & Skoog 1x, 10 g de sacarosa, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% de agar). Alternativamente, cultivar plantas en macetas que contenían 3: 1 mezcla de suelo y vermiculita.
¡ATENCIÓN! El formaldehído es tóxico por inhalación, contacto con la piel y por ingestión, y debe ser manejado en una campana química que use el equipo de protección personal adecuado. Los pasos 1.2 a 1.6 se debe realizar bajo la campana de humos. - Hacer pequeños agujeros en la tapa de los tubos de 50 ml con una aguja de quemador calienta laboratorio. Añadir 40 ml de 1x tampón PBS y 1,08 ml de formaldehído a una concentración final de 1% (acciones 37% solution). Recoger 1,5 g de material vegetal en los tubos de 50 ml. Mantener los tubos en hielo durante la reticulación.
- Cerrar los tubos de 50 ml con la tapa. Colocar los tubos en un desecador y aplicar vacío. Vacío infiltran el tejido durante 10 minutos, a continuación, suelte el vacío con cuidado, para evitar la agitación hasta la solución. Mezclar la muestra. Repetir dos veces. Después de la infiltración, observar el material vegetal y confirme que se vuelve ligeramente translúcido y tienden a hundirse hasta el fondo del tubo (Figura 2).
- Añadir 2,5 ml de 2 M de glicina para lograr una concentración final de 0,125 M. Aplicar vacío durante 5 min. La glicina actúa como un inhibidor competitivo de la reticulación de formaldehído.
- Descartar la solución de PBS-formaldehído glicina invirtiendo el tubo 50 ml cerrado con agujeros en la tapa.
- Enjuagar las plántulas dos veces con PBS 1x y una vez con agua descartando la solución de lavado como se ha descrito en el paso 1.5. Seque con una toalla de papel y congelar en nitroge líquidonorte.
NOTA: El tejido congelado se puede mantener a -80 ° C durante semanas.
2. Preparación de los anticuerpos (1 día)
NOTA: Para la inmunoprecipitación, se recomienda el uso de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos a través de una proteína G o proteína A enlazador con alta afinidad por el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo. Los complejos ADN-proteína pueden adjuntar inespecíficamente a la superficie de los conjugados anticuerpo-perlas. Por esa razón, es necesario realizar controles sin anticuerpos específicos para cuantificar el fondo unión no específica.
- Para cada inmunoprecipitación, preparar 15 l de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. La cantidad de perlas depende de la cantidad de la cromatina usado para la inmunoprecipitación y también en los anticuerpos.
- Para lavar, añadir 1 ml de la cromatina Immunoprecipitation (CHIP) tampón de dilución a las perlas, mezclar por rotación y coloque la microcentrífuga de 1,5 ml maestar en una gradilla magnética. Espere alrededor de 1 minuto para que los granos se adhieren al imán. Con los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml fijas en el bastidor, eliminar el sobrenadante con la pipeta. Repetir dos veces.
NOTA: Para cada línea de plantas se necesitan dos conjuntos de inmunoprecipitación: una con las perlas y el anticuerpo (Ab) y un segundo anticuerpo de control no (No-Ab) con perlas magnéticas solamente. - Resuspender las perlas en 200 l de tampón de dilución chip. Añadir la cantidad requerida de la Ab específico para uno de los dos tubos preparados para cada línea de plantas (la dilución exacta difiere para cada Ab y tiene que ser optimizado experimentalmente o, en el caso de los anticuerpos comerciales, siga las instrucciones del fabricante). Utilice esta muestra para la inmunoprecipitación. Añadir la misma cantidad de IgG no específica al otro tubo, que se utilizó como control negativo.
- Incubar O / N en una rueda giratoria a 4 ° C para permitir que el anticuerpo se unen a las perlas.
3. Extracción de la cromatina (4 horas)
NOTA: En este paso, los núcleos y todos los orgánulos se sedimenten. EXB 1 contiene suficiente sacarosa para proporcionar una alta densidad y prevenir la alteración de la estructura del orgánulo.
NOTA: EXB 2 contiene 1% de Triton X-100 para ayudar a estallar los cloroplastos abierta y eliminar la clorofila.
NOTA: Este paso ayuda a eliminar el detergente de la muestra.
NOTA: Estetampón contiene SDS, para lisar los núcleos y suelte la cromatina.
PRECAUCIÓN Asegúrese de usar equipo de protección para los oídos durante la etapa de sonicación en caso de que el dispositivo de ultrasonido no está contenido en un gabinete a prueba de sonido.
! Paso crucial La fragmentación de la cromatina depende en gran medida del equipo de ultrasonidos. Las condiciones de sonicación deben ajustarse para lograr el enriquecimiento en los tamaños de ADN apropiadas. VerLa figura 3 para un ejemplo de cómo optimizar la fragmentación de la cromatina.
Nota: Las muestras pueden ser congeladas y almacenadas a -20 ° C durante varias semanas.
4. La inmunoprecipitación de la proteína de interés y Rescate de ADN (1 día, 3 horas)
- Lavar las perlas recubiertas con el Ab desde el paso 2.4 tres veces con 1 ml de tampón de dilución ChIP para eliminar el exceso de anticuerpo como se describe en el paso 2.2. Resuspender en 200 l de tampón de dilución chip. Añadir 50 l de aislado de la cromatina. Incubar O / N en una rueda giratoria a 4 ° C.
NOTA: Compruebe los concentratien la cromatina en de UV-Vis microvolumen espectrofotómetro. 50 l de aislado de la cromatina deben contener más de 10 g de ADN. - Para ver los pasos de trabajo 4,2 hasta 4,5 en 4 ° C. Lave las perlas dos veces en 1 ml de tampón de lavado Bajo en sal, como se describe en el paso 2.2.
- Lávese las cuentas una vez en 1 ml de tampón de lavado de alta sal.
- Se lavan las perlas una vez en 1 ml de tampón de lavado LiCl.
- Lavar las perlas dos veces en 1 ml de tampón TE. Después del último lavado, asegúrese de eliminar por completo el tampón TE que queda en el tubo mediante aspiración con una pipeta.
- Saque las muestras de entrada (paso 3.9). Transferencia de 5 l de la entrada a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y continúe como con las muestras de chip. Invertir la reticulación mediante la adición de 200 l de resina de intercambio iónico quelante 5%, y se incuba durante 10 min a 95 ° C agitando cada 2-3 min. Centrifugar a 16.000 xg durante 30 seg y transferir cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga mediante pipeteo.
NOTA: Mientras que el tramétodo condicional para la reticulación de reversión implica un / O N incubación con NaCl, la incubación con una resina quelante de iones a 95 ° C permite decrosslinking y la elución del DNA en 10 min eficiente, por lo tanto haciendo que el protocolo de un días más corto. - Añadir 2 l de proteinasa K (10 mg / ml) y se incuba a 37 ° C durante 30 min para digerir las proteínas y liberar el ADN.
- Detener la reacción mediante incubación a 95 ° C durante 10 min.
- Girar rápidamente a 16.000 xg durante 30 segundos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo con la pipeta.
- Limpie el ADN aislado utilizando un kit de purificación de fragmentos de ADN estándar.
NOTA: Proceder de acuerdo con las instrucciones del fabricante. - Transferir la columna del kit de la unión de ADN a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Eluir el ADN purificado mediante la adición de 20 l de agua libre de DNasa al centro de la columna y girando a 16.000 xg durante 60 seg. Punto de parada: Las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C durante varias semanas. 5. Medir la abundancia de sitios de unión en el ADN inmunoprecipitada por qPCR (4 horas)
- Cebadores de diseño para las regiones genómicas de interés con una temperatura de fusión (Tm) de 60 ° C y un contenido de GC de 30% -80%. Como la cromatina se fragmenta por sonicación, la longitud de secuencia amplificada no debería ser más largo que los nucleótidos 150-200 (Tabla 1).
NOTA: Una herramienta útil para el diseño del cebador es Primer 3 del programa (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Directrices adicionales para primer diseño están disponibles en informes anteriores 8, 14,15. - Utilice un programa BLAST para asegurarse de que los cebadores son específicos (especialmente los promotores pueden compartir secuencias de unión TF similar) y probar el usin eficiencia imprimacióng diluciones 1:10 en el agua del ADN de entrada (paso 4.9). Ciertas regiones del genoma se purificarán mejor que otros. Por tanto, es importante diseñar cebadores de PCR y chequearlos en el ADN de entrada diluida.
- Diluir el ADN purificado 1:10 con agua y pipeta de 5 l de la DNA diluido en un tubo de PCR para cada reacción.
NOTA: Diluir solamente la cantidad necesaria, como el ADN se puede unir a las paredes de los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Ciclos de congelación descongelación múltiples aumentan el número de moléculas de ADN adjuntos. Para cada par de cebadores, la amplificación de la entrada, Ab-chip y No-Ab chip tiene que ser analizado. - Para completar la mezcla de PCR, añadir mezcla maestra SYBR Green PCR a una concentración final de 1x, y 0,5 M de cada cebador. Llenar hasta 20 l con agua libre de DNasa.
- Realizar la reacción qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante de mezcla maestra SYBR Green PCR.
- Análisis de los datos por el método de enriquecimiento veces.
- Cree una hoja de cálculo con muestras nombres y valores de Ct primas que se han obtenido después de la reacción qPCR.
- Para cada muestra, restar de su valor Ct prima el valor Ct prima obtenida para el correspondiente control de n-Ab. NOTA: Después de esta operación matemática, el valor Ct para la muestra n-Ab será igual a 0.
- Calcular el enriquecimiento de pliegue por la operación de exponenciación con la base 2 y el exponente (potencia) igual al resto negativo obtenido en el paso 6.1.2 (Tabla 2).
doblar el enriquecimiento = 2 - (Ct (muestra) - Ct (n-Ab))
NOTA: En este method la abundancia de un fragmento de ADN específico en la muestra de chip-ed se compara con la abundancia de este fragmento en el control de No-Ab. La asunción de este método es que el nivel de señal de fondo es reproducible entre diferentes conjuntos de cebadores, muestras, y replicar los experimentos. Sin embargo, esta'noise' niveles de señal varían entre los conjuntos de cebadores, muestras y experimentos.
- Análisis de los datos por% de método de entrada.
- Cree una hoja de cálculo con muestras nombres y valores de Ct primas que se han obtenido para ellos después de la reacción qPCR.
- Ajuste los valores de Ct primas para muestras de entrada restando un valor de logaritmo en base 2 de la fracción de la cromatina total extraído que se tomó como una entrada.
NOTA: En este protocolo el valor sustraído es igual 3,32, como un 10% del total de la cromatina se tomó como una entrada en este protocolo. Log 2 (10) es igual a 3,32. - Calcular% de la entrada multiplicando por 100 el valor de la operación de exponenciación con base 2 y el exponente (potencia) igual al resto de valores de entrada ajustados restados de los valores de Ct primas de la muestra (Tabla 3).
% De entrada = 100 * 2 (entrada ajustada - Ct (muestra))
NOTA: Con este procedimiento, se calcula la relación entre la abundancia específica de ADN en la muestra chip-ed al aislado de la cromatina (muestra de entrada) en total. Más detalles sobre el análisis de datos ChIP se pueden encontrar en Haring et. Al 8.
NOTA: ADN aislado de la cromatina precipitada tiene que ser analizado para determinar qué fragmentos de ADN se han chip-ed de la cromatina total debido a su unión a la proteína de interés.
Análisis 6. Datos
NOTA: Entre los existing formas de analizar los datos-chip, dos se utilizan con mayor frecuencia. El primero de ellos es el método de enriquecimiento veces, también nombrado como "enriquecimiento relativo", "señal de más de fondo" o "en relación con el control sin anticuerpo». El segundo método se denomina como "% de entrada".
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Representative Results
Ocho pasos principales pueden señalarse en este protocolo chip para la identificación de in vivo proteína-DNA, incluyendo cultivo y la recolección de material vegetal, el entrecruzamiento de la cromatina, el aislamiento de la cromatina, la fragmentación de la cromatina, aislamiento selectivo de los complejos entre ADN y la proteína de interés mediante inmunoprecipitación, la digestión de proteínas, purificación de ADN, y análisis de qPCR (Figura 1). Un paso crucial en el chip de protocolo es la fijación de las interacciones proteína-ADN en una reacción de reticulación. Típicamente, el entrecruzamiento de formaldehído se utiliza en planta de chips. El formaldehído penetra en el tejido y crea puentes de metileno entre NH 2 grupos de proteínas o proteínas y nucleótidos en el ADN 1 6. Una fijación eficiente de los complejos de nucleoproteína in vivo requiere que el formaldehído alcanza la cromatina dentro de los núcleos de las plantas, y es esencial que el tejido vegetal está totalmente sumergido en tél búfer formaldehído para asegurar que durante la inmunoprecipitación de los complejos de proteínas de ADN se tiran eficazmente hacia abajo. Hojas de Arabidopsis están cubiertas de capas de cera que difícil la penetrancia del agente de reticulación en las células. Además, tricomas favorecen la formación de burbujas de aire en la superficie de las hojas, la prevención de la solución de formaldehído de conseguir en el interior del tejido de la planta. Para superar esta limitación, en este paso se aplica vacío a las muestras, evitando la formación de burbujas en la solución de fijación y la mejora de la penetración de formaldehído en los núcleos de todas las células. Las plántulas después del tratamiento de reticulación eficiente se muestran en la Figura 2.
Otro paso clave en el protocolo chip es esquila cromatina. Fragmentos de cromatina grandes pueden resultar en baja resolución de mapeo de los sitios de unión de la proteína de interés en la secuencia de ADN. En contraste, los fragmentos muy pequeños pueden evitar la amplificación eficiente deel ADN unido por qPCR. De acuerdo con la experiencia empírica, el rango de tamaño de la cromatina óptima para el análisis de chip debe estar entre 200 y 600 pb, y las condiciones para lograr la fragmentación adecuada de la cromatina tiene que establecerse en función del dispositivo de sonicación disponible en el laboratorio. La Figura 3 ilustra la procedimiento para optimizar la cromatina de cizallamiento para lograr el enriquecimiento máximo en el intervalo deseado de tamaños de ADN. Antes de la sonicación, la cromatina se compone principalmente de fragmentos muy grandes. Un mayor número de ciclos de sonicación reduce progresivamente el tamaño medio del ADN en muestras de chip, alcanzando el enriquecimiento óptimo en el rango de 200 a 600 pb después de 20-30 ciclos (sección 3.8 del protocolo y Figura 3).
Aquí, se muestra la identificación de la proteína EBS sitios a regiones reguladoras del integrador floral FT unión como un ejemplo de la utilidad de la técnica de chip. La unión de EBS a tlocus que FT se deshizo a través de ensayos de chip con las líneas de Arabidopsis que expresan una proteína de fusión cMyc-EBS bajo el control del promotor nativo EBS (PEBS :: cMyc-EBS). Esta versión etiquetado de EBS es completamente funcional, como se muestra por el fenotipo silvestre de EBS plantas mutantes que expresan este constructo. Cuatro regiones dentro del locus genómico FT se probaron para EBS vinculante; uno en la región promotora del gen (FTII), dos alrededor del sitio de inicio de la transcripción (FTIV, FTVI), y otro en el primer intrón del FT (FTVII) (Figura 4A). Como se muestra en la Figura 4B, los resultados de chip demuestran que la proteína EBS se puede unir una secuencia reguladora cerca del sitio de inicio transcripcional del gen maestro de la floración FT 12. Además, la proteína EBS puede interactuar tanto in vitro como in vivo con histona desacetilasas tales como hda6, otra proteína relacionada con la cromatina-implicada en la regulacióntiempo de la floración en Arabidopsis 1 7. A fin de evaluar la posible influencia de EBS sobre los niveles de acetilación de histonas en la región genómica de FT, ensayos de chip se realizaron utilizando un anticuerpo dirigido contra la histona H3 acetilada en lisinas 9 y 14, una marca de histona correlacionada con transcriptionally cromatina activa 1 2 . Además, estos datos ilustran cómo los enfoques chip pueden contribuir a arrojar luz sobre los mecanismos moleculares que modulan la regulación transcripcional de los procesos de desarrollo de las plantas.
Figura 1. Esquema de la inmunoprecipitación de la cromatina protocolo. ChIP es una técnica comúnmente utilizada para investigar las interacciones entre las proteínas y el ADN, fijados por un compuesto químico. La cromatina con interacciones conservadas está aislada de los núcleos y fragmentado. Mediante el uso de anticuerpos contra la proteína de interés,podemos seleccionar fragmentos de ADN que se le atribuye. El anticuerpo está conjugado con perlas magnéticas que permiten el aislamiento rápido y simple usando un estante magnético. En el siguiente paso, las proteínas se eliminan mediante el tratamiento de proteinasa y el ADN se libera. Fragmentos de ADN purificados se utilizan como plantillas en las reacciones de qPCR para medir su abundancia relativa. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Ejemplo de un tejido después de la reticulación con formaldehído. Con el fin de investigar las interacciones entre el ADN y la proteína, en los complejos in vivo tiene que fijarse para que sean estable y duradera a través de las múltiples etapas del protocolo. En esta versión del protocolo, la fijación se produce por tratamiento con formaldehído. Penetración eficiente de thr formaldehídoough el tejido es crucial para el éxito del método de chip. (A) Antes de la etapa de reticulación del material vegetal flota en la superficie de la solución y se cubre con pequeñas burbujas de aire; las superficies abaxial y adaxial de las hojas difieren en color. (B) Después de la fijación, las plántulas se debe empapar visiblemente en la solución, ligeramente transparente, y uniformemente inmersos en la solución de reticulación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Optimización de las condiciones de sonicación para el análisis de chip. Cromatina aislada de material fijado se compone de amplia gama de longitudes de fragmentos con una fuerte banda en la parte superior del gel que representa tamaños de cromatina extremadamente largos (segunda línea a la izquierda). Con Increacantar número de ciclos de sonicación, el pico de la cromatina fragmentos de tamaños se desplaza hacia fragmentos más pequeños. En el experimento se muestra, los números de ciclo óptimos varían entre 20 y 30, después de lo cual los fragmentos de cromatina óptimas que van de 200 a 600 pb son más abundantes en la muestra chip. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. chip análisis muestran que EBS se une FT y el EBS mutaciones alteran el nivel de acetilación de la histona H3 en este gen integrador floral. (A) región genómica de FT con cajas negras representan los exones. Cuatro fragmentos que abarcan regiones reguladoras de este gen integrador floral fueron probados (griscajas) por el diseño de cebadores específicos qPCR. (B) EBS se une la región FT IV, situado cerca del sitio de inicio de la transcripción. Myc-EBS corresponde a EBS plantas mutantes que expresan la versión cMyc etiquetado de EBS; Myc denota plantas transgénicas que expresan el epítopo cMyc no fusionados a cualquier gen Arabidopsis. (C) EBS plantas mutantes presentan mayor abundancia de H3K9,14Ac de tipo salvaje Landsberg erecta (I er) en las cuatro regiones FT evaluados. Las barras de error muestran la desviación estándar (B y C). Modificado a partir de datos publicados anteriormente en The Plant Cell 1 2. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reenviar | Marcha atrás | probó Región |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tabla 1. Los cebadores usados en este estudio.
| Muestra | Valores Raw Ct | Ct-Ct (n-Ab) | Enriquecimiento Fold 2 - (Ct (muestra) - Ct (n-Ab)) |
| No-Ab | 34.5 | 0 | 1 |
| Ab | -5,3 | 39.4 |
Tabla 2. Ejemplo de análisis de datos de chip por el método de "enriquecimiento doblar". Los valores de Ct para No-Ab muestras representan la señal de fondo causado por la unión inespecífica de ADN a las perlas magnéticas Ab /. Estos valores de Ct deben exceder 30. Diferencia entre los valores de Ct de No-Ab y Ab muestra debe ser superior a 1.
| Paso 1 - Ajuste la entrada | |||
| De entrada ajustado = Raw Ct (entrada) - Ingresar 2 (fracción de la cromatina en total) | |||
| Raw Ct | el aporte de la cromatina totales | Log 2 10 | |
| Entrada | 29.5 | 10% | 3.32 |
| De entrada ajustado = 29,5 a 3,32 = 26,18 | |||
| Paso 2 -% de los cálculos de entrada | |||
| Muestra | Raw Ct | Ct (entrada ajustada) -Ct (muestra) | 2 Ct (entrada ajustada) -Ct (muestra) * 100% |
| Entrada | 26.18 | ||
| Chip-Ab | 31.45 | -5.27 | 2.59 |
| No-Ab | 34.5 | -8.32 | 0.31 |
Tabla 3. Ejemplo de análisis de datos ChIP por el método de "% de entrada". Las entradas representan la cromatina reticulada total aislado de núcleos, por lo que los valores de Ct debe ser igual para todos los pares de cebadores. Convencionalmente, 5% o 10% del total de la cromatina se toma como una entrada. No-Ab representa una muestra de control negativo - las perlas no recubiertas por anticuerpos específicos contra la proteína o etiqueta de interest. Chip-Ab significa la muestra después de la inmunoprecipitación con los anticuerpos contra la proteína o una etiqueta de interés.
| PBS 10x |
| M NaCl 1,3 |
| 30 mM Na 2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Tampón de extracción 1 (EXB 1) |
| 0,4 M de sacarosa |
| MM Tris-HCl pH 8 10 |
| 10 mM MgCl |
| 5 β-mercaptoetanol mM |
| Inhibidores de la proteasa |
| Tampón de extracción 2 (EXB 2) |
| 0,25 M de sacarosa |
| MM Tris-HCl pH 8 10 |
| 10 mM de MgCl 2 |
| 1% Triton X-100 </ td> |
| 5 β-mercaptoetanol mM |
| Inhibidores de la proteasa |
| Tampón de extracción 3 (EXB 3) |
| 1,7 M de sacarosa |
| MM Tris-HCl pH 8 10 |
| 0,15% Triton X-100 |
| 2 mM de MgCl 2 |
| 5 β-mercaptoetanol mM |
| Inhibidores de la proteasa |
| Tampón de sonicación |
| MM Tris-HCl pH 8 50 |
| EDTA 10 mM |
| 1% de SDS |
| Inhibidores de la proteasa |
| Tampón de dilución chip |
| 1,1% Triton X-100 |
| EDTA 1,2 mM |
| MM Tris-HCl pH 8 16,7 |
| NaCl 167 mM |
| Inhibidores de la proteasa |
| Tampón de baja salinidad |
| NaCl 150 mM |
| 0,1% de SDS |
| 1% Triton X-100 |
| EDTA 2 mM |
| MM Tris-HCl pH 8 20 |
| Tampón de lavado de alta Sal |
| NaCl 500 mM |
| 0,1% de SDS |
| 1% Triton X-100 |
| EDTA 2 mM |
| MM Tris-HCl pH 8 20 |
| Búfer LiCl Wash |
| 0,25 M LiCl |
| 1% NP-40 |
| 1% desoxicolato de sodio |
| EDTA 1 mM |
| MM Tris-HCl pH 8 10 |
| MM Tris-HCl pH 8 10 |
| EDTA 1 mM |
Tabla 4. Composición Buffer.
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Discussion
El chip de protocolo descrito aquí es una técnica reproducible y potente para analizar las interacciones entre proteínas y secuencias específicas de ADN in vivo en plantas de Arabidopsis. Una identificación exitosa de sitios de unión para las proteínas de interés requiere una adecuada selección de órganos de la planta o etapas de desarrollo, donde las interacciones relevantes en realidad están teniendo lugar. Además, es crítico para obtener una fijación adecuada del material vegetal y un óptimo de corte de la cromatina por sonicación. Anticuerpos altamente específicos para la inmunoprecipitación eficiente de la proteína seleccionada / tag también son esenciales.
El uso de enfoques de chip en las plantas se enfrenta a algunas dificultades relacionadas con la presencia de metabolitos secundarios y las paredes celulares que potencialmente puede interferir con diferentes pasos en el protocolo. Por otra parte, la complejidad de órganos de la planta, a menudo contiene múltiples tipos de células, donde la proteína de unión a ADN de interest puede ser diferencialmente presente o activo, han obstaculizado el uso de esta metodología. Por esa razón, siempre que sea posible es más ventajoso para utilizar en ChIP enfoques tejidos homogéneos donde la presencia y / o actividad de la proteína de interés han sido ya demostrada. Materiales de plantas complejas que contienen diferentes tejidos tienden a provocar una dilución de los tipos de células que las funciones de la proteína en realidad. Tissue seccionar 2 0 se han utilizado en plantas para estudios en tejidos individuales o tipos de células. Sin embargo, durante los últimos años, diferentes procedimientos han sido desarrollados para el aislamiento de células de tipo específico de la cromatina en Arabidopsis 8 a una serie de fragmentos óptimos (ver sección Resultados Representante) 7. Como se discutió anteriormente, las condiciones para lograr esta distribución de tamaño depende en gran medida del equipo de ultrasonido específico usado. En cualquier caso, la cromatina se debe mantener a baja temperatura para prevenir la reversión de la reticulación favorecidapor el calor generado durante la sonicación. El dispositivo de ultrasonidos de elección debe proporcionar un buen nivel de reproducibilidad, que junto con las condiciones óptimas de fragmentación, es esencial para el análisis de chip (Figura 3).
Otro factor clave en chip experimentos exitosos es el anticuerpo elegido para inmunoprecipitación de la proteína de interés. Los anticuerpos generados contra los factores de transcripción de plantas pueden ser útiles para el análisis de chip, pero estos sueros deben ser probado a fondo porque los anticuerpos controladas en experimentos de Western blot no son necesariamente válidas para chip. Además, los anticuerpos generados contra diferentes etiquetas se usan frecuentemente para este protocolo. Anticuerpos chip-grado que reconocen específicamente una variedad de etiquetas están disponibles comercialmente, y tienen la ventaja de que se han probado en varios laboratorios. El inconveniente para el uso de estos anticuerpos comerciales es que la proteína de interés tiene que ser fusionado con el epítopo correspondientey expresado en líneas transgénicas (Figura 4B). En este caso, es aconsejable asegurarse de que la proteína quimérica es funcional mediante la generación de líneas de Arabidopsis transgénicas que llevan la proteína de fusión en un fondo genético deficiente en el gen que codifica nuestra proteína de interés. La complementación de las anormalidades fenotípicas de la línea mutante en las plantas transgénicas confirmará que la proteína de fusión conserva la actividad normal de la proteína endógena. Cuando se producen líneas transgénicas para identificar los sitios de unión de reguladores transcripcionales, es preferible utilizar el promotor endógeno para conducir la expresión de la proteína etiquetada, la prevención de los problemas asociados con la utilización de promotores constitutivos fuertes (véase más arriba). Los anticuerpos específicos para las modificaciones postraduccionales de las histonas, como la metilación o acetilación de residuos específicos también se utilizan con frecuencia en chip análisis para determinar los paisajes epigenómicos de genes implicados en laregulación de una serie de procesos de desarrollo, incluyendo el control del tiempo de floración (Figura 4C). En cuanto a los anticuerpos contra las etiquetas, los anticuerpos comerciales chip-grado son la opción preferida en el caso de las marcas de las histonas.
Enfoques experimentales chip junto a la expresión génica análisis han sido fundamentales para aumentar nuestro conocimiento sobre cómo los factores de transcripción, proteínas de remodelación de la cromatina y modificaciones covalentes de las histonas modulan la expresión de genes implicados en la regulación de los procesos y las respuestas biológicas de plantas. Inicialmente desarrollado como un método para analizar la interacción de las proteínas presentes en la cromatina con determinadas regiones loci o genes, la ráfaga de recursos genómicos y tecnología NGS ha permitido chip para convertirse en una poderosa herramienta para la elaboración de perfiles de todo el genoma de las proteínas de unión al ADN tales como factores de transcripción o histonas modificadas y variantes de las histonas. Chip-chip y chip-ss han proporcionado una nueva dimen mundialsión a los análisis de las interacciones entre las proteínas de la cromatina y el ADN en Arabidopsis 2 5. Enfoques chip siguientes se consideran la alternativa de elección de chip-chip, que se basa en matrices de hibridación e introduce cierto sesgo, dado que estas matrices contienen un número restringido de sondas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
