Summary
مناعي لونين هي تقنية قوية لتحديد المواقع DNA من البروتينات في الجسم الحي نبات الأرابيدوبسيس ملزمة. ويشمل هذا الإجراء لونين عبر ربط والتشرذم، مناعي مع الأجسام المضادة انتقائية ضد البروتين من الفائدة، وتحليل QPCR من الحمض النووي ملزمة. نحن تصف مقايسة الشذرة بسيط الأمثل لمحطات نبات الأرابيدوبسيس.
Introduction
خلال السنوات الأخيرة تم تطوير مجموعة واسعة من الأدوات الجينية، الجزيئية والجينوم في أنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana. هذه التكنولوجيا قد سهلت بشكل كبير من التقدم في فهم كيفية تنظيم تطوير المصنع. ومن بين العمليات التنموية المدروسة باستخدام نبات الأرابيدوبسيس كنموذج، والسيطرة الوراثية من الوقت المزهرة تم تحليلها على نطاق واسع. وقد أظهرت هذه الدراسات أن النباتات تعدل بدقة متناهية وقت المزهرة في استجابة لمنبهات الذاتية مثل الهرمونات وعمر النبات، وأيضا لإشارات البيئية مثل الإضاءة ودرجة الحرارة التي تزامن المزهرة الوقت مع الدورة الطبيعية للمواسم 1، 2. وقد تم عزل وتوصيف المسوخ نبات الأرابيدوبسيس مع بعض التعديلات في وقت الإزهار حاسما في كشف شبكة معقدة من الجينات التي تنظم للمرة المزهرة استجابة لعوامل داخلية والبيئية. هذه الدوائر الجينيةمتكاملة على مستوى عدد قليل من الجينات الرئيسية التي تكون بمثابة مفاتيح المزهرة، والتوقيت الدقيق لبدء الأزهار يعتمد على ميزان المزهرة تعزيز وقمع الأنشطة التي تعمل المنبع من الجينات تكامل الأزهار 1،3.
وقد كشفت توصيف وظيفي من الجينات التي تم تحديدها لدورها في مراقبة المزهرة بدء، وبمساعدة من استخدام الأخير من النهج الجينومية، والدور المركزي للتنظيم النسخي في التشكيل من الوقت المزهرة. في الواقع، العديد من الجينات سيد المزهرة ترميز عوامل النسخ 4. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدد من لونين مجمعات البروتين إعادة تؤثر على التعبير عن الجينات سيد المزهرة. تحول عدد من المسوخ نبات الأرابيدوبسيس معزولة لمن تغير الوقت المزهرة إلى تحمل طفرات في جينات ترميز مجموعة متنوعة من معدلات الكروماتين. و remodelers لونين مختلفة إدخال تعديلات posttranslational في هيستونالبريد ذيول، أعد nucleosomes نسبة إلى DNA أو تبادل الهستونات الكنسي من قبل المتغيرات هيستون ضرورية لتنظيم السليم لالمزهرة في نبات الأرابيدوبسيس 5،6. بعض هذه الأنشطة إعادة عرض لونين تحفيز ترسب أو إزالة التعديلات التساهمية مثل أستلة أو مثيلة في بقايا هيستون محددة. يتم التعرف على هذه العلامات هيستون تحديدا مؤثرات المتخصصة التي تجند أخرى مجمعات ونين إعادة عرض، عوامل النسخ أو مكونات الآلات النسخي لتنظيم النشاط النسخي الجينات المزهرة.
لونين مناعي (رقاقة) يسمح بتحديد المواقع في الجسم الحي للبروتينات ذات الاهتمام ملزم الحمض النووي (الشكل 1). يأخذ هذا الإجراء الاستفادة من قدرة بعض المواد الكيميائية إلى عبر الارتباط البروتينات على الحمض النووي. مما أدى المجمعات الحمض النووي والبروتينات ويمكن بعد ذلك immunoprecipitated باستخدام الأجسام المضادة الآغا محددةالعوامل انست النسخ والبروتينات ملزم لونين، أو تعديلات معينة والحواتم مغاير (يشار اليه عادة باسم "العلامات") التي تعلق على البروتين في الاختيار. الحمض النووي تنقيته من هذه immunoprecipitates يمكن استخدامها كقالب في PCR (QPCR) ردود فعل الكمية لتقييم لإثراء تسلسل معينة من الاهتمام. وبهذه الطريقة، يمكن إنشاء مواقع الربط من عوامل النسخ أو توزيع علامات هيستون في جينات معينة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع الجيل التالي من التسلسل (خ ع) التي تمكن التسلسل الموازي ضخمة، جعلت تكنولوجيا رقاقة الممكن تحديد الجينوم على نطاق مواقع الربط من عوامل النسخ فضلا عن المناظر الطبيعية epigenomic الكشف عن التعديلات هيستون. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل في وقت واحد في التعبير الجيني يسمح مراقبة كيفية الربط المنظمين النسخي أو ترسب معينة علامات هيستون ترتبط مع النسخي activiتاي من الجينات 9.
وقد سمح باستخدام بروتوكولات الشذرة في نبات الأرابيدوبسيس تقييم الأثر أن مجموعة متنوعة من المنظمين النسخي لها بشأن تنظيم لونين الجينات سيد المزهرة وكيف يمكن لهذه التغيرات الهيكلية تؤثر التعبير الجيني 5،6. وأظهرت النتائج السابقة أن انشقاقه المبكر نبات الأرابيدوبسيس مكان في أيام قصيرة (EBS) بمثابة كاظمة المزهرة والمسوخ في هذا المعرض الجينات تسارع المزهرة وupregulation من الجين سيد المزهرة FT. بالإضافة إلى ذلك، الخسارة من وظيفة الطفرات في FT قمع تماما النمط الظاهري المزهرة في وقت مبكر من النباتات EBS متحولة، مشيرا إلى أن FT مطلوب من أجل ازدهار سابق لأوانه من المسوخ EBS وأن EBS هو ضروري لقمع هذا الجين سيد المزهرة 10 11. بترميز EBS البروتين التي تحتوي على الدكتوراه التي يمكن أن تربط خصيصا هيستون H3 البروميد وtrimethylated في الالبريد يسين 4 بقايا (H3K4me2 / 3)، مما يشير إلى دور لEBS في قمع بوساطة لونين من FT 12. أظهر استخدام نهج الشذرة أن نبات الأرابيدوبسيس التي تحتوي على البروتين الدكتوراه EBS 10،11 يربط المناطق التنظيمية من الأزهار FT تكامل الجيني لقمع التعبير عنها 12. وأظهرت بيانات إضافية تم الحصول عليها من خلال استخدام تكنولوجيا رقاقة ما هو مطلوب هذا البروتين للحفاظ على مستويات منخفضة من أستلة هيستون، وهي السمة المميزة النسخ نشط، في لونين من هذا الجين سيد المزهرة خلال المراحل الأولى من تطوير نبات الأرابيدوبسيس. هذه الملاحظات، جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير الجيني والجينات، وتثبت أن هذا نبات الأرابيدوبسيس الدكتوراه التي تحتوي على البروتين له دور مركزي في ضبط الوقت المزهرة عن طريق تحوير التعبير عن تكامل جين الأزهار FT 12. العمل المقدم هنا يوفر وسيلة الأمثل مفيد ليس فقط لتحليل الهستونات ولكن أيضا لأغراض أخرىلونين المرتبطة البروتينات، ومع زيادة الكفاءة وتقليل الوقت التجريبية. وعلاوة على ذلك، يوضح هذا التقرير كيف قدمت استخدام بروتوكولات الشذرة رؤى جديدة في العلاقة بين التغيرات في تعديلات لونين والدول النسخي من جينات النباتات، وكيف يمكن لهذه الآليات بوساطة لونين من تأثير السيطرة التعبير الجيني في بداية المزهرة في نبات الأرابيدوبسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. يشابك من المواد النباتية (1 ساعة)
- ينمو نبات الأرابيدوبسيس خطوط المستخدمة في التجربة (النوع البري - WT - مقابل المسوخ، و / أو خطوط معربا عن النسخة الموسومة البروتين الخاص بك من الفائدة مقابل خطوط معربا عن العلامة لا تنصهر إلى أي بروتين) لمدة 12-18 يوما على أطباق بتري كبيرة (150 ملم) مع MS-أجار المتوسطة (1 L: 1X Murashige وسكوغ أملاح، 10 غرام السكروز، 0.5 غرام MES، ودرجة الحموضة 5.7 (KOH)، 1٪ أجار). بدلا من ذلك، وتنمو النباتات على الأواني التي تحتوي على 3: 1 مزيج من التربة والخس.
تنبيه! الفورمالديهايد السامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع، وينبغي التعامل معها في غطاء الكيميائية ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. خطوات 1،2-1،6 يجب أن يتم تنفيذ تحت غطاء الدخان. - جعل ثقوب صغيرة في غطاء من 50 مل الأنابيب مع مختبر الموقد ساخنة إبرة. إضافة 40 مل من برنامج تلفزيوني 1X العازلة و1.08 مل من الفورمالدهيد إلى تركيز النهائي من 1٪ (الأسهم 37٪ الصورةolution). جمع 1.5 غرام من المواد النباتية في تلك 50 مل أنابيب. إبقاء الأنابيب على الجليد خلال يشابك.
- إغلاق 50 مل الأنابيب مع الغطاء. وضع الأنابيب في مجفف وتطبيق فراغ. فراغ التسلل الأنسجة لمدة 10 دقيقة، ثم حرر فراغ بعناية، لمنع متماوج تصل الحل. خلط العينة. كرر مرتين. بعد تسلل، ومراقبة المواد النباتية وتأكيد أن يصبح شفافة قليلا وتميل إلى تنزل الى قاع الأنبوب (الشكل 2).
- إضافة 2.5 مل من 2 M جليكاين لتحقيق تركيز النهائي من 0.125 M. تطبيق فراغ لمدة 5 دقائق. يعمل الجلايسين كمثبط تنافسي من الفورمالديهايد يشابك.
- تجاهل حل الفورمالديهايد جليكاين PBS التي كتبها قلب المغلقة أنبوب 50 مل مع ثقوب في الغطاء.
- شطف شتلات مرتين مع 1X PBS ومرة مع الماء نبذ الحل الغسيل كما هو موضح في الخطوة 1.5. تجفيفها على منشفة ورقية وتجميد السائل في nitrogeن.
ملاحظة: الأنسجة المجمدة يمكن أن تظل في -80 درجة مئوية لمدة أسابيع.
2. إعداد الأجسام المضادة (1 اليوم)
ملاحظة: للحصول على مناعي، فمن المستحسن استخدام حبات مغناطيسية مترافق مع الأجسام المضادة عبر بروتين G أو البروتين A رابط مع قابلية عالية للمجال مستمر من السلسلة الثقيلة الأجسام المضادة. يمكن المجمعات الحمض النووي والبروتينات إرفاق unspecifically إلى سطح تقارن الخرز الأجسام المضادة. لهذا السبب، فمن الضروري لأداء الضوابط دون الاجسام المضادة المحددة لقياس خلفية غير محددة ملزمة.
- لكل مناعي، وإعداد 15 ميكرولتر من حبات مغناطيسية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كمية من الخرز يعتمد على كمية من لونين تستخدم لمناعي وأيضا على الأجسام المضادة.
- أن يغسل، إضافة 1 مل من لونين مناعي (رقاقة) عازلة التخفيف من الخرز، مزيج بالتناوب ووضع microcentrifuge ل1.5 مل توأن تكون في الرف المغناطيسي. الانتظار حوالي 1 دقيقة للسماح للالخرز نعلق على المغناطيس. مع 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لا يزال في الرف، وإزالة طاف قبل pipetting. كرر مرتين.
ملاحظة: للحصول على كل سطر مصنع هناك حاجة إلى مجموعتين مناعي: واحد مع الخرز والأجسام المضادة (أب)، والثاني لا الأضداد (لا-أب) التحكم مع حبات مغناطيسية فقط. - resuspend والخرز في 200 ميكرولتر من العازلة الشذرة التخفيف. إضافة المبلغ المطلوب من أب معين إلى واحد من اثنين من أنابيب أعدت لكل خط محطة (التخفيف المحدد يختلف لكل أب وأن يكون الأمثل تجريبيا أو، في حالة الأجسام المضادة التجارية، اتبع تعليمات الشركة المصنعة). استخدام هذا النموذج لمناعي. إضافة نفس الكمية من غير محددة مفتش إلى أنبوب آخر، والتي سيتم استخدامها في مراقبة سلبية.
- احتضان O / N على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية للسماح للأضداد إرفاق الخرز.
3. لونين استخراج (4 ساعات)
ملاحظة: في هذه الخطوة، فإن نوى وجميع العضيات بيليه. EXB 1 يحتوي على السكروز كافية لتوفير عالية الكثافة ومنع اختلال هيكل عضية.
ملاحظة: EXB 2 يحتوي على 1٪ تريتون X-100 للمساعدة في انفجار البلاستيدات الخضراء المفتوحة وإزالة الكلوروفيل.
ملاحظة: هذه الخطوة تساعد إزالة المنظفات من العينة.
ملاحظة: هذاعازلة يحتوي SDS، ليز نوى والافراج عن لونين.
تنبيه! تأكد من ارتداء معدات حماية الأذن أثناء الخطوة صوتنة في حال لم يتم احتواء جهاز الموجات فوق الصوتية في خزانة عازلة للصوت.
خطوة حاسمة! تفتيت لونين يعتمد إلى حد كبير على المعدات صوتنة. ينبغي تعديل الشروط صوتنة لتحقيق تخصيب اليورانيوم في أحجام DNA المناسبة. شاهدالرقم 3 مثالا لكيفية تحسين تجزئة لونين.
ملاحظة: عينات يمكن تجميد وتخزين في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
4. مناعي من البروتين من الفائدة والإنقاذ من الحمض النووي (1 يوم، 3 ساعة)
- تغسل حبات المغلفة مع أب من الخطوة 2.4 ثلاث مرات مع 1 مل من الشذرة العازلة تخفيف لإزالة الفائض من الأجسام المضادة كما هو موضح في الخطوة 2.2. resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة الشذرة التخفيف. إضافة 50 ميكرولتر من لونين معزولة. احتضان O / N على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: التحقق من concentratiعلى من لونين في microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. يجب أن 50 ميكرولتر من لونين معزولة تحتوي على أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي. - لخطوات العمل 4،2-4،5 في 4 ° C. تغسل حبات مرتين في 1 مل من الملح منخفضة العازلة الغسل كما هو موضح في الخطوة 2.2.
- تغسل حبات مرة واحدة في 1 مل من الملح العالية العازلة غسل.
- تغسل حبات مرة واحدة في 1 مل من LiCl غسل العازلة.
- تغسل حبات مرتين في 1 مل من TE العازلة. بعد غسل الماضي، للتأكد من إزالة تماما العازلة TE المتبقية في الأنبوب بواسطة الشفط مع ماصة.
- اخراج عينات INPUT (الخطوة 3.9). نقل 5 ميكرولتر من INPUT إلى الجديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والاستمرار كما هو الحال مع عينات رقاقة. عكس يشابك بإضافة 200 ميكرولتر من 5٪ خالب أيون راتنج التبادل، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية تهز كل 2-3 دقيقة. تدور باستمرار في 16000 x ج لمدة 30 ثانية، ونقل بعناية طاف في أنبوب microcentrifuge جديد من قبل pipetting.
ملاحظة: على الرغم من أن هيئة تنظيم الاتصالاتطريقة المشروط ليشابك عكس ينطوي على O / N الحضانة مع كلوريد الصوديوم، والحضانة مع راتنج خالب أيون في 95 ° C يسمح للdecrosslinking كفاءة وشطف من الحمض النووي في 10 دقيقة، مما يجعل اليوم بروتوكول واحد أقصر. - إضافة 2 ميكرولتر من بروتين K (10 ملغ / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم البروتينات وإطلاق سراح DNA.
- وقف رد فعل من جانب تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تدور بسرعة في 16000 x ج لمدة 30 ثانية ونقل طاف لأنبوب جديد من قبل pipetting.
- تنظيف عزل الحمض النووي باستخدام معيار شظايا الحمض النووي عدة تنقية.
ملاحظة: المضي قدما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. - نقل العمود ملزمة DNA من عدة إلى 1.5 مل جديد أنبوب microcentrifuge. أزل الحمض النووي تنقيته من خلال إضافة 20 ميكرولتر من المياه خالية من الدناز إلى مركز العمود والغزل في 16000 x ج لمدة 60 ثانية. وقف النقطة: يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية لعدة أسابيع. 5. قياس وفرة ملزم مواقع في DNA Immunoprecipitated التي كتبها QPCR (4 ساعات)
- الاشعال التصميم للمناطق الجينوم في المصالح مع درجة حرارة انصهار (TM) 60 ° C ومحتوى GC من 30٪ -80٪. كما تم تجزئة لونين صوتنة، لا ينبغي أن يكون طول تسلسل تضخيمها أطول من 150-200 النيوكليوتيدات (الجدول 1).
ملاحظة: هناك أداة مفيدة لتصميم التمهيدي هو التمهيدي 3 برنامج (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). إرشادات إضافية لتصميم التمهيدي المتاحة في التقارير السابقة 8، 14،15. - استخدام برنامج BLAST للتأكد من أن الاشعال محددة (وخاصة المروجين يمكن أن تشترك TF مماثل تسلسل ملزمة) واختبار كفاءة النقيب التمهيديز 1:10 التخفيفات في الماء من الحمض النووي المدخلات (الخطوة 4.9). سيتم تنقية مناطق معينة من الجينوم أفضل من غيرها. ولذلك فمن المهم أن تصميم الاشعال PCR والتحقق منها على DNA المدخلات المخفف.
- تمييع DNA النقي 01:10 بالماء وماصة 5 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف في أنبوب PCR لكل رد فعل.
ملاحظة: تمييع فقط المبلغ المطلوب، والحمض النووي يمكن أن نعلق على جدران 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. دورات تجميد ذوبان متعددة زيادة عدد جزيئات DNA المرفقة. لكل زوج التمهيدي، والتضخيم في المدخلات، لابد من تحليلها أب رقاقة وبلا أب الشذرة. - لاستكمال مزيج PCR، إضافة SYBR الخضراء PCR مزيج الرئيسي لتركيز النهائي من 1X، و 0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي. ملء تصل إلى 20 ميكرولتر مع المياه خالية من الدناز.
- نفذ رد فعل QPCR اتباع التعليمات من SYBR الخضراء PCR مصنع مزيج الرئيسي.
- تحليل البيانات باستخدام طريقة تخصيب أضعاف.
- إنشاء جدول مع أسماء العينات والقيم ط الخام التي تم الحصول عليها بعد رد فعل QPCR.
- لكل عينة، طرح من قيمة الخام ط ط قيمة خام يتم الحصول عليها عن المقابلة سيطرة بلا أب. ملاحظة: بعد هذه العملية الحسابية، فإن قيمة ط م لعينة لا-أب يساوي 0.
- حساب تخصيب أضعاف بحلول عملية الأسية مع قاعدة 2 والأس (السلطة) مساو لبقية السلبية التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.1.2 (الجدول 2).
أضعاف تخصيب = 2 - (ط م (عينة) - ط (لا-أب))
ملاحظة: في هذا methoد مقارنة وفرة جزء DNA محددة في نموذج رقاقة إد مع وفرة من هذه القطعة في السيطرة بلا أب. افتراض من هذا الأسلوب هو أن مستوى إشارة الخلفية غير قابلة للتكرار بين مجموعات مختلفة التمهيدي، والعينات، وتكرار التجارب. ومع ذلك، هذه المستويات إشارة'noise' لا تختلف بين مجموعات التمهيدي، والعينات، والتجارب.
- تحليل البيانات عن طريق٪ من طريقة الإدخال.
- إنشاء جدول مع أسماء العينات والقيم ط الخام التي تم الحصول عليها بالنسبة لهم بعد رد فعل QPCR.
- ضبط القيم ط الخام لعينات المدخلات عن طريق طرح قيمة من قاعدة اللوغاريتم 2 من جزء من مجموع ونين المستخرج الذي اتخذ كمدخل.
ملاحظة: في هذا البروتوكول تساوي قيمة طرح 3.32، كما تم أخذ 10٪ من إجمالي ونين كمدخل في هذا البروتوكول. تسجيل 2 (10) يساوي 3.32. - حساب٪ من المدخلات عن طريق ضرب من قبل 100 قيمة العملية الأسية مع ببورصة عمان 2 والأس (السلطة) يساوي ما تبقى من قيم الإدخال المعدلة تطرح من القيم ط الخام من العينة (الجدول 3).
٪ من مدخلات = 100 * 2 (المدخلات المعدلة - ط (عينة))
ملاحظة: مع هذا الإجراء، يتم احتساب العلاقة بين وفرة DNA محددة في نموذج رقاقة إد إلى إجمالي ونين معزولة (عينة المدخلات). مزيد من التفاصيل حول تحليل البيانات رقاقة يمكن العثور عليها في هارينغ وآخرون. 8.
ملاحظة: الحمض النووي معزولة عن لونين عجل لابد من تحليلها لتحديد الحمض النووي شظايا كانت رقاقة إد من لونين الكلي، وذلك بسبب ملزما للبروتين من الفائدة.
تحليل 6. البيانات
ملاحظة: من بين السابقينisting طرق تحليل البيانات الشذرة، هي الأكثر شيوعا اثنين. أولهم هو الأسلوب تخصيب أضعاف، ويسمى أيضا "تخصيب النسبي '،' إشارة على خلفية" أو "نسبة إلى السيطرة عدم الضد. يدعى الطريقة الثانية باسم "٪ من مدخلات".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن خص ثمانية خطوات رئيسية في هذا البروتوكول رقاقة لتحديد المجراة التفاعلات DNA البروتين، بما في ذلك زراعة وحصاد المواد النباتية، عبر ربط لونين، والعزلة لونين، تجزئة لونين، والعزلة انتقائية من المجمعات بين الحمض النووي و البروتين من الاهتمام من قبل مناعي، هضم البروتين، وتنقية الحمض النووي، وتحليل QPCR (الشكل 1). خطوة حاسمة في بروتوكول الشذرة هي تثبيت للتفاعلات الحمض النووي والبروتينات في رد فعل عبر ربط. عادة، يتم استخدام الفورمالديهايد عبر ربط في مصنع رقائق. الفورمالديهايد تخترق الأنسجة ويخلق جسور بين الميثيلين NH 2 مجموعات من البروتينات أو البروتينات والنيوكليوتيدات في الحمض النووي 1 6. لتثبيت كفاءة المجمعات البروتين النووي في الجسم الحي يتطلب أن الفورمالديهايد يصل لونين داخل نواة النبات، وأنه من الضروري أن يتم المغمورة الأنسجة النباتية بشكل كامل في تيانه عازلة الفورمالديهايد لضمان أنه خلال مناعي يتم سحبها المجمعات-DNA البروتين بشكل فعال إلى أسفل. وتغطي أوراق نبات الأرابيدوبسيس في طبقات الشمع أن صعوبة انتفاذ من وكيل يشابك في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، trichomes صالح تشكيل فقاعات الهواء على سطح الأوراق، ومنع حل الفورمالديهايد من الحصول على داخل الأنسجة النباتية. للتغلب على هذا القيد، في تطبيق هذه الخطوة فراغ للعينات، ومنع تشكيل فقاعات في الحل التثبيت وتحسين تغلغل الفورمالديهايد في نوى كل الخلايا. وتظهر الشتلات بعد كفاءة المعالجة عبر ربط على الشكل 2.
خطوة رئيسية أخرى في بروتوكول الشذرة هي لونين القص. يمكن لونين شظايا كبيرة يؤدي في قرار التعيين المنخفض للمواقع الربط من البروتين من الفائدة في تسلسل الحمض النووي. في المقابل، يمكن شظايا صغيرة جدا منع التضخيم الفعال للالحمض النووي المتجه QPCR. وفقا لتجربة التجريبية، يجب أن يكون النطاق حجم ونين الأمثل لتحليل الشذرة بين 200 و 600 سنة مضت، والظروف لتحقيق تجزئة المناسب من لونين والتي سيتم تحديدها اعتمادا على الجهاز صوتنة المتوفرة في المختبر. الشكل (3) يوضح إجراءات لتحسين ونين القص لتحقيق أقصى قدر من تخصيب اليورانيوم في مجموعة من الأحجام المطلوبة DNA. قبل صوتنة، ويتكون أساسا من لونين شظايا كبيرة جدا. زيادة عدد دورات صوتنة تدريجيا يقلل من متوسط حجم الحمض النووي في عينات رقاقة، والوصول إلى تخصيب الأمثل في حدود 200-600 نقطة أساس بعد 20-30 دورات (القسم 3.8 من بروتوكول والشكل 3).
هنا، يظهر تحديد البروتين EBS مواقع للمناطق التنظيمية للتكامل الأزهار FT ملزم كمثال على فائدة تقنية رقاقة. الربط من EBS لروتكشفت انه FT مكان من خلال فحوصات رقاقة مع خطوط نبات الأرابيدوبسيس تعبر عن انصهار بروتين cMyc-EBS تحت سيطرة EBS المروج الأصلي (pEBS :: cMyc-EBS). هذا الإصدار الموسومة من EBS يعمل بشكل كامل كما هو مبين من نوع النمط الظاهري البرية من النباتات EBS متحولة معربا عن هذا التصور. تم اختبار أربع مناطق داخل FT موضع الجيني لEBS ملزمة؛ واحد في منطقة المروج من الجينات (FTII)، وهما حول الموقع بداية النسخي (FTIV، FTVI)، وآخر في إنترون الأول من FT (FTVII) (الشكل 4A). كما هو مبين في الشكل 4B، تظهر النتائج الشذرة أن البروتين EBS يمكن ربط تسلسل تنظيمي على مقربة من موقع بداية النسخي من الجين سيد المزهرة FT 12. وعلاوة على ذلك، يمكن للبروتين EBS تتفاعل سواء في المختبر والمجراة مع deacetylases هيستون مثل HDA6، وآخر البروتين ذات الصلة لونين تشارك في تنظيمالمزهرة الوقت في نبات الأرابيدوبسيس 1 7. من أجل تقييم التأثير المحتمل للEBS على مستويات أستلة هيستون في المنطقة الجينومية من FT، وأجريت فحوصات رقاقة استخدام أجسام مضادة موجهة ضد هيستون H3 الأسيتيل في lysines 9 و 14 علامة هيستون ارتباطا مع transcriptionally لونين نشطة 1 2 . وعلاوة على ذلك، توضح هذه البيانات كيف النهج رقاقة يمكن أن تساهم في تسليط الضوء على الآليات الجزيئية التي تعدل تنظيم النسخي من العمليات التنموية النبات.
الشكل 1. مخطط للمناعي لونين البروتوكول. الشذرة هي تقنية تستخدم عادة لتحقيق التفاعل بين البروتينات والحمض النووي، التي تحددها مركب كيميائي. لونين مع التفاعلات الحفاظ معزول من النوى ومجزأة. باستخدام أجسام مضادة ضد بروتين من الفائدة،يمكننا تحديد أجزاء من الحمض النووي المرتبطة به. ومترافق الأجسام المضادة لحبات مغناطيسية التي تمكن العزلة سريعة وبسيطة باستخدام رف المغناطيسي. في الخطوة التالية، تتم إزالة البروتينات عن طريق العلاج بروتين ويتم تحريرها DNA. ثم يتم استخدام شظايا الحمض النووي تنقيته كقوالب في ردود الفعل QPCR لقياس الوفرة النسبية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مثال على الأنسجة بعد عبر ربط مع الفورمالديهايد. ومن أجل تحقيق التفاعل بين الحمض النووي والبروتينات، في المجمعات الجسم الحي يجب أن تكون ثابتة لجعلها مستقرة ودائمة من خلال خطوات متعددة من البروتوكول. في هذا الإصدار من البروتوكول، يحدث التثبيت عن طريق العلاج الفورمالديهايد. اختراق كفاءة الفورمالديهايد عبتيough النسيج هو أمر حاسم لنجاح أسلوب الشذرة. (A) قبل الخطوة عبر ربط المواد النباتية يطفو على السطح من الحل وغطت مع فقاعات الهواء الصغيرة؛ السطوح مجافي المحور ومتجه نحو المحور من الأوراق تختلف في اللون. (B) بعد التثبيت، شتلات ينبغي أن تكون غارقة واضح في الحل، شفافة قليلا، ومغمورة بالتساوي في حل يشابك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويتكون الشكل 3. التحسين من الظروف صوتنة لتحليل الشذرة. معزولا لونين من المواد الثابتة من مجموعة واسعة من شظايا أطوال مع فرقة قوية في الجزء العلوي من هلام تمثل الأحجام لونين طويلة للغاية (السطر الثاني على اليسار). مع increaالغناء عدد من الدورات صوتنة، يتم إزاحة ذروة ونين شظايا أحجام نحو أجزاء أصغر. في التجربة أظهرت، أرقام دورة المثلى تختلف ما بين 20 و 30، وبعد ذلك شظايا ونين المثلى تتراوح 200-600 بي بي هي أكثر وفرة في عينة الشذرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. رقاقة تبين التحليلات EBS يربط FT وEBS الطفرات تغيير مستوى هيستون H3 أستلة في هذا الجين تكامل الأزهار. (A) المنطقة الجينومية من FT مع الصناديق السوداء التي تمثل الإكسونات. تم اختبار أربعة أجزاء تغطي المناطق التنظيمية لهذا الجين تكامل الأزهار (الرماديمربعات) من خلال تصميم الاشعال محددة QPCR. (B) EBS يربط المنطقة FT IV، وتقع على مقربة من موقع بداية النسخي. MYC-EBS يتوافق مع EBS النباتات متحولة معربا عن إصدار cMyc الموسومة من EBS. MYC يدل على النباتات المعدلة وراثيا معربا عن cMyc حاتمة لا تنصهر إلى أي الجينات نبات الأرابيدوبسيس. (C) EBS عرض النباتات متحولة فرة أعلى من H3K9،14Ac من النوع البري ندسبرغ المقف (L إيه) في جميع المناطق FT أربعة المقررة. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (B و C). تعديل من البيانات المنشورة سابقا في الخلية النباتية 1 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| إلى الأمام | عكسي | منطقة اختبار |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT السابع |
الجدول 1. الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة.
| عينة | القيم ط الخام | ط م-ط (لا-أ ب) | تخصيب أضعاف 2 - (ط م (عينة) - ط (لا-أب)) |
| لا-أب | 34.5 | 0 | 1 |
| أب | -5.3 | 39.4 |
الجدول 2. مثال لتحليل البيانات الشذرة التي كتبها "اضعاف التخصيب" الأسلوب. القيم ط م لللا-أب عينات تمثل إشارة خلفية الناجمة عن الربط غير محددة من الحمض النووي للأب / حبات مغناطيسية. يجب أن يتجاوز هذه القيم ط يجب أن يكون الفرق بين 30. القيم ط لا من أب وعينة أب أعلى من 1.
| الخطوة 1 - ضبط المدخلات | |||
| إدخال المعدل = ط الخام (المدخلات) - سجل 2 (جزء من مجموع ونين) | |||
| ط الخام | مساهمة من إجمالي ونين | تسجيل 2 10 | |
| إدخال | 29.5 | 10٪ | 3.32 |
| إدخال المعدل = 29،5-3،32 = 26.18 | |||
| الخطوة 2 -٪ من حسابات المدخلات | |||
| عينة | ط الخام | ط (المدخلات المعدلة) -Ct (عينة) | 2 ط م (المدخلات المعدلة) -Ct (عينة) * 100٪ |
| إدخال | 26.18 | ||
| الشذرة-أب | 31.45 | -5.27 | 2.59 |
| لا-أب | 34.5 | -8.32 | 0.31 |
الجدول 3. مثال لتحليل البيانات الشذرة من قبل "٪ من مدخلات" الأسلوب. وتمثل المدخلات مجموع ونين عبر ربط معزولة عن نوى، لذلك يجب أن تكون القيم ط م على قدم المساواة لجميع أزواج التمهيدي. تقليديا، يتم أخذ 5٪ أو 10٪ من لونين مجموع كمدخل. لا تمثل-أب عينة السيطرة السلبية - حبات لا المغلفة الاجسام المضادة المحددة ضد البروتين أو علامة من ينتيريست. الشذرة-أب لتقف على العينة بعد مناعي مع أجسام مضادة ضد بروتين أو علامة من الفائدة.
| PBS 10X |
| 1.3 M كلوريد الصوديوم |
| 30 ملي نا 2 هبو 4 |
| 30 ملي ناه 2 PO 4 |
| درجة الحموضة 7 |
| استخراج العازلة 1 (EXB 1) |
| 0.4 M السكروز |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| 10 ملي MgCl |
| 5 ملم β المركابتويثانول |
| مثبطات الأنزيم البروتيني |
| استخراج العازلة 2 (EXB 2) |
| 0.25 M السكروز |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| 10 ملي MgCl 2 |
| 1٪ تريتون X-100 </ td> |
| 5 ملم β المركابتويثانول |
| مثبطات الأنزيم البروتيني |
| استخراج العازلة 3 (EXB 3) |
| 1.7 M السكروز |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| 0.15٪ تريتون X-100 |
| 2 مم MgCl 2 |
| 5 ملم β المركابتويثانول |
| مثبطات الأنزيم البروتيني |
| العازلة صوتنة |
| 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| 10 ملي EDTA |
| 1٪ SDS |
| مثبطات الأنزيم البروتيني |
| الشذرة العازلة التخفيف |
| 1.1٪ تريتون X-100 |
| 1.2 ملي EDTA |
| 16.7 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| 167 ملي كلوريد الصوديوم |
| مثبطات الأنزيم البروتيني |
| انخفاض عازلة السلط |
| 150 ملي كلوريد الصوديوم |
| 0.1٪ SDS |
| 1٪ تريتون X-100 |
| 2 مم EDTA |
| 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| ارتفاع الملح العازلة الغسل |
| 500 ملي كلوريد الصوديوم |
| 0.1٪ SDS |
| 1٪ تريتون X-100 |
| 2 مم EDTA |
| 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| LiCl غسل العازلة |
| 0.25 M LiCl |
| 1٪ NP-40 |
| 1٪ deoxycholate الصوديوم |
| 1 ملم EDTA |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8 |
| 1 ملم EDTA |
الجدول 4. تكوين الاحتياطي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الشذرة الموصوفة هنا هو أسلوب استنساخه وقوية لتحليل التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي محددة في الجسم الحي في النباتات نبات الأرابيدوبسيس. A تحديد الناجح لمواقع الربط للبروتينات ذات الاهتمام يتطلب اختيار كافية من أجهزة النبات أو مراحل النمو حيث التفاعلات ذات الصلة وتتخذ فعلا. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جدا للحصول على التثبيت المناسب من المواد النباتية والقص الأمثل للونين صوتنة. أجسام مضادة محددة للغاية للمناعي فعال لاختيار بروتين / العلامة ضرورية أيضا.
استخدام النهج الشذرة في محطات يواجه بعض الصعوبات المتعلقة بحضور المركبات الثانوية وجدران الخلايا التي يمكن ان تتداخل مع الخطوات المختلفة في البروتوكول. وعلاوة على ذلك، تعقد الأجهزة مصنع، وغالبا ما تحتوي على أنواع الخلايا متعددة حيث البروتين ملزمة DNA من الباحثerest يمكن أن تكون موجودة بشكل مختلف أو نشاطا، أعاقت استخدام هذه المنهجية. لهذا السبب، كلما كان ذلك ممكنا هو الأكثر فائدة لاستخدامها في رقاقة النهج الأنسجة متجانسة حيث ثبت وجود و / أو النشاط من البروتين من الفائدة بالفعل. المواد النباتية المعقدة التي تحتوي على أنسجة مختلفة تميل الى التسبب في التخفيف من أنواع الخلايا حيث البروتين في الواقع الوظائف. الأنسجة باجتزاء 2 0 وقد استخدمت في محطات للدراسات في الأنسجة الفردية أو أنواع الخلايا. ومع ذلك، خلال السنوات الأخيرة، وقد وضعت إجراءات مختلفة لعزل خلايا الكروماتين نوع معين في نبات الأرابيدوبسيس 8 إلى مجموعة من الشظايا المثلى (انظر القسم ممثل النتائج) 7. وكما ذكر أعلاه، فإن الظروف لتحقيق هذا التوزيع حجم تعتمد إلى حد كبير على معدات الموجات فوق الصوتية المحددة المستخدمة. في أي حال، يجب أن تبقى لونين في درجة حرارة منخفضة لمنع عكس يشابك المفضلةبواسطة الحرارة المتولدة أثناء صوتنة. وينبغي أن توفر الجهاز صوتنة الاختيار على مستوى جيد من التكاثر، والتي جنبا إلى جنب مع الظروف تجزئة المثلى، أمر ضروري لتحليل الشذرة (الشكل 3).
آخر عاملا رئيسيا في التجارب رقاقة الناجحة هو الضد الذي تم اختياره لمناعي من البروتين من الفائدة. الأجسام المضادة التي أثيرت ضد عوامل النسخ النباتية يمكن أن تكون مفيدة لتحليل الشذرة، ولكن هذه الأمصال يجب اختبارها بدقة لأن الأجسام المضادة المحددة في التجارب الغربية وصمة عار ليست صالحة للرقاقة بالضرورة. بالإضافة إلى ذلك، وكثيرا ما تستخدم الأجسام المضادة التي أثيرت ضد علامات مختلفة لهذا البروتوكول. هي اجسام مضادة رقاقة الصف الاعتراف تحديدا مجموعة متنوعة من العلامات المتاحة تجاريا، ولها ميزة أنها قد تم اختبارها في مختبرات عدة. العيب لاستخدام هذه الأجسام المضادة التجارية هو أن البروتين من الفائدة يجب أن تنصهر في حاتمة المقابلةوأعرب في خطوط المعدلة وراثيا (الشكل 4B). في هذه الحالة، فإنه من المستحسن للتأكد من أن البروتين خيالية غير وظيفية عن طريق توليد نبات الأرابيدوبسيس خطوط المعدلة وراثيا تحمل البروتين الانصهار في الخلفية الوراثية التي تعاني من نقص في الجين ترميز البروتين لدينا من الفائدة. فإن تكامل من تشوهات المظهرية لخط متحولة في النباتات المعدلة وراثيا تأكيد أن البروتين الانصهار يحتفظ النشاط الطبيعي للبروتين الذاتية. عندما يتم إنتاج خطوط المعدلة وراثيا لتحديد مواقع الربط من المنظمين النسخي، فمن الأفضل استخدام المروج الذاتية لدفع التعبير عن بروتين الموسومة، ومنع المشاكل المرتبطة مع الاستفادة من المروجين قوي التأسيسي (انظر أعلاه). أجسام مضادة محددة للتعديلات posttranslational هيستون مثل الحامض أو أستلة من بقايا محددة وكثيرا ما تستخدم أيضا في رقاقة تحاليل لتحديد المناظر الطبيعية epigenomic من الجينات المعنية فيتنظيم عدد من العمليات التنموية، بما في ذلك السيطرة على الوقت المزهرة (الشكل 4C). أما بالنسبة للأجسام مضادة ضد العلامات، والأجسام المضادة التجارية رقاقة الصف هي الخيار المفضل في حالة علامات هيستون.
النهج التجريبية الشذرة بالإضافة إلى التعبير الجيني التحليلات كان لهم دور فعال في زيادة معرفتنا حول كيفية عوامل النسخ، لونين البروتينات إعادة عرض، والتعديلات هيستون التساهمية تعدل التعبير عن جينات لها دور في تنظيم العمليات والاستجابات البيولوجية النباتية. وضعت في البداية كوسيلة لتحليل التفاعل بين البروتينات الموجودة في لونين مع معينة المناطق المكاني أو الجينات، وابلا من الموارد الجينومية والتكنولوجيا NGS سمحت رقاقة لتصبح أداة قوية لالتنميط على نطاق الجينوم من البروتينات الحمض النووي ملزم مثل هذه كما عوامل النسخ أو الهستونات المعدلة والمتغيرات هيستون. وقد وفرت رقاقة رقاقة ورقاقة وما يليها من dimen العالمي الجديدسيون الى التحليلات التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي لونين في نبات الأرابيدوبسيس 2 5. وتعتبر النهج رقاقة وما يليها البديل من خيار رقاقة رقاقة، والتي تقوم على المصفوفات التهجين ويدخل بعض التحيز، بالنظر إلى أن هذه المصفوفات تحتوي على عدد محدود من تحقيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
