Summary
染色质免疫沉淀是一 个功能强大的技术的DNA结合蛋白拟南芥的体内位点的鉴定。此过程包括染色质交联和碎裂，免疫沉淀与针对感兴趣的蛋白的选择性抗体，和结合的DNA的定量PCR分析。我们描述了拟南芥植物优化的一个简单的ChIP实验。
Introduction
近年来广泛的遗传，分子和基因组工具被开发在模型物种拟南芥。该技术促进了极大的进展，了解如何植物生长发育的调节。在使用拟南芥为模式研究的发展过程中，开花时间的基因控制已经被广泛分析。这些研究表明，植物开花响应于内源性线索非常精确的时间调制如激素和植物的年龄，并且还认为则同步开花时间随着季节1的自然循环环境信号诸如光周期和温度， 2。拟南芥突变体的分离和鉴定与改建开花的时候已经决定在公布的基因，调节开花时间响应内源性因素和环境因素的复杂网络。这些遗传电路集成在充当开花交换机的几个主基因水平和花芽分化的确切时间取决于促进开花，压制这项工作的花卉积分基因1,3上游活动的平衡。
确定了其在开花开始的控制作用的基因的功能特性，由最近使用基因组学方法的帮助下，已揭示转录调控中的开花时间的调制的中心作用。事实上，许多的开花编码转录的主控基因因子4。此外，一些染色质重塑蛋白复合物影响开花的主基因的表达。许多拟南芥突变体中分离得到的改变的开花时间的横空出世，携带突变基因编码的各种染色质修饰的。不同的染色质remodelers的引入华宏翻译后修饰Ë尾巴，重新定位相对于DNA核或组蛋白变体交换规范的组蛋白所必需的开花拟南芥5,6的适当调节。其中的一些染色质重塑活动催化沉积或除去的共价修饰，如乙酰化或甲基化的组蛋白的特定残基。这些组蛋白标记由该招募其他染色质重塑复合物，转录因子或转录机制的成分以调节开花的基因的转录活性专门效应特异性识别。
染色质免疫沉淀（ChIP）允许在体内的DNA结合位点的感兴趣的蛋白质（图1）的识别。这个过程利用了某些化学品的能力交联的蛋白质的DNA。得到的DNA蛋白质复合物可以通过使用特异性抗体来阿加然后免疫沉淀研究所转录因子，染色质结合蛋白，或特定变型和异源表位（通常被称为“标签”）附连到所选择的蛋白质。从这些免疫沉淀物进行纯化的DNA可以用作定量PCR（qPCR的）反应的模板，以评估所关注的特定序列的富集。以这种方式，转录因子的结合位点或在特定的基因组蛋白标记的分布可以建立7,8。此外，结合新一代测序（NGS），使大规模平行测序，芯片技术已经成为可能的转录因子结合位点，以及组蛋白修饰揭幕表观景观的全基因组的鉴定。此外，基因表达的同时分析可以监控转录调节如何结合或特定组蛋白标记的沉积相关的转录活性状况TY基因9。
利用拟南芥的ChIP协议允许评估的影响，多种转录调节因子有开花的主控基因的染色质组织，如何将这些结构变化影响基因表达5,6。以前的结果表明，拟南芥基因先期抽薹在短日照 （EBS）作为开花突变体中该基因节目开花和开花的FT的主基因的上调的加速度的阻遏。此外，丧失功能的突变的FT充分抑制EBS突变植物的早期开花表型，这表明FT需要EBS突变体的过早开花和EBS是必要的这个主开花10的基因的压制，11。EBS编码含有PHD-蛋白可以特异性结合组蛋白H3的二和三甲基在第Ë赖氨酸残基4（H3K4me2 / 3），这表明对EBS在FT 12的染色质介导的抑制的作用。使用该芯片的做法表明，拟南芥含有PHD蛋白EBS 10,11结合花卉积分FT基因的调控区，以抑制其表达12。通过使用芯片技术所获得的额外数据表明，该蛋白质是必需的，以保持在拟南芥发展初期低水平组蛋白乙酰化，活性转录的标志的，在这个主开花的基因的染色质。这些观察，连同遗传和基因表达数据，证明该拟南芥含有PHD-蛋白具有在开花时间的微调通过调制花香积分基因FT 12的表达的中心作用。这里提出的工作提供了优化的方法不仅对组蛋白的分析，但也可用于其他有用染色质相关蛋白质，和以更高的效率和降低的实验时间。此外，该报告说明了如何使用的ChIP协议提供了新的见解中染色质修饰改变和植物基因的转录状态之间的关系，以及如何将这些染色质介导的基因表达的控制影响的机制上开花拟南芥的发作。
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Protocol
1.交联的植物材料（1小时）
- 生长在实验中使用的Arabidopsis品系（野生型 - WT - 与突变体，和/或线表达自己感兴趣的蛋白质的相对线表达该标记的标记版本不融合的任何蛋白质）12-18天上大培养皿（150毫米）与MS琼脂培养基（1L：1个的Murashige＆Skoog盐，10g的蔗糖，0.5g的MES，pH值5.7（KOH），1％琼脂）。另外，生长在含有3盆植物：1混合土和蛭石。
注意！甲醛是通过吸入，皮肤接触及吞食，并应在化学罩穿上适当的个人防护装备进行处理。步骤1.2 - 1.6应在通风橱下进行。 - 使在50ml试管用实验室燃烧器加热的针的盖小的孔。加入40毫升的1×PBS缓冲液和1.08甲醛毫升至1％的终浓度（股票37％s的olution）。收集1.5克植物材料在这些50ml试管。请交联过程中冰上管。
- 关闭50ml试管与盖。将管在干燥器和施加真空。真空渗入组织10分钟，然后小心地释放真空，以防止搅动起来的溶液。混合样本。重复两次。浸润后，观察植物材料，并确认它变得稍微半透明的，并趋向于下沉到管（图2） 的底部。
- 添加2.5毫升2M的甘氨酸以达到0.125 M的最终浓度应用真空5分钟。甘氨酸作为甲醛交联的竞争性抑制剂。
- 通过反转闭合50ml管中，在该盖的孔丢弃PBS甲醛甘氨酸溶液。
- 与如在步骤1.5中所述的水弃去洗涤液冲洗小植株两次用1×PBS和一次。干他们在纸巾上并冷冻在液态nitrogeñ。
注：冷冻组织可保持在-80℃为周。
2.制备的抗体的（1天）
注：对于免疫沉淀，利用经由蛋白质G或蛋白质与抗体重链的恒定结构域的高亲和性的连接物结合有抗体的磁珠被推荐。的DNA-蛋白复合物可以非特异性地连接到所述珠 - 抗体偶联物的表面上。出于这个原因，有必要进行控制，而不特异性抗体来定量非特异性背景结合。
- 对于每一个免疫沉淀，制备15微升磁珠在1.5ml微量离心管中。的小珠的量取决于用于免疫沉淀和也对抗体的染色质的量。
- 洗，加入1 ml的染色质免疫沉淀（ChIP）稀释缓冲液至珠，通过旋转混合，然后将1.5 ml微量涂在一个磁性机架。等待约1分钟，以让所述珠附着到磁体。与1.5 ml微量离心管仍然在机架上，通过移液除去上清液。重复两次。
注：对于每个植物系，需要两个免疫组：1与珠子和抗体（抗体）和第二无抗体（无抗体）控制与仅磁珠。 - 重悬在200微升的ChIP稀释缓冲液珠。添加所需的特异性Ab的量为每个植物系中制备的两个管中的一个（确切稀释不同于每个Ab和具有由实验优化，或在商业抗体的情况下，按照制造商的说明）。使用该样品进行免疫沉淀。添加非特异性IgG的相同量的其他管，其将被用作阴性对照。
- 孵育O / N上的旋转轮，在4℃下，让该抗体附着到珠子上。
3.染色质萃取（4小时）
注：在这一步骤中，细胞核，所有的细胞器将沉淀。 EXB 1含有足够的蔗糖，以提供高密度，防止细胞器结构的破坏。
注：EXB 2中含有1％的Triton X-100不由一阵叶绿体开并取下叶绿素。
注：此步骤有助于除去从样品的洗涤剂。
注：此缓冲液含有SDS，以裂解细胞核和释放染色质。
小心！确保期间中的情况下超声装置不包含在一个隔音柜内超声处理步骤到穿耳朵保护设备。
关键的一步！染色质碎片在很大程度上取决于超声设备。超声处理条件应进行调整，以实现富集的合适的DNA尺寸。看到图3为如何优化染色质片段化的一个例子。
注意：样品可以冷冻并储存在-20℃下几个星期。
4.免疫沉淀利益的蛋白质和DNA的救援（1天，3小时）
- 从步骤用1ml的ChIP稀释缓冲液洗涂覆有抗体的珠子的2.4三倍如步骤2.2中所述，以除去过量的抗体。重悬在200微升的ChIP稀释缓冲液。加入50微升孤立的染色质。孵育O / N旋转轮上，在4℃。
注：检查concentrati在微量紫外可见分光光度计的染色质。 50微升孤立染色质应包含超过10个的DNA微克。 - 对于在4℃的步骤4.2-4.5工作。如在步骤2.2中描述的1ml低盐洗涤缓冲液洗两次的珠。
- 1毫升高盐洗涤缓冲液洗一次的珠子。
- 在1ml的LiCl洗涤缓冲液洗一次珠。
- 在1ml TE缓冲液洗两次的珠。最后一次洗涤后，请务必通过抽吸完全删除TE缓冲留在管吸管。
- 取出输入样本（步骤3.9）。转印5微升输入到一个新的1.5 ml离心管，并继续作为与芯片的样品。反向加入200微升5％的螯合离子交换树脂的交联，并孵育10分钟，在95℃下振荡，每2-3分钟。降速在16000×g离心30秒，小心地通过吸液将上清液转移到一个新的离心管中。
注意：当TRA用于交联的逆转ditional方法涉及的O / N培养用NaCl，与螯合离子树脂在95℃下温育允许有效解交联和DNA在10分钟洗脱，因此使得协议之一天缩短。 - 加入2微升蛋白酶K（10毫克/毫升），并在37℃下30分钟以消化蛋白质并释放DNA。
- 停止反应，在95℃下孵育10分钟。
- 快速旋转，在16000×g离心30秒，并通过移液转移上清至新管。
- 清洁用标准的DNA片段纯化试剂盒的DNA分离出来。
注：根据制造商的说明进行操作。 - 从试剂盒中的DNA结合柱转移到新的1.5ml微量管中。通过加入20微升DNA酶的水，以塔的中心，并在16000×g离心纺丝60秒洗脱纯化的DNA。停止点：样品可以贮存于-80℃下几个星期。 5.测量结合位点的免疫沉淀DNA通过qPCR的丰度（4小时）
- 设计的引物用于以60℃的熔融温度（Tm）为30％-80％的GC含量感兴趣的基因组区域。染色质通过超声处理片段化，扩增序列的长度不应该比150-200个核苷酸（表1）长。
注：引物设计的一个有用的工具是底漆3程序（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）。对于引物设计的附加 准则在以前的报告中8，14，15。 - 使用BLAST程序，以确保引物是特定的（特别是启动子可以共享相似TF结合序列）和测试引物效率使用设克1点10稀释在输入脱氧核糖核酸（步骤4.9）的水中。基因组的特定区域将被净化比别人做得更好。因此，重要的是设计PCR引物，并检查它们的稀释输入的DNA。
- 稀释纯化的DNA以1:10的水和吸管在PCR管为每个反应取5μl稀释的DNA。
注的稀释：仅在需要的量，因为DNA可以连接到1.5 ml微量离心管的壁。多个解冻冷冻循环增加附着的DNA分子的数量。对于每个引物对，扩增在输入，抗体芯片和无抗体的ChIP已经被分析。 - 要完成PCR混合物，SYBR绿PCR主混合物添加到1倍的终浓度，及0.5每种引物μM。填充至20微升用DNase的水。
- 执行定量PCR反应后的的SYBR Green PCR主混合物制造商的说明。
- 通过倍富集法数据分析。
- 创建与已定量PCR反应后获得的样品名称和原始Ct值的电子表格。
- 对于每个样品，从它的原始Ct值减去用于相应无抗体对照获得的原始Ct值。注：本数学运算后，对于无抗体样品Ct值将等于0。
- 通过求幂运算计算倍富集与基座2和指数（功率）等于在步骤6.1.2（表2）中获得的负的余数。
倍浓缩= 2 -数（Ct（样品） -的Ct（无抗体））
注：在此实现方法具D中的ChIP-ED试样中的特定DNA片段的丰度与该片段中无抗体对照的丰度进行比较。该方法的前提是，背景信号的电平是可重复的不同的引物组，样品，并重复实验之间。然而，这种'noise'信号电平做引物组，样品和实验之间变化。
- 由％输入法的数据分析。
- 创建与样品名称和qPCR反应后已获得他们的原始Ct值的电子表格。
- 通过从总提取染色质的被取作输入的分数中减去对数底数2的值调整原始Ct值对输入样本。
注：在本协议中的减值等于3.32，占总染色质的10％被作为一个输入在这个协议。日志2（10）等于3.32。 - 通过乘以100求幂运算的用b值计算％输入的酶2和指数（功率）等于从样品（见表3）的原始Ct值中减去调整后的输入值的剩余部分。
％输入= 100 * 2 （调整后的输入-的Ct（样品））
注意：对于这个过程，以总孤立染色质（输入取样）特异性DNA丰度的片编样品之间的关系来计算。芯片数据分析的进一步细节，可以在哈林等人 8中找到。
注：脱氧核糖核酸从沉淀的染色质中分离已被分析，以确定哪些DNA片段已沉淀-编从总染色质，由于它结合到感兴趣的蛋白质。
6.数据分析
注：其中前isting分析的ChIP-数据的方式，两个是最常用的。的其中第一个是在倍富集方法，也命名为“相对富集”，“信号超过背景”或“相对于无抗体对照'。第二种方法被命名为“％输入的”。
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Representative Results
八个主要步骤可以单挑在此芯片协议用 于体内蛋白-DNA相互作用，包括生长和收获的植物材料，交联的染色质的，染色质隔离，染色质片段化，DNA和之间的复合物的选择性分离的的识别通过免疫沉淀，蛋白质消化，DNA纯化，和qPCR分析（图1）感兴趣的蛋白质。在芯片协议的一个关键步骤是DNA-蛋白质相互作用的交联反应进行固定。典型地，甲醛交联是用在植物沉淀。甲醛穿透组织和DNA中的1 6产生的NH 2基团的蛋白质或蛋白质和核苷酸之间的亚甲基桥。 体内核蛋白复合物的高效定影要求甲醛达到植物细胞核内染色质，并且它是必不可少的植物组织在吨完全浸没他甲醛缓冲，以确保免疫沉淀期间蛋白质-DNA复合物有效地下拉。拟南芥叶子覆盖蜡层是困难交联剂进入细胞的外显率。此外，毛状体有利于气泡的叶片的表面上的形成，防止甲醛溶液从得到的植物组织的内部。为了克服这一限制，在该步骤真空被施加到样品，从而防止气泡在固定溶液的形成和改善甲醛的渗透到所有细胞的核。有效交联处理后幼苗示于图2。
在芯片方案的另一个关键步骤是染色质剪切。大染色质片段可导致的DNA序列中的目的蛋白质的结合位点的低分辨率测绘的。与此相反，非常小的片段可以防止的有效扩增结合的DNA通过qPCR。根据实际经验，最优染色质尺寸范围的ChIP分析应该是在200和600碱基对，和条件，以实现对染色质的适当碎裂根据在实验室中可用的超声处理装置上已被设置。 图3示出了过程，以优化染色质剪切实现的DNA尺寸的期望的范围内的最大富集。超声之前，染色质主要由非常大的碎片。超声处理周期的数目增加逐渐降低的ChIP样品中的DNA的平均尺寸，后20-30个循环（该协议的3.8节和图3）达到在200-600碱基范围内的最佳富集。
这里，EBS蛋白结合位点的花香积分器FT的调节区的鉴定被示为芯片技术的有用的例子。 EBS的结合到t他的FT基因座通过ChIP分析揭开用表达天然EBS启动子（PEBS :: cMYC的-EBS）的控制下，一个cMYC的-EBS融合蛋白Arabidopsis品系。 EBS的这个标签版本是全功能如图EBS突变植物表达该构建体的野生型表型。基因组FT基因座内四个地区进行了测试EBS结合;一个在基因（FTII），两个围绕转录起始位点（FTIV，FTVI），而另一个在FT（FTVII）（图4A）的第一内含子的启动子区。 如图4B所示，沉淀结果表明，该蛋白质的EBS可以结合调节序列接近开花的FT 12的主基因的转录起始位点。此外，EBS蛋白能够在体外和体内具有组蛋白脱乙酰如HDA6，参与调节另一个染色质相关蛋白质相互作用开花时间在拟南芥1 7。为了评估EBS对中的FT的基因组区域的组蛋白乙酰化的水平的可能影响，ChIP实验均使用针对组蛋白H3乙酰化赖氨酸9和14的抗体进行的，一组蛋白标记相关与转录活性的染色质1 2 。此外，这些数据说明了如何的ChIP方法可以向揭示了调节植物发育过程的转录调控的分子机制的光。
的染色质免疫沉淀协议。沉淀的图1方案是一种通常用于研究蛋白质和DNA，固定由化学化合物之间的相互作用的技术。与染色质相互作用保存从细胞核和零散孤立的。通过使用抗感兴趣蛋白质，我们可以选择的DNA连接到它的片段。所述抗体是偶联至磁珠，使用磁力架快速和简单的隔离。在下一步骤中，蛋白质被蛋白酶处理除去和DNA被释放。纯化的DNA片段，然后用作定量PCR反应模板来衡量他们的相对丰度。 请点击此处查看该图的放大版本。
图的组织的后交联与甲醛2.实施例。为了研究DNA和蛋白质之间的相互作用， 在体内络合物具有被固定以使它们稳定和持久通过多个步骤的协议。在这个版本的协议，固定时用甲醛处理。甲醛THR的有效渗透ough所述组织是芯片方法的成功是至关重要的。 （A）的交联步骤中的植物材料浮在溶液的表面上，并覆盖有小气泡之前;叶的远轴和近轴表面不同的颜色。 （二）固定后，植株应明显浸泡在溶液中，微透明，均匀地沉浸在交联的解决方案。 请点击此处查看该图的放大版本。
图从固定材料 3 的优化的 超声处理条件的ChIP分析。染色质分离由广泛片段的长度与在凝胶的顶部代表极长染色质的大小（在左边的第二行）一个强条带。随着increa唱声处理周期数，染色质的片段大小的峰值移向更小的片段。在所示的实验中，最佳的周期数字20和30之间变化，在这之后的最佳染色质片段，从200到600基点的芯片样品中更加丰富。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 沉淀分析表明EBS结合 FT和 EBS 突变改变的组蛋白H3乙酰本花香积分基因的水平。FT的（A）与表示外显子的黑盒子的基因组区域。 4个片段跨越这花香积分基因调控区进行了测试（灰箱）通过设计特定的定量PCR引物。 （B）的结合的EBS 对 FT第四区域，位于靠近转录起始位点。 MYC-EBS对应于EBS突变植物表达EBS的cMYC的标记版本; Myc蛋白表示转基因植物表达cMYC的表位没有融合到任何拟南芥的基因。 （ 三）EBS突变体植株显示丰度较高H3K9,14Ac比野生型兰茨贝格万寿菊 （L ER）在评估所有四个FT地区。误差线显示标准差（B和C）。 从植物细胞此前公布的数据修改1 2。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 前锋 | 相反 | 区域测试 |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT七 |
表1引物在该研究中使用。
| 样品 | 原始CT值 | CT-CT（无抗体） | 倍富集 2 - 数（Ct（样品） -的Ct（无抗体）） |
| 无抗体 | 34.5 | 0 | 1 |
| 抗体 | -5.3 | 39.4 |
芯片数据分析的“倍浓缩”的方法，CT值无抗体样品表2例代表引起DNA的AB /磁珠的非特异性结合的背景信号。这些Ct值应该超过无Ab和抗体样品的Ct值之间的差值30应高于1。
| 第1步-调整输入 | |||
| 调整后的输入=原始的Ct（输入） -登录2（总染色质的分数） | |||
| 原始的Ct | 从总的染色质输入 | 日志2 10 | |
| 输入 | 29.5 | 10％ | 3.32 |
| 调整后的输入= 29.5 - 3.32 = 26.18 | |||
| 步骤2 - ％输入计算 | |||
| 样品 | 原始的Ct | CT（调整输入）-CT（ 样品） | 2 的Ct（调整后的输入）-ct（样品）* 100％ |
| 输入 | 26.18 | ||
| 沉淀抗体 | 31.45 | -5.27 | 2.59 |
| 无抗体 | 34.5 | -8.32 | 0.31 |
的芯片的数据分析通过“输入的％”方法表3实施例。输入表示总交联的染色质从细胞核中分离，因此，Ct值应该等于对所有的引物对。以往，5％或总染色质的10％被作为一个输入。无抗体代表负对照样品 - 未通过针对INTERES的蛋白质或标记的特异性抗体涂覆的珠吨。的ChIP抗体手段与针对该蛋白或感兴趣标记的抗体免疫沉淀后的样品。
| PBS 10倍 |
| 1.3 M氯化钠 |
| 的30mM 的 Na 2 HPO 4 |
| 的30mM的NaH 2 PO 4 |
| pH值7 |
| 提取缓冲液1（EXB 1） |
| 0.4蔗糖 |
| 的10mM的Tris-HCl pH为8 |
| 10毫米氯化镁 |
| 5mM的β巯基乙醇 |
| 蛋白酶抑制剂 |
| 提取缓冲液2（EXB 2） |
| 0.25M蔗糖 |
| 的10mM的Tris-HCl pH为8 |
| 10毫米氯化镁2 |
| 1％的Triton X-100 </ TD> |
| 5mM的β巯基乙醇 |
| 蛋白酶抑制剂 |
| 提取缓冲液3（EXB 3） |
| 1.7蔗糖 |
| 的10mM的Tris-HCl pH为8 |
| 0.15％的Triton X-100 |
| 2毫米氯化镁2 |
| 5mM的β巯基乙醇 |
| 蛋白酶抑制剂 |
| 超声缓冲液 |
| 的50mM的Tris-HCl pH为8 |
| 10mM EDTA的 |
| 1％SDS中 |
| 蛋白酶抑制剂 |
| 沉淀稀释液 |
| 1.1％的Triton X-100的 |
| 1.2毫摩尔EDTA |
| 16.7毫的Tris-HCl pH为8 |
| 167毫米氯化钠 |
| 蛋白酶抑制剂 |
| 低盐缓冲液 |
| 150毫米氯化钠 |
| 0.1％SDS中 |
| 1％的Triton X-100的 |
| 2mM EDTA的 |
| 的20mM的Tris-HCl pH为8 |
| 高盐洗涤缓冲液 |
| 500毫米氯化钠 |
| 0.1％SDS中 |
| 1％的Triton X-100的 |
| 2mM EDTA的 |
| 的20mM的Tris-HCl pH为8 |
| 氯化锂洗涤液 |
| 0.25M的氯化锂 |
| 1％NP-40 |
| 1％脱氧胆酸钠 |
| 1mM EDTA的 |
| 的10mM的Tris-HCl pH为8 |
| 的10mM的Tris-HCl pH为8 |
| 1mM EDTA的 |
表4.缓存组成。
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Discussion
此处所描述的沉淀协议是一个可再现的和强大的技术来分析蛋白质和特定的DNA序列之间的相互作用在体内在拟南芥植物。一个成功的鉴定结合位点的目的蛋白质需要适当的选择植物器官或发育阶段，其中相关的相互作用实际上是正在发生的。此外，重要的是，获得的植物材料的适当的固定和染色质的通过超声处理的最佳剪切。是对于所选择的蛋白质/标签的有效免疫沉淀的高度特异性抗体也是必不可少的。
使用的ChIP方法在植物中面临与次级代谢物和细胞壁，可以潜在地在协议不同步骤干扰的存在一些困难。此外，植物器官的复杂性，通常含有多种细胞类型其中int的DNA结合蛋白erest可以是差异性存在或活性，阻碍了使用这种方法的。出于这个原因，只要有可能是最有利的，沉淀用接近其中感兴趣的蛋白的存在和/或活性是已经证实均质组织。含有不同的组织复杂的植物材料往往引起稀释的细胞类型，其中实际上是蛋白质的功能。组织切片2 0已被用于在植物中在个体的组织或细胞类型的研究。然而，在最近几年，不同的程序已经开发了用于细胞类型特异性的染色质在拟南芥8的隔离的范围最佳片段（见代表结果部分）7。如上述所讨论的，条件，以实现这个尺寸分布在很大程度上取决于所使用的特定超声设备。在任何情况下，染色质应保持低温，以防止逆转青睐的交联热超声过程中产生的。选择的超声处理装置应提供再现性良好的水平，这与最佳断裂条件，为的ChIP分析（图3）是必不可少的。
在成功的芯片实验的另一个关键因素是所选择的抗体对感兴趣的蛋白质的免疫沉淀。提出对植物的转录因子的抗体可能是芯片分析非常有用，但这些血清应彻底测试，因为在免疫印迹试验检测抗体并不一定适用于芯片中。此外，经常用于这一协议提出对不同的标记的抗体。的ChIP同类抗体特异性识别各种标记是市售的，并且有，他们已经在几个实验室进行测试的优点。其缺点为用这些商业抗体是所关注的蛋白质具有要熔合到相应的表位的并表示在转基因品系（图4B）。在这种情况下，最好是确保该嵌合蛋白质是功能通过产生拟南芥转基因系轴承融合蛋白在遗传背景缺乏编码我们感兴趣的蛋白质的基因。在转基因植物的突变系的表型异常的互补将确认融合蛋白保留了内源蛋白的正常活性。当转基因品系产生识别转录调节的结合位点，它是优选使用的内源启动子以驱动标记蛋白的表达，防止与组成型强启动子（见上文）的利用率相关的问题。组蛋白的翻译后修饰，如甲基化或特定的残基的乙酰化，也经常用于沉淀的特异性抗体分析，以确定所涉及的基因的表观风景规的一个数发育过程，包括开花时间的控制（图4C）的。作为针对标签的抗体，芯片级的商业抗体的组蛋白标记的情况下优先选择。
的ChIP实验方法联接到基因表达分析已经有助于关于如何转录因子，染色质重塑蛋白和组蛋白的共价修饰调节涉及植物生物过程和响应的调节的基因的表达增加我们的知识。最初开发作为一种方法来分析存在于与特定基因座或基因区域的染色质蛋白的相互作用，脉冲串的基因组资源和NGS技术使沉淀成为一个有力的工具，DNA结合蛋白如的全基因组谱作为转录因子或修饰的组蛋白和组蛋白变体。的ChIP-chip和芯片起提供了一个新的全球扪锡永到染色质蛋白质和DNA之间的相互作用在拟南芥2 5的分析。芯片起方法被认为是选择的ChIP-chip，这是基于杂交阵列和介绍了一些偏差的替代方案中，考虑到这些阵列包含探针的数量有限。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
