Summary
Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.
Introduction
In den letzten Jahren eine Vielzahl von genetischen, molekularen und genomischen Werkzeuge wurden in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana entwickelt. Diese Technologie hat sich enorm die Fortschritte im Verständnis, wie die Pflanzenentwicklung reguliert wird erleichtert. Unter den Entwicklungsprozesse untersucht unter Verwendung von Arabidopsis als Modell hat sich die genetische Kontrolle der Blütezeit wurde ausgiebig untersucht. Diese Studien haben gezeigt, dass Pflanzen modulieren, sehr genau den Zeitpunkt der Blüte als Reaktion auf endogene Signale wie Hormone und Alter der Anlage, aber auch auf Umweltsignale, wie beispielsweise Fotoperiode und der Temperatur, die der Blüte synchronisieren Zeit mit den natürlichen Kreislauf der Jahreszeiten 1, 2. Die Isolierung und Charakterisierung von Arabidopsis-Mutanten mit Veränderungen in der Zeit der Blüte wurde Determinante Enthüllung eines komplexen Netzwerks von Genen, die die Blütezeit als Reaktion auf endogene und Umweltfaktoren zu regulieren. Diese genetischen Schaltkreiseauf der Ebene der wenigen Master-Gene, die als Schalter der Blüte handeln integriert, und der genaue Zeitpunkt der Initiierung Blumen hängt von der Balance der Blüte zu fördern und zu verdrängen Aktivitäten, die stromaufwärts von den Blumen Integrator-Gene 1,3 zu arbeiten.
Die funktionelle Charakterisierung von Genen, die für ihre Rolle bei der Kontrolle der Blüte Einleitung identifiziert, von der jüngsten Nutzung genomischer Ansätze unterstützt, haben die zentrale Rolle der Transkriptionsregulation bei der Modulation der Blütezeit ergab. In der Tat, viele der Mastergene der Blüte kodieren Transkriptionsfaktoren 4. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Chromatin-Remodeling-Protein-Komplexe beeinflussen die Expression der Mastergene der Blüte. Eine Anzahl der Arabidopsis-Mutanten auf ihre veränderten Blühzeit isoliert erwies sich Mutationen in Genen eine Vielzahl von Chromatin Modifikatoren kodiert tragen. Verschiedene Chromatin remodelers die posttranslationale Modifikationen in Histon einzuführene Schwänze, neu zu positionieren Nukleosomen relativ zur DNA oder kanonischen Histone austauschen durch Histon-Varianten sind für die ordnungsgemäße Regulierung der Blüte in Arabidopsis 5,6. Einige dieser Chromatin-Remodeling-Aktivitäten katalysieren die Ablagerung oder Entfernung von kovalenten Modifikationen wie Acetylierung oder Methylierung spezifischer Histon-Resten. Diese Histonmarkierungen werden spezifisch durch spezialisierte Effektoren, die andere Chromatin-Remodeling-Komplexe, Transkriptionsfaktoren oder Komponenten der Transkriptionsmaschinerie zu rekrutieren, um die Transkriptionsaktivität der Blüte Gene regulieren erfasst.
Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ermöglicht die Identifizierung von in vivo-DNA-Bindungsstellen für Proteine von Interesse (Abbildung 1). Dieses Verfahren nutzt die Fähigkeit von bestimmten Chemikalien zu vernetzen, die Proteine mit der DNA. Die resultierenden DNA-Protein-Komplexe können dann unter Verwendung von spezifischen Antikörpern immunpräzipitiert werden against Transkriptionsfaktoren, Chromatin-bindende Proteine oder bestimmte Modifikationen und heterologe Epitope zu dem Protein der Wahl angebracht (im allgemeinen als "Tags" genannt). Die aus diesen Immunpräzipitaten gereinigte DNA kann als Matrize in quantitative PCR (qPCR) Reaktionen verwendet werden, um für die Anreicherung bestimmter Sequenzen von Interesse zu bewerten. Auf diese Weise können die Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren oder die Verteilung Histonmarkierungen in bestimmten Genen 7,8 hergestellt werden. Darüber hinaus kombiniert mit Next Generation Sequencing (NGS), die massiv parallele Sequenzierung ermöglicht, Chip-Technologie ist möglich, die genomweite Identifizierung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren sowie Enthüllung epigenomischen Landschaften von Histon-Modifikationen vorgenommen. Ferner ist die gleichzeitige Analyse der Genexpression ermöglicht die Überwachung, wie die Bindung von Transkriptionsregulatoren oder die Abscheidung insbesondere Histonmarkierungen korrelieren mit der Transkriptions activity von Genen 9.
Die Verwendung von Chip-Protokolle in Arabidopsis hat es die Bewertung der Auswirkungen, dass eine Vielzahl von Transkriptionsregulatoren haben auf der Chromatin-Organisation des Mastergene der Blüte und wie diese strukturellen Veränderungen beeinflussen die Genexpression 5,6. Vorherige Ergebnisse zeigten, dass die Arabidopsis-Locus EARLY BOLTING im Kurztag (EBS) als Repressor der Blüte und Mutanten in diesem Gen zeigen eine Beschleunigung der Blüte und Hochregulation von dem Master-Gen der Blüte FT wirkt. Darüber hinaus loss-of-function Mutationen im FT vollständig zu unterdrücken, die früh blühende Phänotyp der ebs mutierten Pflanzen, die anzeigt, dass FT wird für die vorzeitige Blüte der ebs Mutanten und dass EBS ist für die Unterdrückung von diesem Meister-Gen der Blüte 10 erforderlich erforderlich , 11. EBS kodiert ein PHD-haltigen Protein, das spezifisch binden können Histon H3 Di- und in th trimethyliertese Lysin 4 Rückstand (H3K4me2 / 3), was auf eine Rolle für die EBS in der Chromatin-vermittelten Repression der FT 12. Die Verwendung des Chips Ansatz gezeigt, dass die Arabidopsis PHD-enthaltendes Protein EBS 10,11 bindet regulatorischen Regionen des Blumen Integrator Gen FT seinen Ausdruck 12 zu unterdrücken. Durch die Verwendung von Chip-Technologie erhalten zusätzliche Daten zeigen, dass dieses Protein ist erforderlich, um niedrige Histonacetylierung, ein Markenzeichen der aktiven Transkription im Chromatin dieser Mastergens der Blüte während Anfangsstadien von Arabidopsis Entwicklung. Diese Beobachtungen zusammen mit genetischen und Genexpressionsdaten, zeigen, dass diese Arabidopsis PHD haltige Protein hat eine zentrale Rolle bei der Feinabstimmung der Blütezeit durch Modulation der Expression des Blumen Integrator Gen FT 12. Die vorliegende Arbeit stellt ein optimiertes Verfahren nützlich, nicht nur für die Analyse von Histonen sondern auch für andereChromatin-assoziierten Proteinen, und mit mehr Effizienz und weniger Versuchszeit. Darüber hinaus zeigt dieser Bericht, wie die Verwendung von Chip-Protokolle hat neue Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen Veränderungen der Chromatinstruktur Modifikationen und Transkriptions Staaten von Pflanzengenen diese Chromatin-vermittelten Mechanismen der Gen-Expressionskontroll Auswirkungen auf den Beginn der Blüte in Arabidopsis vorgesehen ist, und wie.
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Protocol
1. Die Vernetzung des Pflanzenmaterials (1 h)
- Wachsen die Arabidopsis-Linien in dem Experiment verwendet (Wildtyp - WT - gegen Mutanten und / oder Linien der markierten Version des Proteins von Interesse im Vergleich zu Linien das Tag zum Ausdruck bringen zum Ausdruck zu keinem Protein fusioniert) für 12-18 Tage auf großen Petrischalen (150 mm) mit MS-Agarmedium (1 L: 1x Murashige & Skoog-Salze, 10 g Sucrose, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% Agar). Alternativ wachsen Pflanzen auf Töpfe mit 3: 1 Mischung aus Erde und Vermiculit.
VORSICHT! Formaldehyd ist giftig beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken und sollte in einer chemischen Abzugshaube trägt geeignete persönliche Schutzausrüstung handhaben. Schritte 1,2-1,6 sollte unter dem Abzug durchgeführt werden. - Stellen kleine Löcher in den Deckel der 50-ml-Röhrchen mit einem Laborbrenner heizten Nadel. 40 ml 1x PBS-Puffer und 1,08 ml Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 1% (stock 37% solution). Sammeln 1,5 g Pflanzenmaterial in den 50-ml-Röhrchen. Während der Vernetzung Halten Sie die Röhrchen auf Eis.
- Schließen Sie die 50-ml-Röhrchen mit dem Deckel. Die Röhrchen in einem Exsikkator und gelten Vakuum. Vacuum infiltrieren das Gewebe für 10 Minuten, dann lassen Sie das Vakuum vorsichtig, am laufenden Band die Lösung zu verhindern. Mischen Sie die Probe. Zweimal wiederholen. Nach der Infiltration des Pflanzenmaterials zu beobachten und bestätigen, dass sie leicht durchscheinend wird, und neigen dazu, an der Unterseite des Rohres (2) zu sinken.
- Hinzufügen von 2,5 ml von 2 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M zu erreichen Anwenden Vakuum 5 min. Glycin wirkt als kompetitiver Inhibitor von Formaldehyd vernetzt.
- Verwerfen die PBS formaldehyd Glycin-Lösung durch Invertieren des geschlossenen 50-ml-Röhrchen mit Löchern im Deckel.
- Zweimal mit 1 × PBS und einmal Spülen Sie die Pflänzchen mit Wasser Verwerfen der Waschlösung, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Trocknen Sie sie auf ein Papiertuch und frieren in flüssiger nitrogen.
HINWEIS: Gefrorenes Gewebe kann bei -80 ° C für Wochen aufbewahrt.
2. Herstellung der Antikörper (1 Tag)
HINWEIS: Immunpräzipitation wird die Verwendung von mit Antikörpern über eine Protein G oder Protein A-Linker mit einer hohen Affinität für die konstante Domäne der Antikörperschwerkette konjugierte magnetische Perlen empfohlen. Die DNA-Protein-Komplexe können unspezifisch an der Oberfläche der Kügelchen-Antikörper-Konjugate zu befestigen. Aus diesem Grund ist es notwendig, Kontrollen ohne spezifische Antikörper durchzuführen, um die nicht-spezifische Hintergrundbindung zu quantifizieren.
- Für jede Immunpräzipitation vorzubereiten 15 ul magnetischen Perlen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die Menge der Kügelchen hängt von der Menge des Chromatin für die Immunpräzipitation als auch an den Antikörper verwendet.
- Zu waschen, 1 ml Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Verdünnungspuffer an die Beads, mischen durch Rotation und legen Sie die 1,5 ml Mikro tuwerden in einem Magnethalter. Warten Sie etwa 1 min zu lassen, die Kügelchen mit dem Magneten befestigen. Mit der 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen noch im Rack, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Zweimal wiederholen.
HINWEIS: Für jedes Pflanzenlinie zwei Immunpräzipitation Sätzen benötigt werden: eine mit den Perlen und Antikörper (Ab), und eine zweite ohne Antikörper (No-Ab) Steuerung mit nur magnetischen Kügelchen. - Resuspendieren der Kügelchen in 200 ul ChIP Verdünnungspuffer. Die erforderliche Menge des spezifischen Ab, um eine der beiden Röhren für jedes Pflanzenlinie hergestellt (die genaue Verdünnung unterscheidet sich für jeden Ab und muss experimentell optimiert werden oder, im Falle der kommerziellen Antikörper, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers). Verwenden Sie dieses Beispiel für die Immunpräzipitation. Dieselbe Menge an unspezifischer IgG zu der anderen Röhre, die als negative Kontrolle verwendet wird.
- Inkubieren O / N auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C der Antikörper an die Kügelchen zu befestigen zu lassen.
3. Chromatin Extraction (4 Stunden)
HINWEIS: In diesem Schritt werden die Kerne und alle Organellen zu pelletieren. ExB 1 enthält genügend Saccharose in hoher Dichte und die Verhinderung einer Unterbrechung der Organellen-Struktur.
HINWEIS: ExB 2 enthält 1% Triton X-100 zu platzen helfen, das Chloroplasten öffnen und entfernen Chlorophyll.
Hinweis: Dieser Schritt hilft Entfernen des Detergens aus der Probe.
HINWEIS: DiesePuffer enthält SDS, um die Kerne zu lysieren und lassen Sie die Chromatin.
VORSICHT! Achten Sie darauf, Gehörschutzausrüstung während der Beschallungsschritt bei der Ultraschall-Gerät nicht in einem schalldichten Gehäuse enthalten tragen.
Entscheidenden Schritt! Das Chromatin Fragmentierung hängt weitgehend von der Beschallungstechnik. Die Beschallung Bedingungen sollten angepasst werden, um die Anreicherung in den entsprechenden DNA-Größen zu erreichen. SehenFigur 3 für ein Beispiel dafür, wie Chromatin-Fragmentierung zu optimieren.
Bemerkung: Die Proben können eingefroren und bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
4. Immunpräzipitation des Proteins von Interesse und Rettung von DNA (1 Tag, 3 Stunden)
- 2.4 dreimal Waschen Sie die mit dem Ab-beschichteten Kügelchen aus Schritt mit 1 ml ChIP Verdünnungspuffer, um Überschuß an Antikörper zu entfernen, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Resuspendieren in 200 ul Verdünnungspuffer ChIP. In 50 ul isolierten Chromatin. Inkubieren O / N auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C.
HINWEIS: Überprüfen Sie die concentratiauf der Chromatinstruktur in Mikrovolumen UV-Vis-Spektralphotometer. 50 ul von isolierten Chromatin sollte mehr als 10 & mgr; g DNA enthalten. - Für die Schritte 4,2-4,5 Arbeit in 4 ° C. Zweimaliges Waschen der Kügelchen in 1 ml salzarmen Waschpuffer wie in Schritt 2.2 beschrieben.
- Einmal in 1 ml High Salt Waschpuffer Waschen der Kügelchen.
- Einmal in 1 ml LiCl Waschpuffer Waschen der Kügelchen.
- Zweimal in 1 ml TE-Puffer Waschen der Kügelchen. Nach dem letzten Wasch, stellen Sie sicher, vollständig zu entfernen die TE-Puffer in der Röhre nach links durch Absaugen mit einer Pipette.
- Nehmen Sie die INPUT-Proben (Schritt 3.9). Transfer 5 ul der Eingabe in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und weiter wie mit dem Chip-Proben. Reverse-Vernetzung durch Zugabe von 200 ul 5% chelatbildenden Ionenaustauscherharzes, und Inkubation für 10 min bei 95 ° C, alle 2-3 min schütteln. Spin down bei 16.000 × g für 30 Sekunden und der Überstand vorsichtig übertragen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen durch Pipettieren.
HINWEIS: Während der trasätzliche Verfahren zum Vernetzen Umkehr beinhaltet eine O / N Inkubation mit NaCl, die Inkubation mit einem chelatbildenden Ionenharz bei 95 ° C ermöglicht eine effiziente Entnetzung und Elution der DNA in 10 min, daher macht das Protokoll einen Tag kürzer. - Add 2 ul Proteinase K (10 mg / ml) und bei 37 ° C für 30 min, um Proteine zu verdauen und zu lösen DNA.
- Die Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min.
- Schnell Spin bei 16.000 × g für 30 Sekunden und Überstand in ein neues Röhrchen durch Pipettieren.
- Reinigen Sie die DNA mit einem Standard-DNA-Fragmente Purification Kit isoliert.
HINWEIS: Gehen Sie nach den Anweisungen des Herstellers. - Übertragen Sie die DNA-Bindungssäule aus dem Kit in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Elution der gereinigten DNA durch Zugabe von 20 ul DNase-freiem Wasser zum Zentrum der Säule und Zentrifugieren bei 16.000 xg für 60 sec. Haltepunkt: Die Proben können bei -80 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. 5. Mess Fülle von Bindungsstellen in der immunpräzipitierten DNA durch qPCR (4 h)
- Design von Primern für die genomischen Regionen von Interesse mit einer Schmelztemperatur (Tm) von 60 ° C und einem GC-Gehalt von 30% -80%. Chromatin ist durch Beschallung fragmentiert, sollte die Länge der amplifizierten Sequenz von nicht mehr als 150-200 Nukleotiden (Tabelle 1).
HINWEIS: Ein nützliches Werkzeug für die Primer-Design ist Primer-3-Programm (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Zusätzliche Leitlinien für die Primer-Design sind in früheren Berichten 8 verfügbar, 14,15. - Verwenden Sie einen BLAST-Programm, um sicherzustellen, dass die Primer spezifisch sind (insbesondere Promotoren können ähnliche TF Bindungssequenzen zu teilen) und testen Sie die Primereffizienz using 1:10 Verdünnungen in der Wasser der eingesetzten DNA (Schritt 4.9). Bestimmte Bereiche des Genoms wird besser als andere gereinigt werden. Es ist daher wichtig, um PCR-Primer zu entwerfen und überprüfen sie auf das verdünnte Eingangs DNA.
- Verdünnen der gereinigten DNA 1:10 mit Wasser und Pipetten 5 ul der verdünnten DNA in einem PCR-Röhrchen für jede Reaktion.
HINWEIS: Verdünnen nur die benötigte Menge, da DNA an den Wänden der 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu befestigen. Mehrere Auftauen Gefrierzyklen erhöhen die Anzahl der DNA-Moleküle gebunden. Für jedes Primerpaar, Verstärkung in der Eingangs hat Ab-Chip und No-Ab ChIP analysiert werden. - Um die PCR-Mix abzuschließen, ergänzen SYBR Green PCR Master-Mix zu einer Endkonzentration von 1X, und 0,5 & mgr; M von jedem Primer. Füllen Sie bis zu 20 & mgr; l mit DNase-freiem Wasser.
- Führen Sie die qPCR Reaktion nach den Anweisungen des SYBR Green PCR Master-Mix-Hersteller.
- Datenanalyse durch fache Anreicherung Methode.
- Erstellen Sie eine Tabelle mit den Proben Namen und raw Ct-Werte, die nach der qPCR Reaktion erhalten wurden.
- Für jede Probe subtrahieren seiner rohen Ct-Wert der rohen Ct-Wert für den entsprechenden No-Ab Steuerung erhalten. HINWEIS: Nach dieser mathematischen Operation wird Ct Wert für No-Ab Proben 0 entsprechen.
- Berechnen fache Anreicherung durch Potenzierung mit Basis 2 und Exponenten (Leistung) gleich der negativen Rest im Schritt 6.1.2 (Tabelle 2) erhalten.
fache Anreicherung = 2 - (Ct (Probe) - Ct (No-Ab))
HINWEIS: In dieser method die Abundanz eines bestimmten DNA-Fragments in dem Chip-ed Probe wird mit der Häufigkeit dieses Fragment in No-Ab Kontrolle verglichen. Die Übernahme dieser Verfahren ist, dass der Pegel des Hintergrundsignals ist reproduzierbar zwischen verschiedenen Primer-Sets, Beispiele und Wiederholungsversuchen. Allerdings tun dies'noise' Signalpegel zwischen Primer-Sets, Proben und Experimente variieren.
- Datenanalyse durch% der Eingabemethode.
- Erstellen Sie eine Tabelle mit den Proben Namen und raw Ct-Werte, die für sie nach der qPCR Reaktion erhalten wurden.
- Einstellen rohen Ct-Werte für Eingangsabtastwerte durch Subtrahieren eines Wertes, der Logarithmus zur Basis 2 aus dem Bruchteil der gesamten extrahierten Chromatin die als Eingabe genommen wurde.
HINWEIS: In diesem Protokoll der subtrahierte Wert gleich 3,32, als 10% der Gesamt Chromatin als Eingang in dieses Protokoll gemacht. Log 2 (10) ist gleich 3,32. - Berechnen% der Eingangs durch Multiplikation mit 100 den Wert der Potenzierung Betrieb mit base 2 und Exponenten (Leistung) gleich Rest des eingestellten Eingangswerte aus rohen Ct-Werte der Probe (Tabelle 3) subtrahiert.
% Der Eingangs = 100 * 2 (bereinigtes Eingangs - Ct (Probe))
HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird das Verhältnis zwischen den spezifischen DNA Fluss in dem Chip-ed Probe zu der Gesamt isolierten Chromatin (Eingangsabtastwert) berechnet. Weitere Einzelheiten zur Chip-Daten-Analyse kann in Haring et al. 8 gefunden werden.
HINWEIS: DNA vom ausgefallenen Chromatin isoliert muss analysiert werden, um zu bestimmen, welche DNA-Fragmente aus der Gesamt Chromatin gewesen ChIP-ED, aufgrund ihrer Bindung an das Protein von Interesse.
6. Datenanalyse
HINWEIS: Unter dem Exbestehenden Möglichkeiten der Analyse ChIP-Daten, zwei am häufigsten verwendet werden. Der erste von ihnen ist die Falte Anreicherungsmethode, die auch als "relative Anreicherung", "Signal über Hintergrund" oder "gegenüber dem Nicht-Antikörper-Kontrolle" bezeichnet. Das zweite Verfahren wird als "% der Eingang" benannt.
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Representative Results
Acht Hauptschritte in diesem Chip-Protokoll zur Identifizierung von in vivo-Protein-DNA-Wechselwirkungen, umfassend das Züchten und Ernten von Pflanzenmaterial, Vernetzen der Chromatin Chromatin Isolierung Chromatin Fragmentierung selektive Isolierung der Komplexe zwischen DNA und vereinzelt werden, das interessierende Protein durch Immunfällung, Proteinverdauung, DNA-Reinigung und qPCR-Analyse (Abbildung 1). Ein entscheidender Schritt in dem Chip-Protokoll ist die Fixierung von DNA-Protein-Interaktionen in einer Vernetzungsreaktion. Typischerweise wird Formaldehyd Vernetzung in Pflanzen ChIP verwendet. Formaldehyd in das Gewebe eindringt und schafft Methylenbrücken zwischen den NH2-Gruppen von Proteinen oder Proteinen und Nukleotiden in der DNA 1 6. Eine effiziente Fixierung Nucleoproteinkomplexen in vivo erfordert, dass Formaldehyd das Chromatin innerhalb der Pflanzenzellkerne erreicht, und es ist wichtig, dass das Pflanzengewebe vollständig in t tauchter Formaldehyd-Puffer, um sicherzustellen, dass während Immunpräzipitation die Protein-DNA-Komplexe werden effizient nach unten gezogen. Arabidopsis Blätter werden in Wachsschichten bedeckt, die nur schwer die Penetranz des Vernetzungsmittels in die Zellen. Zusätzlich Trichomen begünstigen die Bildung von Luftblasen an der Oberfläche der Blätter, verhindert die Formaldehyd-Lösung in das Innere des Pflanzengewebes. Um diese Beschränkung zu überwinden, wird in diesem Schritt ein Vakuum an die Proben angelegt, verhindert die Bildung von Blasen in der Fixierungslösung und zur Verbesserung der Penetration von Formaldehyd in die Kerne aller Zellen. Sämlinge nach effizienten Vernetzungsbehandlung sind auf Abbildung 2 dargestellt.
Ein weiterer wichtiger Schritt in der Chip Protokoll Chromatin Scher. Große Chromatinfragmenten kann in geringer Auflösung Kartierung der Bindungsstellen des Proteins von Interesse in der DNA-Sequenz führen. Im Gegensatz dazu kann sehr kleinen Fragmente effiziente Amplifikation zu verhinderndie gebundene DNA durch qPCR. Nach empirischen Erfahrungen sollte die optimale Chromatin Größenbereich für Chip-Analyse zwischen 200 und 600 bp, und die Bedingungen sind, um die entsprechende Fragmentierung des Chromatins haben, in Abhängigkeit von der Beschallungseinrichtung im Labor vorhanden einstellbar erzielen. 3 zeigt die Verfahren Chromatin Scher optimieren, um die maximale Anreicherung im gewünschten Bereich von DNA Größen erreichen. Vor der Beschallung, Chromatin besteht hauptsächlich aus sehr großen Fragmente. Eine erhöhte Anzahl von Ultraschall-Zyklen schrittweise reduziert die durchschnittliche Größe der DNA in Chip-Proben, das Erreichen der optimalen Anreicherung im Bereich von 200 bis 600 bp nach 20-30 Zyklen (Abschnitt 3.8 des Protokolls und Abbildung 3).
Hier wird die Identifizierung des EBS Proteinbindungsstellen an regulatorische Regionen der Blumen Integrator FT als ein Beispiel für die Nützlichkeit der Chip-Technik gezeigt. Die Bindung von EBS bis ter FT-Locus wurde durch ChIP Assays mit Arabidopsis-Linien eine cMyc-EBS-Fusionsprotein unter der Kontrolle des nativen EBS-Promotor (PEBS :: cMyc-EBS) zum Ausdruck entwirrt. Dies markierte Version des EBS ist voll funktionsfähig, wie durch den Wildtyp-Phänotyp der ebs mutierten Pflanzen, die dieses Konstrukt exprimieren, gezeigt. Vier Regionen innerhalb der genomischen FT-Locus wurden für EBS-Bindung getestet; eine in der Promotorregion des Gens (FTII), zwei um die Transkriptionsstartstelle (FTIV, FTVI) und einen weiteren in dem ersten Intron FT (FTVII) (4A). Wie in 4B gezeigt, ChIP Ergebnisse zeigen, dass die EBS-Protein kann eine regulatorische Sequenz in der Nähe des Transkriptionsstartstelle des Master-Gen der Blüte FT 12 zu binden. Weiterhin kann das EBS-Protein in vitro und in vivo mit Histondeacetylasen wie HDA6, anderen Chromatin-verwandten Proteins in der Regulation beteiligt zu interagierenBlütezeit in Arabidopsis 1 7. Um den möglichen Einfluss der EBS über das Niveau der Histon-Acetylierung in der genomischen Region des FT zu beurteilen, wurden ChIP-Tests unter Verwendung eines gegen die Histon H3 in Lysine 9 und 14 acetyliert gerichteten Antikörpers, ein Histon Markierung mit transkriptionell aktive Chromatin korreliert 1 2 . Darüber hinaus sind diese Daten zeigen, wie ChIP Ansätze können dazu beitragen, die molekularen Mechanismen, die die Transkriptionsregulation von Pflanzenentwicklungsprozesse modulieren zu vergießen.
Abbildung 1 Schematische Darstellung des Chromatin Immunpräzipitationsprotokoll. Chip ist eine Technik, die üblicherweise verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA, die durch eine chemische Verbindung fixiert zu untersuchen. Chromatin mit erhaltenen Wechselwirkungen wird aus den Kernen und fragmentiert isoliert. Unter Verwendung von Antikörpern gegen das Protein von Interesse,Wir können DNA-Fragmente mit ihm verbunden zu wählen. Der Antikörper wird an magnetische Kügelchen, die eine schnelle und einfache Isolierung unter Verwendung eines magnetischen Rack ermöglichen konjugiert. Im nächsten Schritt werden die Proteine durch Proteinase-Behandlung entfernt und die DNA freigesetzt wird. Gereinigtes DNA-Fragmente werden dann als Vorlagen in qPCR Reaktionen auf ihre relative Häufigkeit zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Beispiel eines Gewebes nach der Vernetzung mit Formaldehyd. Um Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu untersuchen, die in vivo-Komplexe müssen fixiert werden, um sie stabil und dauerhaft durch die mehreren Schritte des Protokolls zu machen. In dieser Version des Protokolls erfolgt Fixierung durch Formaldehydbehandlung. Effiziente Eindringen von Formaldehyd through das Gewebe ist entscheidend für den Erfolg des Chip-Verfahren. (A) vor dem Vernetzungsschritt das Pflanzenmaterial schwimmt auf der Oberfläche der Lösung und ist mit kleinen Luftbläschen bedeckt; abaxialen und adaxial Oberflächen der Blätter in der Farbe unterscheiden. (B) Nach der Fixierung sollte Pflänzchen sichtbar in der Lösung eingeweicht werden, leicht transparent und gleichmäßig in der Vernetzungslösung eingetaucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Optimierung der Beschallung Bedingungen für Chip-Analyse. Chromatin isoliert von festen Material besteht aus breiten Spektrum von Fragmenten Längen mit einem starken Band an der Spitze des Gels, die extrem lange Chromatin Größen (zweite Zeile auf der linken Seite). Mit zunehden Zahl Beschallungszyklen wird der Peak der Chromatinfragmenten Größen zu kleineren Fragmenten verschoben. In dem gezeigten Experiment variieren optimale Zykluszahlen zwischen 20 und 30, nach der die optimale Chromatin-Fragmente von 200 bis 600 bp sind häufiger in der Chipprobe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Chip-Analysen zeigen, dass die EBS bindet FT und EBS-Mutationen verändern das Niveau der Histon H3 Acetylierung in diesem Blumen Integrator-Gen. (A) genomischen Region von FT mit schwarzen Boxen, die Exons. Vier Fragmente Spanning regulatorischen Regionen dieser Blumen Integrator-Gen wurden getestet (grauBoxen) durch die Gestaltung spezifischen qPCR Primer. (B) EBS bindet die Region FT IV, in der Nähe der Transkriptionsstartstelle entfernt. Myc-EBS entspricht mutierten Pflanzen ebs die cMyc-markierten Version des EBS zum Ausdruck bringen; Myc zeigt transgenen Pflanzen die cMyc Epitop keiner Arabidopsis-Gen fusioniert. (C) ebs mutierten Pflanzen zeigen höhere Fülle von H3K9,14Ac als Wildtyp-Landsberg erecta (L r) in allen vier FT Regionen bewertet. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung (B und C). Geändert von zuvor veröffentlichten Daten in der Pflanzenzelle 1 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Vorwärts | Umkehren | 100px"> Region getestet |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tabelle 1. Primer in dieser Studie verwendet.
| Sample | Raw CT-Werte | Ct-Ct (No-Ab) | Fache Anreicherung 2 - (Ct (Probe) - Ct (No-Ab)) |
| No-Ab | 34,5 | 0 | 1 |
| Ab | -5,3 | 39,4 |
Tabelle 2. Beispiel von Chip-Datenanalyse durch "fache Anreicherung" -Methode. CT-Werte für No-Ab Proben repräsentieren die Hintergrundsignal durch unspezifische Bindung von DNA an die Ab / magnetische Kügelchen verursacht. Diese Ct-Werte überschreiten sollte 30 Unterschied zwischen Ct-Werte von No-Ab und Ab Probe sollte höher als 1 sein.
| Schritt 1 - Stellen Sie den Eingangs | |||
| Das bereinigte Eingang = Raw Ct (Eingang) - log 2 (Bruchteil der gesamten Chromatin) | |||
| Raw Ct | Eingang von insgesamt Chromatin | Log 2 10 | |
| Eingang | 29,5 | 10% | 3.32 |
| Das bereinigte Eingang = 29,5 bis 3,32 = 26,18 | |||
| Schritt 2 -% der Eingangs Berechnungen | |||
| Sample | Raw Ct | Ct (bereinigtes Eingang) -Ct (Probe) | 2 Ct (bereinigtes Eingang) -Ct (Probe) * 100% |
| Eingang | 26.18 | ||
| ChIP-Ab | 31,45 | -5,27 | 2.59 |
| No-Ab | 34,5 | -8,32 | 0.31 |
Tabelle 3. Beispiel Chip-Daten-Analyse mit "% des Eingangs" Methode. Eingänge stellen die Gesamt vernetzten Chromatin aus Kernen getrennt, so dass die Ct-Werte sollte gleich für alle Primerpaare sein. Herkömmlicherweise ist 5% oder 10% der Gesamt Chromatin als eine Eingabe gemacht. No-AB für eine negative Kontrollprobe - die Perlen nicht durch spezifische Antikörper gegen das Protein oder Tag der interes beschichtett. ChIP-Ab steht für die Probe nach der Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen das Protein oder Umbau von Interesse.
| PBS 10x |
| 1,3 M NaCl |
| 30 mM Na 2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Extraktionspuffer 1 (ExB 1) |
| 0,4 M Saccharose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl |
| 5 mM β-Mercaptoethanol |
| Protease-Inhibitoren |
| Extraktionspuffer 2 (ExB 2) |
| 0,25 M Saccharose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl 2 |
| 1% Triton X-100 </ td> |
| 5 mM β-Mercaptoethanol |
| Protease-Inhibitoren |
| Extraktionspuffer 3 (ExB 3) |
| 1,7 M Saccharose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 0,15% Triton X-100 |
| 2 mM MgCl 2 |
| 5 mM β-Mercaptoethanol |
| Protease-Inhibitoren |
| Beschallungspuffer |
| 50 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| Protease-Inhibitoren |
| ChIP Verdünnungspuffer |
| 1,1% Triton X-100 |
| 1.2 mM EDTA |
| 16,7 mM Tris-HCl pH 8 |
| 167 mM NaCl |
| Protease-Inhibitoren |
| Niedrigsalzpuffer |
| 150 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| High Salt Waschpuffer |
| 500 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| LiCl Waschpuffer |
| 0,25 M LiCl |
| 1% NP-40 |
| 1% Natriumdesoxycholat |
| 1 mM EDTA |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 1 mM EDTA |
Tabelle 4. Pufferzusammensetzung.
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Discussion
Die hier beschriebene ChIP-Protokoll ist eine reproduzierbare und leistungsfähige Technik, um Wechselwirkungen zwischen Proteinen und spezifischen DNA-Sequenzen in vivo in Arabidopsis-Pflanzen zu analysieren. Eine erfolgreiche Identifizierung von Bindungsstellen für die Proteine von Interesse erfordert eine angemessene Auswahl der Pflanzenorgane oder Entwicklungsstadien, wo die relevanten Wechselwirkungen tatsächlich stattfindet. Darüber hinaus ist es wichtig, eine geeignete Fixierung des Pflanzenmaterials und eine optimale Scherung des Chromatin durch Ultraschallbehandlung erhalten. Hochspezifische Antikörper für die effiziente Immunpräzipitation des ausgewählten Proteins / Tag sind auch wichtig.
Die Verwendung von Chip-Ansätze in Pflanzen Flächen einige Schwierigkeiten auf die Anwesenheit von Sekundärmetaboliten und Zellwände, die möglicherweise mit verschiedenen Schritte in dem Protokoll stören können verwandt. Außerdem ist die Komplexität des Pflanzenorganen, oft mehrere Zelltypen enthält, wobei das DNA-bindende Protein von interest differentiell vorhanden oder aktiv zu sein, haben die Verwendung dieser Methode behindert. Aus diesem Grund, wenn möglich es am vorteilhaftesten in der Chip verwenden nähert homogenen Geweben, in denen die Anwesenheit und / oder Aktivität des Proteins von Interesse sind bereits belegt. Komplexe Anlagen Materialien, die verschiedene Gewebe neigen dazu, eine Verdünnung der Zelltypen, wo das Protein tatsächlich Funktionen verursachen. Gewebeschneide 2 0 in Anlagen für Studien in einzelnen Geweben oder Zelltypen verwendet. Jedoch in den letzten Jahren verschiedene Verfahren wurden für die Isolierung von Zelltyp-spezifische Chromatin in Arabidopsis 8 auf einen Bereich der optimalen Fragmente (siehe Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) entwickelt 7. Wie oben diskutiert, um die Bedingungen, die diese Größenverteilung zu erreichen stark von der speziellen Ultraschall-Geräten abhängen. In jedem Fall sollte Chromatin bei niedriger Temperatur gehalten werden, um Umkehrung der Vernetzung begünstigt verhinderndurch Wärme während der Beschallung erzeugte. Die Beschallung Gerät der Wahl sollte eine gute Reproduzierbarkeit, die zusammen mit optimalen Fragmentierung Bedingungen ist von wesentlicher Bedeutung für die Chip-Analyse (Abbildung 3) zu schaffen.
Ein weiterer wichtiger Faktor bei der erfolgreichen ChIP-Experimente ist der bevorzugte Antikörper zur Immunpräzipitation des Proteins von Interesse. Antikörper, die gegen Pflanzentranskriptionsfaktoren erhöht kann für Chip-Analyse sein, aber diese Seren sollten gründlich getestet werden, da Antikörper im Western-Blot-Experimenten überprüft sind nicht unbedingt gültig für Chip. Zusätzlich werden Antikörper, die gegen verschiedene Tags erhöht häufig für dieses Protokoll verwendet wird. ChIP-grade Antikörper spezifisch erkennt eine Vielzahl von Tags sind im Handel erhältlich und haben den Vorteil, dass sie in mehreren Laboratorien getestet. Der Nachteil für die Verwendung dieser handelsüblichen Antikörpern ist, dass das Protein von Interesse ist dem entsprechenden Epitop fusioniert werden,und in transgenen Linien (4B) ausgedrückt. In diesem Fall ist es sinnvoll, dass das chimäre Protein ist funktionell durch Erzeugen Arabidopsis transgene Linien mit dem Fusionsprotein in einem genetischen Hintergrund, der defizient in unserer Protein von Interesse kodierenden Gens. Die Komplementation der phänotypischen Abnormalitäten des Mutantenlinie in den transgenen Pflanzen bestätigt, dass das Fusionsprotein mit der normalen Tätigkeit des endogenen Proteins beibehält. Wenn transgene Linien produziert werden, um die Bindungsstellen von Transkriptionsregulatoren zu identifizieren, ist es vorzuziehen, den endogenen Promotor zu verwenden, um die Expression des markierten Proteins zu fahren und verhindert die Probleme mit der Verwendung von konstitutiven starken Promotoren (siehe oben) verbunden. Spezifische Antikörper für Histon posttranslationale Modifikationen wie zB Methylierung oder Acetylierung spezifischer Rückstände werden auch häufig in der Chip-Analysen verwendet, um die epigenomischen Landschaften von Genen in die beteiligten bestimmenRegulierung einer Reihe von Entwicklungsprozessen, einschließlich der Kontrolle der Blütezeit (4C). Wie für die Antikörper gegen Tags sind ChIP-grade kommerziellen Antikörper die bevorzugte Option bei Histonmarkierungen.
ChIP experimentellen Ansätzen, die Genexpression gekoppelt Analysen maßgeblich an der Erweiterung des Wissens darüber, wie Transkriptionsfaktoren, Chromatin-Remodeling-Proteine und Histon-kovalente Modifikationen Modulieren der Expression von Genen in der Regulation der Pflanzen biologischen Prozessen und Reaktionen beteiligt sind. Zunächst als eine Methode entwickelt, um die Wechselwirkung der im Chromatin mit bestimmten Loci oder Genregionen vorhandenen Proteine zu analysieren, ist die Burst-genomischer Ressourcen und NGS Technologie erlaubte Chip an ein leistungsfähiges Werkzeug für die Genom-weite Profilierung von DNA-bindenden Proteinen, wie sich als Transkriptionsfaktoren oder modifizierte Histone und Histon-Varianten. ChIP-Chip-und Chip-seq haben eine neue globale Dimen bereitgestelltsion zu den Analysen der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA Chromatin in Arabidopsis 2 5. ChIP-seq Ansätze werden als die Alternative der Wahl, um ChIP-chip, die auf Hybridisierungsarrays basiert und stellt eine gewisse Tendenz, da diese Arrays enthalten eine begrenzte Anzahl von Sonden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
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