Summary
クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。
Introduction
近年中に、分子遺伝学的ツールおよびゲノムの広い範囲は、モデル種のシロイヌナズナで開発されてきました。この技術は、植物の開発が規制されている方法を理解する上で非常に進歩を促進してきました。モデルとしてシロイヌナズナを用いて研究し、発達過程の中で、開花時期の遺伝的制御が広範囲に解析されています。これらの研究は、植物は非常に正確にそのようなホルモンや植物の年齢などの内因性手がかりに、また季節1の自然なサイクルで開花時期を同期させるような日長や温度などの環境シグナルに応答して開花時期を調節することが示されています2。開花の時間変化を有するシロイヌナズナ変異体の単離および特性は、内因性および環境要因に応じて開花時期を調節する遺伝子の複雑なネットワークを発表における決定要因となっています。これらの遺伝子回路は、開花のスイッチとして機能するいくつかのマスター遺伝子のレベルで統合され、花芽の正確なタイミングは、開花促進し、花のインテグレータ遺伝子1,3の上流に働くの活動を抑制するのバランスに依存しています。
ゲノムアプローチの最近の使用によって支援開花開始の制御におけるその役割のために同定された遺伝子の機能解析は、開花時期の調節における転写制御の中心的な役割を明らかにしました。実際には、開花エンコード転写のマスター遺伝子の多くは、4因子 。また、クロマチンリモデリングタンパク質複合体の数は、開花のマスター遺伝子の発現に影響を与えます。それらの変化した開花時のために単離さシロイヌナズナ変異体の数は、クロマチン修飾因子の様々なコード化する遺伝子に変異を有することが判明しました。ヒストンで翻訳後修飾を導入異なるクロマチン改築Eテール、ヒストンバリアントによって標準的なヒストンはシロイヌナズナ5,6の開花の適切なレギュレーションのために必要であるDNAまたは交換する相対ヌクレオソームの位置を変更します。これらのクロマチンリモデリング活動のいくつかは、特定のヒストン残基におけるアセチル化やメチル化などの共有結合修飾の堆積または除去を触媒します。これらのヒストンマークは特に開花遺伝子の転写活性を調節するために、他のクロマチンリモデリング複合体、転写因子または転写機構の成分を補充する特殊なエフェクターによって認識されます。
クロマチン免疫沈降（チップ）は、目的のタンパク質のためのin vivoでの DNA結合部位の同定（ 図1）ことができます。この手順は、DNAに架橋タンパク質の特定の化学物質の能力を利用します。得られたDNA-タンパク質複合体は、次いで、特異的抗体AGAを用いて免疫沈降することができ選択したタンパク質に結合instの転写因子、クロマチン結合タンパク質、または特定の改変および異種エピトープ（一般に「タグ」と呼ばれます）。これらの免疫沈降物から精製されたDNAは、目的の特定の配列の濃縮のために評価するために定量的PCR（定量PCR）反応における鋳型として使用することができます。この方法では、転写因子の結合部位または特定の遺伝子でのヒストンマークの分布が7,8を確立することができます。また、大規模並列シーケンシングを可能にする次世代シーケンシング（NGS）と合わせ、チップ技術は、転写因子の結合部位のゲノムワイドな識別だけでなく、ヒストン修飾の除幕式エピ風景を可能にしました。さらに、遺伝子発現の同時分析は、転写調節因子の結合または特定のヒストンマークの堆積は転写activiと相関方法をモニタリングできます遺伝子9のTY。
シロイヌナズナにおけるチッププロトコルの使用は、転写調節因子の様々な開花とどのようにこれらの構造変化は、遺伝子発現に影響を与える5,6のマスター遺伝子のクロマチン組織に与える影響を評価することができました。以前の結果は 、短い日でシロイヌナズナ遺伝子座早期抽苔 （EBS）は 、この遺伝子のショーに開花し、開花FTのマスター遺伝子のアップレギュレーションの加速度を開花し、変異体のリプレッサーとして機能することを示しました。また、FTにおける機能喪失型変異は完全にFTが EBS変異体の早期の開花およびEBS 10開花このマスター遺伝子の抑制のために必要であることが必要であることを示す、EBS変異体植物の初期開花表現型を抑制、11は、EBS は、具体的には 、ヒストンH3のジ-に結合し、目にすることができるトリメチルPHDを含むタンパク質をコードしますFT 12のクロマチン媒介抑制におけるEBSの役割を示唆している電子のリジン残基4（H3K4me2 / 3）、。 ChIPのアプローチの使用は、シロイヌナズナPHD含有タンパク質EBS 10,11は、その発現12を抑制するために花のインテグレータ遺伝子FTの調節領域に結合することを実証しました。チップ技術の使用によって得られる追加のデータは、このタンパク質は、シロイヌナズナの開発の初期段階で開花のこのマスター遺伝子のクロマチンにおけるヒストンアセチル化、活性な転写の顕著な特徴の低レベルを維持するために必要とされることを示しました。一緒に、遺伝子および遺伝子発現データを有するこれらの観察は、このシロイヌナズナPHD含有タンパク質は、花の積分FT遺伝子12の発現を調節することにより、開花時間の微調整において中心的な役割を有していることを示しています。ここで紹介する作品は、ヒストンの分析のためだけでなく、他のためだけでなく、有益な最適化された方法を提供し、タンパク質、および効率の向上と低下し、実験時間に関連するクロマチン。また、この報告書は、チップ・プロトコルの使用は、クロマチンの修飾の変化や植物遺伝子の転写状態、およびシロイヌナズナの開花の発症に遺伝子発現制御への影響をどのようにこれらのクロマチン媒介機構との関係に新たな洞察を提供している様子を示しています。
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Protocol
植物材料の1架橋（1時間）
- シロイヌナズナの実験に用いたライン成長（ - WT - 野生型変異体対を、および/またはタグを表すライン対目的のタンパク質のタグ付けされたバージョンを表す線は、任意のタンパク質を融合していない）大きなペトリ皿に12-18日間（150 mm）のMS寒天培地（1 L：1×ムラシゲ・スクーグ塩、10gのスクロース、0.5グラムのMES、pHを5.7（KOH）、1％寒天）。土壌やバーミキュライトの1ミックス：別の方法として、3を含む鉢に植物を育てます。
注意！ホルムアルデヒドは皮膚に接触し、飲み込む、吸入による毒性があり、かつ、適切な個人用保護具を着用し、化学フード内で処理する必要があります。 1.2手順 - 1.6はヒュームフードの下で実行する必要があります。 - 実験室のバーナー加熱針を用いて50 mlチューブの蓋に小さな穴を作ります。 1％の最終濃度になるように1×PBS 40mlの緩衝液追加の1.08 mlのホルムアルデヒド（37％ストック秒olution）。これらの50mlチューブに植物材料の1.5グラムを収集します。架橋の間にチューブを氷上に保管してください。
- 蓋を用いて50 mlチューブを閉じます。デシケーターにチューブを配置し、真空を適用します。真空は、ソリューションをかき回す防止するために、慎重に真空を解除した後、10分間の組織に潜入。サンプルを混ぜます。二回繰り返します。浸透後、植物材料を観察し、それがわずかに半透明になっていることを確認し、チューブ（ 図2）の底に沈む傾向にあります。
- 5分間真空を適用する0.125 Mの最終濃度を達成するために2 Mグリシン2.5mlのを追加します。グリシンは、ホルムアルデヒド架橋の競合的阻害剤として機能します。
- 蓋の穴と、閉じた50mlのチューブを反転させ、PBSホルムアルデヒド - グリシンソリューションを捨てます。
- 1×PBSで2回苗木をすすぎ、一度ステップ1.5で説明したように水が洗浄溶液を廃棄しています。ペーパータオルの上にそれらを乾燥させ、液体nitrogeに凍結N。
注：凍結組織は、数週間のために-80℃で保存することができます。
抗体の調製（1日）
注：免疫沈降のために、タンパク質Gまたはタンパク質抗体の重鎖の定常ドメインのための高い親和性を有するリンカーを介して抗体と結合させた磁気ビーズを使用することが推奨されます。 DNA-タンパク質複合体は、ビーズ - 抗体複合体の表面に非特異的に接続することができます。そのため、非特異的バックグラウンドを定量化するために特異的な抗体なしのコントロールを行う必要があります。
- 各免疫沈降のために1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の磁気ビーズの15μlのを準備します。ビーズの量は、免疫沈降のために、また、抗体上で使用されるクロマチンの量に依存します。
- 、洗浄ビーズにクロマチン免疫沈降（チップ）の希釈緩衝液1mlを追加し、回転させることにより混合し、1.5ミリリットルの微量TUを配置するには磁気ラックになります。ビーズが磁石に付着させるために約1分待ちます。まだラック1.5 mlマイクロチューブを使用すると、ピペットで上清を除去します。二回繰り返します。
注：各植物系統の場合は2免疫沈降セットが必要とされている：ビーズと抗体（Ab）を持つ唯一の磁気ビーズを有する第二抗体なし（無AB）コントロール。 - ChIPの希釈緩衝液200μlでビーズを再懸濁します。 （正確な希釈は、各抗体のために異なり、実験的に最適化されなければならないか、市販の抗体の場合には、製造業者の指示に従ってください）各植物系統のために調製した2つの管のいずれかに特異的Abの必要な量を追加します。免疫沈降のために、このサンプルを使用してください。ネガティブコントロールとして使用される他のチューブへの非特異的IgGの同じ量を加えます。
- 抗体はビーズに付着させるために4℃で回転ホイール上でO / Nインキュベートします。
3.クロマチン抽出（4時間）
注：このステップでは、核とすべての細胞小器官は、ペレット化されます。 ExB 1は、高密度を提供し、細胞小器官の構造の破壊を防止するのに十分なショ糖が含まれています。
注：のExB 2が開いて葉緑体を破裂助け、クロロフィルを除去するために、1％トリトンX-100が含まれています。
注：この手順は、サンプルから界面活性剤を除去することができます。
注：このバッファは、核を溶解し、クロマチンを解放するために、SDSが含まれています。
注意！超音波装置は、防音キャビネット内に含まれていない場合には、超音波処理工程の間に耳の保護具を着用することを確認します。
重要なステップ！クロマチンの断片化は、主に超音波処理装置に依存します。超音波処理条件は、適切なDNAサイズの濃縮を達成するように調整されるべきです。見るクロマチンの断片化を最適化する方法の例については、図3。
注：サンプルは、数週間凍結させ、-20℃で保存することができます。
目的のタンパク質とDNAの救助の4免疫沈降（1日、3時間）
- ステップ2.2で説明したように、過剰の抗体を除去するためのChIP希釈緩衝液1mlで3回ステップ2.4からAbでコーティングしたビーズを洗ってください。 ChIPの希釈緩衝液200μl中に再懸濁します。分離されたクロマチン50μlのを追加します。 4℃で回転ホイール上でO / Nインキュベートします。
注：concentratiをチェック微量紫外可視分光光度計でのクロマチンの上。分離されたクロマチン50μlのDNAの10以上のμgのを含める必要があります。 - 4℃のステップ4.2から4.5までの仕事のために。ステップ2.2で説明したように低塩洗浄緩衝液1ml中に二回ビーズを洗浄します。
- 高塩洗浄緩衝液1mlに一度ビーズを洗ってください。
- LiClを洗浄緩衝液1mlに一度ビーズを洗ってください。
- TE緩衝液1ml中に二回ビーズを洗浄します。最後の洗浄後、完全にピペットで吸引してチューブ内に残されたTE緩衝液を除去してください。
- 入力サンプル（ステップ3.9）を取り出します。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移し、INPUTの5μLを、チップのサンプルのように続けます。 5％のキレートイオン交換樹脂の200μLを添加することにより架橋逆転、すべて2~3分間振盪し、95℃で10分間インキュベートします。 30秒間16,000×gでスピンダウンし、注意深くピペッティングにより新しいマイクロチューブに上清を移します。
注：TRAながら反転の架橋ditional方法は、したがって、プロトコル一日短くなって、効率的な脱架橋および10分でのDNAの溶出を可能にするのNaCl、95℃でのキレートイオン樹脂とのインキュベーションでのO / Nインキュベーションすることを含みます。 - プロテイナーゼK（10mg / ml）を2μlを添加し、タンパク質を消化し、DNAを放出するために、37℃で30分間インキュベートします。
- 10分間95℃でインキュベートすることによって反応を停止させます。
- すぐに30秒間16,000×gでスピンし、ピペッティングにより上清を新しいチューブに移します。
- DNAをきれいに標準的なDNA断片を精製キットを用いて単離しました。
注：製造元の指示に従って進んでください。 - 新しい1.5 mLのマイクロ遠心チューブにキットからのDNA結合列を転送します。列の中央にDNアーゼを含まない水20μlを添加し、60秒間16,000×gで回転させて精製されたDNAを溶出します。ポイントを停止し、試料を数週間-80℃で保存することができます。 5.定量PCR（4時間）によって免疫沈降したDNA中の結合部位の存在量を測定します
- 60℃の融解温度（Tm）は、30％-80％のGC含量を有する関心のあるゲノム領域の設計プライマー。クロマチンを超音波処理によって断片化されているように、増幅された配列の長さは150〜200ヌクレオチド（ 表1）よりも長くてはなりません。
注：プライマー設計のための有用なツールは、プライマー3プログラム（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）です。プライマー設計のための追加のガイドラインは以前の報告8、14,15でご利用いただけます。 - プライマーが特異的であることを確認してください（特にプロモーターは同様のTF結合配列を共有することができます）とプライマー効率のusinをテストするためにBLASTプログラムを使用してくださいGインプットDNA（ステップ4.9）の水で1:10希釈液。ゲノムの特定の領域は、他のものより優れて精製されます。これは、PCRプライマーを設計し、希釈された入力DNAにそれらを確認することが重要です。
- 各反応のためのPCRチューブに水とピペットで希釈したDNAの5μLを精製されたDNA 1:10に希釈します。
注：DNAを1.5 mlマイクロチューブの壁に取り付けることができますように、必要な量だけを希釈します。複数の融解凍結サイクルが添付されたDNA分子の数を増やします。各プライマー対は、入力での増幅のために、抗体チップと無抗体チップを分析する必要があります。 - PCRミックスを完了するために、1×最終濃度のSYBR Green PCRマスターミックスを追加し、各プライマー0.5μM。 DNアーゼを含まない水で20μlに埋めます。
- SYBRグリーンPCRマスターミックスの製造業者の指示に従って定量PCR反応を実行します。
- 倍の濃縮法によるデータ解析。
- サンプル名および定量PCR反応後に得られた生のCt値とのスプレッドシートを作成します。
- 各サンプルについて、その生のCt値から、対応する無Abの制御のために得られた生のCt値を差し引きます。注：この数学的な操作の後、無抗体サンプルのCt値が0に等しくなります。
- ベース2とステップ6.1.2（ 表2）で得られた負の剰余に等しい指数（パワー）で指数演算によって倍の濃縮を計算します。
濃縮を倍= 2 - （CT（サンプル） - CT（無AB））
注：このメトでDのChIP-EDの試料中の特定のDNA断片の存在量は、無抗体コントロールでこのフラグメントの豊富と比較されます。この方法の前提は、バックグラウンドシグナルのレベルが異なるプライマーセット、サンプル、および複製の実験の間に再現性があることです。しかし、この'noise'信号レベルは、プライマーセット、サンプル、実験の間で変化しません。
- 入力方法の何％でデータ分析。
- サンプル名および定量PCR反応後の彼らのために得られた生のCt値とのスプレッドシートを作成します。
- 入力とした総抽出クロマチンの画分から対数の底2の値を減算することにより、入力サンプルの生Ct値を調整します。
注：合計クロマチンの10％は、このプロトコルで入力としたように、このプロトコルでは減算値は、3.32に等しいです。ログイン2（10）は3.32に等しいです。 - 100でBと指数演算の値を乗算することにより、入力の％を計算します2アーゼサンプル（ 表3）の生のCt値から減算調整された入力値の残りの部分に等しい指数（電力）。
入力の％= 100 * 2 （調整された入力- CT（サンプル））
注：この手順で、総孤立クロマチン（入力サンプル）へのChIP-EDの試料中の特定のDNA豊富との関係を計算します。チップデータの分析に関するさらなる詳細は、ヘリングらに記載されています。8。
注：沈殿クロマチンから分離されたDNAは、その関心のあるタンパク質に結合し、総クロマチンからのChIP-EDされたDNA断片を決定するために分析されなければなりません。
6.データ解析
注：元のうち、ChIPのデータを分析する方法をisting二つの最も一般的に使用されます。それらの最初のも、「無抗体対照に対して ''相対的濃縮」、「バックグラウンドを超えるシグナル」またはという名前の倍の濃縮方法です。第二の方法は、「入力の％」と命名されます。
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Representative Results
エイト主な手順は、成長し、植物材料、クロマチンの架橋、クロマチン分離、クロマチンの断片化、DNAとの間の複合体の選択的単離の収穫など、in vivoでのタンパク質-DNA相互作用の同定のために、このチッププロトコルに白羽することができます免疫沈降、タンパク質の消化、DNA精製、およびqPCR分析による目的のタンパク質（ 図1）。 ChIPプロトコルにおける重要なステップは、架橋反応におけるDNA-タンパク質相互作用の固定です。典型的には、ホルムアルデヒド架橋は、植物のチップに使用されます。ホルムアルデヒドは、組織を貫通し、DNA 1〜6中のタンパク質またはタンパク質およびヌクレオチドのNH 2基の間にメチレン架橋を作成します。 インビボでの核タンパク質複合体の効率的な固定は、ホルムアルデヒドは、植物の核内のクロマチンに到達することを要求し、それは、植物組織が 完全トンに浸漬されることが必須です彼ホルムアルデヒドバッファは、免疫沈降中のタンパク質-DNA複合体が効果的にプルダウンされていることを確認します。シロイヌナズナの葉は、その細胞への架橋剤の困難な浸透度のワックス層で覆われています。また、トリコームは、植物組織の内部へのホルムアルデヒド溶液を防止、葉の表面上の気泡の形成に有利に働きます。この制限を克服するために、このステップ真空で固定液中の気泡の形成を防止する、サンプルに適用され、全ての細胞の核へのホルムアルデヒドの浸透を向上させます。効率的な架橋処理後の苗は 、図2に示されています。
ChIPのプロトコルでもう一つの重要なステップは、クロマチン断片です。大きなクロマチン断片はDNA配列中の目的のタンパク質の結合部位の低解像度のマッピングをもたらすことができます。対照的に、非常に小さな断片は、効率的な増幅を抑制することができます定量PCRによって結合されたDNA。経験的な経験によれば、チップ解析のための最適なクロマチンのサイズの範囲は200と600塩基対の間であるべきであり、クロマチンの適切な断片化を達成するための条件は、実験室で利用可能な超音波処理装置に応じて設定されなければならない。 図3に示し手順は、DNAサイズの所望の範囲内の最大の濃縮を達成するために、クロマチン断片化を最適化します。超音波処理の前に、クロマチンは、主に非常に大きなフラグメントで構成されています。超音波処理サイクル数の増加は、徐々に20〜30サイクル（プロトコルのセクション3.8および図3）の後に200〜600塩基対の範囲内の最適な濃縮に達し、ChIPサンプル中のDNAの平均サイズが小さくなります。
ここでは、花の積分器FTの調節領域に結合部位をEBSのタンパク質の同定は、チップ技術の有用性の例として示されています。トンにEBSの結合彼は、FT遺伝子座は、天然EBSプロモーター（PEBS :: CMYC、EBS）の制御下CMYC、EBSの融合タンパク質を発現シロイヌナズナ株でのChIPアッセイを介して解明しました。この構築物を発現EBS変異植物の野生型表現型によって示されるように、EBSのこのタグの付いたバージョンは、完全に機能しています。 FTゲノム遺伝子座内の4つの領域は、EBSの結合について試験しました。遺伝子の転写開始部位の周り（FTII）、2（FTIV、FTVI）、 および FT（FTVII）（ 図4A）の第一イントロン内の別の1のプロモーター領域内の1つ。 図4（b）に示すように、チップの結果は、EBSタンパク質はFT 12開花のマスター遺伝子の転写開始部位に近い調節配列に結合することができることを示しています。また、EBSのタンパク質は 、インビトロおよびかかるhda6 ext3では、調節に関与する他のクロマチン関連タンパク質などのヒストンデアセチラーゼとインビボの両方で相互作用することができますシロイヌナズナ1 7で時間を開花。 FTのゲノム領域におけるヒストンアセチル化のレベルにEBSの可能な影響を評価するために、チップアッセイは、リジン9及び図14にアセチル化ヒストンH3に対する抗体を用いて行った、ヒストンマークが転写活性クロマチンと相関する1 2 。また、これらのデータは、チップのアプローチは、植物の発生プロセスの転写調節を調節する分子メカニズムに光を当てるために貢献できる方法を示しています。
クロマチン免疫沈降プロトコル。チップの図1のスキームは、一般的に化学化合物によって固定されたタンパク質とDNA、間の相互作用を調査するために使用される技術です。保存相互作用を有するクロマチンは、核および断片化から隔離されています。目的のタンパク質に対する抗体を使用することにより、我々はそれに接続されているDNAの断片を選択することができます。抗体は、磁気ラックを使用して迅速かつ簡単に分離を可能にする磁気ビーズに結合しています。次のステップにおいて、タンパク質は、プロテイナーゼ処理によって除去され、DNAが放出されます。精製されたDNA断片は、その後、それらの相対量を測定するためにqPCR反応でテンプレートとして使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ホルムアルデヒドとの架橋後の組織図2.例。DNAとタンパク質間の相互作用を調べるために、in vivoでの複合体は、プロトコルの複数の工程を経て、それらが安定性と耐久性にするために固定されなければなりません。プロトコルのこのバージョンでは、固定は、ホルムアルデヒド処理によって発生します。ホルムアルデヒドTHRの効率的な浸透ウワーッ組織は、チップ方式の成功のために不可欠です。 （A）架橋工程の前に、植物材料は、溶液の表面に浮遊し、小さな気泡で覆われています。葉の背軸と向軸面は色が異なります。 （B）固定後、苗木は目に見えてやや透明、溶液に浸漬する必要があり、かつ均一に架橋溶液に浸漬した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
チップ解析のための超音波処理条件 の図3. 最適化クロマチンが固定材料から分離された非常に長いクロマチンのサイズを表すゲルの上部にある強いバンド（左の2行目）を有する断片の長さの幅広い構成されています。 increaで超音波処理サイクル数を歌い、クロマチン断片の大きさのピークはより小さな断片に向けてシフトしています。示された実験では、最適なサイクル数は200から600塩基対の範囲で最適なクロマチン断片をチップサンプルにおいてより豊富である後に、20と30の間で変動する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. チップは、EBSは 、FT と EBSの 変異が、この花のインテグレータ遺伝子でヒストンH3のアセチル化のレベルを変更する。エクソンを表すブラックボックスとFTの（A）のゲノム領域に結合ショーを分析します。この花の積分遺伝子の調節領域にまたがる四断片を試験した（グレー具体的な定量PCRプライマーを設計することによって箱）。 （B）EBSは、転写開始部位の近くに位置FT IV領域は、特異的に結合します。 Mycの-EBSはEBSのCMYCタグ付きバージョンを発現している変異体植物をEBSに対応します。 MYCは、任意のシロイヌナズナ遺伝子に融合していないCMYCエピトープを発現するトランスジェニック植物です。 （C）EBS変異植物が評価4つのすべてのFT地域における野生型ランツベルクエレクタ （L 小胞体）よりH3K9,14Acの高い豊かさを表示します。エラーバーは標準偏差（B及びC）を示します 。 植物細胞中で以前に公開されたデータから変更された1 2。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| フォワード | 逆 | テスト>地域 |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
本研究で用いた表1のプライマー。
| サンプル | 生のCt値 | CT-CT（無AB） | 倍の濃縮 2 - （CT（サンプル） - CT（無AB）） |
| 無アブありません | 34.5 | 0 | 1 |
| アブ | -5.3 | 39.4 |
「倍の濃縮」の方法により、チップのデータ解析の表2例。無抗体サンプルのCt値は、抗体/磁気ビーズへのDNAの非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンド信号を表します。これらのCt値は、無抗体および抗体サンプルが1よりも高くなければならないのCt値との間に30の違いを超えている必要があります。
| ステップ1 -入力を調整します | |||
| 調整された入力=生CT（入力） -ログ2（合計クロマチンの割合） | |||
| 生のCt | 合計クロマチンからの入力 | 2 10をログに記録 | |
| 入力 | 29.5 | 10％ | 3.32 |
| 調整された入力= 29.5から3.32 = 26.18 | |||
| ステップ2 -入力の計算％ | |||
| サンプル | 生のCt | CT（調整された入力）-Ct（ サンプル） | 2 CT（調整された入力）-Ct（サンプル）* 100％ |
| 入力 | 26.18 | ||
| ChIPの-AB | 31.45 | -5.27 | 2.59 |
| 無アブありません | 34.5 | -8.32 | 0.31 |
"％入力」方法により、チップのデータ解析の表3例。入力は核から単離した全架橋されたクロマチンを表すので、Ct値は、全てのプライマー対のために等しくなければなりません。従来は、5％または総クロマチンの10％は、入力としてとられます。 interesのタンパク質またはタグに対する特異的な抗体により被覆されていないビーズ - いいえ-Abが陰性対照試料を表していませんトン。 ChIP-ABは、目的のタンパク質またはタグに対する抗体による免疫沈降後のサンプルを表しています。
| PBS 10倍 |
| 1.3 MのNaCl |
| 30 mMのの Na 2 HPO 4 |
| 30 mMののNaH 2 PO 4 |
| pHが7 |
| 抽出緩衝液1（のExB 1） |
| 0.4 Mショ糖 |
| 10mMトリス - 塩酸pHが8 |
| 10のMgCl |
| 5 mMのβメルカプトエタノール |
| プロテアーゼ阻害剤 |
| 抽出バッファー2（のExB 2） |
| 0.25 Mショ糖 |
| 10mMトリス - 塩酸pHが8 |
| 10のMgCl 2 |
| 1％トリトンX-100 </ TD> |
| 5 mMのβメルカプトエタノール |
| プロテアーゼ阻害剤 |
| 抽出緩衝液3（のExB 3） |
| 1.7 Mショ糖 |
| 10mMトリス - 塩酸pHが8 |
| 0.15％トリトンX-100 |
| 2のMgCl 2 |
| 5 mMのβメルカプトエタノール |
| プロテアーゼ阻害剤 |
| 超音波処理バッファ |
| 50mMトリス - 塩酸pHが8 |
| 10mMのEDTA |
| 1％SDS |
| プロテアーゼ阻害剤 |
| ChIPの希釈バッファー |
| 1.1％トリトンX-100 |
| 1.2 mMのEDTA |
| 16.7 mMトリス塩酸pHが8 |
| 167 mMのNaClを |
| プロテアーゼ阻害剤 |
| 低塩緩衝液 |
| 150mMのNaCl |
| 0.1％SDS |
| 1％トリトンX-100 |
| 2mMのEDTA |
| 20mMトリス - 塩酸pHが8 |
| 高塩洗浄バッファー |
| 500mMのNaCl |
| 0.1％SDS |
| 1％トリトンX-100 |
| 2mMのEDTA |
| 20mMトリス - 塩酸pHが8 |
| LiClを洗浄バッファー |
| 0.25 MのLiCl |
| 1％NP-40 |
| 1％デオキシコール酸ナトリウム |
| 1mMのEDTA |
| 10mMトリス - 塩酸pHが8 |
| 10mMトリス - 塩酸pHが8 |
| 1mMのEDTA |
表4.バッファー組成。
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Discussion
ここで説明のChIPプロトコールは、タンパク質およびアラビドプシス植物の in vivo での特定のDNA配列間の相互作用を分析するための再現可能かつ強力な技術です。目的のタンパク質の結合部位の同定に成功し、関連する相互作用が実際に行われている植物器官や発達段階を適切に選択する必要があります。また、植物材料の適切な固定および超音波処理によりクロマチンの最適な剪断を得ることが重要です。選択されたタンパク質/タグの効率的な免疫沈降のための高度に特異的な抗体も不可欠です。
植物におけるチップアプローチの使用は、潜在的プロトコルにおける異なるステップに干渉する可能性が二次代謝産物と細胞壁の存在に関連するいくつかの困難に直面しています。また、植物器官の複雑さは、多くの場合、複数の細胞型を含む場合に整数のDNA結合タンパク質erestは異なって存在またはアクティブにすることができ、この方法論の使用を妨げてきました。そのため、可能な限り、それはチップ内に使用することが最も有利であることは存在および/または目的のタンパク質の活性は、既に実証されている均質な組織に近づきます。異なる組織を含む複雑な植物材料は、タンパク質が実際に機能する細胞種の希釈を引き起こす傾向があります。 2 0の切片の組織は、個々の組織または細胞型における研究のために工場で使用されてきました。しかし、近年中に、別の手順が7（代表的な結果のセクションを参照）最適な断片の範囲にシロイヌナズナ8における細胞型特異的クロマチンの単離のために開発されてきました。上述したように、このサイズ分布を達成するための条件を大幅に使用される特定の超音波機器に依存します。いずれの場合においても、クロマチンは好ま架橋の逆転を防止するために低温で維持されるべきです熱によって超音波処理中に発生しました。選択の超音波処理装置は、一緒に最適な断片化条件で、チップ分析（ 図3）のために不可欠である再現性の良好なレベルを提供する必要があります。
成功したChIP実験のもう一つの重要な要因は、目的のタンパク質の免疫沈降のために選択された抗体です。植物転写因子に対して惹起された抗体は、チップ解析に有用であることができますが、ウェスタンブロット実験で確認された抗体は、チップ用必ずしも有効ではないため、これらの血清を徹底的にテストする必要があります。また、別のタグに対する抗体は、しばしば、このプロトコルのために使用されます。具体的には、タグの多様性を認識したChIPグレード抗体が市販されており、それらはいくつかの研究室で試験されているという利点を有します。これらの市販の抗体を使用するための欠点は、目的のタンパク質は、対応するエピトープに融合しなければならないことですおよびトランスジェニック系統（ 図4B）で表されます。この場合には、キメラタンパク質は、目的の我々のタンパク質をコードする遺伝子が欠損して遺伝的背景に融合タンパク質を保有するトランスジェニックシロイヌナズナ系統を生成することによって機能することを保証することが望ましいです。トランスジェニック植物における突然変異ラインの表現型の異常の相補性は、融合タンパク質は、内因性タンパク質の正常な活性を保持することを確認します。トランスジェニック系統は、転写調節因子の結合部位を同定するために生成されるとき、それは、構成の強力なプロモーター（上記参照）の利用に関連する問題を防止する、タグ付けされたタンパク質の発現を駆動するための内因性プロモーターを用いることが好ましいです。そのような特定の残基のメチル化またはアセチル化のようなヒストンの翻訳後修飾に特異的な抗体はまた、頻繁に使用されるチップ内に関与する遺伝子のエピ風景を決定するために分析開花時期の制御（ 図4C）を含む発達過程、数の調整。タグに対する抗体のために、チップグレード市販の抗体は、ヒストンマークの場合には好ましい選択肢です。
遺伝子発現に結合されたChIP実験的アプローチは、転写因子は、クロマチンリモデリングタンパク質、およびヒストンの共有結合修飾は、植物生物学的プロセスおよび応答の調節に関与する遺伝子の発現を調節する方法に関する我々の知識を増やすことに尽力している分析します。当初は特定の遺伝子座または遺伝子領域をもつクロマチン中に存在するタンパク質の相互作用を分析する方法として開発され、ゲノムリソースとNGS技術のバーストは、チップは、DNA結合タンパク質のゲノムワイドなプロファイリングのための強力なツールとなってすることができました転写因子または修飾されたヒストンおよびヒストン変異体として。チップ間のChIP-seqのとは、新しいグローバルDIMENを提供してきましたシロイヌナズナ2 5におけるクロマチンタンパク質とDNAとの相互作用の解析にシオン。 ChIP-seqのアプローチは、これらの配列は、プローブの限定された数が含まれていることを考えると、ハイブリダイゼーションアレイに基づいており、いくつかのバイアスを紹介されたチップ・チップへの選択肢の代替と考えられています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
