Summary
Kromatin immunoutfellingen er en kraftfull teknikk for identifisering av DNA-bindende områder av Arabidopsis proteiner in vivo. Denne fremgangsmåten omfatter kromatin tverrbinding og fragmentering, immunopresipitering med selektive antistoffer mot proteinet av interesse, og qPCR-analyse av bundet DNA. Vi beskriver en enkel ChIP assay optimalisert for Arabidopsis planter.
Introduction
I løpet av de senere år har en rekke genetiske, molekylære og genomiske verktøy har blitt utviklet i modellen Arabidopsis thaliana arter. Denne teknologien har mulig enormt fremdriften i å forstå hvordan planteutvikling er regulert. Blant de utviklingsprosesser studert ved hjelp av Arabidopsis som modell, har den genetiske kontrollen av blomstringstid blitt grundig analysert. Disse studiene har vist at planter modulere meget nøyaktig tidspunktet for blomstring som svar på endogene signaler, slik som hormoner og alder av anlegget, og også miljø signaler slik som fotoperiode og temperatur som synkroniserer blomstrende tid med den naturlige syklus av årstider 1, 2. Isolering og karakterisering av Arabidopsis mutanter med endringer i blomstringstidspunktet har vært avgjørende faktor i avduke et komplekst nettverk av gener som regulerer blomstringstid som svar på endogene og miljøfaktorer. Disse genetiske kretser erintegrert på nivå med noen mester gener som fungerer som brytere av blomstring, og det nøyaktige tidspunktet for floral initiering avhenger av balansen av blomstrende fremme og undertrykke aktiviteter som fungerer oppstrøms floral Integrator gener 1,3.
Den funksjonelle karakterisering av genene identifisert for sin rolle i kontrollen av blomstring initiering, hjulpet av den nylig bruk av genomiske tilnærminger, har åpenbart den sentrale rollen til transkripsjonsregulering i modulering av blomstring tid. Faktisk er mange av master gener blomstring kode transkripsjonsfaktorer fire. I tillegg er en rekke av kromatin ombygging proteinkomplekser påvirker ekspresjonen av gener som er av stam blomstring. En rekke av de isolerte mutanter Arabidopsis for deres endrede blomstring tid viste seg å bære mutasjoner i gener som koder for et utvalg av kromatin modifikatorer. Ulike kromatin remodelers som introduserer posttranslational endringer i Histone haler, omplassere nukleosomer forhold til DNA eller utveksle kanoniske histoner av histone variantene er nødvendig for riktig regulering av blomstring i Arabidopsis 5,6. Noen av disse kromatin remodeling aktivitetene kata deponering eller fjerning av kovalente modifikasjoner slik som acetylering eller metylering i bestemte histon rester. Disse histone merkene er spesielt anerkjent av spesialiserte effektorer som rekrutterer andre kromatin remodeling komplekser, transkripsjonsfaktorer eller komponenter av transkripsjons maskiner for å regulere transkripsjonen aktivitet av blomstrende gener.
Kromatin immunoutfelling (chip) muliggjør identifikasjon av DNA in vivo-bindingsseter for proteiner av interesse (figur 1). Denne prosedyren utnytter evnen av visse kjemikalier for å kryssbinde proteiner til DNA. De resulterende DNA-proteinkomplekser kan deretter immunopresipitert ved hjelp av spesifikke antistoffer against transkripsjonsfaktorer, kromatin-bindende proteiner, eller bestemte modifikasjoner og heterologe epitoper (ofte referert til som "tags") festet til proteinet av valget. DNA ble renset fra disse immunopresipitater kan brukes som et templat i kvantitative PCR (qPCR) reaksjoner for å vurdere for anrikning av bestemte sekvenser av interesse. På denne måten, kan bindingssetene av transkripsjonsfaktorer eller fordeling av histon merker i bestemte gener bli etablert 7,8. I tillegg kombineres med Next Generation Sequencing (NGS) som gjør at massiv parallell sekvensering, har chip-teknologi gjort mulig genom-wide identifisering av bindingsstedene for transkripsjonsfaktorer samt avduking epigenomic landskapene histonmodifikasjonene. Videre er den samtidige analyse av genekspresjon muliggjør overvåking hvor binding av transkripsjonelle regulatorer eller avsetning av bestemte histon merkene korrelerer med den transkripsjonelle aktivity av gener 9.
Bruken av chip protokoller i Arabidopsis har gjort det mulig å vurdere virkningen at en rekke forskjellige transkripsjonelle regulatorer har på kromatin organiseringen av master-gener av blomstring og hvordan disse strukturelle endringer påvirker genekspresjon 5,6. Tidligere resultater viste at Arabidopsis locus TIDLIG bolting I korte dager (EBS) fungerer som en undertrykker av blomstring og mutanter i dette genet viser en akselerasjon av blomstring og oppregulering av master gen av blomstring FT. I tillegg er tap-av-funksjon-mutasjoner i FT fullstendig undertrykke tidlig blomstring fenotypen til EBS mutant planter, noe som indikerer at FT er nødvendig for tidlig blomstring av EBS mutanter og at EBS er nødvendig for undertrykkelse av denne hoved gen av blomstrende 10 , 11. EBS koder for et PHD holdig protein som spesifikt binder histon H3 di- og trimetylert i the lysin 4 rest (H3K4me2 / 3), noe som tyder på en rolle for EBS i kromatin-mediert undertrykking av FT 12. Bruken av brikken tilnærming vist at Arabidopsis PHD-inneholdende protein EBS 10,11 binder regulatoriske regioner av blomster integrator genet FT for å undertrykke ekspresjon 12. Ytterligere data som oppnås ved bruk av chip teknologi viste at dette proteinet er nødvendig for å opprettholde lave nivåer av histon acetylering, et kjennetegn på aktiv transkripsjon, i kromatin av denne hoved genet av blomstring under innledende stadier av Arabidopsis utvikling. Disse observasjonene, sammen med genetisk og genuttrykk data, viser at denne Arabidopsis PHD holdig protein har en sentral rolle i finjustering av blomstringstid ved å modulere uttrykk for floral integrator genet FT 12. Arbeidet som presenteres her gir en optimalisert metode som er nyttig ikke bare for analyse av histoner, men også for annetkromatin assosierte proteiner, og med økt effektivitet og redusert eksperimentelle tid. Videre viser rapporten hvordan bruken av chip protokoller har gitt ny innsikt i forholdet mellom endringer i kromatin modifikasjoner og transkripsjons tilstander av plantegener, og hvordan disse kromatin-mediert mekanismer for genekspresjon kontroll innvirkning på utbruddet av blomstring i Arabidopsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fornetting av plantemateriale (1 time)
- Vokse Arabidopsis linjer som brukes i eksperimentet (villtype - WT - versus mutanter og / eller linjer som uttrykker den kodede versjon av proteinet av interesse i forhold til linjer som uttrykker merkelappen ikke smeltet til ethvert protein) i 12-18 dager i store Petri-skåler (150 mm) med MS-agar-medium (1 L: Murashige og Skoog 1x salter, 10 g sukrose, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Alternativt, vokser planter på potter som inneholder 3: 1 blanding av jord og vermikulitt.
FORSIKTIG! Formaldehyd er giftig ved innånding, hudkontakt og svelging, og skal håndteres i en kjemisk hette iført egnet personlig verneutstyr. Trinn 1.2 til 1.6 skal utføres under avtrekkshette. - Lage små hull i lokket 50 ml rør med en laboratorie-brenner-oppvarmet nål. Legg 40 ml av 1 x PBS-buffer og 1,08 ml av formaldehyd til en sluttkonsentrasjon på 1% (lager 37% solution). Samle 1,5 g av plantemateriale i de 50 ml rør. Hold rørene på is i løpet av kryssbinding.
- Lukke 50 ml rør med lokket. Plasser rørene i en eksikator og anvend vakuum. Vacuum infiltrere vevet i 10 min, deretter løsne vakuum nøye, for å hindre churning opp løsningen. Bland prøven. Gjenta to ganger. Etter infiltrering, observere plantemateriale, og bekrefter at det blir svakt gjennomskinnelig og har en tendens til å synke til bunnen av røret (figur 2).
- Legg 2,5 ml av 2 M glysin for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,125 M. Apply vakuum i 5 min. Glycin virker som en konkurrerende inhibitor av formaldehyd kryssbinding.
- Kast PBS formaldehyd-glycin-løsning ved å snu den lukkede 50 ml rør med hull i lokket.
- Skyll småplantene to ganger med 1 x PBS og en gang med vann forkaste vaskeløsningen som beskrevet i trinn 1.5. Tørk dem på et papirhåndkle og fryse i flytende nitrogen-n.
MERK: Frosset vev kan oppbevares ved -80 ° C i flere uker.
2. Utarbeidelse av antistoffer (1 dag)
NB: For immunopresipitering, er bruken av magnetiske kuler konjugert med antistoffer via en protein G eller protein A-linker med høy affinitet for det konstante domenet til antistoff tung kjede-anbefalt. DNA-proteinkomplekser kan feste uspesifikt til overflaten av kulene-antistoff-konjugater. Av den grunn, er det nødvendig å utføre kontroller uten spesifikke antistoffer for å kvantifisere den ikke-spesifikk bakgrunnsbinding.
- For hver immunoutfelling, fremstille 15 ul magnetiske kuler i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Mengden av perler avhenger av mengden av kromatin anvendt for immunopresipitering og også på antistoffene.
- Å vaske, tilsett 1 ml Chromatin Immunutfelling (chip) fortynningsbuffer til perlene, bland ved rotasjon og plassere 1,5 ml mikro tuvære i et magnetisk stativ. Vente rundt 1 min å la perlene fester seg til magneten. Med de 1,5 ml mikrosentrifugerør fortsatt i stativet, fjern supernatanten ved pipettering. Gjenta to ganger.
NB: For hver plante linje immunoutfellingsstudier to settene er nødvendig: en med vulstene og antistoff (AB) og en andre ikke-antistoff (No-Ab) kontroll med bare magnetiske kuler. - Resuspender perler i 200 pl ChIP fortynningsbuffer. Legg den nødvendige mengden av den spesifikke Ab til en av de to rørene utarbeidet for hver plante linje (nøyaktig fortynning er forskjellig for hver Ab og må optimaliseres eksperimentelt eller, i tilfelle av kommersielle antistoffer, følg instruksjonene fra produsenten). Bruk denne prøven for immunoprecipitation. Legge den samme mengde uspesifikk IgG til det andre røret, som vil bli brukt som negativ kontroll.
- Inkuber O / N på et roterende hjul ved 4 ° C for å la antistoffet feste til kulene.
3. Chromatin Extraction (4 timer)
MERK: I dette trinnet, vil kjernene og alle organ pellet. EXB 1 inneholder nok sukrose for å gi høy tetthet og hindre forstyrrelse av organstruktur.
MERK: EXB 2 inneholder 1% Triton X-100 til hjelp sprenge kloroplaster åpne og fjerne klorofyll.
MERK: Dette trinnet hjelper å fjerne vaskemiddel fra prøven.
MERK: Dettebuffer inneholder SDS, for å lysere kjerner og slipp kromatin.
FORSIKTIG! Sørg for å bruke hørselsvern utstyr under sonikeringstrinn i tilfelle ultralyd enheten ikke finnes i en lydtett kabinett.
Avgjørende skritt! Den kromatin fragmentering stor grad avhenger av ultralydutstyr. Sonication forhold bør justeres for å oppnå anrikning i passende DNA-størrelser. SeFigur 3 for et eksempel på hvordan du kan optimalisere kromatin fragmentering.
Merk: Prøver kan bli frosset og lagret ved -20 ° C i flere uker.
4. Immunoutfelling av protein av interesse og Redning av DNA (1 dag, 3 timer)
- Vask kulene belagt med Ab fra trinn 2,4 tre ganger med 1 ml ChIP fortynningsbuffer for å fjerne overskudd av antistoff som beskrevet i trinn 2.2. Resuspender i 200 ul ChIP fortynningsbuffer. Tilsett 50 mL av isolert kromatin. Inkuber O / N på et roterende hjul ved 4 ° C.
MERK: Kontroller concentratipå av kromatin i microvolume UV-Vis spektrofotometer. 50 ul av isolerte kromatin bør inneholde mer enn 10 ug DNA. - For trinn 4.2 til 4.5 i arbeids 4 ° C. Vask kulene to ganger i 1 ml Low Salt vaskebuffer som beskrevet i trinn 2.2.
- Vask kulene en gang i 1 ml av høy Salt vaskebuffer.
- Vask kulene en gang i 1 ml LiCl vaskebuffer.
- Vask kulene to ganger i 1 ml TE-buffer. Etter siste vask, sørg for å fullt ut fjerne TE buffer igjen i røret ved aspirasjon med en pipette.
- Ta ut INPUT prøver (trinn 3.9). Overføring 5 mL av innspill til en ny 1,5 ml mikrosentrifugerør og fortsette som med chip prøvene. Omvendt tverrbinding ved tilsetning av 200 ul av 5% gelaterende ionebytteharpiks, og inkuber i 10 min ved 95 ° C risting hvert 2-3 min. Spinne ned ved 16000 xg i 30 sek og nøye Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør ved pipettering.
MERK: Mens tranelle fremgangsmåte for tverrbinding av reversering innebærer en O / N inkubering med NaCl, inkubasjonen med et chelaterende ion-harpiks ved 95 ° C muliggjør en effektiv decrosslinking og eluering av DNA i 10 min, derfor gjør kortere protokollen en dag. - Tilsett 2 pl proteinase K (10 mg / ml) og inkuberes ved 37 ° C i 30 min for å fordøye proteiner og frigjøre DNA.
- Stopp reaksjonen ved å inkubere ved 95 ° C i 10 min.
- Raskt å rotere ved 16 000 xg i 30 sekunder og supernatanten overføres til et nytt rør ved pipettering.
- Rengjør DNA isolert ved hjelp av en standard DNA-fragmenter rensing kit.
MERK: Fortsett i henhold til produsentens instruksjoner. - Overfør DNA-bindings kolonnen fra settet til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Eluer renset DNA ved tilsetning av 20 ul av DNase-fritt vann til midten av kolonnen, og denne roterer med 16.000 xg i 60 sek. Stoppe Punkt: Prøver kan bli lagret ved -80 ° C i flere uker. 5. Måling Overflod av bindingsseter i immunpresipitert DNA av qPCR (4 timer)
- Design primere for de genomiske regioner av interesse med en smeltetemperatur (Tm) på 60 ° C og et GC-innhold på 30% -80%. Som kromatin er fragmentert ved ultralydbehandling, bør lengden av amplifisert sekvens ikke være mer enn 150-200 nukleotider (tabell 1).
MERK: Et nyttig verktøy for primer design er Primer 3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Ytterligere retningslinjer for grunning design er tilgjengelig i tidligere rapporter 8, 14,15. - Bruk en BLAST program for å sørge for at primere er spesifikke (spesielt arrangører kan dele lignende TF bindende sekvenser) og teste primer effektivitet using 1:10 fortynninger i vann av inngangs DNA (trinn 4.9). Visse regioner av genomet skal renses bedre enn andre. Det er derfor viktig å konstruere PCR primere og kontrollere dem på inngangs fortynnede DNA.
- Fortynn renset DNA 1:10 med vann og pipette 5 pl av den fortynnede DNA i en PCR-rør for hver reaksjon.
MERK: Fortynn kun det beløpet som trengs, som DNA kan feste til veggene i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Flere tine-cykler frysing øke antallet tilkoblede DNA-molekyler. For hver primer par, forsterkning i input, Ab-chip og No-Ab ChIP har for å bli analysert. - For å fullføre PCR-blandingen, tilsett SYBR grønn PCR masterblanding til en sluttkonsentrasjon på 1 x, og 0,5 uM av hver primer. Fyll opp til 20 ml med DNase-fritt vann.
- Utfør qPCR reaksjon etter anvisningene fra SYBR Grønn PCR mester mix produsenten.
- Dataanalyse ved fold berikelse metode.
- Lag et regneark med prøvenavnene og rå Ct verdier som har blitt oppnådd etter qPCR reaksjon.
- For hver prøve, trekke fra sin rå Ct verdi rå Ct verdien oppnådd for den tilsvarende No-Ab kontroll. MERK: Etter dette matematisk operasjon, vil Ct verdi for No-Ab prøven lik 0.
- Beregn gangers anrikning av eksponensiering drift med base 2 og eksponent (strøm) som er lik den negative rest oppnådd i trinn 6.1.2 (tabell 2).
fold berikelse = 2 - (Ct (prøve) - Ct (No-Ab))
MERK: I denne method overflod av et spesifikt DNA-fragment i chip-ed prøven sammenlignet med den mengde av dette fragment i No-Ab kontroll. Antakelsen med denne metoden er at nivået av bakgrunnssignalet er reproduserbar mellom ulike primersett, eksempler, og kopierer eksperimenter. Men ikke denne'noise' signalnivåene varierer mellom primersettene, prøver, og eksperimenter.
- Dataanalyse av% av input metoden.
- Lag et regneark med prøvenavnene og rå Ct verdier som har blitt oppnådd for dem etter qPCR reaksjon.
- Juster rå Ct-verdier for inngangsprøver ved å subtrahere en verdi på logaritme med grunntall 2 fra den fraksjon av total ekstrahert kromatin som ble tatt som en inngang.
MERK: I denne protokollen den trekkes verdi lik 3,32, som 10% av total kromatin ble tatt som et innspill i denne protokollen. Logg 2 (10) er lik 3,32. - Beregn% av innspill ved å multiplisere med 100 verdien av eksponensieringen drift med base 2 og eksponent (strøm) som er lik resten av justerte inngangsverdier trekkes fra rå Ct-verdier av prøven (Tabell 3).
% Av input = 100 * 2 (justert innspill - Ct (prøve))
MERK: Med denne fremgangsmåten, er forholdet mellom spesifikke DNA overflod i ChIP-ed prøven til totalt isolert kromatin (input prøve) beregnet. Nærmere om Chip dataanalyse kan finnes i Haring et al. 8.
MERK: DNA isolert fra det utfelte kromatin må analyseres for å bestemme hvilke DNA-fragmenter har vært ChIP-ed fra den totale kromatin, på grunn av sin binding til proteinet av interesse.
6. Data Analysis
MERK: Blant de exrende måter å analysere chip-data, er to mest brukte. Den første av dem er fold berikelse metoden, også benevnt som "relative berikelse ',' signal over bakgrunn" eller "i forhold til no-antistoff kontroll". Den andre metoden er navngitt som «% av input".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Åtte hovedtrinn kan bli utpekt i denne brikken protokoll for identifisering av in vivo protein-DNA-interaksjoner, inkludert dyrking og høsting av plantemateriale, tverrbinding av kromatin, kromatin isolasjon, kromatin fragmentering, selektiv isolering av kompleksene mellom DNA og for proteinet av interesse ved immunoutfelling, protein fordøyelse, DNA-rensing, og qPCR-analyse (figur 1). Et viktig skritt i chip-protokollen er fiksering av DNA-protein interaksjoner i en tverrbindingsreaksjon. Vanligvis er formaldehyd tverrbindingen anvendes i plantebrikke. Formaldehyd penetrerer vevet og skaper metylenbroer mellom NH 2 grupper av proteiner eller proteiner og nukleotider i DNA-en 6. En effektiv fiksering av nukleoprotein komplekser in vivo krever at formaldehyd når kromatin innenfor plantekjerner, og det er viktig at plantevevet er helt nedsenket i tHan formaldehyd buffer for å sikre at i løpet av immunoutfelling av protein-DNA-komplekser er effektivt trukket ned. Arabidopsis bladene er dekket av voks lag som vanskelig pene av tverrbindingsmidlet inn i cellene. I tillegg trichomes favoriserer dannelsen av luftbobler på overflaten av bladene, noe som forhindrer at formaldehydoppløsningen fra å komme inn i plantevevet. For å overvinne denne begrensningen i dette trinn vakuum påføres til prøvene, som hindrer dannelse av bobler i fikseringsløsning, og forbedre gjennomtrengning av formaldehyd inn i kjernen av alle celler. Frøplanter etter effektiv kryssbinding behandling er vist på figur 2.
Et annet viktig skritt i ChIP protokollen er kromatin klipping. Store kromatin fragmenter kan resultere i lav oppløsning kartlegging av bindingssetene av proteinet av interesse i DNA-sekvensen. I motsetning til dette, kan meget små fragmenter forhindre effektiv forsterkning avden bundne DNA ved qPCR. Ifølge empirisk erfaring, bør den optimale kromatin størrelsen på ChIP analyse være mellom 200 og 600 bp, og vilkårene for å oppnå riktig fragmentering av kromatin har å bli satt avhengig av ultralyd enhet tilgjengelig i laboratoriet. Figur 3 illustrerer Fremgangsmåten for å optimalisere kromatin skjær for å oppnå maksimal anrikning av det ønskede område av DNA-størrelser. Før ultralydbehandling, består hovedsakelig av kromatin meget store fragmenter. Et økt antall sykluser sonikering progressivt reduserer den gjennomsnittlige størrelsen av DNA i chip prøver, å nå den optimale anrikning i området fra 200 til 600 bp etter 20-30 sykluser (avsnitt 3.8 i protokollen og figur 3).
Her blir identifisering av EBS proteinbindingsseter til regulatoriske regioner av blomster integrator FT vist som et eksempel på nytten av brikken teknikk. Bindingen av EBS til tHan FT locus ble avslørt ved chip analyser med Arabidopsis linjer som uttrykker et cMyc EBS-fusjonsprotein under kontroll av den native EBS promoter (pEBS :: cMyc-EBS). Denne kodede versjon av EBS er fullt ut funksjonell som vist ved hjelp av villtype fenotypen til EBS mutante planter som uttrykker denne konstruksjon. Fire regioner innenfor det genomiske locus FT ble testet for EBS binding; en i promoterregionen av genet (FTII), to rundt transkripsjons startwebstedet (FTIV, FTVI), og en annen i første intron av FT (FTVII) (Figur 4A). Som vist i figur 4B, chip resultater viser at EBS-proteinet kan binde en regulatorisk sekvens i nærheten av transkripsjonsstartsetet av master-genet av blomstrende FT 12. Videre kan EBS protein kommuniserer både in vitro og in vivo med histon deacetylases som hda6, en annen kromatin-relatert protein som er involvert i reguleringenblomstring tid i Arabidopsis en syv. For å vurdere den mulige påvirkning av EBS på nivåene av histon acetylering i den genomiske regionen FT, ble chip-analyser utført ved anvendelse av et antistoff rettet mot histon H3 acetylert i lysiner 9 og 14, et histon mark korrelert med transkripsjonelt aktive kromatin 1 2 . Videre disse data illustrere hvordan chip tilnærminger kan bidra til å kaste lys over de molekylære mekanismene som modulerer transkripsjonen regulering av plante utviklingsprosesser.
Figur 1. Skjema for Chromatin Immunoutfelling protokollen. ChIP er en teknikk som vanligvis anvendes for å undersøke interaksjonen mellom proteiner og DNA, løst i en kjemisk forbindelse. Chromatin med bevarte interaksjoner er isolert fra kjerner og fragmentert. Ved å bruke antistoffer mot proteinet av interesse,Vi kan velge DNA-fragmenter knyttet til den. Antistoffet er konjugert til magnetiske kuler som muliggjør rask og enkel isolering ved hjelp av et magnetisk stativ. I det neste trinn blir proteinene fjernet ved proteinase behandling og DNA frigjøres. Rensede DNA-fragmenter blir deretter brukt som maler i qPCR reaksjoner for å måle deres relative overflod. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempel på et vev etter tverrbinding med formaldehyd. For å undersøke interaksjonen mellom DNA og protein, in vivo komplekser må være festet for å gjøre dem til stabile og holdbare gjennom flere trinn i protokollen. I denne versjonen av protokollen, skjer fikseringen av formaldehyd behandling. Effektiv penetrasjon av formaldehyd through vevet er avgjørende for å lykkes med chip metoden. (A) før tverrbindingstrinnet plantemateriale flyter på overflaten av oppløsningen, og er dekket med små luftbobler; abaxial og adaxial overflater av bladene varierer i farge. (B) Etter fiksering, bør plantlets bli synlig dynket i løsningen, litt gjennomsiktig, og jevnt midt i kryssbinding løsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Optimalisering av sonikasjonen vilkår for ChIP analyse. Chromatin isolert fra faste materialet består av bredt spekter av fragmenter lengder med et sterkt band på toppen av gelen representerer ekstremt lange kromatin størrelser (andre linje til venstre). Med increasynge antall ultralyd sykluser, er toppen av kromatin fragmenter størrelser forskjøvet mot mindre fragmenter. I forsøket viste optimale sykkel tallene varierer mellom 20 og 30, etter som de optimale kromatin fragmenter som spenner 200-600 bp er mer rikelig i ChIP prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. ChIP Analyser viser at EBS binder FT og EBS mutasjoner endre nivået av histon H3 acetylering i denne floral integrator genet. (A) Genomisk regionen i FT med svarte bokser som representerer eksoner. Fire fragmenter spenner regulatoriske regioner av floral integrator genet ble testet (gråbokser) ved å utforme konkrete qPCR primere. (B) EBS binder FT IV-regionen, som ligger nær transkripsjons start nettstedet. Myc-EBS tilsvarer EBS muterte planter som uttrykker cMyc-merket versjon av EBS; Myc betegner transgene planter som uttrykker cMyc EPITOP ikke smeltet til noen Arabidopsis genet. (C) EBS muterte planter vise høyere overflod av H3K9,14Ac enn villtype Landsberg erecta (L er) i alle fire FT regioner vurderes. Feilsøylene viser standardavvik (B og C). Forandret fra tidligere publiserte data i The Plant Cell 1 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Framover | Omvendt | Region testet |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tabell 1. Primere brukt i denne studien.
| Prøve | Raw Ct verdier | Ct-Ct (No-Ab) | Fold berikelse 2 - (Ct (prøve) - Ct (No-Ab)) |
| No-Ab | 34.5 | 0 | 1 |
| Ab | -5,3 | 39.4 |
Tabell 2. Eksempel på Chip dataanalyse av "Fold berikelse" metoden. Ct verdier for No-Ab prøvene representerer bakgrunnssignal forårsaket av uspesifikk binding av DNA til Ab / magnetiske kuler. Disse Ct-verdier bør overstige 30. Forskjellen mellom Ct verdier av No-Ab og Ab prøven bør være høyere enn 1.
| Trinn 1 - Juster inngangs | |||
| Justert innspill = Raw Ct (input) - Logg 2 (brøkdel av total kromatin) | |||
| Raw Ct | innspill fra total kromatin | Logg to 10 | |
| Input | 29.5 | 10% | 3,32 |
| Justert innspill = 29,5 til 3,32 = 26,18 | |||
| Trinn 2 -% av inngangs beregninger | |||
| Prøve | Raw Ct | Ct (justert input) -CT (prøve) | 2 Ct (justert input) -CT (prøve) * 100% |
| Input | 26.18 | ||
| ChIP-Ab | 31.45 | -5,27 | 2,59 |
| No-Ab | 34.5 | -8,32 | 0,31 |
Tabell 3. Eksempel på brikke dataanalyse med "% av input" metoden. Innganger representerer den totale kryssbundne kromatin isolert fra kjerner, slik at Ct-verdiene bør være lik for alle primerparene. Konvensjonelt er 5% eller 10% av den totale kromatin tatt som en inngang. No-Ab representerer en negativ kontrollprøve - perlene ikke belagt med spesifikke antistoffer mot proteinet eller tag av interest. ChIP-Ab står for prøven etter immunoutfelling med antistoffer mot proteinet eller kode av interesse.
| PBS 10x |
| 1,3 M NaCl |
| 30 mM Na 2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Utvinning buffer 1 (EXB 1) |
| 0,4 M sukrose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteasehemmere |
| Utvinning buffer 2 (EXB 2) |
| 0,25 M sukrose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl2 |
| 1% Triton X-100 </ td> |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteasehemmere |
| Utvinning buffer 3 (EXB 3) |
| 1,7 M sukrose |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 0,15% Triton X-100 |
| 2 mM MgCl2 |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteasehemmere |
| Sonikeringsbuffer |
| 50 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| Proteasehemmere |
| ChIP fortynningsbuffer |
| 1,1% Triton X-100 |
| 1,2 mM EDTA |
| 16,7 mM Tris-HCl pH 8 |
| 167 mM NaCl |
| Proteasehemmere |
| Low Salt buffer |
| 150 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| Høy Salt Vaske buffer |
| 500 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| LiCI vaskebuffer |
| 0,25 M LiCl |
| 1% NP-40 |
| 1% natriumdeoksycholat |
| 1 mM EDTA |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 1 mM EDTA |
Tabell 4. Buffer komposisjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brikken Protokollen er beskrevet her er en reproduserbar og kraftfull teknikk for å analysere interaksjoner mellom protein og spesifikke DNA-sekvenser in vivo i Arabidopsis planter. En vellykket identifisering av bindingssteder for proteiner av interesse krever et tilstrekkelig utvalg av plante organer eller utviklingsstadier hvor de relevante interaksjoner er faktisk skjer. I tillegg er det viktig å oppnå en tilstrekkelig fiksering av plantematerialet, og en optimal skjæring av kromatin ved ultralydbehandling. Høyt spesifikke antistoffer for effektiv immunoutfelling av det valgte protein / tag er også avgjørende.
Bruken av chip tilnærminger i planter overfor noen problemer relatert til tilstedeværelsen av sekundære metabolitter og celleveggene som potensielt kan forstyrre forskjellige trinnene i protokollen. Videre, kompleksiteten av planteorganer, som ofte inneholder flere celletyper, hvor det DNA-bindende protein fra interest kan være forskjellig stede eller aktiv, har hindret bruk av denne metodikken. Av denne grunn, når det er mulig er det mest fordelaktig å anvende i ChIP nærmer homogene vev hvor tilstedeværelsen og / eller aktivitet av proteinet av interesse er allerede demonstrert. Komplekse plantematerialer som inneholder forskjellige vev har en tendens til å forårsake en fortynning av celletypene hvor proteinet faktisk funksjoner. Tissue seksjonering 2 0 har vært brukt i anlegg for studier i enkelte vev eller celletyper. Men i løpet av de senere år, forskjellige fremgangsmåter har blitt utviklet for isolering av celletype spesifikk kromatin i Arabidopsis 8 til et område av optimale fragmenter (se Representative resultater avsnitt) 7. Som omtalt ovenfor, for betingelsene oppnå dette størrelsesfordeling i stor grad avhenge av den spesifikke ultralyd utstyr som brukes. I alle fall bør kromatin holdes ved lav temperatur for å hindre reversering av tverrbinding foretrekkesved hjelp av varme som utvikles under ultralydbehandling. Sonication anordning av valg skal gi en god grad av reproduserbarhet, som sammen med optimale fragmentering forhold, er avgjørende for ChIP analyse (Figur 3).
En annen viktig faktor i vellykkede Chip eksperimenter er det valgte antistoffet for immunpresipitering av proteinet av interesse. Antistoffer dannet mot anleggstranskripsjonsfaktorer kan være nyttig for ChIP analyse, men disse sera bør bli grundig testet fordi antistoffer kontrolleres i Western blot eksperimenter ikke nødvendigvis er gyldig for chip. I tillegg er antistoffer dannet mot forskjellige koder ofte for denne protokollen. ChIP grad av antistoffer som spesifikt gjenkjenner en rekke koder er kommersielt tilgjengelig, og har den fordelen at de har blitt testet i flere laboratorier. Ulempen ved bruk av disse kommersielle antistoffer er at proteinet av interesse må være kondensert til den tilsvarende epitopog uttrykt i transgene linjer (figur 4B). I dette tilfelle er det tilrådelig å sørge for at det chimeriske proteinet er funksjonelt ved å generere Arabidopsis transgene linjer som bærer fusjonsproteinet i en genetisk bakgrunn som mangler genet som koder for proteinet av interesse vår. Det komplementering av de fenotypiske abnormaliteter i mutanten linje i transgene planter vil bekrefte at fusjonsproteinet har beholdt den normale aktivitet av den endogene protein. Når transgene linjer er produsert for å identifisere bindingsstedene for transkripsjonelle regulatorer, er det foretrukket å bruke den endogene promoter for å drive ekspresjonen av det kodede protein, forebygge problemene forbundet med bruken av sterke konstitutive promotorer (se ovenfor). Spesifikke antistoffer for histone posttranslational modifikasjoner som metylering eller acetylering av spesifikke rester er også ofte brukt i ChIP analyser for å bestemme epigenomic landskap av gener som er involvert iregulering av en rekke utviklingsmessige prosesser, herunder kontroll av blomstringstiden (figur 4C). Som for antistoffer mot kodene, Chip grad av kommersielle antistoffer er det foretrukne alternativet i tilfelle av histon merker.
Chip eksperimentelle tilnærminger koblet til genekspresjon analyser har vært medvirkende til å øke vår kunnskap om hvordan transkripsjonsfaktorer, kromatin remodeling proteiner og histon kovalente modifikasjoner modulere uttrykket av gener som er involvert i reguleringen av plante biologiske prosesser og reaksjoner. Opprinnelig utviklet som en metode for å analysere interaksjonen av proteinene som er tilstede i kromatin med bestemte loci eller genområder, og utbrudd av genomiske ressurser og NGS teknologi tillot ChIP å bli et kraftig verktøy for genom-wide profilering av DNA-bindende proteiner slike som transkripsjonsfaktorer eller modifiserte histoner og histon varianter. ChIP-chip og chip-seq har gitt en ny global dimension til analysene av interaksjoner mellom kromatin proteiner og DNA i Arabidopsis 2 5. Chip-seq tilnærminger som et alternativ vurdert valg til chip-chip, som er basert på hybridiserings- arrays og introduserer noen skjevhet, gitt at disse arrays inneholde et begrenset antall sonder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
