Summary
Kromatin immunoprecipitation är en kraftfull teknik för identifiering av DNA-bindande ställen för Arabidopsis-proteiner in vivo. Detta förfarande innefattar kromatin tvärbindning och fragmentering, immunoutfällning med selektiva antikroppar mot proteinet av intresse, och qPCR analys av bundet DNA. Vi beskriver en enkel ChIP-analys optimerad för Arabidopsis växter.
Introduction
Under senare år har ett brett utbud av genetiska, molekylära och genomiska verktyg har tagits fram i modellen arter Arabidopsis thaliana. Denna teknik har underlättat enormt framsteg när det gäller att förstå hur växtutveckling regleras. Bland de utvecklingsprocesser som studerats med hjälp av Arabidopsis som förebild, har genetisk kontroll av blomningstid i stor utsträckning analyserats. Dessa studier har visat att växter modulerar mycket exakt tid för blomning som svar på endogena signaler såsom hormoner och ålder av anläggningen, och även miljö signaler såsom fotoperiod och temperatur som synkroniserar blommande tid med det naturliga kretsloppet av säsongerna 1, 2. Isoleringen och karakteriseringen av Arabidopsis-mutanter med förändringar i tiden för blomningen har determinanten i avtäckningen ett komplext nätverk av gener som reglerar blomningstid i beroende av endogena och miljöfaktorer. Dessa genetiska kretsar ärintegrerad i nivå med några mästare gener som fungerar som växlar av blommande och den exakta tidpunkten för blommor inledande beror på balansen mellan blommande främja och undertrycka aktiviteter som arbetar uppströms blomster Integrator generna 1,3.
Den funktionella karakterisering av gener som identifierades för deras roll i kontrollen av blommande initiering, med hjälp av den senaste tidens användning av genomiska metoder, har avslöjat den centrala roll som transkriptionell reglering i moduleringen av blomningstid. Faktum är att många av befälhavaren gener av blommande kodar transkriptionsfaktörer 4. Dessutom har ett antal kromatin remodeling proteinkomplex påverka uttrycket av mall gener av blomning. Ett antal av de mutanter Arabidopsis isolerade för deras förändrade blomningstid visade sig bära mutationer i gener som kodar för en mängd olika kromatin modifierings. Olika kromatin remodelers som introducerar posttranslationella modifieringar i Histone svansar, flytta nukleosomer i förhållande till DNA eller byta kanoniska histoner genom histon varianter nödvändiga för en korrekt reglering av blomning i Arabidopsis 5,6. Några av dessa kromatin remodeling aktiviteter katalyserar avsättning eller borttagande av kovalenta modifieringar såsom acetylering eller metylering i specifika histon rester. Dessa histon märken specifikt känns igen av specialiserade effektenheter som rekryterar andra kromatin remodeling komplex, transkriptionsfaktorer eller komponenter i transkriptionsmaskineriet att reglera transkriptionsaktiviteten för blommande gener.
Kromatin Immunoprecipitation (chip) möjliggör identifiering av in vivo-DNA-bindningsställen för proteiner av intresse (fig 1). Detta förfarande drar fördel av förmågan hos vissa kemikalier för att tvärbinda proteiner till DNA. De resulterande DNA-protein-komplex kan sedan immunprecipiteras genom användning av specifika antikroppar against transkriptionsfaktorer, kromatin-bindande proteiner, eller vissa modifieringar och heterologa epitoper (vanligen kallat "taggar") bundna till proteinet av val. DNA renades från dessa immunoprecipitat kan användas som en mall i kvantitativa PCR (qPCR) reaktioner för att bedöma för anrikning av speciella sekvenser av intresse. På detta sätt, kan bindningsställena för transkriptionsfaktorer eller distributionen av histon märken i synnerhet gener fastställas 7,8. Dessutom, i kombination med nästa generations sekvensering (NGS) som möjliggör massiva parallella sekvensering, har chiptekniken möjliggjort genomet hela identifiering av bindningsställen för transkriptionsfaktorer samt avtäckningen epigenomiska landskap histon modifieringar. Vidare samtidig analys av genuttryck medger övervakning hur bindningen av transkriptionsregulatorer eller deposition av särskilda histon märken korrelerar med den transkriptionella activity av gener 9.
Användningen av ChIP protokoll i Arabidopsis har gjort en bedömning av inverkan som en variation av transkriptionsregulatorer har på kromatinet organisationen master gener av blomning och hur dessa strukturella förändringar påverkar genuttryck 5,6. Tidigare resultat visade att Arabidopsis locus TIDIGT SÅLLNING I korta dagar (EBS) fungerar som en repressor av blommande och mutanter i denna gen visar en acceleration av blommande och uppreglering av befälhavaren genen av blommande FT. Dessutom förlust-of-funktion mutationer i FT trycka helt tidig blomning fenotypen av ebs muterade växter, vilket tyder på att FT krävs för tidigt blommande i EBS mutanter och att EBS är nödvändig för att undertryckandet av denna herre gen av blommande 10 11. EBS kodar för en PHD-innehållande protein som specifikt kan binda histon H3 di- och trimethylated i the lysin 4 återstod (H3K4me2 / 3), vilket tyder på en roll för EBS i kromatin-medierad repression av FT 12. Användningen av chipet tillvägagångssätt visade att Arabidopsis PHD-innehållande protein EBS 10,11 binder regulatorregionerna enligt blom- integratorn genen FT att förtränga dess uttryck 12. Ytterligare data som erhållits genom användning av chip-teknik visade att detta protein krävs för att bibehålla låga nivåer av histonacetylering, ett kännetecken för aktiv transkription, i kromatinet på denna mastergenen av blomning under initiala stegen av Arabidopsis utveckling. Dessa observationer, tillsammans med genetiska och genuttryck data visar att detta Arabidopsis PHD-innehållande protein har en central roll i finjustering av blomningstid genom att modulera uttrycket av blommor integrator genen FT 12. Arbetet presenteras här ger en optimerad metod användbar inte bara för analysen av histoner utan även för andrakromatin associerade proteiner, och med ökad effektivitet och minskade experimentell tid. Dessutom visar rapporten hur användningen av chipprotokoll har gett nya insikter i förhållandet mellan förändringar i kromatin modifieringar och transkriptionstillstånd växtgener och hur dessa kromatin-medierade mekanismer av genuttryck kontroll inverkan på uppkomsten av blomning i Arabidopsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tvärbindning av växtmaterial (1 tim)
- Odla Arabidopsis linjer som används i experimentet (vildtyp - WT - kontra mutanter och / eller linjer som uttrycker den märkta versionen av proteinet av intresse kontra linjer som uttrycker taggen inte smält till något protein) under 12-18 dagar på stora petriskålar (150 mm) med MS-agarmedium (1 L: 1x Murashige & Skoog-salter, 10 g sackaros, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Alternativt, odla växter på krukor innehållande 3: 1 blandning av jord och vermikulit.
VARNING! Formaldehyd är giftigt vid inandning, hudkontakt och förtäring, och bör hanteras i en kemisk huva bär lämplig personlig skyddsutrustning. Steg 1,2-1,6 bör utföras under dragskåp. - Gör små hål i locket av de 50 ml rör med en laboratoriebrännare-uppvärmd nål. Tillsätt 40 ml 1 x PBS-buffert och 1,08 ml formaldehyd till en slutlig koncentration av 1% (lager 37% solution). Samla 1,5 g växtmaterial i dessa 50 ml rör. Håll rören på is under tvärbindning.
- Stäng 50 ml rör med lock. Placera rören i en torkapparat och anbringa vakuum. Vakuum infiltrera vävnaden för 10 minuter, därefter frigöra vakuumet försiktigt för att förhindra kärning upp lösningen. Blanda provet. Upprepa två gånger. Efter infiltrering, observera växtmaterialet och bekräfta att det blir något genomskinligt och tenderar att sjunka till botten av röret (figur 2).
- Tillsätt 2,5 ml av 2 M glycin för att uppnå en slutlig koncentration av 0,125 M. Applicera vakuum under 5 minuter. Glycin verkar som en kompetitiv inhibitor av formaldehyd tvärbindning.
- Kassera PBS-formaldehyd-glycinlösning genom invertering det slutna 50 ml rör med hål i locket.
- Skölj plantorna två gånger med 1 x PBS och en gång med vatten kasta den tvättlösning som beskrivet i steg 1,5. Torka dem på en pappershandduk och frysa i flytande nitrogen.
OBS: Fryst vävnad kan hållas vid -80 ° C i flera veckor.
2. Framställning av antikroppar (1 dag)
OBS: För immunoutfällning, är användningen av magnetiska pärlor konjugerade med antikroppar via en protein G eller protein En linker med hög affinitet för den konstanta domänen av antikroppens tunga kedja rekommenderas. De DNA-protein-komplex kan fästa ospecifikt till ytan av konjugaten pärlorna-antikroppar. Av detta skäl är det nödvändigt att utföra kontroller utan specifika antikroppar för att kvantifiera den icke-specifika bakgrundsbindningen.
- För varje immunoutfällning, förbereda 15 ul av magnetiska pärlor i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Mängden pärlor beror på mängden av kromatinet som används för immunoutfällning och även på antikropparna.
- Att tvätta, tillsätt 1 ml Kromatin Immunoprecipitation (chip) spädningsbuffert till pärlorna, blanda genom rotation och placera 1,5 ml mikro tuvara i en magnetställning. Vänta cirka 1 minut för att låta kulorna fäster magneten. Med 1,5 ml mikrocentrifugrör fortfarande i rack, avlägsna supernatanten genom pipettering. Upprepa två gånger.
OBS: För varje växtlinjen två immunoprecipitation uppsättningar behövs: en med pärlor och antikropp (Ab) och en andra ingen antikropp (No-Ab) kontroll med bara magnetiska kulor. - Resuspendera kulorna i 200 pl av ChIP utspädningsbuffert. Tillsätt erforderlig mängd av den specifika Ab till en av de två rören förberedda för varje växtlinje (den exakta spädningen skiljer sig för varje Ab och måste optimeras experimentellt eller, när det gäller kommersiella antikroppar, följ instruktionerna från tillverkaren). Använd detta prov för immunoprecipitation. Tillsätt samma mängd ospecifik IgG till det andra röret, som kommer att användas som negativ kontroll.
- Inkubera O / N på ett roterande hjul vid 4 ° C för att låta antikroppen binda till pärlorna.
3. kromatin Extraktion (4 h)
OBS: I detta steg, kärnor och alla organ kommer pellets. Exb 1 innehåller tillräckligt sackaros för att ge hög densitet och förhindra störningar av organell struktur.
OBS: Exb 2 innehåller 1% Triton X-100 för att hjälpa spränga kloroplaster öppna och ta bort klorofyll.
OBS: Detta steg hjälper att ta bort tvättmedel från provet.
OBS: Dettabuffert innehåller SDS, att lysera kärnorna och släpp kromatin.
VARNING! Se till att bära hörselskydd utrustning under sonikeringssteg i fall ultraljud enheten inte ingår i ett ljudisolerat skåp.
Avgörande steg! Den kromatin fragmentering beror till stor del på ultraljudsutrustning. Sonikeringen villkor bör justeras för att uppnå anrikning i de lämpliga DNA-storlekar. SeFigur 3 ett exempel på hur man optimerar kromatin fragmentering.
Notera: Prov kan frysas och förvaras vid -20 ° C under flera veckor.
4. Immunoprecipitation av proteinet av intresse och Räddning av DNA (1 dag, 3 timmar)
- Tvätta pärlor belagda med Ab från steg 2.4 tre gånger med 1 ml ChIP utspädningsbuffert för att avlägsna överskott av antikropp som beskrivs i steg 2,2. Resuspendera i 200 pl ChIP utspädningsbuffert. Tillsätt 50 pl av isolerade kromatin. Inkubera O / N på ett roterande hjul vid 4 ° C.
OBS: Kontrollera concentratipå av kromatin i microvolume UV-Vis spektrofotometer. 50 pl av isolerade kromatin bör innehålla mer än 10 ^ g DNA. - För steg 4,2-4,5 arbete i 4 ° C. Tvätta pärlorna två gånger i 1 ml låg salthalt Tvättbuffert såsom beskrivs i steg 2,2.
- Tvätta pärlorna en gång i 1 ml med hög salthalt Tvättbuffert.
- Tvätta pärlorna en gång i 1 ml LiCl Tvättbuffert.
- Tvätta pärlorna två gånger i 1 ml TE-buffert. Efter den sista tvättningen, se till att helt ta bort den TE-buffert kvar i tuben genom aspiration med en pipett.
- Ta ut INPUT prover (steg 3,9). Transfer 5 pl av INPUT till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör och fortsätta som med flisprover. Omvänd tvärbindning genom tillsats av 200 pl av 5% kelatbildande jonbytarharts, och inkubera under 10 minuter vid 95 ° C skakning varje 2-3 min. Centrifugera ner vid 16 tusen xg under 30 sek och noggrant överföra supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör genom pipettering.
OBS: Även om trationell metod för tvärbindning av återföring innefattar en O / N-inkubation med NaCl, inkuberingen med ett kelatbildande jon-harts vid 95 ° C möjliggör effektiv decrosslinking och eluering av DNA i 10 minuter, därför gör det protokoll en dag kortare. - Tillsätt 2 | il proteinas K (10 mg / ml) och inkubera vid 37 ° C under 30 min för att smälta proteiner och frisätta DNA.
- Stoppa reaktionen genom inkubering vid 95 ° C under 10 minuter.
- Snabbt snurra vid 16.000 xg under 30 sek och överföra supernatanten till ett nytt rör genom pipettering.
- Rengör DNA som isolerats med användning av en standard-DNA-fragment reningskit.
OBS: Fortsätt enligt tillverkarens anvisningar. - Överför den DNA-bindande kolonn ur satsen i ett annat 1,5 ml mikrocentrifugrör. Eluera den renade DNA genom tillsats av 20 | il DNas-fritt vatten till mitten av kolonnen och spinning vid 16 tusen xg under 60 sek. Stoppa Punkt: Prover kan förvaras vid -80 ° C under flera veckor. 5. Att mäta Överflöd av bindningsställen i immunoprecipiterade DNA från qPCR (4 h)
- Design primrar för de genomiska regioner av intresse med en smälttemperatur (Tm) av 60 ° C och en GC-halt av 30% -80%. Som kromatin fragmenteras genom ultraljudsbehandling, bör längden på förstärkta sekvensen inte vara längre än 150-200 nukleotider (tabell 1).
OBS: Ett användbart verktyg för primer design är Primer 3-programmet (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Ytterligare riktlinjer för primer design finns i tidigare rapporter 8, 14,15. - Använd en BLAST program för att se till att primers är specifika (speciellt promotorer kan dela liknande TF bindande sekvenser) och testa primer effektiviteten using 1:10 spädningar i vatten av den ingående DNA (steg 4,9). Vissa regioner i genomet kommer att renas bättre än andra. Det är därför viktigt att utforma PCR-primers och kontrollera dem på den utspädda ingångs DNA.
- Späd det renade DNA: 1:10 med vatten och pipett 5 pl av den utspädda DNA i en PCR-rör för varje reaktion.
OBS: Späd endast den mängd som behövs, som DNA kan fästa till väggarna i de 1,5 ml mikrocentrifugrör. Flera upptining frysning cykler öka antalet anslutna DNA-molekyler. För varje primerpar, amplifiering i input, har Ab-ChIP och No-Ab ChIP som skall analyseras. - För att slutföra PCR-blandningen, tillsätt SYBR Green PCR Master Mix till en slutlig koncentration av 1 x och 0,5 pM av varje primer. Fyll upp till 20 | j, l med DNas-fritt vatten.
- Utför qPCR reaktion efter instruktioner från SYBR Green PCR Master Mix tillverkare.
- Dataanalys av faldig anrikning metod.
- Skapa ett kalkylblad med prover namn och rå Ct-värden som har erhållits efter qPCR reaktion.
- För varje prov, subtrahera från dess råa Ct-värdet rå Ct-värde som erhölls för motsvarande nr-Ab-kontroll. OBS: Efter detta matematisk operation, kommer Ct värde för No-Ab prov lika 0.
- Beräkna faldig anrikning av exponentiering drift med bas 2 och exponent (makt) som är lika med den negativa resten som erhållits i steg 6.1.2 (tabell 2).
faldig anrikning = 2 - (Ct (prov) - Ct (No-Ab))
OBS: I detta metod överflödet av ett specifikt DNA-fragment i Chip-ed prov jämförs med det överflöd av detta fragment i No-Ab-kontroll. Antagandet om denna metod är att nivån av bakgrundssignal är reproducerbar mellan olika primeruppsättningar, prover, och replikerar experiment. Dock inte detta'noise' signalnivåerna varierar mellan primeruppsättningar, prover och experiment.
- Dataanalys med% av inmatningsmetod.
- Skapa ett kalkylblad med prover namn och rå Ct-värden som har erhållits för dem efter qPCR reaktion.
- Justera rå Ct-värden för insampel genom att subtrahera ett värde av logaritmbasen 2 från fraktionen av det totala extraherade kromatin som togs som en ingång.
OBS: I detta protokoll är lika med subtraherade värdet 3,32, som en 10% av den totala kromatin togs som en ingång i detta protokoll. Log2 (10) är lika med 3,32. - Beräkna% av indata genom att multiplicera med 100 värdet av exponentieringen drift med bASE 2 och exponent (power) är lika med återstoden av justerade ingångsvärden subtraheras från rå Ct-värdena av provet (tabell 3).
% Av input = 100 * 2 (justerat ingång - Ct (prov))
OBS: Med denna procedur, är förhållandet mellan specifika DNA överflöd i Chip-ed prov till den totala isolerade kromatin (input prov) beräknas. Mer information på chip dataanalys kan hittas i Haring et al. 8.
OBS: DNA isolerat från den utfällda kromatinet måste analyseras för att bestämma vilket DNA-fragment har Chip-ed från den totala kromatin, på grund av dess bindning till proteinet av intresse.
6. Dataanalys
OBS: Bland frittfintlig sätt att analysera ChIP-data, är två mest använda. Den första av dem är faldig anrikning metoden, även benämnd "relativ vinst", "signal över bakgrund" eller "i förhållande till den icke-antikroppskontroll". Den andra metoden heter som "% av input".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Åtta huvudstegen kan pekas ut i detta chip protokoll för identifiering av in vivo protein-DNA-interaktioner, inklusive odling och skörd av växtmaterial, tvärbindning av kromatin, kromatin isolering, kromatin fragmentering, selektiv isolering av komplexen mellan DNA och proteinet av intresse genom immunoutfällning, proteindigestion, DNA-rening, och qPCR analys (Figur 1). Ett mycket viktigt steg i spån protokollet är fixeringen av DNA-protein-interaktioner i en tvärbindningsreaktion. Typiskt formaldehyd tvärbindning användes i anläggningen ChIP. Formaldehyd penetrerar vävnaden och skapar metylenbryggor mellan NH 2 grupper av proteiner eller proteiner och nukleotider i DNA 1 6. En effektiv fixering av nukleoprotein komplex in vivo kräver att formaldehyd når kromatin inom växtkärnor, och det är viktigt att växtvävnaden är helt nedsänkt i tHan formaldehyd buffert för att säkerställa att under immunoprecipitation protein-DNA-komplex effektivt nerdragen. Arabidopsis blad är täckta i vax lager som svårt att penetrans av tvärbindningsmedlet in i cellerna. Dessutom trichomes gynnar bildningen av luftbubblor på ytan av bladen, förebygga formaldehydlösningen kommer in i växtvävnaden. För att övervinna denna begränsning, i detta steg vakuum appliceras till proverna, förhindrar bildandet av bubblor i fixeringslösningen och förbättra penetrationen av formaldehyd i kärnan hos alla celler. Plantor efter effektiv tvärbindande behandling visas i figur 2.
En annan viktig steg i ChIP protokollet är kromatin klippning. Stora kromatin fragment kan resultera i låg upplösning kartläggning av bindningsställena hos proteinet av intresse i DNA-sekvensen. I motsats härtill kan mycket små fragment förhindra effektiv amplifiering avdet bundna DNA: t genom qPCR. Enligt empiriska erfarenhet, bör den optimala kromatin storleksintervallet för ChIP analys vara mellan 200 och 600 bp, och villkoren för att uppnå en lämplig fragmentering av kromatin måste ställas in beroende på ultraljuds enhet tillgänglig i laboratoriet. Figur 3 illustrerar förfarande för att optimera kromatin klippning för att uppnå maximal anrikning i det önskade intervallet av DNA-storlekar. Före ultraljudsbehandling, kromatin består huvudsakligen av mycket stora fragment. Ett ökat antal sonication cykler minskar successivt den genomsnittliga storleken av DNA i flisprover, når optimal anrikning i intervallet 200-600 bp efter 20-30 cykler (avsnitt 3.8 i protokollet och Figur 3).
Här, är identifieringen av EBS proteinbindningsställen till regulatoriska regioner av blom- integratorn FT visas som ett exempel på användbarheten av chipet tekniken. Bindningen av EBS till than FT locus unraveled genom ChIP-analyser med Arabidopsis som uttrycker en cMyc-EBS-fusionsproteinet under kontroll av den nativa EBS-promotorn (PEBS :: cMyc-EBS). Detta taggade version av EBS är fullt fungerande vilket framgår av den vilda typen fenotypen av ebs muterade växter som uttrycker denna konstruktion. Fyra regioner inom iska FT locus testades för EBS bindning; en i promotorregionen av genen (FTII), två runt transkriptionsstartstället (FTIV, FTVI), och en annan i den första intronen av FT (FTVII) (Figur 4A). Såsom visas i figur 4B, ChIP resultat visar att EBS-proteinet kan binda en regulatorisk sekvens nära transkriptionsstartstället av mastergenen av blommande FT 12. Vidare kan EBS-proteinet interagerar både in vitro och in vivo med histondeacetylaser såsom hda6, annan kromatin relaterat protein involverat i regleringenav blommande tid i Arabidopsis 1 7. För att bedöma eventuell påverkan av EBS på nivåerna av histonacetylering i det genomiska regionen FT, var CHIP analyser utförs med hjälp av en antikropp riktad mot histon H3 acetylerades i lysiner 9 och 14, en histon märke korrelerad med transkription aktiv kromatin 1 2 . Dessutom är dessa data illustrerar hur CHIP metoder kan bidra till att belysa de molekylära mekanismer som modulerar transkriptionell reglering av växt utvecklingsprocesser.
Figur 1. Scheme av Kromatin Immunoprecipitation protokollet. Chip är en teknik som vanligen används för att undersöka interaktioner mellan proteiner och DNA, som fastställts av en kemisk förening. Kromatin med bevarade interaktioner isoleras från kärnorna och fragmenterad. Genom att använda antikroppar mot proteinet av intresse,Vi kan välja fragment av DNA som är knutna till den. Antikroppen är konjugerad till magnetiska pärlor som möjliggör snabb och enkel isolering med hjälp av en magnetisk rack. I nästa steg, är proteiner avlägsnas genom proteinas behandling och DNA frisätts. Renade DNA-fragment används sedan som mallar i qPCR reaktioner för att mäta deras relativa överflöd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Exempel på en vävnad efter tvärbindning med formaldehyd. För att undersöka interaktioner mellan DNA och protein, in vivo-komplex måste fixeras för att göra dem stabila och hållbara genom de multipla stegen i protokollet. I den här versionen av protokollet, sker fixering av formaldehydbehandling. Effektiv penetrering av formaldehyd thrgrundlig vävnaden är avgörande för framgång chip metoden. (A) Före tvärbindningssteget växtmaterialet flyter på ytan av lösningen och är täckt med små luftbubblor; de abaxial och adaxial ytorna på bladen skiljer sig i färg. (B) Efter fixering, bör småplantor vara synligt indränkt i lösningen, lätt transparent, och jämnt nedsänkt i tvärbindningslösningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Optimering av sonication villkoren för ChIP analys. Chromatin isolerats från fasta materialet består av ett brett spektrum av fragment längder med en stark band på toppen av gelén representerar extremt långa kromatin storlekar (andra raden till vänster). Med ökat sjsjunger antal sonication cykler, är toppen av kromatin fragment storlekar förskjutits mot mindre fragment. I experimentet visade optimala cykel siffrorna varierar mellan 20 och 30, varefter de optimala kromatin fragment från 200 till 600 bp är mer rikligt i chippet provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Chip analyser visar att EBS binder FT och ebs mutationer förändrar nivån på histon H3 acetylering i detta blom- integrator gen. (A) Genomisk regionen FT med svarta lådor som representerar exoner. Fyra fragment spänner regulatoriska regioner av detta blom- integrator genen testades (gråboxar) genom att utforma särskilda qPCR primers. (B) EBS binder FT IV regionen, ligger nära transkriptionsstartstället. Myc-EBS motsvarar ebs muterade växter som uttrycker cMyc-märkta versionen av EBS; Myc betecknar transgena växter som uttrycker cMyc epitopen inte fuserad till någon Arabidopsis-genen. (C) ebs muterade växter uppvisar högre förekomst av H3K9,14Ac än vild typ Landsberg erecta (L er) i alla fyra FT regioner bedömas. Felstaplar visar standardavvikelsen (B och C). Modifierad från tidigare publicerade data i The Plant Cell 1 2. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
| Fram | Omvänd | Region testas |
| TCGTGCAAATGGATGGTTAG | TTTTTTATAAACAAGCGGCC | FT II |
| TGATTTCACCGACCCGAGTTAATGCAAATC | AACTCTGCTTACTATAAGAGGGTCTC | FT IV |
| AAACCACCTGTTTGTTCAAGATC | TCCTGAGGTCTTCTCCACCA | FT VI |
| GGGATTTTTCTTTGTTCCTCC | ATTCCACAACAGAGATTCATCA | FT VII |
Tabell 1. Primrar som användes i denna studie.
| Prov | Raw Ct Värden | Ct-Ct (No-Ab) | Faldig anrikning 2 - (Ct (prov) - Ct (No-Ab)) |
| No-Ab | 34,5 | 0 | 1 |
| Ab | -5,3 | 39,4 |
Tabell 2. Exempel på CHIP dataanalys av "vika anrikning" -metoden. Ct Värden för Inga-Ab prover representerar bakgrundssignalen som orsakas av ospecifik bindning av DNA till Ab / magnetiska kulor. Dessa Ct-värden bör överstiga 30. Skillnaden mellan Ct-värden för No-Ab och Ab prov bör vara högre än ett.
| Steg 1 - Justera ingångs | |||
| Justerat input = Raw Ct (ingång) - Logga 2 (del av den totala kromatin) | |||
| Råmaterial Ct | input från total kromatin | Log 2 10 | |
| Input | 29,5 | 10% | 3,32 |
| Justerat input = 29,5 till 3,32 = 26,18 | |||
| Steg 2 -% av ingångsberäkningar | |||
| Prov | Råmaterial Ct | Ct (justerat ingång) -CT (prov) | 2 Ct (justerat ingång) -CT (prov) * 100% |
| Input | 26,18 | ||
| Chip-Ab | 31,45 | -5,27 | 2,59 |
| No-Ab | 34,5 | -8,32 | 0,31 |
Tabell 3. Exempel på ChIP dataanalys med "% av ingående" -metoden. Ingångar visar det totala tvärbunden kromatin isolerat från kärnor, så Ct-värdena bör vara lika för alla primerparen. Konventionellt 5% eller 10% av den totala kromatin tagen som en insignal. Nr-Ab representerar ett negativt kontrollprov - pärlorna inte belagda med specifika antikroppar mot proteinet eller tagg av interest. Chip-Ab står för provet efter immunoutfällning med antikroppar mot proteinet eller tagg av intresse.
| PBS 10x |
| 1,3 M NaCl |
| 30 mM Na 2 HPO 4 |
| 30 mM NaH 2 PO 4 |
| pH 7 |
| Extraktionsbuffert 1 (EXB 1) |
| 0,4 M sackaros |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCb |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteashämmare |
| Extraktion buffert 2 (Exb 2) |
| 0,25 M sackaros |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM MgCl2 |
| 1% Triton X-100 </ td> |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteashämmare |
| Extraktionsbuffert 3 (Exb 3) |
| 1,7 M sackaros |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 0,15% Triton X-100 |
| 2 mM MgCl2 |
| 5 mM β-merkaptoetanol |
| Proteashämmare |
| Sonikeringsbuffert |
| 50 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM EDTA |
| 1% SDS |
| Proteashämmare |
| ChIP utspädningsbuffert |
| 1,1% Triton X-100 |
| 1,2 mM EDTA |
| 16,7 mM Tris-HCl pH 8 |
| 167 mM NaCl |
| Proteashämmare |
| Buffert med låg salthalt |
| 150 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| Hög Salt Tvättbuffert |
| 500 mM NaCl |
| 0,1% SDS |
| 1% Triton X-100 |
| 2 mM EDTA |
| 20 mM Tris-HCl pH 8 |
| LiCl Tvättbuffert |
| 0,25 M LiCl |
| 1% NP-40 |
| 1% natriumdeoxikolat |
| 1 mM EDTA |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 10 mM Tris-HCl pH 8 |
| 1 mM EDTA |
Tabell 4. Buffert komposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chipet protokoll som beskrivits här är en reproducerbar och kraftfull teknik för att analysera växelverkningar mellan proteiner och specifika DNA-sekvenser in vivo i Arabidopsis växter. En framgångsrik identifiering av bindningsställen för proteiner av intresse kräver ett lämpligt urval av växtorgan eller utvecklingsstadier där relevanta interaktioner faktiskt äger rum. Dessutom är det viktigt att erhålla en lämplig fixering av växtmaterialet och en optimal skjuvning av kromatin genom sonikering. Mycket specifika antikroppar för effektiv immunutfällning av det utvalda proteinet / taggen är också viktigt.
Användningen av CHIP metoder i växter möter vissa svårigheter i samband med förekomsten av sekundära metaboliter och cellväggarna som potentiellt kan störa olika steg i protokollet. Dessutom komplexiteten i växtorgan, ofta innehållande flera celltyper där det DNA-bindande proteinet av interest kan vara differentiellt närvarande eller aktiv, har hindrat användningen av denna metod. Av detta skäl, när så är möjligt är det mest fördelaktiga för användning i ChIP närmar homogena vävnader där närvaron och / eller aktiviteten av proteinet av intresse har redan påvisats. Komplexa växtmaterial som innehåller olika vävnader tenderar att orsaka en utspädning av celltyper där proteinet faktiskt funktioner. Vävnad sektione 2 0 har använts i växter för studier i enskilda vävnader eller celltyper. Men under de senaste åren, olika förfaranden har utvecklats för isolering av celltypsspecifik kromatin i Arabidopsis 8 till en rad optimala fragment (se representativa resultat avsnitt) 7. Såsom diskuterats ovan, att de villkor uppnå detta storleksfördelning i hög grad beror på den specifika ultraljudsutrustning användas. I varje fall bör kromatin hållas vid låg temperatur för att förhindra omkastning av tvärbindnings gynnadegenom värme som alstras under sonikering. Sonication anordning val bör ge en god nivå av reproducerbarhet, som tillsammans med optimala fragmentering förhållanden är avgörande för ChIP analys (Figur 3).
En annan viktig faktor i framgångsrika ChIP experiment är den valda antikroppen för immunutfällning av proteinet av intresse. Antikroppar framkallade mot växttranskriptionsfaktorer kan vara användbara för ChIP-analys, men dessa sera bör testas noggrant eftersom antikroppar kontrolleras i Western blot-experiment är inte utan vidare överföras till chipet. Dessutom är antikroppar mot olika taggar som ofta används för detta protokoll. Chip-grade-antikroppar som specifikt känner igen en mängd olika taggar är kommersiellt tillgängliga och har fördelen att de har testats i flera laboratorier. Nackdelen för användning av dessa kommersiella antikroppar är att proteinet av intresse har att sammansmältas med den motsvarande epitopenoch uttryckt i transgena linjer (figur 4B). I detta fall är det lämpligt att se till att det chimära proteinet är funktionell genom att generera Arabidopsis transgena linjer som bär fusionsproteinet i en genetisk bakgrund som saknar den gen som kodar vår proteinet av intresse. Den komplementering av de fenotypiska avvikelser i mutantlinjen i de transgena växterna kommer att bekräfta att fusionsproteinet bibehåller den normala aktiviteten för det endogena proteinet. När transgena linjer produceras för att identifiera bindningsställen för transkriptionsregulatorer, är det föredraget att använda den endogena promotorn för att driva expressionen av det märkta proteinet och förhindrar problemen associerade med användningen av konstitutiva starka promotorer (se ovan). Specifika antikroppar för histon posttranslationella modifieringar såsom metylering eller acetylering av specifika rester är också ofta används vid chip analyser för att fastställa epigenomiska landskap av gener som är involverade ireglering av ett antal utvecklingsmässiga processer, inbegripet kontroll av blomningstid (Figur 4C). När det gäller antikroppar mot taggar Chip-kvalitet kommersiella antikroppar är det bästa alternativet när det gäller histon märken.
ChIP experimentella metoder kopplade till genuttryck analyser har varit avgörande för att öka vår kunskap om hur transkriptionsfaktorer, kromatin remodeling proteiner och histon kovalenta modifieringar modulera uttrycket av gener involverade i regleringen av växt biologiska processer och svar. Utvecklades ursprungligen som en metod för att analysera samspelet mellan proteiner som finns i kromatin med särskilda loci eller genregioner har utbrott av iska resurser och NGS tekniken tillåts chip att bli ett kraftfullt verktyg för genomet hela profilering av DNA-bindande proteiner sådana som transkriptionsfaktorer eller modifierade histoner och histon varianter. Chip-chip och Chip-punkter har gett en ny global dimensionen till analyser av samspelet mellan kromatin proteiner och DNA i Arabidopsis 2 5. Chip-punkter metoder anses alternativet att valet till Chip-chip, som bygger på hybridiserings arrayer och introducerar några fördomar, med tanke på att dessa arrayer innehåller ett begränsat antal sönder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack - DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
References
- Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
- Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
- Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
- Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
- He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
- Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
- Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11 (2007).
- Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
- Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
- Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
- Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998 (2012).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
- Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
- Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
- Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).
- Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
- Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
- Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).
