Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توصيف الأيض من الاستقطاب M1 M2 الضامة والعظام نخاع المستمدة من طريق في الوقت الحقيقي التحليل خارج الخلية الجريان

Published: November 28, 2015 doi: 10.3791/53424
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, Amsterdam

Introduction

في حين الضامة تلعب دورا محوريا في الأمراض تقريبا كل شيء، والآليات الجزيئية التي تنظم ملامحهم لا تزال غير تهاوت تماما. عرض الضامة التجانس عالية وردا على المكروية تعتمد الظواهر المختلفة 1. LPS (+ IFNγ) يسببها تنشيط كلاسيكي M1 أو M (LPS) الضامة تعزز الالتهابات وحماية المضيف ضد أنواع مختلفة من التهديدات الجرثومية 2. ويستخدم آخرون IFNγ وحدها أو بالاشتراك مع TNF كما المحفزات للحصول M1 الاستقطاب. IL-4 و / أو IL-13 يدفع تنشيط البلاعم البديل وهذه M2 أو M (IL-4) الخلايا هي المكثفات قوية والتحكم والاستجابات المناعية الجارية 3. عرض الضامة الاستقطاب لائحة متميزة من الأيض الخلوي مع الضامة M1 LPS تنشيط تمر التحول الأيضي لتعزيز تحلل 4-6. الأكسدة على العكس، وتعزيز الأحماض الدهنية (FAO) وoxidativ الميتوكوندرياالبريد الفسفرة (OXPHOS) توفر الطاقة المستدامة في IL-4 التي يسببها الضامة M2 7-9. وهكذا، والتمثيل الغذائي تغيير ليس فقط سمة من سمات فرعية بلعم الاستقطاب، بل هو أيضا شرط أساسي لاستقطاب والتنظيم السليم للالتهابات. الأهم من ذلك، تثبيط تحلل أو OXPHOS / وقد تجلى منظمة الأغذية والزراعة لتنال M1 M2 أو التنشيط، على التوالي 8،10. على هذا النحو، وتحديد التغيرات الأيضية في الضامة يمكن تطبيقها كأداة لتقييم حالة الاستقطاب وإمكاناتهم التهابات.

ولذلك يمكن أن تستخدم فحص ثابت الذي يقيس الأيض بلعم التنبؤ بما إذا كانت المخدرات، والجينات بهدم أو يؤثر العلاج الأخرى الاستقطاب البلاعم وظيفة. في هذا الفيديو، يتم استخدام محلل تدفق خارج الخلية لتوصيف ملامح الطاقة الحيوية من السذاجة، M1 و M2 الضامة.

هذه المخطوطة تفاصيل بروتوكول الأمثل الذي يسمح للقياسجميع المعلمات ذات الصلة تحلل (تحلل، تحلل القصوى واحتياطي حال السكر) وخصائص وظيفة الميتوكوندريا (التنفس الكلي، والتنفس الميتوكوندريا القاعدية، إنتاج ATP، تسرب بروتون، التنفس القصوى والقدرة التنفسية الغيار) في فحص واحد. باستخدام هذا الإعداد التجريبية، يمكن مقارنة بين الطاقة الحيوية والسيطرة "تغيير" (مثل الجينات نهدم، overexpression المعدلة وراثيا أو العلاج الدوائي) الخلايا.

Protocol

1. الضامة التثقيف والإستقطاب نخاع العظم المشتقة

  1. اليوم 0: عظم الفخذ والساق عزل العظام 6-10 اسبوع الفئران القديمة من الفائدة (C57BL / 6 في هذا الاختبار).
  2. إزالة الأنسجة العضلية من عظام ووضع العظام في 9 سم بتري طبق مليئة PBS الجليد الباردة.
  3. نقل العظام إلى صحن 9 سم بيتري مليئة 70٪ من الإيثانول ويهز بلطف لوحة لمدة 30 ثانية.
  4. نقل العظام إلى الطازج 9 سم طبق بتري مليئة PBS العقيمة الجليد الباردة.
  5. قطع عظم الفخذ والساق في كلا طرفي مع مقص العقيمة.
  6. مسح العظام مع 10 مل PBS العقيمة الجليد الباردة باستخدام حقنة 10 مل و إبرة 25 G. جمع نخاع العظم في أنبوب 50 مل.
  7. نقل خلايا نخاع العظم لأنبوب جديد 50 مل باستخدام إبرة 23 G.
  8. كرر هذه الخطوة مع إبرة 25 G. ملاحظة: هناك حاجة لهذه الخطوات لإزالة كتل الخلايا وبقايا العظام.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  10. تجاهل سوبernatant و resuspend الخلايا في 40 مل خلية متوسطة الثقافة (RPMI-1640 زائد 2 مم L-الجلوتامين، و 10٪ FCS والبنسلين (100 U / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) و 15٪ تصفيتها L-929 خلية ( ATCC، CCL-1) المتوسطة -conditioned تحتوي M-CSF (أو بدلا من 10 نانوغرام / مل المؤتلف M-CSF بدلا من L-929 متوسطة مكيفة الخلية).
    ملاحظة: جيل من L-929 متوسطة مكيفة الخلية كانت مفصلة في هذه المجلة في وقت سابق من عام 2013. 11
  11. ثقافة الخلايا من الماوس واحد في اثنين 15 سم أطباق بتري (لا تستخدم لوحات المعالجة ثقافة الخلية منذ سوف بلعم لا فصل من هذا البلاستيك) في 20 مل الثقافة المتوسطة في لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
  12. إضافة 10 مل الطازجة مستنبت الخلية في اليوم 3، دون إزالة 20 مل السن مستنبت الخلية.
  13. استبدال متوسطة العمر من كل لوحة مع 20 مل المتوسطة ثقافة جديدة في يوم 6. القيام بذلك، كما سيتم إزالة الخلايا غير ملتصقة.
  14. يوم 8:
    1. فصل الخلايا التي يحتضنها منهم 5 مفي في 37 ° C في 10 مل المالحة السيترات (135 ملي كلوريد البوتاسيوم بالإضافة إلى 15 ملي سيترات الصوديوم في H 2 O، تعقيمها) وتغسل مع 10 مل PBS. عد الضامة العظام ناضجة المستمدة من نخاع (BMDM) في يوم 8 باستخدام عداد الخلية.
    2. تحقق من تشكيل ناضجة (CD11b + F4 / 80 +) BMDM عن طريق التفتيش البصري أو عن طريق التدفق الخلوي. بلوك 10 5 الخلايا مع 1/100 مكافحة CD16 / CD32 في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في 100 ميكرولتر PBS، احتضان مع 1/200 المضادة للCD11b-FITC بالإضافة 1/200 مكافحة F4 / 80-APC-Cy7 في RT، ويغسل وتحليل التدفق الخلوي.
      ملاحظة: تم نشر الضامة المشتقة من نخاع العظام زراعة الماوس بالتفصيل في هذه المجلة في وقت سابق يينغ وآخرون 11.
  15. البذور 50000 الخلايا (عدد الخلايا الأمثل تحتاج إلى أن يكون الأمثل) لكل بئر في صفيحة ميكروسكوبية زراعة الخلايا في 100 ميكرولتر الثقافة المتوسطة. لا البذور الخلايا في الآبار تصحيح الخلفية (A1، A12، H1، H12) ووضع المتوسطة فقط (وليس الخلايا) في هذه الآبار تلميح: امسك ماصة في زاوية لنوبة منتصف الطريق إلى أسفل الجانب من الآبار للطبقة الخلايا الأكثر تجانسا.
  16. السماح للخلايا ليستقر على مستوى RT في غطاء الثقافة خلية لمدة 1 ساعة. وسيعزز هذا التوزيع حتى الخلية والحد من آثار الحافة. رصد الالتزام باستخدام المجهر والثقافة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
  17. ثلاثة ساعة بعد الطلاء، وتحفيز الخلايا لمدة 24 ساعة مع 10 نانوغرام / مل LPS، أو 20 نانوغرام / الماوس المؤتلف IL-4 لتوليد M1 M2 أو الضامة، على التوالي مل. تشمل غير المعالجة ساذجة (M0) الضامة كمجموعة تحكم. تقييم السليم M1 و M2 بلعم الاستقطاب عن طريق قياس إفراز الناجمة عن LPS من IL-6، IL-12، TNF (ELISA) وIL-4 التي يسببها أرجيناز-1 النشاط و / أو MMR (CD206) وMGL (CD301) التعبير السطحي (التدفق الخلوي) كما هو موضح سابقا 3،11.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن أن تكون خلايا (قبل) المعالجة بالإثير مع المركبات الدوائية من الفائدة أو الضامة يمكن حفز مع عوامل أخرى. منذ ذلك الحين، الاختلاف بين آبار منفصلة قد تكون الغواصاتtantial، فمن المستحسن استخدام ما لا يقل عن 4 ومثالي 6 آبار في الشرط.

2. إعداد مقايسة خارج الخلية الجريان

  1. هيدرات خرطوشة الاستشعار يوم واحد قبل تشغيل الفحص:
    1. وضع خرطوشة استشعار رأسا على عقب بجانب لوحة فائدة.
    2. ملء كل بئر من لوحة فائدة مع 200 ميكرولتر من محلول calibrant وخفض خرطوشة استشعار على لوحة فائدة غمر أجهزة الاستشعار في حل calibrant.
    3. تحقق من مستوى حل calibrant مرتفع بما يكفي للحفاظ على أجهزة استشعار المغمورة والمكان في غير CO-2 37 درجة مئوية الحاضنة O / N.
  2. إعداد مقايسة المتوسطة في يوم الفحص على النحو التالي:
    1. المتوسط ​​الدافئة 50 مل XF قاعدة إلى 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 500 ميكرولتر 200 ملي L-الجلوتامين للحصول على 2 ملي التركيز النهائي.
    3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم وتعقيم مع فلتر 0.2 ميكرومتر والحفاظ على وسيلة فحص عند 37 درجة مئوية.
  3. بلطف إزالة مستنبت الخلية من الضامة الاستقطاب وتخزينه في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل (مثل ELISA لفحص الاستقطاب بلعم السليم). غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر مقايسة المتوسطة، إضافة 180 ميكرولتر المتوسطة فحص لكل بئر والتحقق تحت المجهر أن الخلايا لم جرفت. وضع لوحة زراعة الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية دون CO 2 لمدة 1 ساعة قبل تشغيل الفحص.
  4. إعداد 10 × حقن مركب خليط من A حتى D كما هو موضح في الجدول رقم 1، الحارة إلى 37 درجة مئوية، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وفلتر تعقيم.
    1. جعل جميع المركبات في هذه الخلائط في 10X تركيز النهائي في الآبار زراعة الخلايا وتحسين هذه التركيزات لكل نوع من الخلايا.
  5. تحميل خرطوشة الاستشعار باستخدام أدلة التحميل المقدمة مع وحدات التخزين المشار إليها (الجدول 1) من استعداد 10X خليط من مجمع حقن في الموانئ A، B، C و D، respectively.
خليط / حقن مجمعات سكنية وأضاف حجم للحصول على خليط 10X (ميكرولتر) حجم الفحص المتوسطة (مل) حجم حقن خلال المدى (ميكرولتر) التركيز النهائي في مقايسة
ا 2.5 M (45٪) الجلوكوز 300 2.7 20 25 ملي
ب 5 ملي أوليغوميسين A (OM) 9 3.0 22 1.5 ميكرومتر
C 5 ملي FCCP 9 2.7 25 1.5 ميكرومتر
حل 100 ملي الصوديوم البيروفات 300 1 ملم
د 5 ملي antimycin A (AA) 15 3.0 28 2.5 ميكرومتر
5 ملي روتينون (العفن) 7.5 1.25 ميكرومتر

الجدول 1. مخاليط الحقن.

3. توصيف الطاقة البيولوجية من الاستقطاب M1 و M2 BMDM باستخدام الجريان محلل خارج الخلية

  1. إنشاء قالب الفحص مع المعالج مقايسة مع MIX 2 دقيقة و 3 مرات التدبير دقيقة و(على الأقل) 3 المزيج ومعدل القياسات حلقات قبل كل من 4 حقن (الجدول 1) وبعد حقن الماضي.
    ملاحظة: هذه التركيزات صالحة للالضامة المشتقة من نخاع العظام وRaw264.7 خطوط الخلايا بلعم، ولكن ينبغي أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا. وهناك حاجة مضيفا البيروفات في خليط FCCP لتغذية التنفس القصوى.
  2. بدء تشغيل عن طريق دفع أسفل البداية واتبع التعليمات من الجهاز. أول شحنة السيارةلوحة tridge مع تحقيقات المائية للسماح للمعايرة من قبل أجهزة والحمل القادم لوحة الخلية.
  3. بعد الفحص، تجاهل بعناية كل المتوسطة فحص وتخزين تحليلها خلية ثقافة صفيحة ميكروسكوبية -20 ° C للتطبيع خلية في المستقبل باستخدام فحص عدة تكاثر الخلايا كما هو موضح بالتفصيل من قبل المورد.
    1. لفترة وجيزة، وإعداد 1X العازلة خلية تحلل عن طريق تمييع العنصر B 20 أضعاف في الماء المقطر وتمييع مجمع A-400 أضعاف في 1X العازلة خلية تحلل. إضافة 200 ميكرولتر لكل بئر، واحتضان 5 دقائق على RT وقياس مضان مع ~ 180 نانومتر الإثارة و~ 520 ماكسيما الانبعاثات نانومتر.
      ملاحظة: عند العمل مع الخلايا غير ملتصقة أو إذا ضعف الالتزام هو مصدر قلق، ومجموعة مباشرة تكاثر الخلايا يمكن استخدامها كبديل منذ هذا البروتوكول لا يتطلب نبذ كل المتوسطة الفحص. ومع ذلك، وهذا البروتوكول المباشر هو قليلا أقل حساسية بالمقارنة مع البروتوكول المستخدم في هذا المختبر.
  4. بعد قياس مضان، وتطبيععدد خلايا في كل بئر كنسبة التي يتم فيها تعيين متوسط ​​عدد خلايا من جميع الآبار بلعم ساذجة في 1.
    ملاحظة: الكمي البروتين (على سبيل المثال باستخدام مقايسة BCA) يمكن أن تستخدم كوسيلة بديلة لتطبيع خلايا التهم الموجهة إليه. ومع ذلك، وبين أيدينا كان هذا الاختبار أقل حساسية بالمقارنة مع فحص عدة تكاثر الخلايا.

Representative Results

بعد الانتهاء من خارج الخلية تدفق فحص والخلية الكمي للبيانات التي يمكن تطبيع لعدد الخلايا وتحليلها. هذا وسوف تسفر عادة ECAR وOCR المؤامرات كما هو مبين في الشكل 1A و 1B الشكل.

بعد حقن الجلوكوز (A)، والزيادة في ECAR تمثل معدل تحلل. أما الزيادة الإضافية في ECAR بعد ATP سينسيز تثبيط مع أوليغوميسين (B) معلومات عن احتياطي حال السكر وقدرة (الشكل 1A). عند تحليل القيم OCR، أوليغوميسين الحقن (B) يسمح حساب استهلاك الأوكسجين تستخدم لتخليق ATP الميتوكوندريا. FCCP (C) uncouples التنفس الميتوكوندريا والقياسات OCR المقابلة تسفر عن بيانات حول القصوى والقدرة التنفسية الغيار. وأخيرا، حقن روتينون (العفن) وantimycin A (AA) كتلة الميتوكوندريا I معقدة والثالث وOCR المتبقي يمثل سلبيات الأكسجين غير الميتوكوندرياumption (الشكل 1B).

الشكل 1
الشكل 1: معلمات الاستقلابية مستمدة من تدفق فحص XF خارج الخلية. (A) وتحسب المعلمات بعد تحلل الخلايا من القيم ECAR (في ميلا في الساعة / دقيقة): تحلل، السعة القصوى حال السكر والاحتياطي حال السكر. وتستخدم القياسات (B) OCR (في pMoles / دقيقة) لحساب الثوابت الأساسية القادمة من وظيفة الميتوكوندريا: التنفس القاعدية، إنتاج ATP، تسرب بروتون، والحد الأقصى التنفس والقدرة التنفسية الغيار. Gluc = الجلوكوز؛ OM = أوليغوميسين A؛ FCCP = الكربونيل السيانيد 4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون. AA = antimycin A؛ تعفن = روتنون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد تشغيل، ECAR وOCR القياسات 1 سمسمل 15 لكل بئر يمكن تصديرها إلى إكسل ويمكن حساب المعلمات حال السكر التالية من القياسات ECAR على النحو التالي:

تحمض غير حال السكر = متوسط. ECAR (1،2،3)

تحلل = متوسط. ECAR (4،5،6) - متوسط. ECAR (1،2،3)

القدرة القصوى حال السكر = متوسط. ECAR (7،8،9) - متوسط. ECAR (1،2،3)

احتياطي حال السكر = متوسط. ECAR (7،8،9) - متوسط. ECAR (4،5،6)

من معدلات OCR، وخصائص التمثيل الغذائي المقبلة يمكن تحديد:

تنفس غير الميتوكوندريا = متوسط. OCR (13،14،15)

التنفس القاعدية = متوسط. OCR (4،5،6) - متوسط. OCR (13،14،15)

إنتاج ATP = متوسط. OCR (4،5،6) - متوسط. OCR (7،8،9)

بروتون تسرب =متوسط. OCR (7،8،9) - متوسط. OCR (13،14،15)

التنفس الأقصى = متوسط. OCR (10،11،12) - متوسط. OCR (13،14،15)

قدرة الجهاز التنفسي الغيار (SRC) = متوسط. OCR (10،11،12) - متوسط. OCR (4،5،6)

الرقم 2
وتقدم خصائص التمثيل الغذائي من السذاجة (M0)، LPS- (M1) وIL-4- (M2) الضامة الاستقطاب لكل قياس، المتوسط ​​والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) من 8 الآبار الفردية: الرقم 2. يتم قياس (A) معدلات تحمض خارج الخلية (ECAR، في ميلا في الساعة / دقيقة) و (B) معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR، في pMoles / دقيقة) عن الاستقطاب تفاضلي (M1 و M2) والضامة ساذجة (M0). وتم تطبيع جميع القياسات لعدد خلايا (مقاسا مع CyQUANT) وكان من المقرر أن متوسط ​​عدد الخلايا الضامة من السذاجة في 1. فيjection A = الجلوكوز؛ B = أوليغوميسين. C = FCCP. D = antimycin A + روتنون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كما هو مبين في الشكل 2A، وتفعيل بلعم مع LPS تحرض على زيادة التمثيل الغذائي حال السكر. الاختلافات بين LPS والضامة IL-4 المعاملة، بل هي أكثر وضوحا عند النظر في معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) في الشكل 2B. في الواقع، في حين قمعت بشدة الأيض المؤكسدة القصوى في M (LPS)، IL-4 الحث التنفس القاعدية والأقصى خاصة في الضامة M2. ينبغي للمرء أن يلاحظ أن زيادة حال السكر هي فريدة من نوعها وليس لM (LPS) الضامة، وليس بالضرورة أن يكون سمة من سمات الضامة M1 منذ M (IFNγ) الضامة لا تعرض تعزيز تحلل.

عموما، يوضح هذا التحليل تدفق خارج الخلية ثار IL-4 التي يسببها تتميز الضامة M2 خلال تعزيز الأيض المؤكسدة وخاصة قدرة عالية في الجهاز التنفسي الغيار (SRC)، في حين عرض تفعيلها LPS-الضامة تعزيز الأيض حال السكر ولا يملكون أي قدرة الجهاز التنفسي الغيار.

Discussion

والهدف من المختبر لدينا هو أن نفهم كيف يمكن أن يتأثر الاستقطاب بلعم وظيفة مع الهدف النهائي لتحسين نتائج تصلب الشرايين وحالات الالتهابات الأخرى 12. لتقييم البلاعم الاستقطاب، واحد عادة ما يقيس LPS (+ IFNγ) يسببها وIL-4-الناجم عن التعبير الجيني من M1 و M2 الجينات علامة (QPCR)، ويحدد IL-6، IL-12، TNF وNO إفراز (بواسطة ELISA وGriess رد فعل) ويدرس IL-4 التي يسببها CD71، CD206، CD273 CD301 والتعبير السطحية (التدفق الخلوي) وأرجيناز النشاط 3،13. بالإضافة إلى ذلك، المقايسات موت الخلايا المبرمج (عن طريق Annexin-V / PI تلطيخ)، المقايسات البلعمة (مع حبات الفلورسنت اللاتكس و / أو pHrodo كولاي) وفحوصات تشكيل خلية الرغوة (عن طريق الجاذبة-oxLDL امتصاص، LipidTOX محايد الدهون تلطيخ) لا يمكن أن يؤديها ل تقييم وظائف بلعم 14. بالإضافة إلى ذلك، تحليل التدفق خارج الخلية لا يمكن أن يؤديها لقياس الطاقة الحيوية لمحات من لجنة الهدنة العسكرية المستقطبةrophages كما قراءات وظيفية جديدة وبديلة.

وتظهر هذه المخطوطة أن الاستقطاب بلعم يدفع إعادة برمجة التمثيل الغذائي مع الضامة LPS الناجم عن التحول إلى زيادة تحلل كمصدر للطاقة. على العكس من ذلك، الضامة M2 IL-4 التي يسببها استخدام الفسفرة المؤكسدة الميتوكوندريا كمصدر رئيسي للاعبي التنس المحترفين. الأهم من ذلك، إعادة برمجة التمثيل الغذائي لا يوفر فقط طاقة لمتطلبات معينة من M1 و M2 الضامة الاستقطاب. في الواقع، والتغيرات الأيضية تؤثر تركيزات المستقلب التي هي المنظمين مباشرة من النمط الظاهري بلعم 10،15،16. وبالتالي، والتمثيل الغذائي بلعم ليس فقط صفة (كما هو موضح هنا في الشكل 2)، ولكن أيضا سائق متميزة الدول الاستقطاب بلعم ويدعم هذه المعرفة الجديدة والنمو السريع للمنطقة البحث immunometabolism خلال العامين الماضيين.

ومع ذلك، والقياسات قوية لمحات التمثيل الغذائي في ماكروظلت فاجات صعبة وكان محدوديتها. في هذه الدراسة، يتم تطبيق محلل تدفق خارج الخلية لقياس بقوة تحلل، احتياطي حال السكر، والقدرة حال السكر القصوى، وتحمض غير حال السكر، القاعدية والتنفس القصوى، إنتاج ATP، والقدرة التنفسية الغيار، تسرب بروتون والتنفس غير الميتوكوندريا في الوقت الحقيقي في الحد الأدنى من الضامة.

ولذلك، فإننا تعديل وتحسين بروتوكولات الشركة المصنعة على النحو التالي. معيار اختبار الإجهاد ميتو (# 103015-100) يوحي باستخدام المتوسطة مع الجلوكوز والبيروفات وبروتوكولا مع 3 حقن (OM، FCCP، AA / العفن). اخترنا لبدء الفحص مع الجلوكوز / خالية من البيروفات المتوسطة، إضافة الجلوكوز باعتباره الحقنة الأولى في ميناء A (كما هو الحال في تحلل السكر اختبار الإجهاد # 103020-100) وإضافة البيروفات جنبا إلى جنب مع uncoupler FCCP في ميناء C. وبهذه الطريقة ، تستمد جميع المعلمات تحلل ذات الصلة من القياسات ECAR 1-9 وجميع المعلومات ذات الصلة حول mitochondriوظيفة القاعدة من القياسات OCR 15/04.

لاحظ أنه من الأهمية بمكان لحقن البيروفات جنبا إلى جنب مع FCCP لتغذية التنفس القصوى على فك ربط. قبل استخدام هذا البروتوكول المشترك، ينبغي للمرء أيضا التحقق من أن 2-ديوكسي-D-الجلوكوز (2-DG) يخفض مستويات ECAR بعد الفحص إلى القيم القاعدية (1-3) وأن معدلات ECAR سجلت 4-6 هي في الواقع يرجع إلى تحلل. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي للمرء أن يفهم أن تركيز مركب وأرقام الهواتف المحمولة المستخدمة في هذه المخطوطة هي صالحة للالضامة المشتقة من نخاع العظام وRaw264.7 خطوط الخلايا بلعم وينبغي أن يكون الأمثل لأنواع الخلايا الأخرى. وعلاوة على ذلك، ينبغي للمرء أن يلاحظ أن M-CSF الذي يستخدم لتوليد الضامة المشتقة من نخاع العظام يعزز النمط الظاهري المضادة للالتهابات مثل M2. لذا قد تكون النتائج المقدمة من الضامة المستمدة من نخاع العظم غير قابلة للمقارنة تماما لقياسات مع الضامة المقيمين الأنسجة الضامة الأولية أو خطوط الخلايا التي لا تتطلب M-CSF خلال culturi الخليةنانوغرام.

بالمقارنة مع الطرق القائمة، هذا البروتوكول يتطلب كميات ضئيلة من الضامة ويوفر بسرعة تقريبا جميع خصائص الخلية الأيض الأساسية. هذا ينتج في الخلايا فائض كافية لتنفيذ المقايسات المناعية الأخرى، وحتى الخلايا المستخدمة في الطاقة الحيوية التنميط لا يزال من الممكن استخدامها لأغراض أخرى قصد بعد الفحص. وعلاوة على ذلك، وبشكل خاص 96 شكل لوحة جيد يسمح تقييم ظروف متعددة في الوقت الحقيقي في نفس الوقت. ومع ذلك، فإن الاختلاف بين الآبار الفردية يمكن أن تكون كبيرة، وبالتالي غالبا ما هو المطلوب استخدام ما لا يقل عن 4 آبار في الشرط. اتخذت هذا القيد في الاعتبار، وتحليل تدفق خارج الخلية وصفها لا يزال يسمح لتشغيل أكثر من 10 الظروف التجريبية (ن = 6) في وقت واحد، والتي هي أكثر بكثير من التقنيات التقليدية.

عموما، توفر هذه المقالة مقايسة وظيفية سهلة وقابلة للتكرار الذي يسمح بقياس جميع تحلل ذات الصلة والمعلمة الميتوكوندرياeters في مجموعات فرعية بلعم الاستقطاب. هذه التقنية يمكن أن تكون بمثابة تطبيقها في المستقبل لتقييم وظيفة البلاعم وتقييم أثر التلاعب متميزة (مثل الجينات نهدم والأدوية الجديدة، وما إلى ذلك) في (التمثيل الغذائي) النمط الظاهري والبلاعم و. على هذا النحو، وبيانات التدفق خارج الخلية يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى للسماح توصيف متعمق لحالة تنشيط البلاعم.

Disclosures

وترعى حرية الوصول إلى هذه المادة من قبل فرس البحر العلوم البيولوجية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
23G and 25G needles Becton Dickinson #300800 and #300600 To flushed bone marrow
10 ml syringes Becton Dickinson #307736 To flushed bone marrow
Petri dishes Greiner #639161 To culture bone marrow cells
CyQUANT Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #C7026 For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit  Molecular Probes #35011 For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)
XFe96 cell culture microplate Seahorse Bioscience #101085-004 96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done
recombinant mouse interleukin-4 (IL-4) Peprotech #214-14-B Used to induced alternative macrophage activation
lipopolysaccharide (LPS) Sigma #L2637 Pro-inflammatory stimulus
Seahorse Sensor Cartridge  Seahorse Bioscience #102416-100 Contains the probes for pH and O2 measurement
Seahorse XF Calibrant  Seahorse Bioscience #100840-000 Needed to hydrate the probes overnight 
XF base medium  Seahorse Bioscience #102353-100 Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes
L-glutamine Life Technologies #25030-081
D-(+)-Glucose Sigma #G8769 Fuels glycolysis once added to the cells
oligomycin A Sigma #75351 Inhibits mitochondrial ATP synthase
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) Sigma #C2920 Uncouples mitochondrial respiration
100 mM Sodium Pyruvate solution Lonza #BE13-115E Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis
Antimycin A Sigma #BE13-115EA8674 Inhibits complex III of the mitochondria
Rotenone Sigma #BE13-115EA8674R8875 Inhibits complex I of the mitochondria
Casy Cell Counter Roche Diagnostics #05 651 697 001 Instrument to count cells
anti-CD16/CD32 eBioscience #14-0161 Fc receptor block flow cytometry
anti-F4/80-APC-eFluor780 eBioscience #47-4801 Antibody to stain macrophages
anti-CD11b-FITC eBioscience #11-0112 Antibody to stain macrophages

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436 (2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 105، M1 M2 بلعم تفعيل / الاستقطاب، فرس البحر، وتحليل تدفق خارج الخلية، immunometabolism، تحلل السكر، الفسفرة التأكسدية (OXPHOS)، الميتوكوندريا (DYS) وظيفة، التهاب، وتنشيط البلاعم، الحصانة الفطرية، بلعم وظيفة، انترلوكين 4 (IL -4)، خلوى
توصيف الأيض من الاستقطاب M1 M2 الضامة والعظام نخاع المستمدة من طريق في الوقت الحقيقي التحليل خارج الخلية الجريان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Van den Bossche, J., Baardman, J.,… More

Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis. J. Vis. Exp. (105), e53424, doi:10.3791/53424 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter