Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Forbedret generation af inducerede cardiomyocytes Ved hjælp af en polycistronisk Construct udtrykker optimale forhold for Gata4, Mef2c og Tbx5

Published: November 13, 2015 doi: 10.3791/53426
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

Abstract

Direkte omdannelse af hjerte-fibroblaster (CFS) i inducerede kardiomyocytter (ICMS) besidder et stort potentiale for regenerativ medicin ved at tilbyde alternative strategier til behandling af hjertesygdomme. Denne omdannelse er opnået ved tvungen ekspression af definerede faktorer, såsom Gata4 (G), Mef2c (M) og Tbx5 (T). Traditionelt er ICMS genereret af en cocktail af vira, der udtrykker disse individuelle faktorer. Men omprogrammering forholdsvis lav effektivitet og de ​​fleste af in vitro G, M, T-transducerede fibroblaster ikke blive fuldt omprogrammeres, hvilket gør det vanskeligt at undersøge de mekanismer omprogrammering. Vi har for nylig har vist, at støkiometrien af ​​G, M, T er afgørende for effektiv ICM omprogrammering. En optimal støkiometri G, M, T med relativ højt M og lave niveauer af G og T er opnået ved hjælp af vores polycistronisk MGT vektor (i det følgende benævnt MGT) signifikant forøget omprogrammering effektivitet og forbedret ICM kvalitet in vitro. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den metode, der anvendes til at generere ICMS med MGT konstruktion fra hjerte-fibroblaster. Isolering af hjerte-fibroblaster, dannelse af virus til omprogrammering og evaluering af omprogrammering proces er også inkluderet for at skabe en platform for effektiv og reproducerbar generation af ICMS.

Protocol

Protokollen beskrevet her bruger neonatale mus. Dyrepleje og eksperimenter udføres i overensstemmelse med de retningslinjer, som Afdelingen for Laboratory Animal Medicine (DLAM) ved University of North Carolina, Chapel Hill.

1. Fremstilling af buffere og medier

  1. Forbered fibroblast (FB) medium: Supplement 500 ml IMDM medier med 100 ml kalvefosterserum (FBS) og 6 ml penicillin / streptomycin.
  2. Forbered ICM medium: Supplement 400 ml DMEM medier med 100 ml M199 medier og 50 ml FBS.
  3. Forbered B27 medie: Supplement 490 ml RPMI1640 medier med 10 ml B27 medier.
  4. Forbered Plat-E dyrkningsmedium: Supplement 500 ml DMEM-medium med 50 ml FBS, 5 ml penicillin / streptomycin og 5 ml ikke-essentielle aminosyrer.
  5. Forbered Plat-E transfektionsmedium: Supplement 500 ml DMEM-medium med 50 ml FBS og 5 ml ikke-essentielle aminosyrer.
  6. Prepare gelatineovertrukne plade med 24 brønde: Tilsæt 0,5 ml 0,1% gelatineopløsning til en brønd af 24-brønds plade, inkuberes ved 37 ° C i mindst 10 minutter og aspireres lige før brug.
  7. Forbered FACS mærkning buffer: Supplement 500 ml DPBS med 10 ml FBS og 2 ml EDTA (0,5 M) for at nå en endelig koncentration på 2 mM. Passere gennem et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C.
  8. Forbered MACS sortering buffer: Supplement 500 ml DPBS med 2,5 g BSA og 2 ml EDTA (0,5 M) for at nå en endelig koncentration på 2 mM. Passere gennem et 0,22 um filter og opbevares ved 4 ° C.
  9. Forbered 2x HBS buffer for transfektion: Supplement 500 ml HEPES-buffer (50 mM) med 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCI (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glucose (1,08096 g ). Tilføj omkring 650 pi 10 N NaOH til justering af pH til 7,05-7,12. Der filtreres gennem et 0,22 um porefilter og opbevares ved 4 ° C.
  10. Forbered 2,5 M CaCl2-opløsning til transfektion: Tilføj 18,376 g CaCl 2 til 50 ml Hedeselskabet 2 O. Der filtreres gennem et 0,22 um porefilter og opbevares ved 4 ° C.
  11. Forbered ICC (immunocytokemi) fiksering buffer: Tilføj 5 ml paraformaldehyd (PFA, 32%) til 35 ml DPBS for at nå en endelig koncentration på 4%.
  12. Forbered ICC permeabilisering buffer: Tilføj 0,1 ml Triton til 100 ml DPBS for at nå en endelig koncentration på 0,1%.
  13. Forbered ICC blokerende buffer: Tilføj 5 g bovint serumalbumin (BSA) til 100 ml DPBS for at nå en endelig koncentration på 5%.
  14. Forbered ICC farvning buffer: Tilsæt 1 g BSA til 100 ml DPBS for at nå en endelig koncentration på 1%.

2. generation af neonatal Mouse Hjerte fibroblaster

  1. Generere kardiale fibroblaster fra eksplantatet dyrkningsmetode
    1. Ren neonatal αMHC-GFP transgene mus (P1 til P2) med 75% ethanol. Skær hovedet af med steril saks. Derefter foretage en vandret snit fra under en armhule til den anden. Brug en sterilstumpe og bøjede pincet til at dissekere ud hjertet og placere den i en brønd på 24 brønd plade indeholdende iskold PBS-buffer.
      1. Alternativt kan presse ud i hjertet, efter den vandrette snit.
    2. Check GFP-ekspression i hjertet ved fluorescerende mikroskop. Da GFP-ekspression drives af αMHC promotor, som er en hjerte-specifik promotor, bør hjertet fra transgene mus i grønt 15, medens den negative hjertet er dæmpet i nogen fluorescens.
    3. Tag 3-4 GFP-positive hjerter i en 60 mm centerhul dyrkningsskål og hakkekød dem i små stykker mindre end 1 mm3 i størrelse ved steril saks og pincet.
    4. Placer 3-4 hakket hjerter i én 10 cm skål med 2 ml FB medier. Lad væv slå sig ned i 3 timer.
    5. Tilsæt langsomt 8 ml foropvarmet FB medie til skålene, som indeholdt hjertevæv. Forstyr ikke vævet i tre dage.
    6. Udskift medierne hver tredje dag.
    7. På dag 7, aspirspiste dyrkningsmediet og vaskes cellerne med DPBS. Tilsæt 3 ml 0,05% trypsin til hver plade og fordøje ved 37 ° C i 5 minutter.
    8. Der tilsættes 5 ml FB medier for at standse trypsin. Forsigtigt løsne cellerne med en celleskraber. Pipetteres mediet op og ned for yderligere mekanisk dissociere vævet.
    9. Indsamle celler og filtreres gennem 40 um celle sier at undgå forurening af hjertet vævsfragmenter, og derefter pelletere cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter.
    10. Vask cellerne én gang med MACS buffer og celler er klar til sortering.
  2. Generer hjerte-fibroblaster fra enzymfordøjelse metode
    1. Harvest GFP positive hjerter som 2.1.1. Overfør alle hjerter i en 10 cm skål med 10 ml iskold DPBS.
    2. Klem ventrikler med sterile pincet til at fjerne blod og skyl gang med iskolde DPBS.
    3. Trim hjerter til at være fri for andre væv og fedt.
    4. Skær hver hjerte i omkring 4 stykker, der stadig løst forbundne.
    5. Hvis mindre end 20 hjerter, overføre hjerter i et 15 ml konisk rør med 8 ml varmt 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 15 minutter.
      1. Hvis der er 20-30 hjerter, overføre hjerter i et 50 ml konisk rør med 10 ml varm 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 15 minutter.
    6. Kassér trypsin og der tilsættes 5 ml (for mindre end 20 hjerter) eller 10 ml (til 20-30 hjerter) varm type II collagenase (0,5 mg / ml) i HBSS.
    7. Vortex røret på hvirvelomrøreren i 1 minut ved en hastighed niveau omkring 4 til 6 (hvis væsken ikke komme op til låget, så hastigheden er fint).
    8. Inkubér røret i 37 ° C vandbad i 3-5 min.
    9. Vortex rør i 1 min.
    10. Sediment i 1 min ved hjælp af tyngdekraften, indtil vævsstykkerne slå sig ned, opsamling af væsken i et nyt rør indeholdende 5 ml koldt FB medium.
    11. Gentag trin 3-5 2.2.6-2.2.10 gange.
    12. Ved filtrering gennem 40 um cellefilter Bland alle samlingerat foretage en enkelt cellesuspension.
    13. Der centrifugeres ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    14. Resuspender cellerne i 10 ml MACS buffer, og der centrifugeres ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    15. Valgfrit: Hvis der er en masse af blodceller, resuspender cellerne med 1 ml RBC lysis buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, og 0,1 mM EDTA), holde på is i 1 min, derefter fortyndet med 10 ml MACS buffer og centrifugeres ved 200 xg i 5 min. Vask en gang mere med MACS buffer.
  3. Isolering af Thy1.2 + fibroblaster af MACS (magnetisk cellesortering)
    1. Bestem antal levedygtige celler ved farvning med trypanblåt.
      1. Tage 10 celler pi ud fra 10 ml cellesuspension i trin 2.2.14. Bland det med 10 pi 0,4% trypanblåt løsning.
      2. Tilsæt blandingen til et hæmocytometer. Lad det stå i 3-5 min og derefter undersøge straks under et mikroskop. De døde celler er farvet i blå og levedygtige celler er ufarvede.
        3. 4 (samlet volumen cellesuspension).
    2. For mindre end 1 x 10 7 celler, resuspender cellerne med 10 pi Thy1.2 mikroperler i 90 pi kølet MACS buffer. Tilføj flere perler proportionalt, hvis der er mere end 1 x 10 7 celler. Bland godt og inkuber i et køleskab (2-8 ° C) i 30 minutter.
    3. Der tilsættes 10 ml MACS buffer og spin-prøver ved 200 xg i 5 min; Der vaskes én gang med 10 ml MACS buffer og centrifugeres igen.
    4. Bring volumen til 2 ml i MACS buffer.
    5. Opsætning af en MACS Separator i hætte. Indsæt et LS kolonne til separatoren. Anvendelse 3 ml MACS buffer til søjlen at ækvilibrere det.
    6. Pass cellesuspensionen gennem ækvilibreret LS-søjle.
    7. Vask 3 gange med 2 ml MACS buffer hver gang.
    8. Tag LS kolonnen off than Separator og eluere 3 gange med 2 ml MACS buffer i et nyt 50 ml rør.
    9. Spin ved 200 xg i 5 minutter.
    10. Resuspender cellerne i 10 ml FB medier tælle cellerne og frø i plader ved korrekt tæthed. For fibroblaster genereret fra eksplantatet dyrkningsmetode, kunne såning celler massefylde være omkring 2-3 x 10 4 celler / brønd af 24-brønds plade. For fibroblaster genereret fra enzymfordøjelse metode, kunne celler massefylde være omkring 4-5 x 10 4 celler / brønd af 24-brønds plade.

3. Generation af retrovirus til ICM Omprogrammering

Bemærk: Udfør følgende trin i en BSL2 biologisk sikkerhedsskab under sterile forhold. Det anbefales at korrekt bortskaffelse af transfekterede celler, pipettespidser og rør for at undgå risikoen for miljø- og sundhedsmæssige risici.

  1. Opretholde Plat-E-celler i Plat-E medium suppleret med 1 ug / ml puromycin og 10 ug / ml blasticidin ved 37 ° C med 5% CO2.
  2. På dag 2, udskiftes mediet ved Plat-E dyrkningsmedium mangler puromycin og blasticidin.
  3. På dag 0, split Plat-E-celler i 10 cm skåle dagen før transfektion ved ca. 4-5 x 10 6 celler pr plade. Celler bør være ~ 80-90% konfluente på dagen for transfektion.
  4. På dag 1, skift dyrkningsmedier til transfektion medier på celler inden for 1 time før transfektion. Transfektion procedure er som følger:
    1. Transfektion under anvendelse af kommercielle kits
      1. Bland 20 pi transfektionsreagens (f.eks Lipofectamin) og 500 pi reduceret serum medier (f.eks, Opti-MEM). Der tilsættes 10 ug af retroviral plasmid til en anden 500 pi reduceret serummedium. Inkuber hver blanding ved stuetemperatur (RT) i 5 minutter.
      2. Tilsæt langsomt plasmidet blandingen til transfektion blanding. Dette trin kan tage 15-30 sek. Inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur (opløsningen kan forekomme uklar). Tilføj blandingen dråbevis til cellerne.
      3. Inkuber natten over i en 37 ° C inkubator.
    2. Transfektion hjælp calciumphosphat.
      1. Bland 40 pi 2,5 M CaCl2 og 440 pi Hedeselskabet 2 O, tilsæt derefter 20 pg af det retrovirale plasmid (justere mængden af Hedeselskabet 2 O, således at den samlede volumen er 500 ul).
      2. Tilføj 500 pi 2x HBS til en 15 ml konisk rør.
      3. Vortex HBS og i mellemtiden tilføje Calcium-DNA blandingen til HBS droppe klogt. Dette trin tager omkring 30 sek for hver prøve. Så maksimalt gøre 3-4 prøver samtidigt.
      4. Inkuber ved stuetemperatur i 3 minutter Inkubation i længere tid fører til større bundfald og mindre celler vil tage bundfaldet.
      5. Tilsæt blandingen falde klogt at cellerne og observere under 20X mikroskop. Fin bundfald (en masse små dem er gode, men et par store virksomheder er ikke gode) skal ses.
      6. Inkuber natten over ved 37 ° C inkubator.
    3. På dag 2, ændre medier på celler med 8 ml forvarmet kulturmedier. Der inkuberes i 24 timer.
    4. På dag 3 og dag 4, indsamle kultursupernatant fra skålene ved hjælp af en 10 ml steril engangssprøjte, filtrere det gennem et 0,45 um porestørrelse celluloseacetatfilter og overførsel i et 50 ml rør. Der tilsættes 2 ml retrovirus nedbør løsning på alle 8 ml virusholdige supernatant. Blandes den forsigtigt og inkuberes natten over ved 4 ° C.
    5. På dag 5, spinde den virale blandingen ved 1500 x g ved 4 ° C i 30 minutter. De virale partikler skal vises i hvid pellet nederst i røret.
    6. Kassér supernatanten. Spin ned resterende opløsning ved centrifugering ved 1500 x g i 5 min. Fjerne alle spor af væske ved aspiration, idet der stor omhu for ikke at forstyrre de udfældede retroviruspartikler i pillen.
    7. Resuspender retrovirale pellets med 100 pi DPBS buffer for hver 8 ml viral supernatant. Portionvirus på is. Anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C.

    4. Omprogrammering af Hjerte fibroblaster

    1. Tilføj 4 pi 10 mg / ml polybren opløsning i 10 ml ICM medium, og blandes forsigtigt ved pipettering op og ned. Slutkoncentrationen af ​​polybren er 4 pg / ml.
    2. Tilsæt 500 pi ICM medium indeholdende polybren til hver brønd i 24 brønds plade podet med fibroblaster.
    3. Tilsæt 10 pi retrovirus til hver brønd indeholdende enten 2-3 x 10 4 celler fra eksplantatet kultur eller 4-5 x 10 4 celler fra enzymfordøjelse metode. Mængden af ​​virus bør øges proportionalt med øget celletal i forskellige dyrkningsplader eller fade. Sæt pladen i en 37 ° C inkubator i 24-48 timer for at tillade viral infektion. Tidslinien for cardiac omprogrammering er vist i figur 1.
    4. Efter viral transduktion, erstatte virusholdige medier med 500 pi regelmæssige ICM medier.
    5. Skift medier hver 2-3 dage. Til positiv selektion af virale transducerede celler, tilsættes ICM medium suppleret med puromycin ved 2 ug / ml til målceller. Hold det i tre dage. Efter at opretholde puromycin i ICM-medium med en koncentration på 1 ug / ml.
    6. Tre dage efter virusinfektion, tage pladen ud fra inkubatoren og placere den under et omvendt fluorescerende mikroskop (20X) at observere GFP-ekspression.
      Bemærk: Ti dage efter virusinfektion, kan cellerne høstes til FACS analyse og ICC analyse for at bestemme omprogrammering effektivitet (i trin 5 og 6).
    7. Fjorten dage efter virusinfektion, erstatter ICM medier med B27 medier. Skift medier hver tredje dag. Spontan bankende celle loci kan forekomme fra tre (celler fra enzymfordøjelse metoden) eller fire (celler fra eksplantatet dyrkningsmetode) uger efter viral transduktion.

    5. Immuncytokemisk Analyse af Omprogrammering Effektivitet

    1. Skyl cellermed iskold PBS tre gange; fjerne overskydende opløsning.
    2. Tilsæt 0,5 ml ICC fiksering buffer til hver brønd i plader med 24 brønde. Fikseres cellerne ved stuetemperatur i 15-20 min.
    3. Skyl celler med PBS tre gange.
    4. Tilsæt 0,5 ml ICC permeabilisering buffer til hver brønd i pladerne med 24 brønde. Permeabilisere cellerne ved stuetemperatur i 15 minutter.
    5. Skyl celler med PBS tre gange.
    6. Tilsæt 0,5 ml ICC blokerende buffer til hver brønd i 24 brønds plade, inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
    7. Fortyndede primære antistoffer med ICC farvning buffer. Tilsæt 200 pi antistofopløsninger til hver brønd og inkuberes natten over ved 4 ° C. Antistoffortyndingen faktorer er angivet i Materials.
    8. Den næste dag vaskes cellerne med PBS tre gange.
    9. Tilsæt 200 pi sekundært antistof løsninger til cellerne og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
    10. Vask cellerne med PBS tre gange.
    11. Tilsæt 150 pi montering opløsning indeholdende DAPI til hver brønd. Tillad at farve kerner i 1 min. Sådække hver brønd med rund glas cover slip og tryk forsigtigt slip mod bunden overflade med en pincet for at fjerne luftbobler.
    12. Aspirer overskydende opløsning og prøverne er klar til billeddannelse. De repræsentative billeder, der viser de omprogrammerede celler, der udtrykker kardiel markør cTnT og αActinin på D14 er vist i figur 2B.

    6. FACS analyse af Omprogrammering Effektivitet

    1. Vaskes cellerne én gang med DPBS. Tilføj 0,3 ml trypsin (0,05%) til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 5 minutter.
    2. Bank forsigtigt på pladen for at lette løfte cellerne. Kontroller Cellefrigørelse under mikroskop. Tilsæt 1 ml FACS buffer til hver brønd, når de fleste celler dissocieres. Pipette op og ned for yderligere mekanisk dissociere cellerne.
    3. Overfør celler i 24-brønds plade til en 96-brønds dyb brønd plade brønd til brønd. Centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C for at opsamle cellerne.
    4. Vask cellerne en gang medFACS-buffer.
    5. Tilsættes 100 pi fiksering / permeabilisering løsninger for at resuspendere cellerne i 20 minutter ved 4 ° C.
    6. Vask cellerne to gange med 1x vask løsning, pellet, og fjern supernatanten.
    7. Forbered primære antistofopløsning mod GFP og cTnT i 1X vaskebuffer. Grundigt resuspender hver prøve med 50 pi antistofopløsning og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter.
    8. Vask cellerne en gang i 1x vaskeopløsning, pellet, og fjern supernatanten.
    9. Der tilsættes 50 pi sekundært antistof opløsning indeholdende Alexa Fluor 488-konjugeret æsel anti-kanin IgG og Alexa Fluor 647-konjugeret æsel-anti-muse-IgG til hver prøve. Der inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter i mørke.
    10. Vask cellerne en gang i 1x vaskeopløsning, pellet, og fjern supernatanten.
    11. Resuspender celler i 400 pi fiksering buffer (DPBS med 1% PFA). Overfør celle i FACS rør med cellefilter hætte. Prøver er klar til FACS-detektion. Det repræsentative FACS-analyse af omprogrammering efficiency hjælp pMxs-puromycin-MGT konstruktion med eller uden puromycinselektion er vist i figur 2A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omprogrammering trin er sammenfattet af skematiske i figur 1. Efter MGT transduktion, kunne GFP-ekspression i omprogrammering celler påvises så tidligt som dag 3. Puromycin udvalg af transducerede celler starter fra dag 3 og vedligeholdes i de første to uger, hvis PMX-puro -MGT konstruktion anvendes. Ved dag 10 til dag 14, kunne ekspression af hjertemarkører som cTnT og αActinin påvises ved både ICC (figur 2B, trin 5) og FACS (figur 2A, trin 6), hvilket indikerer, at de begynder fibroblaster undergår omprogrammering mod en hjertecellen skæbne.

Figur 1
Figur 1:. Skematisk fremstilling af den direkte kardiel omprogrammering proces Procedurer ved hvert tidspunkt er beskrevet i sorte bokse. Dyrkningsmedier til hvert trin er vist i farvede felter under den tidlinje.

Figur 2
Figur 2: Omprogrammering effektivitet evalueret ved FACS og ICC (A) FACS-analyse på ICMS genereret fra frisk isolerede fibroblaster på dag 10 efter MGT transduktion.. (B) Farvning af ICMS på 2 uger med αMHC-GFP, hjerte cTnT og αActinin med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol). Scale bar: 200 um

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For vellykkede ICM generation, når du bruger denne protokol, er der flere vigtige faktorer, der har indflydelse på den samlede effektivitet. Især betingelserne for startende fibroblaster og kvaliteten af ​​retrovirus kodning MGT kan i høj grad påvirke omprogrammering effektivitet.

Det er vigtigt at generere fibroblaster som friske og sunde som muligt. For eksplantation dyrkningsmetode kan fibroblaster anvendes inden syv dage efter eksplantaterne blev udpladet på skåle. For enzymfordøjelse fremgangsmåde kan fibroblaster anvendes så tidligt som den næste dag af isolation. Frysning eller passage af fibroblaster for omprogrammering ikke anbefales. Disse yderligere behandlinger af fibroblaster i væsentlig grad vil mindske omprogrammering effektivitet. Den udsåningstæthed er en anden vigtig faktor, der påvirker omprogrammering effektivitet. Hvis celler er tyndt podes, har de tendens til at blive usunde med uregelmæssige celle morfologi og i stor størrelse. Sjældent could disse celler omdannes til ICMS. Hvis celler podes for tæt, er MOI (infektionsmultiplicitet) for virusinfektion faldet. Tilgroning af inficerede fibroblaster betydeligt udvander de omprogrammering begivenheder hvilket resulterer i en lav procentdel af ICMS. Vi bemærker også, at der opstår mindre celler i brosten-lignende morfologi, hvis flere celler udsås til omprogrammering. De kunne næsten ikke omprogrammeres, og dermed resultere i nedsat omprogrammering effektivitet. Når modificere protokollen for anden størrelse vævskulturskåle, anbefales det, at podning celleantal justeres proportionalt med overfladearealet af dyrkningsskålen.

Renheden af ​​fibroblaster er kritisk for omprogrammering. Den høje renhed af fibroblaster kunne opnås enten ved FACS sortering 15 eller MACS berigelse som vi beskrevet her. Sammenlignet med FACS sortering, MACS sortering er lettere, blidere og mere bekvem. Cell renhed efter MACS kunne nå over 90% whøne strengt efter protokollen. Lav renhed af fibroblaster kan nedsætte omprogrammering effektivitet, da de forurenede celler er sværere at omprogrammeres end fibroblaster, og at de formere meget hurtigere end omprogrammering celler. Det er også stærkt anbefales til frø cellerne lige efter MACS og udfører virusinfektion natten efter såning. De sorterede fibroblaster kan delvist blive aldrende efter dyrkning i skålen i lang tid, hvilket nedsætter optagelse af retrovirus, der inficerer kun de prolifererende celler. Tail-tip fibroblaster (TTFs) og embryonale fibroblaster (MEF'er) er blevet rapporteret at blive omdannet til ICMS med nogle andre transkriptionsfaktorer 10,12,19,26. Vores protokol her kun fokuserer på hjerte-fibroblaster. Anvendelsen af ​​denne protokol til andre fibroblast typer kan optimeres yderligere på grund af de iboende variationer af fibroblast signaturer såsom spredning status, genetiske og epigenetiske vartegn.

The kvaliteten af ​​retrovirus til transduktion er af allerstørste betydning. Lav titer virus undlader at konvertere fibroblaster i ICMS. Hvorimod vira på overdreven mængde vil forårsage cytotoksicitet, der direkte fører til fibroblast celledød. Det er nødvendigt at bestemme den virale titer og optimere den virale dosis for omprogrammering baseret på laboratorie set-up og eksperimentelle betingelser. Metoden til viral titrering er blevet grundigt beskrevet inden den 23.. Faktisk fandt vi, at tilstanden af ​​Plat-E celler vækst direkte vedrører viral kvalitet. Det anbefales at tø Plat-E celler ved nedre passage (<30) hver gang. Celler opnået ved passage tre er bedst for emballage virus ved en densitet omkring 4-5 x 10 6 celler pr 10 cm dyrkningsskål. Derudover friskhøstede virus giver højere effektivitet end omprogrammering frosne vira. Bemærk venligst, at co-infektion af MGT virus med en anden pMxs vektor baserede retrovirus vil mindske omprogrammering effektivitet possibly på grund af konkurrencen mellem de to vira af samme type. To forskellige transfektionsmetoder er tilvejebragt her. Begge metoder frembringer sammenlignelige retrovirus. Mens kommercielle Lipofectamin er dyrt, men stabil transfektion med calciumphosphat er billigere. Udarbejdelse af HBS-buffer skal tage stor forsigtighed, fordi pH i HBS buffer påvirker transfektionseffektiviteten betydeligt.

Der er nogle begrænsninger i denne protokol, der skal løses. En af begrænsningerne ligger i brugen af ​​retrovirus, hvilket uundgåeligt gør at spørgsmål om biosikkerhed. Heterogenitet af fibroblaster og mangel på specifik cardiac fibroblast markør til isolering også påvirke renheden af ​​celler, der er omprogrammerbar. Variation af omprogrammering effektivitet kan observeres på grund af batch variation iboende fibroblast tilstand og virus produktion. Desuden, selv om de omprogrammerede celler udtrykker sarkomeret struktur proteiner, såsom kardial troponin Tog αActinin, er de stadig ikke er modne cardiomyocytter karakteriseret ved funktionelle egenskaber såsom kontraktilitet og elektrisk formering.

Sammenfattende metoden beskrevet her muliggør effektiv generering af ICMS baseret på retroviral levering af M, G, T transkriptionsfaktorer i en enkelt konstruktion. Vores protokol giver en reproducerbar og værdifuld platform for ICM forskning, og vil lette igangværende bestræbelser på high-throughput screening og mekanistiske studier af ICM omprogrammering, og i sidste ende flytte ICM omprogrammering felt tættere på kliniske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Tags

Developmental Biology Cardiac fibroblast direkte omprogrammering ICM kardiomyocytter Mef2c Gata4 Tbx5 MGT polycistronisk konstruktion.
Forbedret generation af inducerede cardiomyocytes Ved hjælp af en polycistronisk Construct udtrykker optimale forhold for Gata4, Mef2c og Tbx5
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou,… More

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter