Abstract
Conversão directa de fibroblastos cardíacos (CFS) em cardiomiócitos induzida (ICMS) tem um grande potencial para a medicina regenerativa, oferecendo estratégias alternativas para o tratamento de doenças cardíacas. Esta conversão foi conseguida através da expressão forçada de factores tais como definidos GATA4 (L), MEF2C (M) e Tbx5 (T). Tradicionalmente, iCMS são gerados por um cocktail de vírus que expressam esses factores individuais. No entanto, a eficiência da reprogramação é relativamente baixa e a maior parte do in vitro, G, M, T transduzidas fibroblastos não se tornem totalmente reprogramado, o que torna difícil estudar os mecanismos de reprogramação. Recentemente, têm mostrado que a estequiometria de L, M, T, é crucial para a eficiente reprogramação MIC. Um estequiometria óptima de G, M, T com alto nível relativo de M e baixos níveis de G e T obtidos usando nosso vetor MGT policistrónico (doravante referida como MGT) aumentou significativamente a eficiência de reprogramação e melhoria da qualidade iCM in vitro. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada da metodologia utilizada para gerar ICMS com MGT construção de fibroblastos cardíacos. Isolamento de fibroblastos cardíacos, geração de vírus de reprogramação e avaliação do processo de reprogramação também estão incluídos para fornecer uma plataforma para a geração eficiente e reprodutível de ICMS.
Protocol
O protocolo descrito aqui utiliza camundongos recém-nascidos. Cuidados com os animais e as experiências sejam realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pela Divisão de Laboratório de Medicina Animal (DLAM) na Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill.
1. Preparação de amortecedores e Mídia
- Prepare de fibroblastos (FB) forma: Suplemento 500 ml de meio IMDM com 100 ml Soro Fetal Bovino (FBS) e 6 ml de penicilina / estreptomicina.
- Prepare médio iCM: Suplemento 400 ml meio DMEM com 100 ml de mídia M199 e 50 ml FBS.
- Prepare meio B27: Suplemento 490 ml de mídia RPMI1640 com 10 ml de meio B27.
- Prepare Plat-E meio de cultura: 500 mL de Suplemento meio DMEM com 50 ml de FBS, 5 ml penicilina / estreptomicina e 5 ml de aminoácidos não-essenciais.
- Prepare Plat-E meio de transfecção: Suplemento 500 ml meio DMEM com FBS a 50 ml e 5 ml de aminoácidos não-essenciais.
- Prepare revestidos com gelatina placa de 24 poços: Adicionar 0,5 ml de solução de gelatina a 0,1% para um poço de placa de 24 poços, incubar a 37 ° C durante pelo menos 10 min e aspirado imediatamente antes da utilização.
- Preparar tampão de marcação FACS: Suplemento 500 ml de DPBS com FBS a 10 ml e 2 ml de EDTA (0,5 M) até atingir uma concentração final de 2 mM. Filtrar através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
- Preparar tampão de triagem MACS: Suplemento 500 ml de DPBS com 2,5 g de BSA e 2 ml de EDTA (0,5 M) até atingir uma concentração final de 2 mM. Filtrar através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
- Preparar tampão HBS 2x para a transfecção: Suplemento 500 ml de tampão HEPES (50 mM) com NaCl 280 mM (8,1816 g), 10 mM de KCl (0,37275 g), 1,5 mM de Na 2 HPO 4 (0,10647 g), Glicose 12 mM (1,08096 g ). Adicionar cerca de 650 ul de NaOH 10 N para ajustar o pH a 7,05-7,12. Filtrar através de um filtro de 0,22? M de poro e armazenar a 4 ° C.
- Prepare 2,5 M CaCl 2 solução para a transfecção: Adicione 18,376 g CaCl 2 a 50 ml de ddH 2 O. Filtrar através de um filtro de 0,22? M de poro e armazenar a 4 ° C.
- Prepare TPI (imunocitoquímica) tampão de fixação: Adicionar 5 ml de paraformaldeído (PFA, 32%) a 35 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 4%.
- Preparar tampão de permeabilização ICC: Adicionar 0,1 mL de Triton a 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 0,1%.
- Preparar um tampão de bloqueio ICC: Adicionar 5 g de albumina de soro bovino (BSA) a 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 5%.
- Preparar tampão de coloração ICC: Adicionar 1 g de BSA para 100 ml de DPBS para se atingir uma concentração final de 1%.
2. Geração de Neonatais mouse fibroblastos cardíacos
- Gerar fibroblastos cardíacos de método de cultura de explante
- Limpe neonatal αMHC-GFP camundongo transgênico (P1 a P2) com etanol 75%. Cortar a cabeça com uma tesoura esterilizada. Em seguida, faça uma incisão horizontal debaixo de uma axila para o outro. Use um estérilfórceps sem corte e dobrados para dissecar o coração e colocá-lo em um poço da placa de 24 poços contendo tampão PBS gelado.
- Alternativamente, espremer o coração após a incisão horizontal.
- Verifique expressão da GFP no coração por microscópio de fluorescência. Uma vez que a expressão da GFP é accionado por αMHC promotor que é um promotor específico cardíaco, o coração de ratinho transgénico deve ser em verde 15, enquanto o coração é negativa fraca em qualquer fluorescência.
- Tome 3-4 GFP corações positivos em 60 mm centro bem prato de cultura e pique-os em pedaços pequenos menos de 1 mm 3 em tamanho por tesouras e pinças esterilizadas.
- Coloque 3-4 corações picada em uma placa de 10 cm com 2 ml de mídia FB. Deixe os tecidos se estabelecer durante 3 horas.
- Lentamente, adicionar 8 ml de mídia FB pré-aquecido para os pratos que contenham tecidos cardíacos. Não perturbe os tecidos por três dias.
- Substitua o material a cada três dias.
- No dia 7, ASPIRcomeu o meio de cultura e lavar as células com DPBS. Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina a cada placa e digerir a 37 ° C durante 5 min.
- Adicionar 5 ml de mídia FB para saciar a tripsina. Suavemente separar as células com um raspador de células. Pipetar os meios de comunicação cima e para baixo para dissociar ainda mais mecanicamente o tecido.
- Recolher as células e filtrar através de filtros de 40 uM de células para evitar a contaminação de fragmentos de tecido do coração, e, em seguida, peletizar as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min.
- Lave as células uma vez com MACS tampão e células estão prontas para a classificação.
- Limpe neonatal αMHC-GFP camundongo transgênico (P1 a P2) com etanol 75%. Cortar a cabeça com uma tesoura esterilizada. Em seguida, faça uma incisão horizontal debaixo de uma axila para o outro. Use um estérilfórceps sem corte e dobrados para dissecar o coração e colocá-lo em um poço da placa de 24 poços contendo tampão PBS gelado.
- Gerar fibroblastos cardíacos de método de digestão enzimática
- Colheita GFP corações positivos como 2.1.1. Transferir todos os corações em uma placa de 10 cm com 10 ml DPBS geladas.
- Esprema ventrículos com uma pinça estéril para remover o sangue e lavar uma vez com DPBS geladas.
- Apare os corações para ser livre de outros tecidos e gordura.
- Corte cada coração em cerca de 4 peças que ainda são frouxamente ligados.
- Se menos de 20 corações, transferir os corações em um tubo de 15 ml com 8 ml quente 0,05% de tripsina-EDTA, e incuba-se a 37 ° C durante 15 min.
- Se houver 20-30 corações, transferir os corações em um tubo de 50 ml com 10 ml quente 0,05% de tripsina-EDTA, e incuba-se a 37 ° C durante 15 min.
- Descartar a tripsina e adicionam-se 5 ml (para menos de 20 corações) ou (10 ml) durante 20-30 corações quente colagenase tipo II (0,5 mg / ml) em HBSS.
- Vortex o tubo em vortex durante 1 min a um nível de velocidade de cerca de 4 a 6 (se o líquido não se levantar para a tampa, em seguida, a velocidade é fina).
- Incubar o tubo 37 ° C em banho de água durante 3-5 min.
- Vortex o tubo durante 1 min.
- Sedimento durante 1 min por gravidade até que os pedaços de tecido sossegar, recolher o líquido em um novo tubo contendo 5 ml de meio FB frio.
- Repita os passos 3-5 2.2.6-2.2.10 vezes.
- Combine todas as coleções, filtrando através de 40 um filtro de célulaspara fazer a suspensão de célula única.
- Centrifuga-se a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em 10 ml de tampão MACS, e centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Opcional: Se há um grande número de células do sangue, Ressuspender as células com 1 ml de tampão de lise de RBC (150 mM de NH4Cl, 10 KHCO 3 mM, e EDTA 0,1 mM), manter em gelo durante 1 min, em seguida, dilui-se com 10 ml MACS tampão e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Lave mais uma vez com tampão de MACS.
- Isolamento de fibroblastos THY1.2 + por MACS (triagem magnética-activada de células)
- Determinar o número de células viáveis através de coloração azul de tripano.
- Tome 10 células ul a partir de suspensão de células 10 ml na etapa 2.2.14. Misturá-lo com solução de azul de 10 mL de 0,4% tripano.
- Adicione a mistura para um hemocitômetro. Deixe-a repousar durante 3-5 minutos e depois examinar imediatamente sob um microscópio. As células mortas são manchadas em células azuis e viáveis são imaculado.
- Determinar o número de células viáveis através de coloração azul de tripano.
- Por menos de 1 x 10 7 células, as células ressuspender com 10 ul microbeads THY1.2 em 90 ul refrigerados tampão MACS. Adicionar mais grânulos proporcionalmente se houver mais do que 1 x 10 7 células. Misturar bem e incubar num frigorífico (2-8 ° C) durante 30 min.
- Adicionar 10 ml de tampão e MACS amostras de rotação a 200 g durante 5 min; lavar uma vez com tampão de MACS 10 ml e centrifugar novamente.
- Levar o volume a 2 ml em tampão MACS.
- Configurar uma Separator MACS na capa. Inserir uma coluna LS para o separador. Aplicar 3 ml MACS tampão para a coluna para equilibrar isso.
- Passar a suspensão de células através da coluna LS equilibrada.
- Lavar 3 vezes com 2 ml de tampão de MACS cada vez.
- Tome a coluna LS fora tSeparador ele e elui-se 3 vezes com 2 ml de tampão MACS para um novo tubo de 50 ml.
- Gire a 200 xg durante 5 min.
- Ressuspender as células em 10 ml de mídia FB, contar as células e sementes em placas a densidade adequada. Para fibroblastos gerados a partir de método de cultura de explante, a densidade de sementeira de células poderia ser de cerca de 2-3 x 10 4 células / poço de placa de 24 poços. Para fibroblastos gerados a partir de método de digestão enzimática, a densidade de células poderá ser cerca de 4-5 x 10 4 células / poço de placa de 24 poços.
3. Geração de Retrovirus para iCM Reprogramação
Nota: Execute as seguintes etapas em um BSL2 Gabinete de Segurança Biológica em condições estéreis. O descarte adequado de células transfectadas, pontas para pipetas e tubos é recomendado para evitar o risco de riscos ambientais e de saúde.
- Manter células Plat-E em meio Plat-E suplementado com 1 ug / ml de puromicina e 10 ug / mL blasticidin a 37 ° C com 5% de CO 2.
- No dia 2, substituir o meio por Plat-E meio de cultura sem puromicina e blasticidina.
- No dia 0, dividir células Plat-E em placas de 10 cm no dia antes da transfecção, aproximadamente 4-5 x 10 6 culas por placa. As células devem ser ~ 80-90% confluentes no dia da transfecção.
- No dia 1, os meios para mudança de cultura meio de transfecção em células dentro de 1 h antes da transfecção. Procedimento de transfecção é o seguinte:
- A transfecção usando kits comerciais
- Misturar 20 ul de reagente de transfecção (por exemplo, de Lipofectamine) e 500 ul de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM). Adiciona-se 10 ug do plasmídeo retroviral para mais 500 ul de meio de soro reduzido. Incubar cada mistura à temperatura ambiente (TA) durante 5 min.
- Adiciona-se lentamente a mistura de plasmídeo a mistura de transfecção. Esta etapa pode demorar 15-30 segundos. Incubar a mistura durante 20 min à temperatura ambiente (solução pode aspecto turvo). Adicionar gota mistura sábia para as células.
- Incubar durante a noite numa incubadora a 37 ° C.
- A transfecção com fosfato de cálcio.
- Misturar 40 ul de 2,5 M de CaCl2 e 440 uL ddH2O, em seguida, adiciona-se 20 ug do plasmídeo retroviral (ajustar a quantidade de ddH2O modo que o volume total seja de 500 uL).
- Adicionar 500 mL 2x HBS a um tubo de 15 ml.
- Vortex da HBS e, entretanto, adicione a mistura de cálcio-ADN para a HBS gota a gota. Esta etapa demora cerca de 30 segundos para cada amostra. Assim maximamente fazer 3-4 amostras simultaneamente.
- Incubar à temperatura ambiente durante 3 minutos de incubação por mais tempo leva a maior precipitado e menos células vai ocupar o precipitado.
- Adicione a mistura gota a gota às células e observar ao microscópio 20X. Precipitados finos (um monte de pequenos são bons, mas alguns grandes não são bons) deve ser visto.
- Incubar durante a noite a 37 ° C incubadora.
- No dia 2, mudar meios sobre as células, com 8 ml de meio de cultura previamente aquecido. Incubar durante 24 h.
- No dia 3 e no dia 4, recolher o sobrenadante da cultura a partir das placas, utilizando uma seringa descartável de 10 ml estéril, filtrando-a através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 um de tamanho de poro, e transferir para um tubo de 50 ml. Adicionar 2 ml de solução de precipitação de retrovírus para cada sobrenadante contendo vírus de 8 ml. Suavemente misturá-lo e incubar durante a noite a 4 ° C.
- No dia 5, a mistura viral girar a 1.500 x g a 4 ° C durante 30 min. As partículas virais devem aparecer no sedimento branco no fundo do tubo.
- Desprezar o sobrenadante. Girar solução residual por centrifugação a 1500 × g durante 5 min. Remover todos os vestígios de líquido por aspiração, tomando muito cuidado para não perturbar as partículas retrovirais precipitados em pelota.
- Ressuspender retrovirais peletes com tampão de DPBS 100 uL para cada 8 ml de sobrenadante viral. Alíquotao vírus em gelo. Utilizar imediatamente ou armazenar a -80 ° C.
4. A reprogramação de fibroblastos cardíacos
- Adicione 4 ml de solução polibrene 10 mg / ml para o meio iCM 10 ml, e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. A concentração final de polibreno é de 4 ug / ml.
- Adicionar 500 ul de meios iCM contendo polibreno a cada poço da placa de 24 poços semeada com fibroblastos.
- Adicionar 10 ul a cada poço retrovírus contendo os 2-3 x 10 4 células de cultura de explante ou 4-5 x 10 células de 4 método de digestão enzimática. A quantidade de vírus deve ser aumentada proporcionalmente com o aumento do número de células em placas de cultura ou diferentes pratos. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 24-48 h, para permitir que a infecção virai. A linha do tempo para a reprogramação cardíaca é mostrado na Figura 1.
- Depois de transdução viral, substitua vírus contendo mídia com 500 mL de mídia regulares iCM.
- Mudança de mídia a cada 2-3 dias. Para a selecção positiva de células transduzidas virais, adicionar ICM meios suplementados com puromicina a 2 ug / ml para as células alvo. Mantê-lo por três dias. Depois disso, manter a puromicina na forma iCM na concentração de 1 ug / ml.
- Três dias após a infecção virai, tomar a placa para fora da incubadora e colocá-lo sob um microscópio de fluorescência invertido (20X) para observar a expressão da GFP.
Nota: Dez dias após a infecção virai, as células podem ser colhidas para análise FACS e análise ICC para determinar a eficiência de reprogramação (no passo 5 e 6). - Quatorze dias após a infecção viral, substituir a mídia iCM com a mídia B27. Mudança de mídia a cada três dias. Batimento espontâneo loci célula pode aparecer a partir de três células (método de digestão enzimática) ou quatro (células de cultura método explante) semanas após a transdução virai.
5. Immunocytochemical Análise de Eficiência Reprogramação
- Células de enxágüecom PBS gelado três vezes; remover o excesso de solução.
- Adicionar 0,5 ml de tampão de fixação ICC para cada poço de placas de 24 poços. Fixar as células à temperatura ambiente durante 15-20 min.
- Enxaguar as células três vezes com PBS.
- Adicionar 0,5 ml de tampão de permeabilização ICC para cada poço das placas de poços 24. Permeabilizar as células à TA durante 15 min.
- Enxaguar as células três vezes com PBS.
- Adicionar 0,5 ml de ICC tampão de bloqueio a cada poço da placa de 24 poços, incubar à TA durante 1 h.
- Anticorpos primários diluídos com tampão de coloração TPI. Adicionar 200 ul de soluções de anticorpo a cada poço e incubar durante a noite a 4 ° C. Os factores de diluição de anticorpo estão listados em materiais.
- No dia seguinte, lavar as células com PBS três vezes.
- Adicionar 200 ul de soluções de anticorpo secundário para as células e incuba-se durante 1 h à TA em escuro.
- Lavar as células com PBS três vezes.
- Adicionar 150 ul de solução contendo DAPI para cada cavidade de montagem. Permitir que a mancha núcleos durante 1 min. Entãocobrir cada poço com rodada tampa de vidro deslizante e pressione suavemente o deslizamento contra a superfície inferior com uma pinça para remover bolhas de ar.
- Aspirar o excesso de solução e as amostras estão prontas para imagiologia. As imagens representativas que mostram as células que expressam o marcador reprogramadas cardíaca e TnT αActinin em D14 são mostrados na Figura 2B.
6. FACS análise da eficiência Reprogramação
- Lave as células uma vez com DPBS. Adicionar 0,3 ml de tripsina (0,05%) a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 5 min.
- Bata suavemente na placa para facilitar o levantamento das células. Verifique o desprendimento de células ao microscópio. Adicionar 1 mL de tampão de FACS a cada poço quando a maioria das células são dissociadas. Pipeta-se para baixo e para dissociar mais mecanicamente as células.
- Transferir as células na placa de 24 poços para uma placa de 96 poços poço profundo poço a poço. Rotação a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para recolher as células.
- Lavar as células uma vez comTampão FACS.
- Adicionar soluções de fixação 100 / ul permeabilização para ressuspender as células durante 20 min a 4 ° C.
- Lave as células duas vezes com solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
- Prepare solução de anticorpo primário contra GFP e cTnT em tampão de lavagem 1x. Ressuspender cuidadosamente cada uma das amostras com uma solução de anticorpo de 50 ul e incubar a 4 ° C durante 30 min.
- Lave as células uma vez em solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
- Adicionar 50 ul de solução de anticorpo secundário contendo Alexa Fluor 488 conjugado de IgG de burro anti-coelho Alexa Fluor 647 e burro conjugado anti-IgG de ratinho a cada amostra. Incubar a 4 ° C durante 30 min no escuro.
- Lave as células uma vez em solução de lavagem 1x, pelota, e remover o sobrenadante.
- Ressuspender as células em tampão 400 ul de fixação (DPBS com 1% de PFA). Transferência de células para dentro do tubo FACS com tampa de filtro de células. As amostras estão prontos para a detecção de FACS. A análise FACS representante de reprogramação eficy usando pMxs-puromicina-construção MGT com ou sem puromicina selecção é mostrado na Figura 2A.
- A transfecção usando kits comerciais
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Representative Results
Os passos de reprogramação são resumidos por esquemática na Figura 1. Após a transdução MGT, a expressão da GFP em células reprogramação pode ser detectada tão cedo como o dia 3. A puromicina selecção de células transduzidas é iniciado a partir do dia 3 e é mantida durante as duas primeiras semanas, se pMX-puro constructo -MGT é usado. Por volta do dia 10 até ao dia 14, a expressão dos marcadores cardíacos como TnT e αActinin poderia ser detectado por ambos TPI (Figura 2B, passo 5) e FACS (Figura 2A, etapa 6), indicando que os fibroblastos de partida são submetidos a reprogramação para uma célula cardíaca destino.
Figura 1:. Representação esquemática do processo de reprogramação cardíaca directa Procedimentos em cada ponto de tempo são descritos em caixas pretas. O meio de cultura para cada fase estão apresentados em caixas coloridas abaixo do tempolinha.
Figura 2: Reprogramação eficiência avaliada por FACS e ICC (A) FACS análise sobre o ICMS gerados a partir de fibroblastos isolados de fresco no dia 10 após a transdução MGT.. (B) Coloração de iCMS às 2 semanas com αMHC-GFP, TnT cardíaca, e αActinin com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindole). Barra de escala: 200 mm
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Discussion
Para a geração iCM bem sucedido ao usar este protocolo, existem vários fatores importantes que têm um impacto sobre a eficiência global. Particularmente as condições de fibroblastos de partida e da qualidade de codificação retrovírus MGT pode afetar consideravelmente a eficiência de reprogramação.
É importante para gerar fibroblastos tão fresco e saudável possível. Para o método de cultura de explante, os fibroblastos podem ser usadas antes de sete dias depois de os explantes foram plaqueadas em pratos. Para o método de digestão enzimática, os fibroblastos podem ser usadas o mais cedo no dia seguinte de isolamento. O congelamento ou a passagem das fibroblastos de reprogramação não é recomendado. Estes tratamentos adicionais de fibroblastos irá diminuir significativamente a eficiência de reprogramação. A densidade de semeadura é outro fator importante que afeta a eficiência de reprogramação. Se as células são escassamente semeado, eles tendem a tornar-se doentia com a morfologia celular irregular e em tamanho grande. Raramente could essas células ser convertido em ICMS. Se as células são semeadas muito densamente, a MOI (multiplicidade de infecção) para infecções virais é diminuída. Crescimento excessivo de fibroblastos não infectados dilui significativamente os eventos de reprogramação, resultando, assim, em um baixo percentual de ICMS. Observamos também o surgimento de células menores na morfologia paralelepípedos-se como mais células são semeadas para a reprogramação. Eles dificilmente poderia ser reprogramado e, portanto, resultar em redução da eficiência de reprogramação. Ao modificar o protocolo para diferentes tamanhos de placas de cultura de tecido, recomenda-se que os números de células semeando ser proporcionalmente ajustada para a área de superfície da placa de cultura.
A pureza de fibroblastos é crítica para reprogramação. O elevado grau de pureza de fibroblastos pode ser conseguido quer por triagem FACS ou MACS 15 enriquecimento como descrita aqui. Comparado a separação por FACS, MACS ordenação é mais fácil, mais suave, e mais conveniente. Pureza celular após MACS pode chegar a mais de 90% wgalinha seguindo rigorosamente o protocolo. Baixa pureza de fibroblastos podem diminuir a eficiência de reprogramação vez que as células contaminadas são mais difíceis de ser reprogramado de fibroblastos e que proliferam muito mais rapidamente do que as células de reprogramação. Também é altamente recomendável para semear as células logo após MACS e executar infecção viral durante a noite após a semeadura. Os fibroblastos podem parcialmente ordenadas tornam-se senescentes após crescimento em prato para um longo período de tempo, o que diminui a absorção do retrovírus que infecta apenas as células em proliferação. Fibroblastos da ponta da cauda (TTFs) e fibroblastos embrionários (MEFs) têm sido relatados para ser convertido em alguma outra iCMS com factores de transcrição 10,12,19,26. Nosso protocolo aqui só incide sobre fibroblastos cardíacos. A aplicação do presente protocolo a outros tipos de fibroblastos podem ser optimizadas devido às variações inerentes de assinaturas de fibroblastos, como o status proliferação, genéticos e epigenéticos marcos.
ºe qualidade de retrovírus para a transdução é de extrema importância. Vírus de baixo título não conseguem converter fibroblastos em ICMS. Considerando vírus em quantidade excessiva fará com que a citotoxicidade que leva diretamente para fibroblastos morte celular. É necessário determinar o título viral e otimizar a dosagem viral para a reprogramação com base em laboratório condições experimentais set-up e. O método de titulação viral tem sido exaustivamente descrita antes de 23. Na verdade, achamos que a condição de crescimento de células Plat-E relaciona-se diretamente com a qualidade viral. É recomendado para descongelar células Plat-E na passagem inferior (<30) de cada vez. As células obtidas na passagem três são os melhores para o vírus da embalagem a uma densidade cerca de 4-5 x 10 6 células por 10 centímetros prato de cultura. Além disso, os vírus recém-colhidas produzir maior eficiência reprogramação do que os vírus congelados. Por favor, note que a co-infecção do vírus da MGT com outro pMxs vetor baseado retrovírus irá diminuir a possib eficiência reprogramaçãoly devido à concorrência entre os dois vírus do mesmo tipo. Dois métodos diferentes de transfecção são fornecidos aqui. Ambos os métodos produzem retrovírus comparáveis. Enquanto Lipofectamina comercial é caro, mas estável, transfecção com fosfato de cálcio é mais barato. Preparação de tampão HBS precisa tomar muito cuidado, pois o pH do tampão HBS afeta significativamente a eficiência de transfecção.
Existem algumas limitações do presente protocolo que precisam ser abordadas. Uma das limitações reside no uso de retrovírus, o que torna inevitavelmente para as questões de biossegurança. A heterogeneidade dos fibroblastos e a ausência de marcador de fibroblastos cardíacos específicos para o isolamento também afectar a pureza das células que são reprogramáveis. Variação de eficiência de reprogramação podem ser observados devido à variabilidade do lote inerente à condição de fibroblastos e produção de vírus. Além disso, embora as células reprogramadas expressar proteínas estrutura sarcômero tais como troponina Te αActinin, eles ainda não são maduros cardiomiócitos caracterizados por propriedades funcionais, tais como a contratilidade e propagação elétrica.
Em resumo, a metodologia aqui descrita permite a geração eficiente de iCMS baseadas na entrega retroviral de factores de transcrição M, G, T numa única construção. Nosso protocolo fornece uma plataforma reprodutível e valioso para a investigação iCM, e irá facilitar os esforços em curso sobre rastreio de alto rendimento e estudos sobre os mecanismos de iCM reprogramação e, finalmente, mover o campo reprogramação iCM mais perto de aplicações clínicas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-cardiac troponin T | Thermo Scientific | MS-295-PO | 1:200 for FACS and 1:400 for ICC |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti- aActinin | Sigma-Aldrich | A7811 | 1:500 for both FACS and ICC |
| anti-Connexin43 | Sigma-Aldrich | C6219 | 1:500 for ICC |
| anit-Mef2c | Abcam | ab64644 | 1:1,000 for ICC |
| anti-Gata4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237 | 1:200 for ICC |
| anti-Tbx5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17866 | 1:200 for ICC |
| Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-545-152 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 715-605-150 | 1:500 for both FACS and ICC |
| Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining | BD Biosciences | 554722 | |
| Rhod-3 Calcium Imaging Kit | Life Technologies | R10145 | |
| Thy1.2 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | |
| Vectashield solution with DAPI | Vector labs | H-1500 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F-2442 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052 | |
| PRMI1640 medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| IMDM | Life Technologies | 12440-053 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | |
| M199 medium | Life Technologies | 10-060 | |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 10-013 | |
| Penicillin-streptomycin | Corning | 30-002 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11130-050 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668500 | |
| blasticidin | Life Technologies | A11139-03 | |
| puromycin | Life Technologies | A11138-03 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | BP358-212 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | PX1405 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | 9048-46-8 | |
| paraformaldehyde | EMS | 15714 | |
| Retrovirus Precipitation Solution | ALSTEM | VC-200 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Corning | 21022 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 0.45 μm cellulose acetate filter | Thermo Scientific | 190-2545 | |
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Thermo Scientific | 172958 | |
| 60 mm center well culture dish | Corning | 3260 | |
| 96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate | Denville Scientific | P9639 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Vortexer MINI | VWR | 58816-121 | |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System | Life Technologies | AMAFD1000 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Round glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 72195-15 |
References
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