Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Förbättrad Generering av inducerade Cardiomyocytes Använda en polycistroniskt konstruktion som uttrycker optimala förhållandet mellan GATA4, Mef2c och Tbx5

Published: November 13, 2015 doi: 10.3791/53426
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

Abstract

Direkt omvandling av hjärt fibroblaster (CFS) i inducerade hjärtmuskelceller (ICMS) rymmer en stor potential för regenerativ medicin genom att erbjuda alternativa strategier för behandling av hjärtsjukdomar. Denna omvandling har uppnåtts genom tvångs uttryck av definierade faktorer såsom GATA4 (G), Mef2c (M) och Tbx5 (T). Traditionellt ICMS genereras av en cocktail av virus som uttrycker dessa individuella faktorer. Det är dock relativt låg och omprogrammering effektivitet mesta av in vitro G, M, T-omvandlade fibroblaster inte bli helt omprogrammeras, vilket gör det svårt att studera omprogrammeringar mekanismer. Vi nyligen har visat att stökiometrin av G, M, T är avgörande för effektiv icm omprogrammering. En optimal stökiometri av G, M, T med relativ hög nivå av M och låga nivåer av G och T som uppnås genom att använda vår polycistrona MGT vektor (nedan kallad MGT) signifikant ökad omprogrammering effektivitet och förbättrad ICM kvalitet in vitro. Här ger vi en detaljerad beskrivning av den metod som används för att generera ICM med MGT konstruktion från hjärt fibroblaster. Isolering av hjärt fibroblaster, generering av virus för omprogrammering och utvärdering av omprogrammering processen ingår också att skapa en plattform för effektiv och reproducerbar generation ICMS.

Protocol

Det protokoll som beskrivs här använder neonatala möss. Djuromsorg och experiment utförs i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Avdelningen för försöksdjursmedicin (DLAM) vid University of North Carolina, Chapel Hill.

1. Framställning av buffertar och medier

  1. Förbered fibroblast (FB) -medium: Supplement 500 ml IMDM-media med 100 ml fetalt bovint serum (FBS) och 6 ml penicillin / streptomycin.
  2. Förbered ICM medium: Tillägg 400 ml DMEM media med 100 ml M199 media och 50 ml FBS.
  3. Förbered B27 medium: Tillägg 490 ml RPMI1640 media med 10 ml B27 media.
  4. Förbered Plat-E odlingsmedium: Supplement 500 ml DMEM-medium med 50 ml FBS, 5 ml penicillin / streptomycin och 5 ml Icke-essentiella aminosyror.
  5. Förbered Plat-E transfektionsmediet: Supplement 500 ml DMEM-medium med 50 ml FBS och 5 ml Icke-essentiella aminosyror.
  6. Prepare gelatinbelagda 24-brunnars platta: Lägg 0,5 ml 0,1% gelatinlösning till en brunn i 24 brunnars platta, inkubera vid 37 ° C under minst 10 minuter och aspirera precis innan användning.
  7. Förbered FACS märkning buffert: Tillägg 500 ml DPBS med 10 ml FBS och 2 ml EDTA (0,5 M) för att nå en slutlig koncentration av 2 mM. Passera genom en 0,22 | im filter och förvara vid 4 ° C.
  8. Förbered MACS sorteringsbuffert: Tillägg 500 ml DPBS med 2,5 g BSA och 2 ml EDTA (0,5 M) för att nå en slutlig koncentration av 2 mM. Passera genom en 0,22 | im filter och förvara vid 4 ° C.
  9. Bered 2x HBS-buffert för transfektion: komplettera 500 ml HEPES-buffert (50 mM) med 280 mM NaCl (8,1816 g), 10 mM KCI (0,37275 g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glukos (1,08096 g ). Lägg omkring 650 | il 10 N NaOH för att justera pH till 7,05-7,12. Filtrera genom ett 0,22 ^ m por-filter och förvara vid 4 ° C.
  10. Förbered 2,5 M CaCl2-lösning för transfektion: Lägg 18,376 g CaCl 2 till 50 ml DDH 2 O. Filtrera genom ett 0,22 ^ m por-filter och förvara vid 4 ° C.
  11. Förbered ICC (immunocytokemi) fixering buffert: Tillsätt 5 ml paraformaldehyd (PFA, 32%) till 35 ml DPBS för att nå en slutlig koncentration av 4%.
  12. Förbered ICC permeabilization buffert: Tillsätt 0,1 ml Triton till 100 ml DPBS för att nå en slutlig koncentration av 0,1%.
  13. Bered ICC blockerande buffert: Lägg 5 g bovint serumalbumin (BSA) till 100 ml DPBS för att nå en slutlig koncentration av 5%.
  14. Förbered ICC färgning buffert: Tillsätt 1 g BSA till 100 ml DPBS för att nå en slutlig koncentration av 1%.

2. Framställning av neonatala Mus Hjärtat fibroblaster

  1. Generera hjärt fibroblaster från Explantation odlingsmetoden
    1. Ren neonatal αMHC-GFP transgen mus (P1 till P2) med 75% etanol. Skär huvudet av med steril sax. Sedan gör ett horisontellt snitt från under en armhåla till den andra. Använda en steriltrubbiga och böjda pincett för att dissekera ut hjärtat och placera den i en brunn i 24 brunnars platta innehållande iskall PBS-buffert.
      1. Alternativt, pressa ut hjärtat efter den horisontella snittet.
    2. Kontrollera GFP uttryck i hjärtat av fluorescensmikroskop. Eftersom GFP uttryck drivs av αMHC promotor som är en hjärt promotor bör hjärtat från transgen mus vara i grönt 15, medan den negativa hjärta är svag i alla fluorescens.
    3. Ta 3-4 GFP-positiva hjärtan in i en 60 mm centrum väl odlingsskål och finhacka dem i små bitar mindre än 1 mm 3 i storlek av steril sax och tång.
    4. Placera 3-4 finhackade hjärtan i en 10 cm skål med 2 ml FB media. Låt vävnaderna bosätta sig under 3 timmar.
    5. Tillsätt långsamt 8 ml förvärmda FB media till rätter som innehåller hjärtvävnad. Stör inte vävnaderna i tre dagar.
    6. Byt medierna var tredje dag.
    7. På dag 7, aspiråt odlingsmedium och tvätta cellerna med DPBS. Lägg 3 ml 0,05% trypsin till varje platta och smälta vid 37 ° C under 5 minuter.
    8. Tillsätt 5 ml FB media för att släcka trypsin. Lossa försiktigt cellerna med en cell skrapa. Pipett media upp och ner för att ytterligare mekaniskt dissociera vävnaden.
    9. Samla celler och filtrera genom 40 um cell silar för att undvika kontaminering av hjärtvävnadsfragment, och sedan pellets celler genom att snurra på 200 xg under 5 minuter.
    10. Tvätta cellerna en gång med Mac buffert och celler är redo för sortering.
  2. Generera hjärt fibroblaster från enzymdigestion metod
    1. Harvest GFP positiva hjärtan som 2.1.1. Överför alla hjärtan i en 10 cm skål med 10 ml iskall DPBS.
    2. Pressa ventriklarna med steril pincett för att avlägsna blod och skölj en gång med iskall DPBS.
    3. Trimma hjärtan för att vara fri från andra vävnader och fett.
    4. Skär varje hjärta i cirka 4 bitar som fortfarande är löst kopplade.
    5. Om mindre än 20 hjärtan, överföra hjärtan i en 15 ml koniska rör med 8 ml varmt 0,05% trypsin-EDTA, och inkubera vid 37 ° C under 15 minuter.
      1. Om det finns 20-30 hjärtan överföra hjärtan i en 50 ml koniska rör med 10 ml varmt 0,05% trypsin-EDTA, och inkubera vid 37 ° C under 15 minuter.
    6. Kasta trypsin och tillsätt 5 ml (mindre än 20 hjärter) eller 10 ml (för 20-30 hjärter) varm typ II kollagenas (0,5 mg / ml) i HBSS.
    7. Vortex röret på virvel under 1 minut med en hastighet nivå kring 4-6 (om vätskan inte få upp till locket, då hastigheten är bra).
    8. Inkubera röret i 37 ° C vattenbad under 3-5 minuter.
    9. Vortexa röret i en minut.
    10. Sediment under 1 min genom tyngdkraften tills vävnaden bitar slå sig ner, samla vätskan till ett nytt rör innehållande 5 ml kall FB medel.
    11. Upprepa steg 2.2.6-2.2.10 3-5 gånger.
    12. Kombinera alla samlingar genom filtrering genom 40 ìm cell silför att göra enkelcellsuspension.
    13. Centrifugera vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C.
    14. Resuspendera cellerna i 10 ml MACS-buffert och centrifugera vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C.
    15. Valfritt: Om det finns en hel del blodkroppar, resuspendera cellerna med 1 ml RBC lysisbuffert (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, och 0,1 mM EDTA), hålla på is under 1 minut, späd sedan med 10 ml MACS buffert och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. Tvätta en gång med MACS-buffert.
  3. Isolering av Thy1.2 + fibroblaster från MACS (magnetisk aktiverad cellsortering)
    1. Fastställa livskraftiga cellantalet genom trypan blå färgning.
      1. Ta 10 | il celler ut från 10 ml cellsuspension i steg 2.2.14. Blanda det med 10 | il 0,4% lösning av trypanblått.
      2. Tillsätt blandningen till en hemocytometer. Låt den stå i 3-5 minuter och sedan undersöka omedelbart under ett mikroskop. De döda cellerna färgade i blått och livskraftiga celler är ofärgade.
        3. 4 X 10 (total volym av cellsuspension).
    2. För mindre än 1 x 10 7 celler, återsuspendera cellerna med 10 il Thy1.2 mikrokulor i 90 pl kylda MACS-buffert. Lägg till fler pärlor proportionellt om det finns mer än 1 x 10 7 celler. Blanda väl och inkubera i kylskåp (2-8 ° C) under 30 minuter.
    3. Tillsätt 10 ml MACS buffert och spin prover vid 200 xg under 5 min; Tvätta en gång med 10 ml MACS-buffert och centrifugera igen.
    4. Ta volymen till 2 ml i MACS-buffert.
    5. Inrätta en MACS Separator i huva. Sätt en LS kolumn till separatorn. Applicera 3 ml MACS-buffert till kolonnen för att jämvikta den.
    6. Passera cellsuspensionen genom den ekvilibrerade LS kolumnen.
    7. Tvätta 3 gånger med 2 ml MACS-buffert varje gång.
    8. Ta LS kolumnen off tHan Separator och eluera 3 gånger med 2 ml MACS buffert i en ny 50 ml tub.
    9. Spin vid 200 xg under 5 minuter.
    10. Resuspendera cellerna i 10 ml FB media, räkna cellerna och utsäde i plattor på rätt täthet. För fibroblaster genereras från explantatet odlingsmetoden, kunde den sådd celler densiteten vara cirka 2-3 x 10 4 celler / brunn av 24-brunnsplatta. För fibroblaster genereras från enzymdigestion metod kunde celler densiteten vara cirka 4-5 x 10 4 celler / brunn av 24-brunnsplatta.

3. Framställning av retrovirus för ICM Omprogrammering

Obs: Utför följande steg i en BSL2 biologisk säkerhet skåp under sterila förhållanden. Korrekt bortskaffande av transfekterade celler, pipettspetsar och rören rekommenderas för att undvika risken för miljö- och hälsorisker.

  1. Bibehåll Plat-E-celler i Plat-E-medium kompletterat med 1 | ig / ml puromycin och 10 ^ g / ml Blasticidin vid 37 ° C med 5% CO2.
  2. Dag 2, byt ut mediet genom Plat-E odlingsmedium som saknar puromycin och blasticidin.
  3. På dag 0, dela Plat-E-celler i 10 cm rätter dagen innan transfektion vid ungefär 4-5 x 10 6 celler per platta. Celler bör vara ~ 80-90% konfluenta på dagen för transfektion.
  4. På dag 1, förändring odlingsmedia till transfektion media på cellerna inom 1 h före transfektion. Transfektion förfarande är enligt följande:
    1. Transfektion med användning av kommersiella kit
      1. Blanda 20 l transfektionsreagens (t.ex. Lipofectamine) och 500 pl minskade serum medier (t.ex. Opti-MEM). Lägg 10 mikrogram av den retrovirala plasmiden till en annan 500 pl minskade serum media. Inkubera varje blandning vid rumstemperatur (RT) under 5 minuter.
      2. Tillsätt långsamt plasmiden blandningen till transfektionsblandningen. Detta steg kan ta 15-30 sekunder. Inkubera blandningen i 20 min vid RT (lösningen kan synas grumlig). Lägg blandningen droppvis till cellerna.
      3. Inkubera över natt i en 37 ° C inkubator.
    2. Transfektion med användning kalciumfosfat.
      1. Blanda 40 pl 2,5 M CaCl2 och 440 mikroliter DDH 2 O, lägg sedan till 20 mikrogram av den retrovirala plasmiden (justera mängden DDH 2 O, så att den totala volymen är 500 l).
      2. Tillsätt 500 pl 2x HBS till en 15 ml koniska rör.
      3. Virvel HBS och samtidigt lägga till kalcium-DNA-blandningen till HBS släppa klokt. Detta steg tar omkring 30 sek för varje prov. Så maximalt göra 3-4 prover samtidigt.
      4. Inkubera vid rumstemperatur under 3 minuter Inkubation under längre tid leder till större fällningen och färre celler tar upp fällningen.
      5. Lägg blandningen släppa klokt att cellerna och provet i 20X mikroskop. Fina fällningar (en hel del små är bra men några stora sådana är inte bra) bör ses.
      6. Inkubera över natten vid 37 ° C inkubator.
    3. Dag 2, byta media på celler med 8 ml förvärmd odlingsmedier. Inkubera i 24 h.
    4. På dag 3 och dag 4, samla odlingssupernatant från skålarna genom användning av en 10 ml steril engångsspruta, filtrera den genom ett 0,45 ^ m porstorlek cellulosaacetatfilter, och överföring till en 50 ml-rör. Tillsätt 2 ml av retrovirus fällningslösningen till varje 8 ml virusinnehållande supematanten. Blanda försiktigt och inkubera över natten vid 4 ° C.
    5. På dag 5, snurra det virala blandningen vid 1500 x g vid 4 ° C under 30 minuter. De virala partiklama ska visas i vit pellet på botten av röret.
    6. Kasta bort supernatanten. Centrifugera ner kvarvarande lösningen genom centrifugering vid 1500 x g under 5 minuter. Ta bort alla spår av vätskan genom aspiration, med stor omsorg att inte störa de utfällda retroviruspartiklar i pellet.
    7. Resuspendera retrovirala pellets med 100 pl DPBS buffert för var 8 ml viral supematant. Alikvotviruset på is. Använd omedelbart eller förvara vid -80 ° C.

    4. Omprogrammering av hjärt fibroblaster

    1. Tillsätt 4 | il av 10 mg / ml polybren lösningen i 10 ml ICM-medium, och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Den slutliga koncentrationen av polybrene är 4 mikrogram / ml.
    2. Lägg 500 pl ICM medium innehållande polybren till varje brunn i 24 brunnars platta ympades med fibroblaster.
    3. Tillsätt 10 pl retrovirus till varje brunn innehåller antingen 2-3 x 10 4 celler från Explantation kultur eller 4-5 x 10 4 celler från enzymdigestion metod. Mängden virus bör proportionellt ökas med ökat cellantal i olika odlingsplattor eller rätter. Placera plattan i en 37 ° C inkubator i 24-48 timmar för att göra det möjligt för virusinfektion. Tidslinjen för hjärt omprogrammering visas i figur 1.
    4. Efter viral transduktion, byt virus innehållande media med 500 l vanlig ICM media.
    5. Ändra media var 2-3 dagar. För positiv selektering av virala transducerade celler, tillsätt ICM medium kompletterat med puromycin vid 2 | ig / ml till målceller. Håll det i tre dagar. Efter det, bibehålla puromycin i ICM-medium vid koncentrationen 1 | ig / ml.
    6. Tre dagar efter virusinfektion, ta plattan ur kuvösen och placera den under ett inverterat fluorescerande mikroskop (20X) för att observera GFP uttryck.
      Obs: Tio dagar efter viral infektion, kunde cellerna skördas för FACS-analys och ICC analys för att fastställa omprogrammering effektiviteten (i steg 5 och 6).
    7. Fjorton dagar efter virusinfektion, byt ICM media med B27 media. Ändra media var tredje dag. Spontan slå cell loci kan visas från tre (celler från enzymdigestion metod) eller fyra (celler från Explantation odlingsmetod) veckor efter virus transduktion.

    5. Immuncytokemiska Analys av omprogrammering effektivitet

    1. Skölj cellermed iskall PBS tre gånger; avlägsna överskott lösning.
    2. Lägg 0,5 ml ICC fixeringsbuffert till varje brunn i plattor med 24 brunnar. Fixera cellerna vid RT under 15 till 20 minuter.
    3. Skölj celler med PBS tre gånger.
    4. Lägg 0,5 ml ICC permeabilization buffert till varje brunn i de 24 brunnars plattor. Permeabilisera cellerna vid RT under 15 minuter.
    5. Skölj celler med PBS tre gånger.
    6. Lägg 0,5 ml ICC blockerande buffert i varje brunn i 24-brunnars platta, inkubera vid RT i 1 h.
    7. Utspädda primära antikroppar med ICC färgning buffert. Tillsätt 200 pl antikroppslösningar till varje brunn och inkubera över natten vid 4 ° C. Utspädningsantikroppsfaktorer listas i Materials.
    8. På nästa dag, tvätta cellerna med PBS tre gånger.
    9. Tillsätt 200 | il sekundära antikroppslösningar till cellerna och inkubera i 1 timme vid RT i mörker.
    10. Tvätta cellerna med PBS tre gånger.
    11. Tillsätt 150 pl monteringslösning innehållande DAPI till varje brunn. Tillåt att färga kärnor för en minut. Sedantäcka varje brunn med runda glas täckglas och tryck försiktigt glida mot bottenytan med en tång för att ta bort luftbubblor.
    12. Aspirera överskottslösningen och proverna är redo för bildframställning. De representativa bilder som visar de omprogrammerade celler som uttrycker hjärtmarkör cTnT och αActinin vid D14 visas i figur 2B.

    6. FACS analys av omprogrammering effektivitet

    1. Tvätta cellerna en gång med DPBS. Lägg 0,3 ml trypsin (0,05%) till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 5 min.
    2. Knacka försiktigt på plattan för att underlätta lyft cellerna. Kontrollera cell lossnar under mikroskop. Tillsätt 1 ml FACS buffert till varje brunn när de flesta celler dissocieras. Pipettera upp och ner för att ytterligare mekaniskt dissociera cellerna.
    3. Överför celler i 24 brunnar i ett 96 väl djup brunn platta brunn till brunn. Snurra vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C för att samla upp cellerna.
    4. Tvätta cellerna en gång medFACS-buffert.
    5. Tillsätt 100 | il fixering / permeabilization lösningar för att återsuspendera cellerna under 20 min vid 4 ° C.
    6. Tvätta cellerna två gånger med 1x tvättlösning, pellets, och avlägsna supernatanten.
    7. Förbered primära antikroppen lösningen mot GFP och cTnT i 1x tvättbuffert. Grundligt resuspendera varje prov med 50 | il antikropplösning och inkubera vid 4 ° C under 30 minuter.
    8. Tvätta cellerna en gång i 1 x tvättlösning, pelleten, och avlägsna supernatanten.
    9. Tillsätt 50 pl lösning sekundär antikropp innehållande Alexa Fluor 488 konjugerat åsna anti-kanin-IgG och Alexa Fluor 647 konjugerat åsna anti-mus-IgG till varje prov. Inkubera vid 4 ° C under 30 min i mörker.
    10. Tvätta cellerna en gång i 1 x tvättlösning, pelleten, och avlägsna supernatanten.
    11. Resuspendera cellerna i 400 | j, l fixeringsbuffert (DPBS med 1% PFA). Överför cell i FACS rör med cell sil mössa. Prover är redo för FACS upptäckt. Företrädaren FACS-analys av omprogrammering effektiviteten såy med användning pMxs-puromycin-MGT konstrukt med eller utan puromycinselektion visas i figur 2A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Omprogrammering steg sammanfattas av schemat i figur 1. Efter MGT transduktion, kan GFP uttryck i omprogrammering celler upptäckas så tidigt som dag 3. Puromycinselektion av omvandlade celler börjar från dag 3 och upprätthålls under de första två veckorna om PMX-puro -MGT konstrukt används. Vid dag 10 till dag 14, kunde expression av hjärtmarkörer som cTnT och αActinin detekteras genom både ICC (figur 2B, steg 5) och FACS (Figur 2A, steg 6), vilket indikerar att utgångs fibroblaster genomgår omprogrammering mot en hjärtcell öde.

Figur 1
Figur 1:. Schematisk bild av den direkta hjärt omprogrammering process Rutiner vid varje tidpunkt beskrivs i svarta lådor. Odlingsmedier för varje steg visas i färgade rutor under tidenlinje.

Figur 2
Figur 2: Omprogrammering effektivitet utvärderas av FACS och ICC (A) FACS-analys på ICMS genereras från nyisolerade fibroblaster på dag 10 efter MGT transduktion.. (B) Färgning av ICMS på 2 veckor med αMHC-GFP, hjärt- cTnT och αActinin med DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Skala bar: 200 pm

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För framgångsrik ICM generation när du använder detta protokoll, finns det flera viktiga faktorer som inverkar på den totala effektiviteten. Särskilt villkoren för start fibroblaster och kvaliteten på retrovirus som kodar för MGT kan i hög grad påverka omprogrammering effektivitet.

Det är viktigt att skapa fibroblaster som friska som möjligt. För Explantation odlingsmetod kan fibroblaster användas innan sju dagar efter explantaten ströks ut på rätter. För enzymdigestion metod, kan fibroblaster användas så tidigt som nästa dagen av isoleringen. Rekommenderas inte frysa eller passage fibroblaster för omprogrammering. Dessa ytterligare behandlingar av fibroblaster kommer att avsevärt minska omprogrammering effektivitet. Den såddtäthet är en annan viktig faktor som påverkar omprogrammering effektivitet. Om cellerna är glest ympades, tenderar de att bli ohälsosamt med oregelbunden cellmorfologi och i större format. Sällan could dessa celler omvandlas till ICMS. Om celler ympas alltför tätt, är MOI (multiplicitet av infektion) för viral infektion minskas. Överväxt av oinfekterade fibroblaster späder signifikant omprogrammering händelser sålunda resulterar i en låg andel av ICMS. Vi märker också framväxten av mindre celler i kullersten morfologi om fler celler ympas för omprogrammering. De kunde knappast omprogrammeras och därmed leda till minskad omprogrammering effektivitet. När du ändrar protokollet för olika storlek på vävnadsodlingsskålar, rekommenderas att sådd cell nummer justeras i proportion till ytan av kulturen skålen.

Renheten av fibroblaster är avgörande för omprogrammering. Den höga renheten hos fibroblaster skulle kunna uppnås antingen genom FACS sortering 15 eller MACS-anrikning som vi beskrivit här. Jämfört med FACS sortering, är MACS sortering lättare, mjukare och mer bekvämt. Cell renhet efter MACS kan nå över 90% whöna strikt följa protokollet. Låg renhet av fibroblaster kan minska omprogrammering effektivitet, eftersom de kontaminerade cellerna är svårare att omprogrammeras än fibroblaster och att de förökar sig mycket snabbare än omprogrammering celler. Det är också rekommenderas att ympa cellerna direkt efter MACS och utföra virusinfektion natten efter sådd. De sorterade fibroblaster kan delvis bli senescent efter att ha ökat i skålen under en lång tid, vilket minskar upptag av retrovirus som endast infekterar prolifererande celler. Tail-tip fibroblaster (TTFs) och embryonala fibroblaster (MEF) har rapporterats att omvandlas till ICMS med någon annan transkriptionsfaktorer 10,12,19,26. Vår protokoll fokuserar här endast på hjärt fibroblaster. Tillämpningen av detta protokoll till andra fibroblaster typer kan optimeras ytterligare på grund av de inneboende variationer av fibroblastceller signaturer såsom spridning status, genetisk och epigenetiska landmärken.

The kvalitet retrovirus för transduktion är av yttersta vikt. Låg titer virus inte omvandla fibroblaster i ICMS. Medan virus på alltför mycket kommer att orsaka cytotoxicitet som direkt leder till fibroblast celldöd. Det är nödvändigt att bestämma den virala titern och optimera den virala dosen för omprogrammering baserat på laboratorie installation och experimentella förhållanden. Metoden för viral titrering har noggrant beskrivits tidigare 23. I själva verket fann vi att tillväxten skick Plat-E-celler direkt hänför sig till virala kvalitet. Det rekommenderas att tina Plat-E-celler vid lägre passage (<30) varje gång. Celler erhållna vid passage tre är bäst för förpacknings virus vid en densitet cirka 4-5 x 10 6 celler per 10 cm odlingsskål. Dessutom är nyskördade virus ger högre omprogrammering effektivitet än frysta virus. Observera att samtidig infektion av MGT virus med annan pMxs vektorbaserade retrovirus minskar omprogrammering effektiviteten possibly på grund av konkurrensen mellan de två virusen av samma typ. Två olika transfektion metoder finns här. Båda metoderna ger jämförbara retrovirus. Även kommersiella Lipofectamine är dyrt, men stabil, är transfektion med kalciumfosfat billigare. Framställning av HBS buffert måste ta stor försiktighet eftersom pH HBS buffert påverkar avsevärt transfektionseffektiviteten.

Det finns vissa begränsningar i detta protokoll som måste åtgärdas. En av begränsningarna ligger i användningen av retrovirus, vilket oundvikligen gör att biosäkerhetsaspekter. Heterogenitet fibroblaster och bristen på specifika hjärt fibroblast markör för isolering påverkar också renheten hos celler som är omprogrammerbar. Variation av omprogrammering effektivitet kan observeras på grund av att partiet variabilitet inneboende fibroblast skick och virusproduktion. Dessutom, fastän de omprogrammerade cellerna uttrycker sarcomere strukturproteiner såsom kardiellt troponin Toch αActinin, är de fortfarande inte mogna kardiomyocyter som kännetecknas av funktionella egenskaper såsom kontraktilitet och elektrisk förökning.

Sammanfattningsvis den metod som beskrivs här tillåter effektiv generering av ICMS baserade på retroviral tillförsel av M, G, T transkriptionsfaktorer i en enda konstruktion. Vår protokoll ger en reproducerbar och värdefull plattform för ICM forskning, och kommer att underlätta pågående ansträngningarna för high-throughput screening och mekanistiska studier av ICM omprogrammering, och i slutändan flytta ICM omprogrammering fältet närmare kliniska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Tags

Utvecklingsbiologi Cardiac fibroblast direkt omprogrammering ICM kardiomyocyter Mef2c GATA4 Tbx5 MGT polycistron konstruktion.
Förbättrad Generering av inducerade Cardiomyocytes Använda en polycistroniskt konstruktion som uttrycker optimala förhållandet mellan GATA4, Mef2c och Tbx5
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou,… More

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter