Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Gata4, Mef2c ve Tbx5 Optimal Oranı ifade bir polisistronik Construct kullanma Kaynaklı kardiyomiyositlerde Geliştirilmiş Nesil

Published: November 13, 2015 doi: 10.3791/53426
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, McAllister Heart Institute, University of North Carolina, Chapel Hill

Abstract

Kaynaklı kardiyomiyositlere kardiyak fibroblastlar (CFS) Doğrudan dönüşüm (ICMS) kalp hastalıklarının tedavisi için alternatif stratejiler sunarak rejeneratif tıp için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu dönüşüm Gata4 (G), Mef2c (M) ve Tbx5 (T) gibi tanımlanmıştır faktörler zorla ifade ile elde edilmiştir. Geleneksel olarak, bu ICMS bireysel faktörlerin ifade virüslerin bir kokteyl ile üretilmiştir. Bununla birlikte, verim yeniden programlama nispeten düşük olan ve in vitro G en büyük kısmı, E, fibroblastlar zor yeniden programlama mekanizmaları incelemek için yapım tamamen yeniden programlanması olmazlar T-transdüksiyonlu. Biz son zamanlarda G, M stokiyometrisi, T verimli ICM yeniden programlama için çok önemli olduğunu göstermiştir. Bir M ve polisistronik MGT vektörü (bundan sonra MGT olarak anılacaktır) önemli ölçüde artmıştır yeniden programlama etkinliğini kullanılarak elde G ve T düşük seviyelerde göreli yüksek düzeyde G, M, T optimal stoikiometri ve in vitro olarak geliştirilmiş ICM kalitesi. Burada kalp fibroblastlardan MGT yapısı ile ICMS oluşturmak için kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir açıklama sağlar. Kalp fibroblastlar, yeniden programlama ve yeniden programlama sürecinin değerlendirilmesi için virüsün nesil izolasyonu da ICMS verimli ve tekrarlanabilir nesil için bir platform sağlamak için dahil edilmiştir.

Protocol

Burada özetlenen protokol yenidoğan fareler kullanır. Hayvan bakım ve deneyleri Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Bölümü Laboratuvarı Hayvan Tıp (DLAM), Chapel Hill tarafından kurulan kurallarına uygun olarak yapılmaktadır.

Tamponlar ve Medya 1. Hazırlık

  1. Fibroblast (FB) orta hazırlayın: 100 ml cenin sığır serumu (FBS) ve 6 ml penisilin / streptomisin, 500 ml IMDM ortamı Supplement.
  2. 100 ml M199 medya ve 50 ml FBS ile 400 ml DMEM ortamı Supplement: ICM ortamı hazırlayın.
  3. B27 ortamı hazırlayın: 10 ml B27 medya ile 490 ml RPMI1640 ortam Supplement.
  4. Plat-E kültür ortamı hazırlayın: 50 ml FBS, 5 ml penisilin / streptomisin ve 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler ile birlikte 500 ml DMEM ortamı Supplement.
  5. Plat-E transfeksiyon ortamı hazırlayın: 50 ml FBS ve 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler ile birlikte 500 ml DMEM ortamı Supplement.
  6. Prepare Jelatin 24 plaka kaplanmış 24 çukurlu bir levhanın bir oyuğuna 0.5 ml% 0.1 jelatin çözeltisi ekleme, kullanımdan önce en az 10 dakika karıştırıldı ve aspirat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  7. FACS markalama tamponu hazırlayın: 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere, 10 ml FBS ve 2 mi EDTA (0.5 M) ile birlikte 500 mi DPBS Supplement. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden geçirin.
  8. Tampon sıralama MACS hazırlayın: 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere 2,5 g BSA ve 2 ml EDTA (0.5 M) ile birlikte 500 mi DPBS Supplement. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden geçirin.
  9. Transfeksiyon için 2x HBS tamponu hazırlayın: 280 mM NaCI (8,1816 g), 10 mM KCI (0,37275 g), 1.5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glukoz ile 500 mL HEPES tamponu (50 mM) ek (1,08096 g ). 7.05-7.12 pH ayarlamak için yaklaşık 650 ul 10 N NaOH ekleyin. 4 ° C'da bir 0.22 mikron gözenek filtre ve mağaza üzerinden filtre.
  10. Transfeksiyon için 2.5 M CaCI2 çözeltisi hazırlayın: 18,376 g Ca ekleCl 2 50 ml GKD 2 O. 4 ° C'da bir 0.22 mikron gözenek filtre ve mağaza üzerinden filtre.
  11. ICC (immünositokimya) sabitleme tamponu hazırlayın:% 4 bir nihai konsantrasyon elde etmek 35 mi DPBS 5 mi paraformaldehid (PFA,% 32) ekleyin.
  12. ICC permeabilizasyon tamponu hazırlayın:% 0.1 bir son konsantrasyona ulaşmak için 100 ml DPBS 0.1 ml Triton ekleyin.
  13. ICC bloke tamponu hazırlayın:% 5 oranında bir nihai konsantrasyon elde etmek 100 mi DPBS 5 g sığır serum albümini (BSA) ilave edin.
  14. ICC boyama tamponu hazırlayın:% 1 bir son konsantrasyona ulaşmak için 100 ml DPBS 1 g BSA ekleyin.

Yenidoğan Fare Kardiyak Fibroblastları 2. Nesil

  1. Eksplant kültürü yöntemi kardiyak fibroblastlar oluşturun
    1. Temiz neonatal αMHC-GFP transgenik fare% 75 etanol ile (P2 P1). Steril makas ile kafasını kesti. Sonra diğer bir koltuk altından yatay bir kesi yapmak. Steril kullanınkünt ve bükülmüş forseps kalbini incelemek ve buz gibi soğuk PBS tampon içeren 24 plaka bir kuyuya yerleştirmek.
      1. Alternatif olarak, yatay kesi sonrası kalp dışarı sıkmak.
    2. Floresan mikroskop ile göbeğinde GFP ifade edin. GFP tanımı, bir kalp-spesifik promotör olmaktadır αMHC promotörü tarafından tahrik edilir yana negatif kalp herhangi bir floresan loş iken transgenik fare kalp yeşil 15 olmalıdır.
    3. 60 mm merkez kuyu kültür çanak içine 3-4 GFP pozitif kalpleri alın ve steril makas ve forseps ile küçük parçalar boyutu 1 mm'den az 3 içine kıyma.
    4. 2 ml FB medya ile bir adet 10 cm'lik çanak içine 3-4 kıyılmış kalpleri yerleştirin. Dokular 3 saat aşağı dinlendiriniz.
    5. Yavaşça kalp dokuları içeren yemekleri 8 ml önceden ısıtılmış FB medya ekleyebilirsiniz. Üç gün boyunca dokuların rahatsız etmeyin.
    6. Her üç günde medyayı değiştirin.
    7. Gün 7, aspir Onkültür ortamı yedik ve DPBS hücreleri yıkayın. Her plaka için 3 ml% 0.05 tripsin ilave edilir ve 5 dakika boyunca 37 ° C 'de özet.
    8. Tripsin gidermek için 5 ml FB Medya ekle. Yavaşça hücre kazıyıcı ile hücreleri ayırmak. Yukarı ve ileri mekanik doku ayırmak aşağı medyayı pipetle.
    9. Hücreleri toplamak ve kalp doku parçalarının kirlenmesini önlemek için 40 mikron hücre süzgeçler süzülmeye ve daha sonra 5 dakika boyunca 200 xg'de iplik pelet hücreleri.
    10. Yıkama hücreleri bir kez MACS tamponu ve hücreler sıralamak için hazırız.
  2. Enzimi sindirimi yöntemi kardiyak fibroblastlar oluşturmak
    1. Hasat GFP 2.1.1 olumlu kalpler. 10 ml buz gibi soğuk DPBS ile 10 cm'lik bir tabak içine bütün kalpleri aktarın.
    2. Kan kaldırmak ve buz gibi soğuk DPBS ile bir kez yıkayın steril forseps ile ventriküller sıkıştırın.
    3. Diğer doku ve yağ özgür olmak kalpleri Trim.
    4. Hala gevşek bağlanmış kabaca 4 parçaya her kalbi kesin.
    5. En az 20 kupa, 8 ml ılık% 0.05 tripsin-EDTA ile 15 ml konik bir tüp içine kalpleri aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      1. 20-30 kalpler varsa, 10 ml ılık% 0.05 tripsin-EDTA ile 50 ml konik tüp içine kalpleri aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    6. Tripsin atın ve HBSS ya da (20-30 kalpleri için) 10 ml ılık tip II kollajenin (0,5 mg / ml) (az 20 kalpleri için) 5 ml ilave edin.
    7. Vortex 4 ila 6 civarında bir hız seviyesinde 1 dakika boyunca vortexer tüp (sıvı kapağına kadar almazsa, o zaman hız gayet).
    8. 3-5 dakika boyunca, 37 ° C su banyosu içinde tüp inkübe edin.
    9. 1 dakika boyunca tüp vorteksleyin.
    10. Doku parçaları sakinleşene kadar yerçekimi ile 1 dakika boyunca sediment, 5 ml soğuk FB ortamı içeren yeni bir tüp içine sıvı toplamak.
    11. Tekrarlayın 2.2.6-2.2.10 3-5 kez yineleyin.
    12. 40 mikron hücre süzgecinden filtreleme tüm koleksiyonları birleştirintek bir hücre süspansiyonu yapmak.
    13. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
    14. Süspanse 10 ml MACS tamponu hücrelerinde ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje tabi tutulur.
    15. İsteğe bağlı: 1 ml RBC liziz tamponu (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, ve 0.1 mM EDTA) ile kan hücreleri, tekrar süspansiyon hücrelerinin bir yeri vardır, daha sonra 10 ml MACS ile seyreltilir, 1 dakika boyunca buz üzerinde tutulur tampon ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje tabi tutulur. MACS tamponu ile bir kez daha yıkanır.
  3. MACS tarafından Thy1.2 + fibroblast İzolasyonu (manyetik aktive hücre sıralama)
    1. Tripan mavisi ile canlı hücre sayısını belirler.
      1. Adım 2.2.14 10 ml'lik hücre süspansiyonu 10 ul hücreleri dışarı atın. 10 ul% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ile karıştırılır.
      2. Bir hemasitometre karışımı ekleyin. 3-5 dakika boyunca ayakta ve daha sonra mikroskop altında hemen incelemeye izin verin. Mavi ve canlı hücrelerde lekeli ölü hücreler boyanmamış bulunmaktadır.
        3. sayısı 4 x 10 10 (hücre süspansiyonu toplam hacmi) x.
    2. Az 1 x 10 7 hücreleri için, 90 ul 10 ul Thy1.2 mikro ile tekrar süspansiyon hücreleri MACS tamponu soğutulmuş. 1'den fazla x 10 7 hücre vardır orantılı ise daha çok boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca bir buzdolabı (2-8 ° C) 'de inkübe edilir.
    3. 10 ml MACS tamponu ve sıkma örnekler 5 dakika boyunca 200 xg'de ekleyin; Tekrar 10 ml MACS tamponu ve santrifüj ile bir kez yıkanır.
    4. MACS tamponu içinde 2 ml hacim getirin.
    5. Bir MACS ayırıcı kaputu ayarlayın. Ayırıcı bir LS sütun ekleyin. MACS sütun tampon 3 ml bunu dengelenmeye uygulayın.
    6. Dengelenmiş LS sütunu içinden hücre süspansiyonu geçirin.
    7. Her tampon, 2 ml MACS ile 3 kez yıkanır.
    8. T off LS sütun alınO Ayırıcı ve MACS yeni bir 50 ml tüp içine tampon 2 ml ile 3 kez Zehir.
    9. 5 dakika boyunca 200 xg'de Spin.
    10. 10 ml FB medyada yeniden süspanse hücreleri, hücre sayımı ve uygun yoğunlukta plakalara tohum. Eksplant kültürü yöntemiyle üretilen fibroblastlar için, tohumlama hücreler yoğunluğu 2-3 x 10 4 hücre / kuyu 24 plaka olabilir. Enzimi sindirimi yöntemi elde fibroblastlar için, hücreler yoğunluğu yaklaşık 4-5 x 10 4 hücre / kuyu 24 oyuklu plaka olabilir.

ICM yeniden programlanması için retrovirüsün 3. Nesil

Not: steril koşullar altında BSL2 Biyolojik Güvenlik kabinesinde aşağıdaki adımları uygulayın. Transfekte hücreler, pipet uçları ve tüplerin doğru atılması, çevre ve sağlık tehlikeleri riskini önlemek için tavsiye edilir.

  1. 1 ug / ml puromisin ve 10 ug / ml ile takviye edilmiş b Plat-E medya Plat-E hücreleri korumak% 5 CO2 ile 37 ° C 'de lasticidin.
  2. 2 gün, puromisin ve blastisidin eksik Plat-E kültür ortamı ile orta yerine.
  3. 0. günde, 10 cm'lik kaplar yaklaşık Transfeksiyondan bir önceki gün plaka başına 4-5 x 10 6 hücre içine Plat-E hücreleri bölme. Hücreler ~ transfeksiyon günü% 80-90 ortak akışlı olmalıdır.
  4. 1. gün önce transfeksiyondan 1 saat içinde hücreler üzerinde transfeksiyon medya değişiklik kültür ortamı. Şöyle transfeksiyon prosedürü şöyledir:
    1. Ticari kitler kullanılarak transfeksiyonu
      1. 20 ul transfeksiyon reaktifi (örneğin, Lipofectamine) ve 500 ul karıştırın düşük serum ortamı (örneğin, Opti-MEM). Serum medya azaltılmış bir 500 ul retroviral plazmid 10 mikrogram ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) her karışımın inkübe edin.
      2. Yavaş yavaş transfeksiyon karışımı plazmid karışımı ekleyin. Bu adım 15-30 sn sürebilir. (Çözelti bulanık görünebilir) oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı. Hücrelere bilge karışım damla ekleyin.
      3. Bir 37 ° C inkübatör içinde gece boyunca inkübe edin.
    2. Kalsiyum Fosfat ile transfeksiyonu.
      1. 40 ul 2.5 M CaCl2 ve 440 uL GKD 2 O, daha sonra retroviral plazmid 20 ug (toplam hacim 500 ul böylece GKD 2 O miktarını ayarlamak) ekleyin karıştırın.
      2. 15 ml konik tüp HBS 2x 500 ul ekleyin.
      3. HBS vorteks ve bu arada HBS Kalsiyum-DNA karışımı damla damla ekleyin. Bu adım, her numune için 30 saniye sürer. Yani maksimum eşzamanlı 3-4 örnekleri yok.
      4. Daha uzun bir zaman bir çökelti alacak daha geniş ve daha az çökelti hücrelere yol açar 3 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübasyon için inkübe edilir.
      5. Karışım hücrelere damla damla ve 20X mikroskop altında gözlemlemek ekleyin. İnce çökeltiler (küçük olanlar bir sürü iyi ama birkaç büyük olanları iyi değildir) görülmelidir.
      6. 37 ° C inkübatör gecede inkübe.
    3. 2 gün, kültür ortamı önceden ısıtılmış 8 ml hücreler üzerinde ortamı değiştirmek. 24 saat süreyle inkübe edin.
    4. Gün 3 ve 4. günde, 0.45 mikron gözenek boyutlu selüloz asetat filtre boyunca, 10 ml steril bir şırınga kullanılarak ve 50 ml'lik bir tüp içine aktarılarak yemekler kültür süpernatan toplamak. Her 8 ml virüs içeren süpernatan için retrovirüs çökeltme çözeltisinin 2 ml ilave edilir. Yavaşça karıştırın ve 4 ° C'de gece boyunca kuluçkaya yatmaktadır.
    5. 5. günde, 30 dakika boyunca 4 ° C'de 1500 x g'de viral karışımı dönerler. Viral parçacıklar tüpün alt kısmında beyaz pelet görünmelidir.
    6. Süpernatantı atın. 5 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme ile bir artık çözeltinin dönerler. Pelet Çöken retroviral parçacıklar rahatsız etmemek için büyük bir özen, aspirasyon yoluyla sıvının tüm izlerini silmek.
    7. Her 8 ml viral süpernatan için 100 ml DPBS tamponu ile retroviral pelet yeniden süspanse edin. TümbölenBuz üzerinde virüsü. Hemen kullanın veya -80 ° C'de saklayın.

    Kardiyak Fibroblastları 4. yeniden programlanması

    1. 10 ml ICM ortama 10 mg / ml polybrene solüsyonu 4 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe karıştırın. Polibren nihai konsantrasyonu 4 ug / ml'dir.
    2. Fibroblastlar ile tohumlanmış 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna 500 ul ICM ortam ihtiva eden polybrene ekleyin.
    3. Eksplant kültürü veya enzimi sindirimi yöntemi 4-5 x 10 4 hücrelerinden içeren her birini 2-3 x 10 4 hücrelere 10 ul retrovirüs ekleyin. Virüs miktarı orantılı olarak, farklı kültür plakaları ya da bulaşıklar için artmış bir hücre sayısı ile yükseltilmelidir. Viral enfeksiyon izin vermek için 24-48 saat için 37 ° C inkübatör plaka koyun. Kalp yeniden programlama için zaman çizgisi Şekil 1'de gösterilmiştir.
    4. Viral iletimi sonrasında 500 ul düzenli ICM medya ile virüs içeren medya değiştirin.
    5. 2-3 günde ortamı değiştirmek. Viral transduse hücreleri, pozitif seleksiyon için, hedef hücrelere 2 ug / ml'de puromisin ile desteklenmiş ICM ortamı eklenir. Üç gün boyunca tutun. Bundan sonra, 1 ug / ml konsantrasyonunda da ICM ortam içinde puromisin korumak.
    6. Üç gün viral enfeksiyondan sonra, inkübatör dışarı plaka almak ve GFP ifade gözlemlemek için bir ters floresan mikroskop (20X) altına yerleştirin.
      Not: On gün viral enfeksiyondan sonra, hücreler, FACS analizi ve yeniden programlama etkinliğini belirlemek için ICC analizi için hasat edilebilir (adım 5 ve 6).
    7. Ondört gün viral enfeksiyondan sonra, B27 medya ile ICM ortamı değiştirin. Her üç günde ortamı değiştirmek. Spontan dayak hücre loci üç (enzim sindirim yöntemi hücrelerin) veya viral transdüksiyon sonra dört (eksplant kültürü yöntemiyle elde edilen hücreler) hafta görünebilir.

    Yeniden programlanması Verimliliğinin 5. İmmünositokimyasal Analizi

    1. Durulayın hücrelerüç kez PBS soğuk buz ile; Fazla çözüm kaldırmak.
    2. 24 oyuklu plakalar, her çukuruna 0.5 ml ICC sabitleme tamponu ekleyin. 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreleri saptamak.
    3. PBS ile üç kez hücreleri durulayın.
    4. 24 oyuklu plakalar, her çukuruna 0.5 ml ICC permeabilizasyon tamponu ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreleri geçirgenliği.
    5. PBS ile üç kez hücreleri durulayın.
    6. 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna bloklama tamponu, 0.5 ml ICC ekleme, 1 saat süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir.
    7. ICC lekeleme tampon maddesi ile seyreltilmiş birincil antikorlar. De 200 ul her bir antikor çözeltileri ilave edin ve gece boyunca 4 ° C enkübe edilir. Antikor seyreltme faktörleri Malzeme listelenmiştir.
    8. Bir sonraki gün, PBS ile üç kez yıkama hücreleri.
    9. Hücrelere 200 ul ikincil antikor çözüm ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
    10. Üç kez PBS ile hücrelerin yıkayın.
    11. Solüsyonu her bir çukura DAPI içeren montaj 150 ul ekle. 1 dakika boyunca çekirdekleri leke izin verin. Daha sonrayuvarlak cam kapak slip ile her iyi kapak ve yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için bir forseps ile taban yüzeyine karşı kayma basın.
    12. Fazla solüsyonun aspire ve örnekler görüntüleme için hazırdır. D14 de ifade yeniden programlanan hücreleri kalp işaretleyici cTnT ve αActinin gösteren temsili resim Şekil 2B'de gösterilmektedir.

    Yeniden programlanması Verimliliği 6. FACS Analizi

    1. İyice DPBS ile bir kez yıkama hücreleri. Her oyuğa 0.3 ml tripsin (% 0.05) ilave edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Yavaşça hücreleri kaldırma kolaylaştırmak için plaka dokunun. Mikroskop altında hücre ayrışması edin. En hücreleri kesilerek zaman, her bir kuyucuğa 1 mi FACS tampon ekleyin. Pipet yukarı ve ileri mekanik hücreleri ayırmak için aşağı.
    3. Kuyuya bir 96 derin oyuklu plakaya 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücrelerin aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de Spin hücreleri toplamak için.
    4. Bir kez yıkayın hücreleriFACS tamponu.
    5. 4 ° C'de 20 dakika boyunca hücreler tekrar süspansiyon 100 ul sabitleme / permeabilizasyon çözümler ekleyin.
    6. 1x yıkama solüsyonu, pelet ile iki kez hücre yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
    7. 1x yıkama tamponu GFP ve cTnT karşı birincil antikor çözüm hazırlayın. İyice 50 ul antikor çözeltisi ile her bir örnek tekrar süspansiyon ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    8. 1x yıkama solüsyonu, pelet kez hücreleri yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
    9. Her bir örnek için Alexa Fluor 488 konjüge edilmiş eşek anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 647 konjüge edilmiş eşek anti-fare IgG içeren 50 ul ikincil antikor solüsyonu ilave. Karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
    10. 1x yıkama solüsyonu, pelet kez hücreleri yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
    11. 400 ul sabitleme tampon maddesi (% 1 PFA ile DPBS) içinde süspanse edin hücreleri. Hücre süzgecinden kapaklı FACS tüpü hücreyi aktarın. Numuneler, FACS tespiti için hazırdır. Yeniden programlama efficienc temsili FACS analiziy pMxs-puromycin MGT Şekil 2A gösterilmiştir veya puromisin seçimi olmadan inşa kullanarak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yeniden programlama adımlar. Şekil 1'de şematik özetlenmiştir MGT transdüksiyon sonra, hücreleri yeniden programlama GFP ifade gibi erken transduced hücrelerin 3. Puromycin seçimi 3 gün başlar ve ilk iki haftasında korunur gün olarak tespit olabilir eğer PMX-puro -MGT yapı kullanılır. Gün 14 10. günde, cTnT ve αActinin gibi kardiyak markerlerinin ifadesi başlangıç ​​fibroblastlar, bir kalp hücre doğru yeniden programlamayı geçiren belirten iki ICC (Şekil 2B, adım 5) ve FACS (Şekil 2A, adım 6) ile tespit edilebilir kader.

figür 1
Şekil 1:. Her bir zaman noktasında doğrudan kalp yeniden programlama işleminin şematik temsili prosedürler siyah kutular olarak tarif edilmektedir. Her etap için Kültür ortamları sürenin altında renkli kutular gösterilmektedirçizgi.

Şekil 2,
Şekil 2: FACS ve ICC tarafından değerlendirilir yeniden programlanması verimliliği MGT transdüksiyon sonra 10. günde taze fibroblastta üretilen ICMS (A) FACS analizi.. DAPI ile αMHC-GFP, kardiyak cTnT ve αActinin 2 hafta ICMS (B) boyanması (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Ölçek çubuğu: 200 mikron

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolü kullanarak başarılı ICM nesil için, genel verimliliği üzerinde bir etkiye sahip birkaç önemli faktör vardır. Özellikle başlangıç ​​fibroblast koşulları ve retrovirüs kodlama MGT kalitesini büyük ölçüde yeniden programlama verimliliğini etkileyebilir.

Mümkün olduğunca taze ve sağlıklı fibroblastlar oluşturmak için önemlidir. Eksplantlar yedi gün sonra tabaklara önce eksplant kültürü yöntemi için, fibroblastlar kullanılabilir. Enzimi sindirim yöntemi için, fibroblastlar gibi erken izolasyon ertesi gün olarak kullanılabilir. Dondurucu veya yeniden programlanmasına fibroblastlar pasaj tavsiye edilmez. Fibroblastlar Bu ek tedaviler önemli ölçüde yeniden programlama verimliliği azaltacaktır. Ekim yoğunluğu yeniden programlama verimliliği etkileyen önemli bir faktördür. Hücreler seyrek numaralı seribaşı varsa, bunlar düzensiz hücre morfolojisi ve büyük boyutta sağlıksız olma eğilimindedir. Nadiren coULD bu hücreler ICMS dönüştürülebilir. Hücreler çok yoğun bir şekilde ekilir ise, viral enfeksiyon için MOI (enfeksiyon çokluğu) azalır. Bulaşmamış fibroblast büyümesi önemli ölçüde böylece ICMS düşük bir oranda sonuçlanan yeniden programlama olayları sulandırır. Daha fazla hücre yeniden programlama için tohumlanır varsa Ayrıca arnavut benzeri bir morfoloji ile küçük hücrelerin ortaya çıkmasını edin. Bunlar neredeyse yeniden programlanması ve böylece azaltılmış yeniden programlama verimliliği neden olabilir. Doku kültür tabakları, farklı boyut için protokol değiştirirken, hücre sayıları tohum kültürü çanağı yüzey alanına orantılı olarak ayarlanacaktır önerilir.

Fibroblast saflığı yeniden programlama için kritik önem taşır. Fibroblast yüksek saflıkta biz burada anlatıldığı gibi FACS 15 veya MACS zenginleştirme sıralayarak ya elde edilebilir. FACS sıralama karşılaştırıldığında, MACS sıralama, kolay yumuşak ve daha rahat. MACS sonra hücre saflık% 90 w üzerinde ulaşabilirtavuk kesinlikle protokolü takip. Kirlenmiş hücreler fibroblastlar daha reprogrammed zordur çünkü fibroblast Düşük saflık yeniden programlama verimliliği azaltabilir ve yeniden programlayarak hücrelerden daha hızlı çoğalırlar söyledi. Aynı zamanda son derece doğru MACS sonra hücrelerin tohum ve geceleme tohumlama sonrası viral enfeksiyon gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Kriteri fibroblastlar, kısmen sadece çoğalan hücreleri enfekte eden retrovirüs alımını azaltır uzun bir süre için, çanak büyüdükten sonra yaşlanmış olabilir. Kuyruk ucu fıbroblastları (TTFs) ve embriyonik fibroblastlar (MEFS) 10,12,19,26 faktörleri diğer bazı transkripsiyon ile ICMS dönüştürülebilir bildirilmiştir. Bizim protokol burada sadece kalp fibroblastlar üzerinde duruluyor. Diğer fibroblast türlerine bu protokolün uygulama ayrıca dolayı böyle çoğalması, genetik durumu ve epigenetik simge olarak fibroblast imza doğasında varyasyonları için optimize edilebilir.

Thtransdüksiyon için retrovirüsün e kalitesi büyük önem taşımaktadır. Düşük titre virüsleri ICMS içine fibroblastlar dönüştürmek için başarısız. Oysa aşırı miktarda virüs doğrudan hücre ölümüne fibroblast neden sitotoksiteyi neden olur. Bu labaratuvar düzeneğinin yukarı ve deneysel koşullara bağlı olarak yeniden programlanması için viral doz virüs titresini belirlemek ve optimize etmek için gereklidir. Viral titrasyon için yöntem, tümüyle 23 daha önce tarif edilmiştir. Aslında Plat-E hücrelerinin büyümesi durumu ile doğrudan viral kalitesi ile ilgili olduğunu bulduk. Bu düşük geçiş (<30), her zaman Plat-E hücreleri çözülme için tavsiye edilir. Geçit üç elde edilen hücreler bir yoğunlukta 10 cm kültür çanak başına yaklaşık 4-5 x 10 6 hücre ambalaj virüs için en iyisidir. Buna ek olarak, taze hasat virüsler dondurulmuş virüs daha yüksek yeniden programlama verimi verir. Yeniden programlama verimi possib azalacak başka pMxs vektör tabanlı retrovirüs ile MGT virüsünün bu ko-enfeksiyon unutmayınAynı türden iki virüsler arasındaki rekabet nedeniyle ly. İki farklı transfeksiyon yöntemleri burada verilmiştir. Her iki yöntem de benzer retrovirüs üretir. Ticari Lipofektamin pahalı ama kararlı olsa da, kalsiyum fosfat ile transfeksiyon ucuzdur. HBS tampon hazırlanması HBS tamponu pH anlamlı transfeksiyon verimini etkiler çünkü çok dikkatli almak gerekiyor.

Ele alınması gereken bu protokolün bazı sınırlamalar vardır. Sınırlamalar biri kaçınılmaz olarak bio etkisiz kılar retrovirüsün kullanımı, yatmaktadır. Fibroblast heterojenliği ve izolasyon için belirli bir kalp fibroblast işaretleyici eksikliği de yeniden programlanabilir olan hücre saflık etkiler. Yeniden programlama verimliliği değişimi nedeniyle fibroblast durumuna ve virüs üretimi için doğal toplu değişkenliğe gözlenebilir. Buna ek olarak, yeniden programlanan hücreler kardiyak troponin T gibi sarkomer yapı proteinleri ifade rağmenve αActinin, onlar böyle kontraktilite ve elektrik yayılımı gibi fonksiyonel özellikleri ile karakterize olgun kardiyomiyositler hala vardır.

Özet olarak, burada açıklanan yöntem, tek bir yapı içinde E, G, T, transkripsiyon faktörlerinin retroviral olarak gönderilmesi göre ICMS verimli üretimi sağlar. Bizim protokol ICM araştırma için tekrarlanabilir ve değerli bir platform sağlar ve yüksek verimli tarama ve ICM yeniden programlama ve mekanik çalışmalar devam eden çabalarını kolaylaştıracak ve sonuçta klinik uygulamalara ICM yeniden programlama alanı yaklaşın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-cardiac troponin T Thermo Scientific MS-295-PO 1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFP Life Technologies A11122 1:500 for both FACS and ICC
anti- aActinin Sigma-Aldrich A7811 1:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43 Sigma-Aldrich C6219 1:500 for  ICC
anit-Mef2c Abcam ab64644 1:1,000 for ICC 
anti-Gata4 Santa Cruz Biotechnology sc-1237 1:200 for ICC
anti-Tbx5 Santa Cruz Biotechnology sc-17866 1:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Inc 711-545-152 1:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Inc 715-605-150 1:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining BD Biosciences 554722
Rhod-3 Calcium Imaging Kit Life Technologies R10145
Thy1.2 microbeads Miltenyi Biotec 130-049-101
Vectashield solution with DAPI Vector labs H-1500
FBS Sigma-Aldrich F-2442
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052
PRMI1640 medium Life Technologies 11875-093
B27 supplement Life Technologies 17504-044
IMDM Life Technologies 12440-053
Opti-MEM Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070
M199 medium Life Technologies 10-060
DMEM, high glucose Life Technologies 10-013
Penicillin-streptomycin Corning 30-002
Non-essential amino acids Life Technologies 11130-050
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668500
blasticidin Life Technologies A11139-03
puromycin Life Technologies A11138-03
Collagenase II Worthington LS004176
polybrene Millipore TR-1003-G
Triton X-100 Fisher BP151-100
CaCl2 Sigma-Aldrich C7902
HEPES Sigma-Aldrich H4034
NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
KCl Sigma-Aldrich PX1405
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
Glucose Sigma-Aldrich G6152
Bovine serum albumin Fisher 9048-46-8
paraformaldehyde EMS 15714
Retrovirus Precipitation Solution ALSTEM VC-200
0.4% Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
gelatin Sigma-Aldrich G1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x) Sigma-Aldrich D8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Corning 21022
LS column Miltenyi Biotec 130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter  Thermo Scientific 190-2545
24-well plates Corning 3524
10 cm Tissue culture dishes  Thermo Scientific 172958
60 mm center well culture dish   Corning 3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well Plate Denville Scientific P9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
Centrifuge Eppendorf 5810R
Vortexer MINI VWR 58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging System Life Technologies AMAFD1000
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Round glass cover slip Electron Microscopy Sciences 72195-15

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577 (2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 105 Kardiyak fibroblast doğrudan yeniden programlama ICM kardiyomiyositler Mef2c Gata4 Tbx5 MGT polisistronik yapı.
Gata4, Mef2c ve Tbx5 Optimal Oranı ifade bir polisistronik Construct kullanma Kaynaklı kardiyomiyositlerde Geliştirilmiş Nesil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou,… More

Wang, L., Liu, Z., Yin, C., Zhou, Y., Liu, J., Qian, L. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. J. Vis. Exp. (105), e53426, doi:10.3791/53426 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter