Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Protokoller til analyse af rolle Paneth Celler i Regenerating de murine Tarm hjælp Betinget Published: November 21, 2015 doi: 10.3791/53429
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1European Cancer Stem Cell Research Institute, Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

Tarmepitel stamceller (HTT) er blandet med Paneth celler. Disse celler er differentieret afkom af ISC, som støtter individuelle og fælles give antibakteriel beskyttelse. Her viser vi, hvordan vi anvendte transgene betingede musemodeller at fastslå, at Paneth celler spiller en afgørende rolle i at opretholde tarmens epitel.

Abstract

Epiteloverfladen pattedyr-tyndtarm er et dynamisk væv, der fornyer hver 3 - 7 dage. Forståelse denne fornyelsesproces identificeret en befolkning på hurtigt at cykle tarm stamceller (HTT) er kendetegnet ved deres udtryk af Lgr5 genet. Disse er understøttet af en hvilende stamceller population, kendetegnet ved Bmi-1-ekspression, er i stand til at erstatte dem i tilfælde af skade. Undersøgelse samspillet mellem disse populationer er afgørende for at forstå deres roller i sygdomme og kræft. De individuelle servicekontrakter eksistere inden krypter på tarmens overflade, disse nicher understøtter ISC i påfyldning af epitel. Samspillet mellem aktive og rolige individuelle servicekontrakter sandsynligvis involverer andre differentierede celler i den niche, som det tidligere er blevet påvist, at '' stemness '' af Lgr5 ISC er tæt knyttet til tilstedeværelsen af deres nabolande Paneth celler. Brug af betinget cre-lox musmodeller testede vi virkningen af ​​at slette de fleste aktive ISC i nærvær eller fravær af Paneth celler. Her beskriver vi de teknikker og analyser gennemført for at karakterisere tarmen og vise, at de Paneth celler spiller en afgørende rolle i ISC niche i at hjælpe inddrivelse efter betydelig fornærmelse.

Introduction

Den luminale overflade af pattedyr-tyndtarm funktioner gentagelsesenheder af krypter og finger fremspring, betegnet villi, som rager ind i hulrummet. Denne overflade er en kontinuerlig plade af epitel, der undergår fuldstændig selvfornyelse ca. hver 3 - 4 dage 1. Denne dynamiske væv understøttes af en population af kort cyklustid stamceller (HTT; også kendt som krypt basen søjleformede celler), som oprindeligt blev identificeret ved deres ekspression af genet Lgr5 2,3. Eksisterer disse celler i en niche i bunden af ​​krypterne af Lieberkuhn. I første omgang, den opdagelse, at indgå individuelle servicekontrakter blev hurtigt cykling var uharmonisk med den fremherskende idé om, at en stamcelle var inaktiv i naturen. Forud for identifikation af Lgr5 + ISC det blev postuleret, at en population af hvilende etiket fastholde cellerne på fire stilling i forhold til bunden af krypten, var ISC 1. Nyere forskning hsom nu forenes disse observationer ved at demonstrere, at primært er der en pulje af ækvipotent cykling individuelle servicekontrakter i hvert krypten hvis skæbne er reguleret af sine naboer 4,5. I tilfælde af, de er tabt disse kan erstattes af hvilende celler, der normalt er forpligtet til det sekretoriske afstamning, men kan gå tilbage til individuelle servicekontrakter, hvis ISC befolkning er beskadiget 6.

ISC naboer kan enten være individuelle servicekontrakter eller deres datterceller. De individuelle servicekontrakter producerer naive datterceller, som formerer sig og differentierer i de specialiserede celletyper, der omfatter epithelial ark, som linjer tarmlumen 1. Pokalen, enteroendokrin, enterocytter, tot og M celler migrerer opad til den luminale overflade, hvor de giver forskellige absorberende og regulerende funktioner, men forbliver Paneth celler i bunden af ​​krypten, hvor de findes blandet med individuelle servicekontrakter. I de senere år er det blevet vist, at en del af det naive daughtER celler bestemt til en sekretorisk afstamning er hvilende etiket fastholde Lgr5 lo celler er i stand til at vende tilbage til en ISC efter skade 6,7.

På grund af sin betydning i krypt regenerering prioriteres blev placeret på at forstå samspillet mellem individuelle servicekontrakter og dets naboer, især Paneth cellerne. De Paneth celler spiller en afgørende rolle i den niche, der understøtter ISC 8. Udover bakteriedræbende produkter de Paneth celler producerer signalmolekyler, der aktiverer de veje, der styrer ISC fornyelse eller differentiering. Tidligere undersøgelser viste, at Lgr5 + individuelle servicekontrakter kunne kun eksistere, når de kunne konkurrere om vigtige niche signaler, som deres datter Paneth celler 8. Disse studier undersøgte rolle Paneth celler på normal Lgr5 + individuelle servicekontrakter og ikke i en situation, hvor de er beskadiget og kræver genopfyldning fra en Lgr5 lo befolkning.

9,10. Ofte disse modeller anvender cre-lox-teknologi til betinget ændre gen (er) 9,10. Cre (Årsager rekombination) rekombinase er et site specifik rekombinase af integrase familien, isoleret fra bakteriofag P1. Cre katalyserer stedspecifik rekombination mellem definerede 34 bp ' Lox P '(locus χ af crossover P1) sites. Mus er genetisk manipuleret til at indeholde loxP-sites, som flankerer områder af interesse, der ved ekspression af Cre-rekombinase udskæres. Sammenkædning ekspressionen af Cre-gen til en celle eller udviklingsmæssig specifik promotor muliggør ændringer der skal foretages i en rumlig mode 9,10, dette er især nyttig i at overvinde embryonale letale mutationer. At knytte Cre-ekspression til en receptor pathway,der kan aktiveres kunstigt, tillader tidsmæssige ændringer.

Ved hjælp af denne teknologi, vi inaktiverede CatnB genet 11 i den intestinale epitel. β-catenin, at CatnB genproduktet, er en vigtig regulator af den kanoniske Wnt signalvej, som regulerer ISC homeostase. To tidligere undersøgelser ved hjælp af denne strategi modstridende resultater 12,13. Undersøgelsen fra Fevr et al. 12, viste tab af stamceller og intestinal homeostase. Henviser til, at Irland et al. 14 undersøgelse rapporterede, at efter en reduktion i cellernes levedygtighed krypten-villus aksen blev genopbyggede fra vild type celler, der udtrykker CatnB. Den største forskel i disse studier var initiativtageren anvendes til at udtrykke Cre i tarmens epitel. Den Fevr et al., Undersøgelse benyttede villin genpromotor forbundet med østrogenreceptoren, som kan aktiveres ved at administrere tamoxifen (will-Cre-ER T2) 15,16. I modsætning Irland et al., Anvendt promotorelementet af rotte cytochrome P450A1 (CYP1A1) genet til at drive Cre-ekspression som reaktion på de xenobiotiske β-naphthoflavon (Ah-CRE). Kendetegnene for disse forskellige systemer genereret to hypoteser for at tage højde for disse forskellige observationer. Det første, at CatnB mere effektivt slettes i ISC hjælp af vIL-Cre-ER T2 systemet i forhold til Ah-cre, hvorved antallet af ISC til sub-genudsættelse niveauer. Alternativt var det på grund af forskelle CatnB deletion i differentieret cellepopulation. De vIL-Cre-ER T2 systemets mål alle epitelceller i krypten og villus henviser Ah-cre systemet er kun rettet mod de ikke-Paneth celler af ISC niche og krypt. Disse systemer forudsat ideelle værktøjer til at undersøge Behavior af individuelle servicekontrakter og deres samspil med Paneth cellerne. Her præsenterer vi flere detaljerede protokoller baseret på, hvor vi anvendte disse systemer at fastslå, at Paneth celler spiller en afgørende rolle ved mediering af den intestinale respons på skade 17.

Protocol

Oplysninger om alle anvendte materiale er angivet i tabel 1. Alle dyreforsøg blev udført under ledelse af en britiske indenrigsministerium projekt licens.

1. CatnB Sletning ved hjælp af Ah-CRE og Vil-Cre-ER T2 Systems

  1. Kryds mus stammer til at generere 10-14 uger gamle kohorter af Ah-cre + CatnB + / +, Ah-cre + CatnB FLOX / FLOX, will-Cre-ER T2 CatnB + / + og will-Cre-ER T2 CatnB FLOX / FLOX. For visuel analyse af rekombination, via en β-gal plet, bør kohorter indeholde Rosa26R-lacZ reporter 17. Kohorter bør kontrollere for tilstedeværelsen af ​​modificerede gener og brug af induktion stoffer, bør størrelsen af ​​kohorter kræves estimeres ved hjælp af en magt-analyse.
  2. At inducere Ah-CRE transgen forberede β; -Naphthoflavone (BNF) eller for vIL-Cre-ER T2 transgen tamoxifen (TAM) i majsolie til opnåelse af en brugsopløsning på 10 mg / ml. BEMÆRK: Agenterne skal afvejes i et stinkskab anvendelse af passende personlige værnemidler.
  3. Heat løsninger i en ravfarvet flaske (BNF er lysfølsomt) til enten 99,9 ° C i BNF eller 80 ° C for TAM i et vandbad.
  4. Overførsel til en opvarmet omrører indstillet på 100 ° C i BNF eller 80 ° C for TAM og omrør i 10 minutter.
  5. For BNF gentage 1,3-1,4 indtil opløsning (kan tage> 1 time).
  6. Portion i små gule flasker (~ 5 ml) og derefter fryse ved -20 ° C. Flasker skal kasseres efter 3 fryse / tø cykler. Forud for anvendelse tø midler og opvarmning til passende temperaturer, hvis de er faldet ud af opløsning. Afkøles til <37 ° C før injektion.
  7. Injicere mus intraperitonealt (IP) med en dosis på 80 mg / kg, for eksempel en 25 g mus modtager 0,2 ml af appropriate induktion middel. For Ah-CRE leverer tre injektioner i 24 timers periode, will-Cre-ER T2 giver én injektion per dag i 4 dage.

2. Dissektion af Tarm til Reporter Visualisering og Immunohistokemi (IHC)

  1. Aflive musen ved hjælp af cervikal dislokation uden forudgående bedøvelse i overensstemmelse med etiske godkendelse. Placer musen i rygleje og våd pelsen anvendelse af 70% EtOH, åbne intra-peritoneale hulrum i længderetningen langs midterlinjen ved hjælp af en saks.
  2. Fastgør maven med en pincet og skille forbindelsen til spiserøret. Fjern tyndtarmen op til appendiks ved forsigtigt at trække på maven. Fjern tyktarmen op til anus ved forsigtigt at trække i tillægget.
  3. Når tarmene er blevet isoleret fjerne maven og tillæg. Skyl tarme med 1x PBS ved hjælp af en sprøjte med en stump ende pipettespids. BEMÆRK: Hver tarmen skal være immediately forarbejdet til en af de efterfølgende anvendelser er beskrevet nedenfor.

3. formalinfiksering af Tarmen

  1. Skær blussende tarmen i 3 lige store sektioner og etiket proksimal, midterste og distale. Skær hver sektion i 1 cm stykker. Tag en lille strimmel af kirurgisk tape 2 cm x 2 cm. Placer tre til fem stykker på 1 cm på midten af ​​den kirurgiske bånd i en pyramide formation.
  2. Luk og forsegle tape rundt brikkerne i længderetningen, for at give en "log bunke" effekt. Placer væv i en fladbundet beholder, der indeholder et stort overskud af neutral bufret formalin fiksativ, mindst 10x mængden af ​​fiksativ til mængden af ​​væv. BEMÆRK: Undgå at placere overskydende mængder af væv i et rør til fiksering, opdele det i flere beholdere.
  3. Anbring prøverne ved 4 ° C i mindst 18 - 24 timer før indlejring og sektionering. For at forhindre tab af nukleart β-catenin, do not fix ud over 24 timer.Efter fiksering overførsel væv til en fladbundet beholder, der indeholder et stort overskud af 70% EtOH, mindst 10x volumen af ​​væv.

4. Methacarn Fiksering af Tarmen

  1. Forud for dissektion fremstille Methacarn fiksativ ved at kombinere 300 ml MeOH, 150 ml chloroform og 75 ml iseddike (4: 2: 1). Skær blussende tarmen i 3 lige store sektioner proksimale, midterste og distale.
  2. Placer hvert stykke tarmen ved siden af ​​hinanden på et stykke filtrerpapir (15 cm x15 cm) og ved hjælp af en springbow saks åbne det op 'en ansigt'. Placer tarmen og filtrerpapir over i en glasskål indeholdende Methacarn for 3 - 24 timer ved stuetemperatur. Efter fiksering afhente slutningen af ​​en tarm afsnit ved hjælp af en pincet.
  3. Vind tarmen omkring pincet til at danne en "roulade" og fastgør roll ved let at åbne pincet og lægge en 25 G nål gennem det. Placer væv i en fladbundet beholder indeholdende a laRGE overskud af neutral bufret formalin fiksativ, mindst 10x mængden af ​​fiksativ til volumenet af væv og opbevares i mindst 1 time, før man går videre til behandling.

5. Hele Mount LacZ Visualisering (Modificeret fra El Marjou et al. 18)

  1. Forbered voks plader ved at kombinere smeltede ralwax med mineralolie på 10: 1. Hæld i 15 cm petriskåle og lad den køle. Forbered X-gal fiksativ som pr tabel 1 og gemme på is.
  2. Fjern hele tarmen og skyl igennem med iskoldt 1x PBS, som anført i afsnit 2. Fix tarmen ved at skylle med 25 ml iskold X-gal fiksativ.
  3. Ved hjælp af en saks skære tarmen i 3 - 5 lige store dele (maksimalt 5 pr plade). Placer hver sektion på voks plade og pin ned hver ende, så afsnittet er lidt strakt med mesenterial linje øverst; trim eventuelt overskydende mesenterium. Ved hjælp af en springbow saks klippe tarmen på langs og pin ud undervejs.60;
  4. Oversvømme plade med X-gal fiksativ til dækning af sektioner og efterlade mindst 1 time ved 4 ° C. Fjern X-gal fiksativ anvendelse af en 25 ml pipette og vaskes en gang med 30 ml 1x PBS. Cover sektioner med 30 ml DTT demucifying løsning for 30 - 60 minutter ved stuetemperatur, helst på en vippende platform.
  5. Fjern demucifiying løsning med en 25 ml pipette og oversvømme pladen med 30 ml 1x PBS. Ved hjælp af en Pasteur-pipette vaske tarmen sektioner med 1x PBS i pladen for at fjerne slim.
  6. Fjern 1x PBS med en 25 ml pipette og skylles med 30 ml X-gal farvning. Inkuber natten over ved stuetemperatur i mørke under forsigtig omrøring på en vippende platform.
  7. Efter inkubation natten over kontrollere, at sektionerne har udviklet en blå / grøn plet, hvis baggrundsfarven stadig hvidt, kan tilsættes frisk farvningsopløsning og overvåges Til farvning udvikles. BEMÆRK: Når sektioner har farves derefter ingen yderligere farvning kan forsøges.
  8. Fjern X-gal farvninganvendelse af en 25 ml pipette og oversvømmelse plade med 30 ml 1x PBS og henstår i 3 min med forsigtig omrøring. Fjern nedenfor og afhente, med pincet, i slutningen af ​​en tarm sektion. Vind tarmen omkring pincet til at danne en "Swiss roll", fastgøre roll ved let at åbne pincet og lægge en 25 G nål gennem det.
  9. Placer væv i en bred mund fladbundet beholder, der indeholder et stort overskud af neutral bufret formalin fiksativ, mindst 10x mængden af ​​fiksativ til mængden af ​​væv. Anbring prøverne ved 4 ° C i mindst 24 timer forud for indlejring og sektionering.

6. Udvinding af Cryptocoryner fra Tarm

  1. Isoler de første 20 cm af tyndtarmen, som anført i afsnit 2. Placer tarmen på en ren dissekere overflade og ved hjælp af en pincet og sakse fjerne enhver vedhæftet fedt / mesenterium. Ved hjælp af en saks springbow åbne tarmen på langs.
  2. Anvendelse af et mikroskop dækglas, firmly skrabe tarmlumen at fjerne villi og slim. Ved hjælp af en saks skære tarmen i ~ 5 mm stykker og overføres til en 50 ml rør med 25 ml 1x HBSS suppleret med penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 U / ml).
  3. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern antibiotikummet holdige medier ved at passere prøverne gennem en 70 um cellefilter.
  4. Placer tarm sektioner i en frisk 50 ml rør indeholdende 10 ml 1x HBSS og sæt hætten.
  5. Vend forsigtigt to gange og fjerne 1x HBSS ved passage gennem en 70 um cellefilter. Yderligere vaske tarm stykker ved at gentage 6,4 & 6,5 tre gange, og sikre, at den endelige fraktion er forholdsvis klar.
  6. Overfør væv til et frisk 50 ml rør indeholdende 10 ml EDTA (8 mM) / 1x HBSS og henstår ved stuetemperatur i 5 min. Rystes kraftigt (20 - 30x) eller vortex, passere gennem en 70 um cellefilter og overførsel væv brikker til en frisk 50 ml rør indeholdende EDTA (8 mm) / 1x HBSS. NOTE:Gennemstrømningen kan enten kasseres eller bevares, hvis analyse af villi epitel er påkrævet.
  7. Inkubér vævsstykker på is i 30 minutter, rystes prøven kraftigt (20 - 30x) eller vortex. Før prøverne gennem en 70 pm cellefilter og fastholde strømmen gennem, da dette indeholder krypter.
  8. Overfør vævsstykkerne til et frisk 50 ml rør indeholdende 10 ml 1x HBSS. Rystes kraftigt (20 - 30x) eller vortex, passerer gennem en 70 um cellefilter og fastholde gennemstrømningen. Gentag en gang mere for at sikre maksimal genvinding af krypter fra tarm stykker. Kombiner strømmen gennem fraktioner og centrifugeres ved 300 xg i 5 min. Hæld supernatanten og fastholde krypten pellet. BEMÆRK: Pellets kan umiddelbart anvendes til dyrkning (hvis relevant) eller opbevares ved -80 ° C forud for standard DNA / RNA / protein ekstraktionsprocedurer.

7. Standard Immunohistokemisk Visualisering

  1. Skær 5 μm sektioner af paraffinindlejret væv på poly-L-lysin (PLL) glider. Bemærk: En standardprotokol for farvning med en B-cateninantistof er angivet nedenfor, er parametre for andre antistoffer angivet i tabel 2.
  2. De-voks med 2x 3 min vaske i slide bade indeholder frisk xylen. Rehydrere ved at lede objektglas i 3 minutter ved slide bade indeholdende friske: 100% EtOH (2x), 95% EtOH og 70% EtOH og endelig i 1 x PBS.
  3. Glassene anbringes i et bad indeholdende slide citratbuffer (pH 6) og opvarmes 99,9 ° C i 20 minutter for at hente antigener. Lad dias til afkøling og derefter vaske 3 x 5 min i et dias bad indeholdende 1xTBS / T i 5 min. Fjern slides fra sidste vask straks trækker omkring væv med en PAP pen, og afdækningsprofil med en kommerciel peroxidase blok eller 1,5% H 2 O 2 (i destilleret H2O).
  4. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur (RT) og vask derefter 3x i slide bade indeholdende frisk 1x TBS / T for 5 min. Efter vasking cover sektioner ved hjælp af en pipette, i 5% normalt kaninserum (NRS) / 1xTBS / T i 30 minutter ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik binding af hydrofobe din primære antistof.
    1. Fjern NRS blok med en Pasteur-pipette og dække afsnit i B-catenin primære antistof fortyndet 1: 200 med 5% NRS. Vask slides til 3x 5 min i slide bade indeholder friske 1xTBS / T. Bemærk - andre antistoffer vil kræve optimering til fortynding og specificitet. For at sikre specificitet af et antistof, bør passende ingen antistof og isotypekontrol pletter skal udføres. En isotypekontrol er tilpasset til værten arter og isotypen af ​​din primære antistof.
  5. Visualisere med enten et kommercielt HRP afsløring kit eller med en passende fluorescensmærket sekundært antistof (tabel 2). BEMÆRK: Længden af ​​udviklingen er forskellig for hvert antistof, for β-catenin 10 - 15 sek er normalt tilstrækkeligt. For at optimere udvikling for et antistof første establish hvor lang tid, der kræves til at visualisere positive celler ved hjælp af en positiv slide kontrol og derefter anvende det til alle efterfølgende dias.
  6. Vask slides til 3x 5 min i slide bade indeholder frisk TBS / T. Kontrastfarve lysbilleder ved at nedsænke i et dias bad indeholdende hæmatoxylin for ~ 45 sek (kræves ikke, hvis du bruger fluorescensmærkede sekundære antistoffer). Sæt glider i et rent objektglas bad og skyl med rindende vand i ~ 1 minut, sikre hæmatoxylin ikke er fuldstændigt udvaskes.
  7. Dehydrere slides ved at passere gennem slide bade indeholdende stigende koncentrationer af alkoholer; 1x 30 sek i 70% EtOH, 1x 30 sek i 95% EtOH, 2x 30 sek vaske i 100% EtOH, 2x 2 min i xylen.
  8. Mount glider under et dækglas anvendelse af et kommercielt montering medier. BEMÆRK: Hvis du bruger fluorescens mærket antistof montere med et medie, der indeholder DAPI at mærke kernen.

8. Histologisk Identifikation af Specific Intestinal epitelceller

  1. Enterocytter
    1. Forbered sektioner ved hjælp af § 7 med villin antistof og betingelser, der er beskrevet i tabel 2.
  2. Entero-endokrine celler (Grimelius plette 18,19).
    1. Forbered sektioner ved at følge trin 7,1-7,2. Vask glider i et dias bad, der indeholder ultrarent vand i 3 min. Overfør objektglassene til et objektglas bad indeholdende forvarmet sølvopløsning (tabel 1) og inkuberes ved 60 ° C i 3 timer.
    2. Fjern dias fra den sølv løsning og sted i et dias bad indeholdende nylavede forvarmet reducering løsning (tabel 2) ved 45 ° C i 3 min. Fjern dias og anbringes i et dias bad, der indeholder frisk ultrarent vand i 3 min. Følg trin 7,6-7,8 fra afsnit 7.
  3. Bægerceller (Alcian blåsplint).
    1. Forbered sektioner ved følgende trin 7,1-7,2 .. Overfør dias til et dias bad indeholdende Alcian Blue pH 2,5 i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern Alcian blå pletten med en pipette og sted slide bad under vandhanen i 3 - 5 min. Følg trin 7,6-7,8. BEMÆRK: Alcian blå opløsning kan opbevares til senere brug.
  4. Individuelle servicekontrakter.
    1. At identificere de individuelle servicekontrakter følge § 9.
  5. Paneth celler.
    1. Forbered sektioner følgende afsnit 7 ved hjælp af lysozym antistof og betingelser, der er beskrevet i tabel 2.

9. In situ RNA Detection med de murine Tarmen 19-21

  1. Placer 5 um sektioner fra formalinfikseret tarmen (afsnit 3) på PLL dias. Forbered en lineariseret digoxigenin mærket RNA-probe til påvisning Olfm4 udtryk 21. Afvoksning og rehydrere sektioner pr afsnit 7. BEMÆRK: Denne protokol skal udføres i et RNAse frit miljø for at forhindre nedbrydning af RNA-probe.
  2. Tegn rundt tproblem med en PAP pen til at minimere reagenser. Inkuber sektioner i et dias bad med 6% H 2 O 2 (i destilleret H2O) i 30 min. Vask to gange i et dias bad med frisk 1x PBS i 3 min. Kassér 1x PBS og ved hjælp af en pipette, dække sektion med 4% paraformaldehyd i 20 min på is.
  3. Vask to gange i et dias bad med frisk 1x PBS i 3 min. Ved hjælp af en pipette dækker sektioner med proteinase K løsning i 5 min vask i et dias bad med frisk 1x PBS i 3 min. Anvendelse af en pipette post-fix sektioner ved at dække i 4% paraformaldehyd i 5 minutter ved stuetemperatur.
  4. Vask i et dias bad med DEPC behandlet H 2 0 i 2 min. Ved hjælp af en pipette cover sektioner i eddikesyreanhydrid opløsningen i 10 minutter under omrøring. Vask i en slide bad med frisk 1x PBS / 3 min, efterfulgt af 1x saltvand / 3 min. Pass glider gennem bade indeholdende stigende koncentrationer af alkoholer; 1x 30 sek i 70% EtOH, 1x 30 sek i 95% EtOH, 2x 30 sek vaske i frisk 100% EtOH,2x 2 min i frisk xylen og lad det lufttørre.
  5. Fortynd Olfm4 probe 1: 100 i hybridiseringsbuffer og denaturere probe ved opvarmning til 80 ° C i 3 min. Påfør 100 ul sonde til hvert afsnit og dækker med parafilm at undgå dehydrering af slæden. Inkuber natten over i et mørkt, fugtigt kammer ved 65 ° C.
  6. Vask i et dias bad med 5 x SSC ved 65 C i 15 min. Vask sektioner i et dias bad to gange med friske 50% formamid / 5 x SSC / 1% SDS i 30 minutter ved 65 ° C. Vask sektioner to gange i et dias bad i frisk PBT i 10 minutter, den første ved 65 ° C og den anden ved stuetemperatur. Ved hjælp af en pipette cover sektioner med PBT indeholdende 25 ug RNAse i 45 minutter ved 37 ° C. Vask sektioner i et dias bad i PBT i 5 minutter ved stuetemperatur.
  7. Vask sektioner i et dias bad to gange med friske 50% formamid / 5 x SSC i 30 minutter ved 65 ° C. For at blokere, cover sektioner ved hjælp af en pipette med 10% får serum i PBT og opbevares i en mørk, moist kammer ved stuetemperatur i 2 - 3 timer.
  8. Forbered antistof ved fortynding anti-digoxigenin-alkalisk phosphatase-konjugeret antistof ved 1: 500 med 10% fåreserum i PBT indeholdende 5 mg / ml muse intestinal pulver. Der inkuberes i 3 timer ved 4 ° C i mørke på en vippende platform. Spin ned for at fjerne overskydende intestinal pulver og tilføj 3x volumener 1% fåreserum i PBT til supernatanten.
  9. Fjern blok fra dias med en pipette, og 100 pi af antistof-opløsning til hver sektion, dække med parafilm og inkuber i et mørkt, fugtigt kammer ved 4 ° C natten over. Vask sektioner i et dias bad 3 × med frisk PBT i 5 min. For at blokere sektioner vaske i et dias bad 3 × med frisk NTMT buffer i 5 min.
  10. At visualisere ved hjælp af en pipette dækker hver sektion med BM lilla og inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 24 - 72 timer, indtil en tilstrækkelig stærk farve udvikles. Vask sektioner i et dias bad en gang i PBT og modfarve ved nedsænkning i eosin i 1 min. Remove overskydende eosin ved vask sektioner i et dias bad under en rindende vand i 3 - 5 min. Fordybe dias i xylen og lad det lufttørre. Monter under et dækglas hjælp kommercielle medier.

10. Histologisk Karakterisering af intestinal epitel

  1. Placer 5 um sektioner fra den faste væv (afsnit 3 & 4) på ​​PLL dias. Analyser ≥25 tilfældige hele (eller halve ≥50) krypter fra ≥ 4 mus i hver gruppe for hver af de følgende parametre. BEMÆRK: For at bevare sammenhængen analysere krypter fra samme sted på hver tarmen (brug kun den proksimale ende).
  2. Cellulære parametre fra standard H & E-farvede sektioner (medmindre andet er angivet): Crypt nummer, højde, apoptose og mitose.
    1. Crypt nummer.
      1. Bruge en lav forstørring (f.eks 4X eller 10X) for manuelt at tælle antallet af krypter i kontakt med det basale lag. Tæl ≥10 tværgående proksimale tarm sektioner fra mindst 4 mus.
    2. Crypt højde.
      1. Brug en stor forstørring (f.eks 20X eller 40X) for manuelt at tælle antallet af celler fra bunden af krypten til krypten / villus akse (3b figur).
    3. Apoptose 22, 23.
      1. Metode 1: Brug en høj effekt forstørrelse (f.eks 20X eller 40X.) Til manuelt at tælle antallet af apoptotiske celler i hver krypt. Apoptotiske celler kan identificeres ved celleskrumpning, chromatinkondensering, dannelse af cytoplasmiske bleb'er og apoptotiske legemer (figur 3A).
      2. Metode 2: Udfør en IHC-farvning (afsnit 7) for caspase-3 under anvendelse af betingelser beskrevet i tabel 2 Brug en stor forstørring (f.eks 20X eller 40X.) Manuelt at tælle antallet af positive celler i hver krypt at kvantificere cellerne i. udførelse fase af apoptose.
    4. Mitose. Brug en stor forstørring (f.eks 20X eller 40X) for manuelt at tælle antallet af mitotiske celler i hver krypt. Mitotiske celler indeholder kondenseret DNA-materiale og er typisk symmetrisk og velformede (figur 3b).
  3. Proliferation.
    1. Udfør en IHC (afsnit 7) pletten for Ki-67 under anvendelse af betingelser beskrevet i tabel 2. Tæller manuelt positive celler for at kvantificere andelen af kryptceller prolifererende.

Representative Results

Sammenligning ISC rekombinationseffektivitet i Ah-CRE og VIL-Cre-ER T2 Systems

Anvendelse af disse cre-lox-systemer til evaluering rolle Paneth celler, i genbefolkning tarmen efter skader, kræves karakterisering af effektiviteten af rekombination inden for ISC. Brug af Rosa26R-lacZ reporter betingede vi vist, at i begge systemer 3 dage efter induktion (dpi) der er ~ 100% rekombination i tyndtarmen (figur 1a). Kvantificering af tilstedeværelsen af rekombineret allel af qPCR blev forstyrret af forskellene i Cre ekspressionsmønstre mellem systemerne. Den will-Cre-ER T2 systemet viste en 3,53 ganges forøgelse i nærværelse af rekombineret allel sammenlignet med Ah-cre systemet på grund af dets ekspression i en større andel af epithelien 16. For at overvinde dette vedtog vi en anden strategi, der gav os mulighed for direkte at sammenligne systemerne. Vi inducerede musene med forskellige induktion regimer og analyseret ved 30 dpi, på hvilket tidspunkt LacZ positive krypter og villus udgør en ISC rekombinationshændelse. Anvendelse af denne fremgangsmåde vi vist, at i begge systemer, 3 injektioner af inducerende middel (leveret IP ved 80 mg / kg i 24 timer), rekombinerede i et tilsvarende antal individuelle servicekontrakter trods indledende rekombination niveauer er langt større i will-Cre-ER T2 systemet 16 (figur 1b-d). Endvidere anvendelse af DNA ekstraheret fra de rekombinerede krypter, qPCR for de rekombinerede alleller viste en ikke-signifikant stigning i rekombination ved hjælp af vIL-Cre ER T2 systemet, potentielt på grund af rekombination i Paneth cellerne ikke observeret ved anvendelse af Ah-cre systemet (figur 1d). Endvidere farvning for epitel celletyper ikke indiCate enhver ændring til differentiering mønster, repræsentative billeder af hver celletype undersøgt er vist i figur 2e-2h.

Karakterisering af Intestinal epiteler efter CatnB Sletning

Kvantificering af Crypt Loss

Karakterisere kinetik rekombination i disse Cre systemer muligt for os at analysere musen tarmen, når tilsvarende antal individuelle servicekontrakter er rekombineret. Brug af LacZ reporter begge systemer viste fuldstændig tab af rekombinerede (blå) celler ved 3 dpi (figur 2a). Som tidligere rapporteret tre dage efter sletning af CatnB AH-CRE mus viste partiel krypt tab, mens will-Cre-ER T2 mus demonstrerede fuldstændig destruktion af krypten / villus akse 13,16,24 (figur 2b-d). Dynamics of Epithelial Genbefolkning

Brug af teknikker over vi karakteriseret flere parametre til at sætte os i stand til at forstå denne observation. Repræsentative billeder af parametrene og celletyper analyseret under anvendelse protokoller 7 - 10 er angivet i (figur 3a & 3b). Kort fortalt, tab af krypter var i overensstemmelse med vises i begge systemer (figur 3e) de forhøjede niveauer af apoptose. Den mitose, spredning, krypt cellulære højde, krypt og udtryk (ikke vist) data viste imidlertid Ah-CRE systemet kunne komme sig, formodentlig på grund af repopulation ved un-rekombineret individuelle servicekontrakter (figur 3c). I skarp sammenligning will-Cre-ER T2 undladt at inddrive trods fastholde epitelceller kryptceller (figur 3d).

Karakterisering af cellefænotyper inden Crypt

For at forstå hvorfor krypter fra Ah-Cre mus kunne genskabe hvorimod will-Cre-ER T2 kunne vi ikke karakteriseret epithelcellerne tre dage efter sletning af CatnB. Brug in situ hybridisering (afsnit 9) og IHC-analyse (afsnit 7, 8 & 10) vi viste, at kryptceller i will-Cre-ER T2 CatnB FLOX / FLOX mus var ikke-proliferative og manglede udtryk for ISC markør Olfm4 modsætning krypter i AH-Cre mus (figur 4C, F). Da den indledende karakterisering havde vist, at rekombination i krypter svarede fortsatte vi til at undersøge, hvilken rolle de Paneth celler. Vi udførte en dobbelt fluorescerende IHC mod CatnB og Lyz1 at identificere, hvilke celler havde mistet β-catenin og om de var Paneth celler (figur 5a-5c). Som tidligere beskrevet vi demonstrated at alle kryptceller er målrettet ved hjælp af vIL-Cre-ER T2 system. I sammenligning Ah-CRE systemet sparet de Paneth celler og villus epitel. Yderligere Paneth celler blev kun observeret undergår apoptose efter CatnB sletning brug af will-Cre-ER T2 (figur 5d & 5e).

Figur 1
Figur 1: Sammenligning af specificitet og effektivitet Cre / Lox Rekombination i Intestinal epiteler hjælp af Ah-CRE og VIL-Cre-ER T2 Systems (a):. Visualisering af Ah-cre LacZ reporter udtryk i wholemount lille (SI; * distale ende) og store (LI * distale ende) fra en vildtype mus. (b): Resultater af qPCR viser fold forandring til det rekombineret CatnB FLOX allel på 1 dpi at sammenligne forskellige induktion regimer i Ah-cre CatnB FLOX / FLOX (BNF induceret) og will-Cre-ER T2 CatnB FLOX / FLOX (TAM inducerede ); * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] sammenlignet med kontrol). (c) - (e):.. wholemount tyndtarm viser LacZ positiv krypt 30 dpi Panel (b) - (e), modificeret fra Parry et al 16 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Sammenligning af Ah-CRE og Vil-Cre-ER T2 CatnB i Tyndtarm epithel (a):. wholemount tyndtarm viser tab af rekombinerede celler i Ah-cre CatnB FLOX / FLOX LacZ + mus over 3 dage. (b): Kvantificering af krypt tab 3 dage efter sletning af CatnB; * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-tail] sammenlignet med kontrol). (c & d): Tværgående H & E sektioner af formalin fikseret tarm demonstrerer tab af krypter efter CatnB sletning. (e) - (h) Eksempel celletyper fra kontrolmus: (e) entero-endocriine celler, (f) slimceller, (g) CatnB IHC indikerer en ISC (→) med nuklear B-catenin & (h) Paneth celler. Panel (b) modificeret fra Parry et al. 16. Klik her for at se en større version af dette tal.

gether.within-side = "altid"> Figur 3
Figur 3: Karakterisering af indtræden af Fænotype ved brug af Ah-CRE og VIL-Cre-ER T2 systemer til Betinget Sletning CatnB i tilsvarende Antal individuelle servicekontrakter i tyndtarmen epithel (a & b) H & E farvede formalin faste sektioner viser placeringen af krypt. højde ([), en apoptotisk (←) og mitotiske celler (↓). Kvantificering af det gennemsnitlige antal celler pr krypt mellem vildtype (blå) og CatnB FLOX (orange) mus ved tre tidspunkter (dpi) (c) crypt højde, (d) mitose og (e) apoptose (fejlmargener indikerer standardafvigelse ). Panel (c) - (e) modificeret fra Parry et al 16.3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Sammenligning af ISC Karakteristik hjælp Ah-CRE og Vil-Cre-ER T2 Systemer til Betinget Sletning CatnB i tyndtarmen epitel Epiteliale kryptceller 3 dage efter sletning af CatnB hjælp af Ah-CRE (AC) eller lands- Cre-ER T2 (df) system. (a & d) H & E afsnittet viser områder af krypt tab; (b & d) Ki-67 IHC demonstrerer tab af proliferative celler ved hjælp will-Cre-ER T2; (c & f) Olfm4 in situ demonstrere tilstedeværelse af funktionelle indgå individuelle servicekontrakter hjælp Ah-CRE. Panel (a) -. (f) modificeret fra Parry et al 16 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Karakterisering af Paneth celler efter CatnB sletning brug vIL-Cre-ER T2 og Ah-CRE (AC):. Immunofluorescens billeder af krypter viser Paneth celle (rød), B-catenin (grøn) og kernen (blå ), pil angiver membranbundet β-catenin; (de) IHC for caspase-3 angiver apoptotiske Paneth celler er fraværende i Ah-CRE (d), men er til stede i will-Cre-ER T2 systemet (e). Panel (a) - (e) modificeret fraParry et al 16. Klik her for at se en større version af dette tal.

Immpress HRP anti-mus IgG Kit
Acetatbuffer * * For at gøre 100 ml: 4,8 ml 0,2 M eddikesyre, 45,2 ml 0,2 M natriumacetat og 50 ml destilleret vand
Eddikesyre Fisher Scientific C / 0400 / PB17
Eddikesyreanhydrid Sigma A6404
Eddikesyreanhydridopløsning * * 2 M eddikesyreanhydrid i 0,1 M triethanolamin-hydrochlorid
Alcianblåt Sigma A5268
Alcian Blue pH 2,5 * * For at gøre 500 ml: 15 ml eddikesyre, 5 g Alcian Blue & 485 ml destilleret vand
anti-digoxigenin-alkalisk phosphatase-konjugeret antistof Abcam ab119345
B (beta) -Naphthoflavone Sigma N3633 BNF injiceres uden at lade opløsningen køle for meget som forbindelsen vil falde ud af opløsningen. Opløsning kan genbruges - opbevares ved -20 ° C mellem anvendelser, ikke genopvarme mere end to gange.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM lilla Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovint serumalbumin
Chloroform Fisher Scientific C / 4920/17
Citratpuffer / Antigen demaskering Solution Vector Labs H-3300
Majsolie Sigma C8627
Demucifiying løsning * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0,1 M pH 8,8, 100 ml EtOH, 300 ml saltvand (0,9% NaCl i vand), 1,7 g DTT. Demucifying opløsning kan fremstilles i forvejen og opbevares, men DTT sholud tilsættes lige før inkubering (340 mg / 100 ml).
DEPC behandlet vand Life Technologies 750.023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0,5 M
Ethanol Fisher Scientific E / 0650DF / 17
Filtrerpapir Whatman 3000917
Formaldehyd Sigma F8775
Formalin Sigma SLBL11382V Neutral bufret formalin
Formamid Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H 2 O 2 Sigma 216.763
Haematoxylin Raymond et lam 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2)
Hybridiseringspuffer * * 5 x SSC, 50% formamid, 5% SDS, 1 mg / ml heparin, 1 mg / ml kalvelever tRNA
Hydroquinon Sigma H9003
IMMPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Vector Labs MP-7402
Immpress HRP anti-kanin IgG Kit Vector Labs MP-7401
Tarmvæv pulver * * De små tarme af 5 voksne mus blev kombineret og homogeniseret i minimalt volumen iskold PBS. 4 volumener iskold acetone blev tilsat til den homogeniserede tarmen, hvilket blev blandet grundigt og inkuberet på is i 30 minutter. Dette blev centrifugeret, og pelleten blev vasket under anvendelse iskold acetone. Dette blev yderligere centrifugeret, og den resulterende pellet spredt på filtrerpapir og fik lov til at tørre. Når du tørre materiale blev formalet til et fint pulver ved hjælp af pistil og morter.
K-ferricyanid Sigma P-3667
K-ferrocyanid Sigma P3289 Levamisol Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol: 30% chloroform: 10% Eddikesyre
Methanol Fisher Scientific M / 4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normalt gedeserum Vector Labs S-1012 NGS
Normalt kaninserum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCI, 50 mM MgCI2, 0,1% Tween 20, 2 mM levamisol
PAP pen Vektor H-400
Paraformaldehyd Sigma P6148
PBT * * 0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20
Penicillin / Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphatpufret saltvand (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 med destilleret vand for at gøre 1x
PLL dias Sigma P0425-72EA Poly-L-lysin objektglas
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase K-opløsning * * Fortynd proteinase K ved 200 ug / ml i 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36.154 7N
Reducer Solution * * For at gøre 100 ml: 1 g hydroquinon, 5 g natriumsulfit og 100 ml destilleret vand
RNaseA Sigma R6148 </ td>
Saltvand * * 0,9% NaCl i destilleret vand
SDS Sigma I3771
Fåreserum Sigma S3772
Sølvnitrat Sigma S / 1240/46
Sølvopløsning * * For at gøre 100 ml: 10 ml acetatbuffer, 87 ml destilleret vand, 3 ml 1% sølvnitrat
Natriumacetat Fisher Scientific S / 2120/53
Natriumchlorid Sigma S6753 NaCl
Natriumsulfit Sigma 239.321
SSC Sigma 93.017 20x saltvand natriumcitrat
Kirurgisk tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM injiceres uden at opløsningen køle for meget som forbindelsen vil falde ud af opløsningen. Opløsning kan genbruges - opbevares ved -20 ° C mellem anvendelser, ikke genopvarme mere end to gange.
TBS / T Celle Signalering # 9997
Triethanolamin hydrochlorid Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
Vectashield Hardset montering Mellem med DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vecteller Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fiksativ * * 2% formaldehyd, 0,1% glutaraldehyd i 1 x PBS
X-gal farvning * * X-gal plet; 200 pi X-gal (A) i opløsning 50 ml B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-ferricyanid, 0,734 g K-ferrocyanid i 500 ml PBS). Opløsning B kan gøres op oin forvejen og opbevares ved 4 ° C
Xylen Fisher Scientific X / 0200/21

Tabel 1: Materialer og metoder

d> 1/200, 30 minutter ved stuetemperatur
Mål beta-Catenin Lysozym Ki67 Caspase-3 Villin
Kommerciel kilde til primær Ab Transduction Labs NeoMarkers Vector Labs F & U-Systems Santa Cruz
Katalognummer 610.154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672
Primær Ab rejst i Mus (mAb) Kanin (pAb) Mus (mAb) Kanin (pAb) Ged (pAb)
Antigen genfinding Kogende vandbad / citratpuffer Kogende vandbad / citratbuffer Kogende vandbad / citratbuffer Kogende vandbad / citratbuffer Kogende vandbad / citratbuffer
Peroxidase blok Bloxall eller 2% H 2 O 2, 45 sek Bloxall eller 1,5% H 2 O 2, 30 min Bloxall eller 0,5% H 2 O 2, 20 min Bloxall eller 2%H 2 O 2, 45 sek Bloxall eller 3% H 2 O 2, 20 min
Serum blok 1% BSA, 30 min 10% NGS, 30min 20% NRS, 20 min 10% NGS, 45 min 10% NRS, 30 min
Vaskebuffer PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T
Betingelser for primær Ab 1/300, 2 timer ved stuetemperatur 1/100, 1 time ved stuetemperatur 1/50, 1 time ved stuetemperatur 1/750, o / n ved 4 ° C 1/500, 1 time ved stuetemperatur
Sekundær Ab Immpress HRP anti-mus IgG Kit Immpress HRP anti-kanin IgG Kit Biotinyleret kanin-anti-mus Biotinyleret gede-anti-kanin Biotinyleret Kanin anti-Goat
Betingelser for sekundær Ab 1 time ved stuetemperatur 30 minutter ved stuetemperatur 1/200, 30 min ved stuetemperatur 1/200, 30 min ved stuetemperatur
Signalforstærkning N / A N / A ABC-kit ABC-kit ABC-kit
Signal afsløring IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase IMMPACT DAB Peroxidase
Immunofluorescens antistof AlexaFluor 488 AlexaFluor 594 N / A N / A N / A
Immunofluorescens Egenskaber Excitation Max 488 / Emission Max 525 Excitation Max 595 / Emission Max 617
Fælles filtersæt FITC Texas Red
indhold "> Tabel 2: IHC Antistoffer og betingelser

Discussion

Brug betingede CRE-lox transgene mus til at dissekere funktionen af gener og celler er et almindeligt anvendt metode. Disse modeller har været anvendt med stor succes i tarmen til at identificere og karakterisere de stamceller 2,4-6 og forstå deres rolle i sygdom 25. For fuldt ud at udnytte disse modeller kræver en omfattende karakteristik af systemet for at gøre det muligt for data, der skal fortolkes korrekt. En fuldstændig forståelse af disse systemer er vanskeligt at opnå på grund af gener sjældent er specifik for en enkelt celletype eller placering, manglende biologiske viden og ineffektivitet i de systemer, der anvendes til at inducere Cre-ekspression. De her beskrevne metoder vise, hvordan vi overvinde disse spørgsmål gennem eksperimentelle design og anvendelse af eksisterende viden. Selvom vi brugt disse metoder til at besvare et bestemt forskningsspørgsmål de teknikker præsenteres her er generiske og kan bruges til nogen forskning undersøger Murine tarmen.

Fremstilling af tarmvæv

Det afgørende skridt for at sikre robuste resultater er høstning og forarbejdning af vævet, som skal behandles i tide og fiksering protokoller nøje. Som næsten alle væsentlige spørgsmål nedstrøms kan tilskrives artefakter forbundet med vævet udtørring og / eller ufuldstændig fiksering. Timing er afgørende for at forhindre nedbrydning af væv arkitektur og / eller nukleinsyrer og proteiner. Ufuldstændige eller nidkære fiksering kan resultere i tab af histokemisk opløsning. Ufuldstændig fiksering på grund af utilstrækkelig tid eller sektioner for tykke til at tillade fiksativ indtrængning kan resultere i tab af opløsning inden for de intestinale krypter, der kan iagttages som et "tidevand mark" på IHC-analyse. Endvidere er det afgørende, at fiksering ikke strækker sig for længe, ​​som det nukleare β-catenin kan diffundere ud af kernen, medmindre omgående probejdet og voks indlejret efter formalin fiksering.

Rolle Paneth celler i ISC Niche

De data, der præsenteres her, viser effektivt betydningen af ​​Paneth celler i krypt regenerering i den voksne tarmen efter ISC tab. Men der var fortsat den mulighed, at Ah-CRE skåner en befolkning på individuelle servicekontrakter, at will-Cre-ER T2 mål. Tian et al. 26 elegant påvist, at Lgr5 hi individuelle servicekontrakter er erstattet af en befolkning på Lgr5 lo reserve individuelle servicekontrakter. Det virker nu sandsynligt, at disse individuelle servicekontrakter er sparet i Ah-CRE systemet på grund af reserven befolkningen er blevet identificeret som sekretorisk celle forstadier 6,7. Betydningen af ​​den modne Paneth celle i støtte disse sekretoriske celleforstadier når det er nødvendigt for at vende tilbage til en ISC staten mangler at blive besvaret. Som Paneth celler udgør ISC niche 8 og spille roller i reguleringen af ISC reaktioner på kalorieindtag 27 og inflammation 28 er det stadig sandsynligt, at deres sygepleje funktioner vil strække sig til deres egne forstadier.

Nye metoder og teknologier til effektivt Model Menneskelig kolorektal cancer

Opdagelsen af ISC førte til identifikation af gener, som nu bliver brugt til at generere nye musemodeller for at undersøge roller gener og celler i tarm biologi og sygdom, gennemgået af Clarke et al 9. De eneste begrænsninger for denne teknik er identifikationen af ​​gener at udtrykke Cre protein. I øjeblikket ISC rutinemæssigt undersøgt under anvendelse betingede transgene mus baseret på Lgr5 genekspression mønster. Mus, der udtrykker Cre fra Lgr5 promotoren er blevet anvendt til at slette APC genet hyppigst muteret i colorektal cancer (CRC), Hvilket viser ISC som celle af 25. Selektivt at slette andre CRC gener i disse celler er at give indsigt i sygdomsprogression og spredes f.eks. PTEN 29. Yderligere indsigt i ISC-funktionen bliver hentet ved specifikt ablation Lgr5 udtrykkende celler i mus ved hjælp af en menneskelig difteri toxin-receptor (DTR) genet bankede ind i Lgr5 locus 26. Andre strategier bruge Tet-O, ​​som muliggør løbende reversibel ekspression af mutantproteiner 30. Ved hjælp af disse værktøjer til at ændre genet (r) i forskellige celler 31 og steder 32,33 bruges til at forstå, hvordan kræft initiere, fremskridt og metastaserer 34. Alternativt mutagenese ved hjælp af sovende skønhed transposonet systemet identificere nye førere af CRC. Den fortsatte udvikling af mus, teknikker og genetiske ændringer strategier fortsætter med at udvikle mere patient relevante modeller.

Ny metoder er blevet udviklet til karakterisering af tarmens epitel og individuelle servicekontrakter. Karakterisering af forholdet mellem epitelcelletyper kan opnås ved anvendelse af flowcytometri baseret på differentiel ekspression af lectin og CD24 35. Potentielt den største fremgang i forståelsen ISC biologi og deres rolle i sygdommen vil blive foretaget ved hjælp af ex vivo organoide kultur-system 36. Dette system gør det muligt for normale og maligne individuelle servicekontrakter til kultur i 3D, hvor de replikere og differentiere i en mere fysiologisk relevant måde. Det er håbet, at disse vil gøre det muligt direkte test af lægemidler på patientprøver in vitro, hvilket banede vejen for personlig medicin 37.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetate buffer * * To make 100 ml: 4.8 ml 0.2 M Acetic acid, 45.2 ml 0.2 M Sodium acetate & 50 ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue pH 2.5 * * To make 500 ml: 15 ml acetic acid, 5 g Alcian Blue & 485 ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7 g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340 mg/100 ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 min. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100 ml: 1 g Hydroquinone, 5 g sodium sulphite & 100 ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100 ml: 10 ml Acetate buffer, 87 ml distilled water, 3 ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1x PBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200 μl X-gal (A) in 50 ml solution B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferricyanide, 0.734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4 °C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: http://www.molecularmovies.com/movies/view/96 (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  5. Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
  6. Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
  7. Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
  8. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  9. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
  10. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  11. Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
  12. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  13. Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
  14. Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
  15. Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
  16. Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
  17. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  18. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  19. Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
  20. Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
  21. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  22. Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
  23. Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
  24. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  25. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  26. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  27. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
  28. Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
  29. Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
  30. Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
  31. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  32. Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
  33. Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
  34. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  35. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
  36. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  37. van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Tags

Developmental Biology tarm ska-Lox mus stamcelle Paneth celle transgene
Protokoller til analyse af rolle Paneth Celler i Regenerating de murine Tarm hjælp Betinget<em&gt; Cre-lox</em&gt; Musemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., … More

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter