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Developmental Biology

सशर्त का उपयोग कर Murine आंत Regenerating में Paneth कोशिकाओं की भूमिका का विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल Published: November 21, 2015 doi: 10.3791/53429
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1European Cancer Stem Cell Research Institute, Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

आंतों उपकला स्टेम कोशिकाओं (ISCs) Paneth कोशिकाओं के साथ intermingled रहे हैं। इन कोशिकाओं को ISCs का समर्थन और जीवाणुरोधी सुरक्षा प्रदान करते हैं, जो आईएससी की संतान भेदभाव कर रहे हैं। यहाँ हम हम Paneth कोशिकाओं आंतों epithelia बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि स्थापना के लिए ट्रांसजेनिक सशर्त माउस मॉडल का इस्तेमाल किया कैसे प्रदर्शित करता है।

Abstract

7 दिन - स्तनधारी आंत के उपकला सतह हर 3 नवीनिकृत है कि एक गतिशील ऊतक है। तेजी से Lgr5 जीन की उनकी अभिव्यक्ति के द्वारा होती आंतों स्टेम कोशिकाओं (ISCs) साइकिल चालन की आबादी के इस नवीकरण प्रक्रिया की पहचान को समझना। ये चोट की स्थिति में उन्हें जगह करने में सक्षम बीएमआई 1 अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित एक मौन स्टेम सेल की आबादी, द्वारा समर्थित हैं। इन आबादियों के बीच बातचीत की जांच की बीमारी और कैंसर में उनकी भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। ISCs आंतों की सतह पर तहखाने के भीतर मौजूद हैं, इन आलों epithelia भरपाई में आईएससी समर्थन करते हैं। यह पहले से Lgr5 आईएससी की '' stemness '' बारीकी से उनके पड़ोसी Paneth कोशिकाओं की उपस्थिति से जुड़ा हुआ है कि प्रदर्शन किया गया है के रूप में सक्रिय और मौन ISCs के बीच बातचीत होने की संभावना है, आला के भीतर अन्य विभेदित कोशिकाओं शामिल है। सशर्त रचनात्मक-Lox माउस का प्रयोगमॉडल हम Paneth कोशिकाओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति में सक्रिय ISCs के बहुमत को हटाने के प्रभाव का परीक्षण किया। यहाँ हम आंत को चिह्नित करने के लिए शुरू की गई तकनीक और विश्लेषण Paneth कोशिकाओं पर्याप्त अपमान निम्नलिखित वसूली सहायता में आईएससी आला में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाना है कि वर्णन है।

Introduction

स्तनधारी आंत के ल्यूमिनल सतह अनुमानों की तरह तहखाने और उंगली की इकाइयों को दोहरा सुविधाओं, लुमेन में फैलाना जो विल्ली, करार दिया। 4 दिन 1 - यह सतह लगभग हर 3 पूरा आत्म नवीकरण से होकर गुजरती है जो epithelia की एक सतत पत्र है। इस गतिशील ऊतक तेजी से स्टेम कोशिकाओं से साइकिल की आबादी के द्वारा समर्थित है (ISCs; भी तहखाना आधार स्तंभ कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है) शुरू में Lgr5 जीन 2,3 की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की गई है, जो। इन कोशिकाओं को Lieberkuhn के तहखाने के तल पर एक विशेष जगह में मौजूद हैं। प्रारंभ में, ISCs तेजी से साइकिल गया है कि खोज एक स्टेम सेल प्रकृति में मौन था कि प्रचलित विचार के साथ बेताल था। यह मौन लेबल की आबादी तहखाना के आधार के सापेक्ष 4 स्थिति में कोशिकाओं को बनाए रखना है कि माने था Lgr5 + आईएससी की पहचान करने के लिए पिछला, ISCs एक थे। हाल के शोध से जके रूप में अब मुख्य रूप से जिसका भाग्य अपने पड़ोसियों 4,5 द्वारा विनियमित रहे हैं हर कब्रगाह में equipotent साइक्लिंग ISCs का एक पूल है कि वहाँ प्रदर्शन से इन टिप्पणियों के मेल मिलाप। घटना में वे इन आमतौर पर स्रावी वंश के लिए प्रतिबद्ध हैं, लेकिन आईएससी जनसंख्या 6 क्षतिग्रस्त है ISCs में लौट सकते हैं कि मौन कोशिकाओं द्वारा बदला जा सकता है खो रहे हैं।

आईएससी पड़ोसियों ISCs या उनकी बेटी कोशिकाओं हो सकते हैं। ISCs गुणा और लाइनें जो आंतों लुमेन 1 उपकला शीट शामिल है कि विशेष प्रकार की कोशिकाओं में अंतर है, जो भोले बेटी कोशिकाओं का उत्पादन। जाम, enteroendocrine, एन्तेरोच्य्तेस, गुच्छा और एम कोशिकाओं वे विभिन्न अवशोषण और विनियामक कार्य उपलब्ध कराने जहां ल्यूमिनल सतह को ऊपर की तरफ विस्थापित, तथापि, Paneth कोशिकाओं वे ISCs साथ intermingled मौजूद है, जहां तहखाना के तल पर रहते हैं। हाल के वर्षों में यह प्रदर्शन किया गया है कि भोले daught के अनुपातएक स्रावी वंश के लिए किस्मत एर कोशिकाओं चोट 6.7 पर एक आईएससी की ओर लौटना करने में सक्षम Lgr5 लो कोशिकाओं को बनाए रखना है मौन लेबल हैं।

कारण तहखाना उत्थान में इसके महत्व को प्राथमिकता ISCs और उसके पड़ोसी देशों, विशेष रूप से Paneth कोशिकाओं के बीच बातचीत को समझने पर रखा गया था। Paneth कोशिकाओं ISCs 8 का समर्थन करता है जो आला में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जीवाणुनाशक उत्पादों के अलावा Paneth कोशिकाओं आईएससी नवीकरण या भेदभाव को नियंत्रित करने वाले रास्ते को सक्रिय कि संकेतन अणुओं का उत्पादन। पिछले अध्ययनों से वे अपनी बेटी Paneth कोशिकाओं 8 द्वारा प्रदान की आवश्यक आला संकेतों के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकता है जब Lgr5 + ISCs ही मौजूद हो सकता है कि पता चला है। इन अध्ययनों से सामान्य Lgr5 + ISCs पर नहीं है और वे क्षतिग्रस्त हो गया और एक Lgr5 लो आबादी से पुनःपूर्ति की आवश्यकता होती है जहां एक की स्थिति में Paneth कोशिकाओं की भूमिका की जांच की।

9,10 का उपयोग कोशिकाओं और / या जीन की कार्यात्मक भूमिका की जांच आंतों जीव विज्ञान और मॉडल की बीमारी को समझने के लिए। अक्सर इन मॉडलों को सशर्त (ओं) जीन 9,10 संशोधित करने के लिए रचनात्मक-Lox प्रौद्योगिकी का उपयोग। Cre Recombinase जीवाणुभोजी P1 से पृथक इंटिग्रेस परिवार की एक साइट विशिष्ट Recombinase है, (पुनर्संयोजन कारण बनता है)। Cre परिभाषित 34 बीपी के बीच साइट विशिष्ट पुनर्संयोजन catalyses ' Lox पी 'साइटों (क्रॉसओवर P1 का ठिकाना χ)। चूहे आनुवंशिक रूप से रचनात्मक Recombinase की अभिव्यक्ति पर excised हैं जो हित के क्षेत्रों पार्श्व कि LoxP साइटों को शामिल करने के लिए इंजीनियर हैं। एक सेल या विकास विशिष्ट प्रमोटर को रचनात्मक जीन की अभिव्यक्ति जोड़ने परिवर्तन एक स्थानिक फैशन 9,10 में किए जाने के लिए, यह भ्रूण घातक म्यूटेशन पर काबू पाने में विशेष रूप से उपयोगी है की अनुमति देता है। इसके अलावा एक रिसेप्टर मार्ग के लिए रचनात्मक अभिव्यक्ति को जोड़ने,कि कृत्रिम रूप से सक्रिय किया जा सकता, अस्थायी परिवर्तन परमिट।

इस प्रौद्योगिकी का उपयोग हम आंतों epithelia में CatnB जीन 11 निष्क्रिय। β-catenin, CatnB जीन उत्पाद, आईएससी समस्थिति को नियंत्रित करता है जो विहित WNT सिगनल मार्ग की एक प्रमुख नियामक है। इस रणनीति का उपयोग कर दो पिछले अध्ययनों परस्पर विरोधी परिणाम 12,13 का उत्पादन किया। Fevr एट अल। 12 से अध्ययन, स्टेम कोशिकाओं और आंतों homeostasis के नुकसान का प्रदर्शन किया। आयरलैंड एट अल। जबकि 14 अध्ययन सेल व्यवहार्यता में कमी के बाद तहखाना-अंकुर अक्ष CatnB व्यक्त जंगली प्रकार की कोशिकाओं से repopulated गया था कि सूचना दी। इन अध्ययनों में प्रमुख अंतर यह आंतों epithelia में रचनात्मक व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया प्रमोटर था। Fevr एट अल।, अध्ययन टी प्रशासन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है जो एस्ट्रोजन रिसेप्टर से जुड़ा हुआ villin जीन प्रमोटर इस्तेमाल कियाamoxifen (विलास-CRE ईआर टी 2) 15,16। इसके विपरीत आयरलैंड एट अल।, Xenobiotic β-naphthoflavone (आह-सीआरई) के जवाब में रचनात्मक अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए चूहे साइटोक्रोम P450A1 (CYP1A1) जीन के प्रमोटर तत्व का उपयोग किया। इन विभिन्न प्रणालियों की विशेषताओं इन विभिन्न टिप्पणियों के लिए खाते में दो परिकल्पना उत्पन्न। CatnB अधिक कुशलता जिससे उप repopulation स्तर तक ISCs की संख्या को कम करने, आह-रचनात्मक की तुलना में गांव-CRE ईआर टी 2 प्रणाली का उपयोग कर आईएससी में नष्ट कर दिया गया है जो पहले। वैकल्पिक रूप से यह विभेदित सेल की आबादी में CatnB विलोपन अंतर की वजह से था। गांव-CRE ईआर टी 2 प्रणाली के लक्ष्यों आह-रचनात्मक सिस्टम जबकि तहखाना और अंकुर के सभी उपकला कोशिकाओं केवल आईएससी आला और तहखाना की गैर Paneth कोशिकाओं को लक्षित करता है। इन पद्धतियों बिहेव की जांच के लिए आदर्श उपकरण उपलब्ध कराएISCs की आईओआर और Paneth कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत। यहाँ हम हम Paneth कोशिकाओं की चोट से 17 आंतों प्रतिक्रिया में मध्यस्थता करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि निर्धारित करने के लिए इन पद्धतियों का इस्तेमाल कैसे के आधार पर कई विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Protocol

प्रयुक्त सभी सामग्री पर सूचना तालिका 1 में दी गई है। सभी पशु प्रयोगों एक ब्रिटेन के गृह मंत्रालय परियोजना लाइसेंस के अधिकार के तहत प्रदर्शन किया गया।

1. CatnB विलोपन आह-रचनात्मक और गांव-CRE ईआर टी 2 सिस्टम का उपयोग

  1. आह-रचनात्मक + CatnB + + /, आह-रचनात्मक + CatnB Flox / Flox, गांव-CRE ईआर टी 2 CatnB + + / और गांव-CRE ईआर टी 2 CatnB Flox के 14 सप्ताह पुरानी साथियों - 10 उत्पन्न करने के लिए चूहों उपभेदों पार / Flox। एक β -gal दाग के माध्यम से पुनर्संयोजन के दृश्य विश्लेषण, के लिए, साथियों Rosa26R-lacZ रिपोर्टर 17 को शामिल करना चाहिए। संशोधित जीन और प्रेरण एजेंटों के उपयोग की उपस्थिति के लिए नियंत्रण करना चाहिए साथियों, आवश्यक साथियों के आकार के एक शक्ति के विश्लेषण का उपयोग कर अनुमान लगाया जाना चाहिए।
  2. Β तैयार आह-रचनात्मक ट्रांस्जीन प्रेरित करने के लिए;, या 10 मिलीग्राम / एमएल के एक काम समाधान देने के लिए मक्का का तेल में (टीएएम) tamoxifen गांव-CRE ईआर टी 2 ट्रांस्जीन के लिए -Naphthoflavone (बी एन एफ)। नोट: एजेंट उचित व्यक्तिगत सुरक्षा का उपयोग कर एक धूआं हुड में से तौला जाना चाहिए।
  3. नहाने के पानी में बी एन एफ के लिए 99.9 डिग्री सेल्सियस या टैम के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए या तो एक एम्बर बोतल में हीट समाधान (बी एन एफ प्रकाश के प्रति संवेदनशील है)।
  4. बी एन एफ के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्म दोषी को हस्तांतरण, या टैम के लिए 80 डिग्री सेल्सियस, और 10 मिनट के लिए हलचल।
  5. जब तक भंग बी एन एफ 1.3-1.4 दोहराने के लिए (> 1 घंटे लग सकते हैं)।
  6. छोटे एम्बर बोतलों (~ 5 एमएल) और में विभाज्य तब -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर। बोतलें 3 / फ्रीज पिघलना चक्र के बाद खारिज किया जाना चाहिए। पहले पिघलना एजेंटों का उपयोग करें और वे समाधान के बाहर गिर गया है, तो उचित तापमान पर गरम करना। इंजेक्शन के लिए पहले <37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
  7. एक 25 ग्राम माउस approp की 0.2 मिलीग्राम प्राप्त करता है, उदाहरण के लिए 80 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक के साथ चूहों intraperitoneally (आईपी) इंजेक्षनriate प्रेरण एजेंट। आह-CRE के लिए 4 दिनों के लिए प्रति दिन एक इंजेक्शन देने के गांव-CRE ईआर टी 2 के लिए, 24 घंटा अवधि में तीन इंजेक्शन देने के लिए।

रिपोर्टर दृश्य और immunohistochemistry के लिए आंत के 2. विच्छेदन (आईएचसी)

  1. नैतिक अनुमोदन के अनुसार पूर्व के संज्ञाहरण के बिना गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग माउस euthanize। एक लापरवाह स्थिति में माउस प्लेस और 70% EtOH का उपयोग कर फर गीला, एक कैंची का उपयोग midline के साथ अनुलंबीय अंतर peritoneal गुहा खुला।
  2. एक संदंश के साथ पेट को सुरक्षित और घेघा करने के संबंध तोड़ने। धीरे पेट पर खींच कर परिशिष्ट को छोटी आंत तक निकालें। धीरे परिशिष्ट पर खींच कर गुदा के बड़ी आंत तक निकालें।
  3. आंतों पृथक किया गया है एक बार पेट और परिशिष्ट हटा दें। एक कुंद एंडेड विंदुक टिप के साथ एक सिरिंज का उपयोग 1x पीबीएस के साथ फ्लश आंतों। नोट: प्रत्येक आंत मैं होना चाहिएmmediately नीचे वर्णित बहाव के अनुप्रयोगों में से एक के लिए कार्रवाई की।

आंत के 3. formalin निर्धारण

  1. मध्यम और बाहर का 3 बराबर आकार वर्गों और लेबल समीपस्थ, में प्लावित आंत कट। 1 सेमी टुकड़ों में प्रत्येक अनुभाग में कटौती। सर्जिकल टेप 2 सेमी एक्स 2 सेमी की एक छोटी सी पट्टी ले लो। एक पिरामिड गठन में सर्जिकल टेप के बीच करने पर तीन एक से पांच सेमी टुकड़े रखें।
  2. बंद और एक "लॉग ढेर" प्रभाव देने के लिए, अनुलंबीय टुकड़े आसपास टेप सील। कम से कम 10x, ऊतक की मात्रा को लगानेवाला की मात्रा तटस्थ बफर formalin लगानेवाला की एक बड़ी अतिरिक्त युक्त एक फ्लैट तली कंटेनर में ऊतक रखें। निर्धारण के लिए एक ट्यूब के भीतर ऊतक से अधिक मात्रा में रखने से बचें कई कंटेनरों में विभाजित: ध्यान दें।
  3. प्रायर embedding और सेक्शनिंग करने के लिए 24 घंटा - कम से कम 18 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह नमूने हैं। परमाणु β-catenin के नुकसान को रोकने के लिए, 24 घंटा परे ठीक नहीं है।कम से कम 10x ऊतक की मात्रा 70% EtOH की एक बड़ी अतिरिक्त युक्त एक फ्लैट तली कंटेनर के निर्धारण हस्तांतरण ऊतक के बाद।

आंत के 4. Methacarn फिक्सेशन

  1. 300 एमएल MeOH, 150 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म और 75 एमएल हिमनदों एसिटिक एसिड के संयोजन से methacarn लगानेवाला तैयार विच्छेदन के लिए प्रायर (4: 2: 1)। , समीपस्थ मध्यम और बाहर का 3 बराबर आकार वर्गों में प्लावित आंत कट।
  2. फिल्टर पेपर (15 सेमी x15 सेमी) और एक springbow कैंची 'चेहरा एन' इसे खोलने का उपयोग कर के एक टुकड़े पर कंधे से आंत पक्ष का एक टुकड़ा रखें। आरटी पर 24 घंटा - 3 के लिए methacarn युक्त एक गिलास पकवान में आंत और फिल्टर पेपर रखें। निर्धारण के बाद एक संदंश का उपयोग कर एक आंत अनुभाग के अंत उठाओ।
  3. एक "स्विस रोल" के रूप में और थोड़ा संदंश खोलने और इसके माध्यम से एक 25 जी सुई डालने से रोल को सुरक्षित करने के संदंश के आसपास आंत पवन। एक ला युक्त एक फ्लैट तली कंटेनर में ऊतक रखेंतटस्थ बफर formalin लगानेवाला के rge अतिरिक्त, प्रसंस्करण के लिए आगे बढ़ने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए ऊतक और दुकान की मात्रा को लगानेवाला के कम से कम 10x मात्रा।

5. पूरा पर्वत lacZ विज़ुअलाइज़ेशन (एल Marjou एट अल से संशोधित। 18)

  1. 10 में खनिज तेल के साथ पिघला हुआ ralwax संयोजन से मोम प्लेटों की तैयारी: 1। 15 सेमी पेट्री डिश में डालो और शांत करने के लिए छोड़ दें। 1 टेबल के अनुसार एक्स-लड़की लगानेवाला को तैयार है और बर्फ पर दुकान।
  2. पूरे आंत निकालें और 25 मिलीलीटर ठंडा एक्स-लड़की लगानेवाला साथ निस्तब्धता द्वारा धारा 2 फिक्स आंत के अनुसार, बहुत ठंडा 1x पीबीएस के साथ के माध्यम से फ्लश।
  3. 5 बराबर वर्गों (प्रति प्लेट 5 अधिकतम) - एक कैंची का उपयोग कर 3 में आंत काट दिया। मोम की थाली पर प्रत्येक अनुभाग में रखें और खंड थोड़ा mesenteric लाइन ऊपरवाला के साथ फैला है, इसलिए प्रत्येक के अंत नीचे पिन; किसी भी अतिरिक्त अन्त्रपेशी ट्रिम। एक springbow कैंची का प्रयोग अनुलंबीय पेट में कटौती और जिस तरह से साथ बाहर पिन।60;
  4. वर्गों को कवर किया और 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए छोड़ने के लिए एक्स-लड़की लगानेवाला के साथ थाली बाढ़। एक 25 एमएल पिपेट का उपयोग एक्स-लड़की लगानेवाला निकालें और 1x पीबीएस के 30 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें। आदर्श एक कमाल मंच पर आरटी पर 60 मिनट, - 30 के लिए डीटीटी demucifying समाधान के 30 मिलीलीटर के साथ कवर वर्गों।
  5. एक 25 एमएल पिपेट का उपयोग demucifiying समाधान निकालें और 1x पीबीएस के 30 मिलीलीटर के साथ थाली बाढ़। एक पाश्चर विंदुक का उपयोग बलगम दूर करने के लिए थाली में 1x पीबीएस के साथ आंत वर्गों धो लें।
  6. एक्स-लड़की दाग ​​के 30 मिलीलीटर के साथ एक 25 मिलीलीटर पिपेट और बाढ़ के साथ 1x पीबीएस निकालें। एक कमाल मंच पर कोमल आंदोलन के साथ अंधेरे में आरटी पर रातोंरात सेते हैं।
  7. पृष्ठभूमि रंग अभी भी सफेद है यदि वर्गों, एक नीले / हरी दाग ​​विकसित किया है कि रात ऊष्मायन की जांच के बाद नए सिरे से धुंधला समाधान जोड़ा गया है और धुंधला विकसित करता है जब तक नजर रखी जा सकती है। नोट: वर्गों तो दाग है एक बार आगे नहीं धुंधला करने का प्रयास किया जा सकता है।
  8. एक्स-लड़की दाग ​​को दूर1x पीबीएस के 30 मिलीलीटर के साथ एक 25 मिलीलीटर पिपेट और बाढ़ प्लेट का उपयोग और कोमल आंदोलन के साथ 3 मिनट के लिए छोड़ दें। पिन निकालें और संदंश के साथ, एक आंत अनुभाग के अंत उठाओ। एक "स्विस रोल" फार्म थोड़ा संदंश खोलने और इसके माध्यम से एक 25 जी सुई डालने से रोल को सुरक्षित करने के संदंश के आसपास आंत पवन।
  9. कम से कम 10x ऊतक की मात्रा को लगानेवाला की मात्रा तटस्थ बफर formalin लगानेवाला की एक बड़ी अतिरिक्त युक्त एक विस्तृत वाला फ्लैट तली कंटेनर में ऊतक रखें। प्रायर embedding और सेक्शनिंग करने के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह नमूने हैं।

आंत से तहखाने के 6. निष्कर्षण

  1. धारा 2 की जगह एक साफ विदारक सतह पर आंत प्रति और एक संदंश और कैंची किसी भी संलग्न वसा / अन्त्रपेशी हटाने का उपयोग कर के रूप में, छोटी आंत के पहले 20 सेमी अलग। एक springbow कैंची अनुलंबीय पेट खोलने का उपयोग करना।
  2. एफ, एक माइक्रोस्कोप कवर स्लाइड का उपयोगirmly विल्ली और बलगम को दूर करने के आंत लुमेन परिमार्जन। एक कैंची का प्रयोग पेनिसिलिन (100 यू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल) के साथ पूरक ~ 5 मिमी टुकड़ों में आंत में कटौती और 25 एमएल 1x HBSS के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण।
  3. आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से नमूने से गुजर रहा एंटीबायोटिक युक्त मीडिया निकालें।
  4. 10 मिलीलीटर 1x HBSS युक्त एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब में आंतों वर्गों की जगह और टोपी की जगह।
  5. धीरे दो बार पलटना और एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से गुजर रहा 1x HBSS हटा दें। इसके अलावा 6.4 और 6.5 तीन बार दोहरा द्वारा आंतों टुकड़े धोने और अंतिम अंश अपेक्षाकृत स्पष्ट है कि यह सुनिश्चित करने।
  6. EDTA (8 मिमी) / 1x HBSS के 10 मिलीग्राम से युक्त एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब ऊतक स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें। सख्ती (20 - 30x) शेक या भंवर, EDTA (8 मिमी) / 1x HBSS युक्त एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी और हस्तांतरण ऊतक के टुकड़े के माध्यम से गुजरती हैं। ध्यान दें:त्याग या विल्ली epithelia का विश्लेषण आवश्यक है, तो बनाए रखा जा सकता है या तो के माध्यम से प्रवाह।
  7. 30 मिनट के लिए बर्फ पर ऊतक टुकड़े सेते सख्ती नमूना हिला (20 - 30x) या भंवर। एक 70μm सेल झरनी के माध्यम से नमूने के पास है और इस तहखाने में शामिल है के रूप में प्रवाह के माध्यम से बरकरार रहती है।
  8. 1x HBSS के 10 मिलीग्राम से युक्त एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब ऊतक टुकड़े स्थानांतरण। सख्ती (20 - 30x) शेक या भंवर, एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से गुजरती हैं और के माध्यम से प्रवाह बनाए रखने के लिए। आंतों टुकड़े से तहखाने की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए एक बार और दोहराएँ। 5 मिनट के लिए 300 XG पर भिन्न और सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से प्रवाह का मिश्रण। सतह पर तैरनेवाला डालो और तहखाना गोली बरकरार रहती है। नोट: छर्रों संवर्धन के लिए तुरंत इस्तेमाल (यदि लागू हो) या पूर्व मानक डीएनए / आरएनए / प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रियाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

7. मानक इम्युनोहिस्टोकैमिकल विज़ुअलाइज़ेशन

  1. 5 μ कटपाली एल लाइसिन (पीएलएल) स्लाइड पर आयल एम्बेडेड ऊतक का मीटर वर्गों। नोट: एक बी-catenin एंटीबॉडी के साथ धुंधला के लिए एक मानक प्रोटोकॉल नीचे दी गई है, अन्य एंटीबॉडी के लिए मानकों 2 टेबल में दिए गए हैं।
  2. ताजा xylene युक्त स्लाइड स्नान में 2x 3 मिनट washes के साथ डी-मोम। ताजा युक्त स्लाइड स्नान के माध्यम से 3 मिनट के लिए स्लाइड से गुजर रहा rehydrate: 1x पीबीएस में 100% EtOH (2x), 95% EtOH और 70% EtOH और अंत में।
  3. 20 मिनट के एंटीजन को पुनः प्राप्त करने के लिए साइट्रेट बफर (पीएच 6) और गर्मी 99.9 डिग्री सेल्सियस से युक्त एक स्लाइड स्नान में जगह स्लाइड। स्लाइड शांत और फिर 5 मिनट के लिए 1xTBS / टी युक्त एक स्लाइड स्नान में 3x 5 मिनट धोने के लिए अनुमति दें। तुरंत एक पीएपी कलम के साथ ऊतक चारों ओर आकर्षित, पिछले धोने से स्लाइड्स निकालें, और (आसुत एच 2 ओ में) एक वाणिज्यिक peroxidase ब्लॉक या 1.5% एच 2 ओ 2 के साथ खंड को कवर किया।
  4. कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए सेते हैं तो 5 मिनट के लिए ताजा 1x टीबीएस / टी युक्त स्लाइड स्नान में 3x धो लें। धोने के बाद(एनआरएस) आरटी पर 30 मिनट के अपने प्राथमिक एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट हाइड्रोफोबिक बाध्यकारी को ब्लॉक करने के लिए / 1xTBS / टी 5% सामान्य खरगोश सीरम में, एक विंदुक का उपयोग, कवर वर्गों हैैं।
    1. 5% एनआरएस के साथ 200: 1 पतला बी-catenin प्राथमिक एंटीबॉडी में एक पाश्चर विंदुक और कवर अनुभाग के साथ एनआरएस ब्लॉक निकालें। वॉश / टी ताजा 1xTBS युक्त स्लाइड स्नान में 3x 5 मिनट के लिए स्लाइड। नोट - अन्य एंटीबॉडी कमजोर पड़ने और विशिष्टता के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। एक एंटीबॉडी की विशिष्टता को सुनिश्चित करने, उचित कोई एंटीबॉडी और निर्धारण नियंत्रण दाग किया जाना चाहिए। एक निर्धारण नियंत्रण मेजबान प्रजातियों और अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी का निर्धारण करने के लिए मिलान किया जाता है।
  5. या तो एक व्यावसायिक एचआरपी का पता लगाने किट के साथ या एक उपयुक्त fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी (तालिका 2) के साथ कल्पना। नोट: - 15 सेकंड आमतौर पर पर्याप्त है विकास की लंबाई 10 β-catenin के लिए, प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अलग है। एक एंटीबॉडी पहले स्था के लिए विकास का अनुकूलन करने के लिएतो एक सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड का उपयोग सकारात्मक कोशिकाओं कल्पना और करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई बाद के सभी स्लाइड्स के लिए यह लागू ablish।
  6. धो ताजा टीबीएस / टी युक्त स्लाइड स्नान में 3x 5 मिनट के लिए स्लाइड। ~ 45 सेकंड के लिए एक स्लाइड स्नान युक्त haematoxylin में डुबो कर स्लाइड Counterstain (fluorescently माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल का उपयोग करता है, तो जरूरी नहीं)। एक साफ स्लाइड स्नान में स्लाइड्स रखो और पूरी तरह से बाहर नहीं धोया जाता है haematoxylin सुनिश्चित करने, ~ 1 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के साथ कुल्ला।
  7. एल्कोहल की सांद्रता बढ़ युक्त स्लाइड स्नान के माध्यम से गुजर द्वारा स्लाइड निर्जलीकरण; 1x 70% EtOH में 30 सेकंड, 95% EtOH में 1x 30 सेकंड, 100% EtOH में 2x 30 सेकंड washes, xylene में 2x 2 मिनट।
  8. माउंट एक वाणिज्यिक बढ़ते मीडिया का उपयोग कर एक coverslip के तहत स्लाइड। नोट: fluorescently लेबल एंटीबॉडी का उपयोग तो नाभिक लेबल करने के लिए DAPI युक्त मीडिया के साथ माउंट।

विशिष्ट Intestina 8. ऊतकीय पहचानएल उपकला कोशिकाओं

  1. Enterocytes
    1. तालिका 2 में वर्णित villin एंटीबॉडी और शर्तों के साथ धारा 7 का उपयोग कर वर्गों तैयार करें।
  2. Entero अंत: स्रावी कोशिकाओं (Grimelius 18,19 दाग)।
    1. कदम 7.1-7.2 पालन करके वर्गों तैयार करें। धो 3 मिनट के लिए ultrapure पानी युक्त एक स्लाइड स्नान में स्लाइड। छोड़ देते चांदी समाधान (तालिका 1) युक्त एक स्लाइड स्नान करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण और 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 3 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर हौसले से तैयार preheated प्रसारण समाधान युक्त एक स्लाइड स्नान (तालिका 2) में चांदी समाधान और जगह से स्लाइड्स निकालें। स्लाइड्स निकालें और 3 मिनट के लिए ताजा ultrapure पानी युक्त एक स्लाइड स्नान में जगह है। पालन ​​धारा 7 से 7.6-7.8 कदम।
  3. जाम कोशिकाओं (Alcian नीला दाग)।
    1. Alcian बीएल युक्त एक स्लाइड स्नान करने के लिए .. निम्न चरणों को 7.1-7.2 से स्थानांतरण स्लाइड वर्गों को तैयारआरटी पर 5 मिनट के लिए UE पीएच 2.5। 5 मिनट - 3 के लिए चल रहे एक नल के नीचे एक पिपेट और जगह स्लाइड स्नान के साथ Alcian नीला दाग निकालें। कदम 7.6-7.8 का पालन करें। नोट: Alcian नीले समाधान आगे उपयोग के लिए बनाए रखा जा सकता है।
  4. ISCs।
    1. ISCs धारा 9 का पालन पहचान करने के लिए।
  5. Paneth कोशिकाओं।
    1. तालिका 2 में वर्णित लाइसोज़ाइम एंटीबॉडी और शर्तों का उपयोग धारा 7 के निम्न वर्गों तैयार करें।

Murine आंत 19-21 के साथ बगल आरएनए का पता लगाने में 9.

  1. पीएलएल स्लाइड पर formalin तय आंत (धारा 3) से 5 माइक्रोन वर्गों रखें। Olfm4 अभिव्यक्ति 21 का पता लगाने के लिए एक linearized digoxigenin लेबल शाही सेना जांच के लिए तैयार करें। Dewax और धारा 7 के नोट के अनुसार वर्गों rehydrate: इस प्रोटोकॉल आरएनए जांच की गिरावट को रोकने के लिए एक RNase मुक्त वातावरण में किया जाना चाहिए।
  2. टी चारों ओर आकर्षितएक पैप कलम के साथ इस मुद्दे अभिकर्मकों कम करने के लिए। 30 मिनट के लिए (आसुत एच 2 ओ में) 6% एच 2 ओ 2 के साथ एक स्लाइड स्नान में वर्गों सेते हैं। 3 मिनट के लिए ताजा 1x पीबीएस के साथ एक स्लाइड स्नान में दो बार धोएं। बर्फ पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ एक पिपेट, कवर अनुभाग का उपयोग कर, 1x पीबीएस त्यागें और।
  3. 3 मिनट के लिए ताजा 1x पीबीएस के साथ एक स्लाइड स्नान में दो बार धोएं। 3 मिनट के लिए ताजा 1x पीबीएस के साथ एक स्लाइड स्नान में 5 मिनट धो लिए Proteinase कश्मीर समाधान के साथ एक पिपेट कवर वर्गों का उपयोग करना। आरटी पर 5 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में कवर द्वारा एक पिपेट के बाद तय वर्गों का उपयोग करना।
  4. DEPC के साथ एक स्लाइड स्नान में धो 2 मिनट के लिए एच 2 0 इलाज किया। आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए एसिटिक एनहाइड्राइड समाधान में एक पिपेट कवर वर्गों का उपयोग करना। 1x खारा / 3 मिनट के द्वारा पीछा ताजा 1x पीबीएस / 3 मिनट के साथ एक स्लाइड स्नान में धो लें। एल्कोहल की सांद्रता बढ़ युक्त स्नान के माध्यम से स्लाइड पारित; 1x 30 सेकंड में 70% EtOH में, 1x 30 सेकंड में 95% EtOH में, ताजा 100% में 2x 30 सेकंड washes EtOH,2x 2 ताजा xylene में मिनट और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं।
  5. संकरण बफर में 100 और 3 मिनट के लिए 80 सी के लिए हीटिंग से जांच denature: Olfm4 जांच एक पतला। प्रत्येक खंड के लिए जांच की 100 μl लागू करें और स्लाइड के निर्जलीकरण को रोकने के लिए parafilm के साथ कवर किया। 65 सी पर एक अंधेरे, नम कक्ष में रात भर सेते हैं।
  6. 15 मिनट के लिए 65 सेल्सियस पर 5 × एसएससी के साथ एक स्लाइड स्नान में धो लें। 65 सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ताजा / 50% formamide के साथ दो बार एक स्लाइड स्नान में 5 × एसएससी / 1% एसडीएस वर्गों धो लें। 10 मिनट, 65 सी में पहला और आरटी पर दूसरे के लिए ताजा पीबीटी में एक स्लाइड स्नान में दो बार वर्गों धो लें। पीबीटी 37 सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 25 माइक्रोग्राम RNAse युक्त के साथ एक पिपेट कवर वर्गों का उपयोग करना। आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीटी में एक स्लाइड स्नान में वर्गों धो लें।
  7. 65 सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ताजा / 50% formamide के साथ दो बार एक स्लाइड स्नान में 5 × एसएससी वर्गों धो लें। ब्लॉक करने के लिए, एक काले, मोई में पीबीटी और दुकान में 10% भेड़ सीरम के साथ एक विंदुक का उपयोग कवर वर्गों3 घंटा - 2 के लिए आरटी पर सेंट चैम्बर।
  8. 5 मिलीग्राम / एमएल माउस आंतों पाउडर युक्त पीबीटी में 10% भेड़ सीरम के साथ 500: 1 पर विरोधी digoxigenin alkaline फॉस्फेट संयुग्मित एंटीबॉडी गिराए द्वारा एंटीबॉडी तैयार करें। एक कमाल मंच पर अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सेते हैं। अतिरिक्त आंतों पाउडर को हटाने और सतह पर तैरनेवाला को पीबीटी में 1% भेड़ सीरम की 3x मात्रा में जोड़ने के लिए स्पिन।
  9. एक विंदुक के साथ स्लाइड से ब्लॉक निकालें और प्रत्येक अनुभाग के लिए एंटीबॉडी समाधान के 100 μl जोड़ने, parafilm के साथ कवर किया और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे, नम कक्ष में सेते हैं। 5 मिनट के लिए ताजा पीबीटी के साथ एक स्लाइड स्नान में 3 × वर्गों धो लें। वर्गों 5 मिनट के लिए ताजा NTMT बफर के साथ एक स्लाइड स्नान में 3 × धोने को ब्लॉक करने के लिए।
  10. एक पर्याप्त मजबूत रंग विकसित तक 72 घंटा - एक पिपेट बी.एम. बैंगनी के साथ प्रत्येक अनुभाग को कवर किया और 24 के लिए आरटी पर अंधेरे में सेते का उपयोग कर, कल्पना करने के लिए। पीबीटी में एक बार एक स्लाइड स्नान में वर्गों धो लें और 1 मिनट के लिए eosin में डुबो कर counterstain। रेमो5 मिनट - 3 के लिए एक पानी चलाने के अंतर्गत एक स्लाइड स्नान में धोने वर्गों द्वारा अतिरिक्त eosin किया है। Xylene में विसर्जित स्लाइड और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं। वाणिज्यिक मीडिया का उपयोग कर एक coverslip के तहत माउंट।

आंतों epithelia की 10 ऊतकीय विशेषता

  1. पीएलएल स्लाइड पर तय ऊतक (धारा 3 एवं 4) से 5 माइक्रोन वर्गों रखें। ≥25 यादृच्छिक पूरे (या ≥50 आधा) निम्नलिखित मानकों से प्रत्येक के लिए प्रत्येक पलटन के ≥4 चूहों से तहखाने का विश्लेषण करें। नोट: स्थिरता (केवल समीपस्थ अंत का उपयोग करें) प्रत्येक आंत का एक ही स्थान से तहखाने का विश्लेषण बनाए रखने के लिए।
  2. मानक एच एंड ई दाग वर्गों से सेलुलर मानकों (जब तक अन्यथा कहा): तहखाना संख्या, ऊंचाई, apoptosis और बँटवारा।
    1. तहखाना संख्या।
      1. मैन्युअल बेसल परत के साथ संपर्क में तहखाने की संख्या गिनने के लिए एक कम बिजली की बढ़ाई (जैसे 4X या 10X) का प्रयोग करें। गणना ≥10 अनुप्रस्थ समीपस्थ आंत संप्रदायकम से कम 4 चूहों से आयनों।
    2. तहखाना ऊंचाई।
      1. मैन्युअल तहखाना / अंकुर अक्ष (चित्रा 3 बी) के लिए कब्रगाह के नीचे से कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए एक उच्च शक्ति बढ़ाई (जैसे 20X या 40X) का प्रयोग करें।
    3. Apoptosis 22, 23।
      1. विधि 1: स्वयं एक कब्रगाह में apoptotic कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए एक उच्च शक्ति बढ़ाई (। उदाहरण के लिए 20X या 40X) का प्रयोग करें। Apoptotic कोशिकाओं सेल संकोचन, क्रोमेटिन संक्षेपण, साइटोप्लास्मिक blebs और apoptotic निकायों (चित्रा 3 ए) के गठन से पहचाना जा सकता है।
      2. विधि 2: एक आईएचसी दाग प्रदर्शन करना के लिए (धारा 7) कस्पासे 3 मैन्युअल में कोशिकाओं quantitate करने के लिए प्रत्येक कब्रगाह में सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या गिनने के एक उच्च शक्ति बढ़ाई (जैसे 20X या 40X।) का उपयोग में 2 टेबल वर्णित शर्तों का उपयोग। apoptosis के निष्पादन चरण।
    4. सूत्रीविभाजन। स्वयं एक कब्रगाह में mitotic कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए एक उच्च शक्ति बढ़ाई (जैसे 20X या 40X) का प्रयोग करें। Mitotic कोशिकाओं के डीएनए सामग्री गाढ़ा और आम तौर पर सममित और अच्छी तरह से (चित्रा 3 बी) का गठन कर रहे हैं होते हैं।
  3. प्रसार।
    1. की-67 2 तालिका में वर्णित शर्तों का उपयोग करने के लिए एक आईएचसी (धारा 7) दाग प्रदर्शन करते हैं। मैन्युअल proliferating तहखाना कोशिकाओं का अनुपात quantitate करने के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की गिनती।

Representative Results

आह-सीआरई में आईएससी पुनर्संयोजन दक्षता तुलना और विल-CRE ईआर टी 2 सिस्टम्स

क्षति के बाद आंत, ISCs भीतर पुनर्संयोजन की दक्षता के लिए जरूरी लक्षण वर्णन repopulating में, Paneth कोशिकाओं की भूमिका के मूल्यांकन के लिए इन रचनात्मक-Lox सिस्टम का प्रयोग करें। Rosa26R-lacZ सशर्त संवाददाता का प्रयोग हम छोटी आंत (चित्रा 1 ए) में 100% पुनर्संयोजन ~ वहाँ दोनों प्रणालियों में 3 दिन प्रेरण (डीपीआई) पोस्ट कि प्रदर्शन किया। QPCR द्वारा recombined एलील की उपस्थिति Quantitating प्रणालियों के बीच रचनात्मक अभिव्यक्ति पैटर्न में अंतर से चकित था। गांव-CRE ईआर टी 2 प्रणाली की वजह से epitheli का एक बड़ा अनुपात में अपनी अभिव्यक्ति के लिए, आह-रचनात्मक प्रणाली की तुलना में recombined एलील की उपस्थिति में एक 3.53 गुना वृद्धि देखी गईएक 16। इस पर काबू पाने के लिए हम हमें सीधे प्रणालियों की तुलना करने के लिए अनुमति दी है कि एक अलग रणनीति अपनाई। हम अलग अलग प्रेरण शासनों के साथ चूहों प्रेरित और बात जिस पर lacZ सकारात्मक तहखाने और अंकुर एक आईएससी पुनर्संयोजन घटना का प्रतिनिधित्व करते हैं, 30 डीपीआई पर विश्लेषण किया। इस दृष्टिकोण का उपयोग हम प्रदर्शन किया है कि गांव-CRE ईआर टी 2 में कहीं अधिक से अधिक किया जा रहा प्रारंभिक पुनर्संयोजन स्तर के बावजूद ISCs के एक बराबर संख्या में recombined दोनों प्रणालियों, (24 घंटे में 80 मिलीग्राम / किग्रा आईपी दिया) उत्प्रेरण एजेंट के 3 इंजेक्शन में प्रणाली 16 (चित्रा 1 बी-डी)। इसके अलावा, recombined तहखाने से निकाले डीएनए का उपयोग कर, recombined alleles के लिए qPCR संभावित कारण आह-रचनात्मक प्रणाली का उपयोग नहीं मनाया Paneth कोशिकाओं में पुनर्संयोजन, गांव-Cre- ईआर टी 2 प्रणाली का उपयोग कर पुनर्संयोजन में एक गैर महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रदर्शन (चित्रा -1)। इसके अलावा, epithelia प्रकार की कोशिकाओं के लिए धुंधला भारतीयों नहीं कियाकेट भेदभाव पैटर्न के लिए किसी भी परिवर्तन, जांच की प्रत्येक कोशिका प्रकार की छवियों प्रतिनिधि चित्रा 2 ई-2H में दिखाया गया है।

आंतों epithelia की विशेषता CatnB विलोपन निम्नलिखित

तहखाना घटाने की मात्रा

इन रचनात्मक प्रणालियों में पुनर्संयोजन के कैनेटीक्स निस्र्पक ISCs के बराबर संख्या recombined हैं जब माउस आंत का विश्लेषण करने के लिए सक्षम होना चाहिए। LacZ रिपोर्टर का उपयोग करते हुए दोनों प्रणालियों 3 डीपीआई (चित्रा 2) पर recombined (नीला) कोशिकाओं का पूरा नुकसान दिखाया। पहले तीन दिन CatnB के हटाए जाने के बाद रिपोर्ट के रूप में गांव-CRE ईआर टी 2 चूहों तहखाना / अंकुर अक्ष 13,16,24 (चित्रा 2 बी-डी) के पूर्ण विनाश का प्रदर्शन किया जबकि आह-रचनात्मक चूहों, आंशिक तहखाना नुकसान दिखाया। उपकला Repopulation की गतिशीलता

कई मापदंडों तकनीकों हम विशेषता ऊपर का उपयोग करते हुए इस अवलोकन को समझने के लिए हमें सक्षम करने के लिए। मानकों और सेल प्रकार की छवियों प्रतिनिधि 7 प्रोटोकॉल का उपयोग विश्लेषण - 10 में दिए गए हैं (चित्रा 3 ए व 3 बी)। संक्षेप में, तहखाने की हानि दोनों प्रणालियों (3E चित्रा) में दिखाया एपोप्टोसिस का ऊंचा स्तर के अनुरूप था। हालांकि बँटवारा, प्रसार, तहखाना सेलुलर ऊंचाई, तहखाना और अभिव्यक्ति () नहीं दिखाया डेटा आह-रचनात्मक सिस्टम संयुक्त राष्ट्र recombined ISCs (चित्रा 3 सी) द्वारा संभवतः कारण repopulation करने के लिए, ठीक हो सकता है का संकेत दिया। निरा तुलना में, गांव-CRE ईआर टी 2 उपकला तहखाना कोशिकाओं (चित्रा 3 डी) को बनाए रखने के बावजूद उबरने में नाकाम रहे।

तहखाना भीतर सेलुलर phenotypes की विशेषता

आह-CRE चूहों से तहखाने गांव-CRE ईआर T2 नहीं हम CatnB के हटाए जाने के बाद उपकला कोशिकाओं तीन दिन की विशेषता सकता है, जबकि फिर से आबाद सकता है क्यों समझते हैं। सीटू संकरण (धारा 9) और आईएचसी विश्लेषण (धारा 7, 8 और 10) में प्रयोग हम गांव-CRE ईआर टी 2 CatnB Flox / Flox चूहों में तहखाना कोशिकाओं गैर proliferative थे कि प्रदर्शन किया और आईएससी मार्कर Olfm4 की अभिव्यक्ति का अभाव आह-CRE चूहों में तहखाने (चित्रा 4C एंड एफ) के विपरीत है। प्रारंभिक लक्षण वर्णन तहखाने में पुनर्संयोजन बराबर होता था कि प्रदर्शन किया था के रूप में हम Paneth कोशिकाओं की भूमिका की जांच के लिए रवाना हुए। हम β-catenin खो दिया था जो कोशिकाओं की पहचान करने के लिए CatnB और Lyz1 के खिलाफ एक दोहरी फ्लोरोसेंट आईएचसी प्रदर्शन किया और वे Paneth कोशिकाओं (चित्रा 5 ए-5C) थे या नहीं। पहले हम घ वर्णित हैसभी तहखाना कोशिकाओं गांव-CRE ईआर टी 2 प्रणाली का उपयोग लक्षित कर रहे हैं कि emonstrated। इसकी तुलना में आह-रचनात्मक सिस्टम Paneth कोशिकाओं और अंकुर epithelia बख्शा। इसके अलावा Paneth कोशिकाओं ही गांव-CRE ईआर टी 2 प्रणाली (चित्रा 5 डी और 5e) का उपयोग CatnB हटाए जाने के बाद एपोप्टोसिस के दौर से गुजर मनाया गया।

चित्र 1
चित्रा 1: आह-रचनात्मक और विल-CRE ईआर टी 2 सिस्टम का उपयोग आंतों epithelia भीतर विशिष्टता और रचनात्मक / Lox पुनर्संयोजन की क्षमता की तुलना (एक):। Wholemount छोटे (एसआई में आह-रचनात्मक lacZ संवाददाता अभिव्यक्ति के दृश्य; * बाहर का अंत) और बड़े (लाइट, एक जंगली प्रकार माउस से * बाहर का अंत)। (ख): 1 डीपीआई पर recombined CatnB Flox एलील के लिए qPCR दिखा गुना परिवर्तन का परिणाम आह-रचनात्मक CatnB Flox / Flox (बी एन एफ प्रेरित) में अलग प्रेरण शासनों की तुलना करने और गांव-CRE ईआर टी 2 CatnB Flox / Flox (टैम प्रेरित ); * पी> 0.05 (मान व्हिटनी [2-पूंछ] नियंत्रण की तुलना में)। (ग) - (ङ):।। Wholemount छोटी आंत दिखा lacZ सकारात्मक तहखाना 30 डीपीआई पैनल (ख) - (ई) पैरी एट अल 16 से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: आह-रचनात्मक और विल-CRE ईआर टी 2 की तुलना छोटी आंत epithelia में सशर्त हटाना CatnB (क) के लिए सिस्टम:। 3 दिनों में आह-रचनात्मक CatnB Flox / Flox lacZ + चूहों में recombined कोशिकाओं के wholemount छोटी आंत दिखा नुकसान। (ख): 3 दिनों CatnB के हटाए जाने के बाद तहखाना नुकसान की मात्रा; * पी> 0.05 (मान व्हिटनी [2-पूंछ] नियंत्रण की तुलना में)। (सी एंड डी): CatnB हटाए जाने के बाद तहखाने के नुकसान का प्रदर्शन formalin तय आंत की अनुप्रस्थ एच ई वर्गों। (ई) - (ज) नियंत्रण चूहों से सेल प्रकार का उदाहरण: (ई) Entero-endocriine कोशिकाओं, (च) जाम कोशिकाओं, परमाणु बी-catenin और (ज) के साथ एक आईएससी (→) का संकेत (G) CatnB आईएचसी Paneth कोशिकाओं। पैनल (ख) पैरी एट अल। 16 से संशोधित किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

gether.within-पेज 'हमेशा' => चित्र तीन
चित्रा 3: phenotype की शुरुआत की विशेषता छोटी आंत epithelia भीतर ISCs के समान संख्या में सशर्त हटाना CatnB के लिए आह-रचनात्मक और विल-CRE ईआर टी 2 सिस्टम (ए एंड बी) एच एंड ई दाग formalin तय वर्गों तहखाना के स्थान का संकेत का उपयोग करते समय। ऊंचाई ([), एक apoptotic (←) और mitotic सेल (↓)। तीन बार के अंक (डीपीआई) (ग) तहखाना ऊंचाई, (घ) बँटवारा और (ङ) एपोप्टोसिस पर जंगली प्रकार (नीला) और CatnB Flox (नारंगी) चूहों के बीच तहखाना प्रति कोशिकाओं की औसत संख्या की मात्रा (त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत )। पैनल (ग) - पैरी एट अल 16 से संशोधित (ई)।3429fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। आह-रचनात्मक और 3 दिन CatnB आह-रचनात्मक उपयोग (एसी) या के हटाए जाने के बाद छोटी आंत epithelia उपकला तहखाना कोशिकाओं में सशर्त हटाना CatnB के लिए विल-CRE ईआर टी 2 सिस्टम का उपयोग कर आईएससी के लक्षण की तुलना गांवों Cre पर ईआर टी 2 (डीएफ) प्रणाली। (ए एंड डी) तहखाना नुकसान के क्षेत्रों दिखा एच ई खंड; (B & D) गांव-CRE ईआर टी 2 का उपयोग कर proliferative कोशिकाओं के की-67 आईएचसी प्रदर्शन नुकसान; (सी एंड एफ) Olfm4 बगल में आह-सीआरई का उपयोग कर कार्यात्मक ISCs की उपस्थिति का प्रदर्शन है। पैनल (एक।) - (च) पैरी एट अल 16 से संशोधित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: CatnB विलोपन विल-CRE ईआर टी 2 और आह-रचनात्मक सिस्टम उपयोग करने के बाद Paneth प्रकोष्ठों की विशेषता (एसी):। Paneth सेल (लाल), बी-catenin (हरा) और नाभिक दिखा तहखाने के immunofluorescence छवियों (नीला ), झिल्ली बाध्य β-catenin संकेत मिलता तीर; Apoptotic Paneth कोशिकाओं का संकेत कस्पासे 3 के लिए (डी) आईएचसी गांव-CRE ईआर टी 2 सिस्टम (ई) में आह-रचनात्मक (घ) में अनुपस्थित लेकिन मौजूद हैं। पैनल (क) - (ई) से संशोधितपैरी एट अल 16। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Immpress एचआरपी विरोधी माउस आईजीजी किट
एसीटेट बफर * * 100 मिलीलीटर बनाने के लिए: 4.8 मिलीलीटर 0.2 एम एसिटिक एसिड, 45.2 मिलीलीटर 0.2 एम सोडियम एसीटेट और 50 मिलीलीटर पानी आसुत
एसीटिक अम्ल फिशर साइंटिफिक सी / 0400 / PB17
एसिटिक एनहाईड्राइड सिग्मा A6404
एसिटिक एनहाइड्राइड समाधान * * 0.1 एम triethanolamine हाइड्रोक्लोराइड में 2 एम एसिटिक एनहाइड्राइड
Alcian ब्लू सिग्मा A5268
Alcian ब्लू पीएच 2.5 * * 500 मिलीलीटर बनाने के लिए: 15 एमएल एसिटिक एसिड, 5 ग्राम Alcian ब्लू और 485 मिलीलीटर आसुत जल
विरोधी digoxigenin alkaline फॉस्फेट संयुग्मित एंटीबॉडी Abcam ab119345
बी (बीटा) -Naphthoflavone सिग्मा N3633 बी एन एफ, यौगिक समाधान के बाहर छोड़ देगा के रूप में समाधान बहुत ज्यादा शांत करने के लिए अनुमति के बिना इंजेक्षन। समाधान फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है - दुकान का उपयोग करता है के बीच -20 डिग्री सेल्सियस पर, दो बार से अधिक गरम करना नहीं है।
Bloxall वेक्टर लैब्स सपा-6000
बैंगनी बी.एम. रॉश 11442074001
बीएसए सिग्मा A4503 पशुओं से जुड़े टीके का अन्नसार
क्लोरोफार्म फिशर साइंटिफिक सी / 4920/17
साइट्रेट बफर / एंटीजन अनमास्किंग समाधान वेक्टर लैब्स एच 3300
मक्के का तेल सिग्मा C8627
Demucifiying समाधान * * 50 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, 50 मिलीलीटर Tris 0.1M pH8.8, 100 मिलीलीटर EtOH, (पानी में 0.9% सोडियम क्लोराइड) 300 मिलीलीटर खारा, डीटीटी 1.7 छ: 500 मिलीलीटर के लिए। Demucifying समाधान अग्रिम में किया और संग्रहीत है, लेकिन डीटीटी सिर्फ ऊष्मायन (340 मिलीग्राम / 100 मिलीलीटर) से पहले जोड़ा जा sholud जा सकता है।
DEPC पानी का इलाज किया जीवन टेक्नोलॉजीज 750,023
डीटीटी सिग्मा 101509944
EDTA सिग्मा O3690 0.5 एम
इथेनॉल फिशर साइंटिफिक ई / 0650DF / 17
छन्ना कागज क्या आदमी 3000917
: संक्रामक सिग्मा F8775
Formalin सिग्मा SLBL11382V तटस्थ बफर formalin
Formamide सिग्मा F5786
Glutaraldehye सिग्मा G6257
एच 2 ओ 2 सिग्मा 216,763
Haematoxylin रेमंड एक भेड़ का बच्चा 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2)
संकरण बफर * * 5 × एसएससी, 50% formamide, 5% एसडीएस, 1 मिलीग्राम / एमएल हेपरिन, 1 मिलीग्राम / एमएल बछड़ा जिगर tRNA
उदकुनैन सिग्मा H9003
ImmPACT थपका Peroxidase वेक्टर लैब्स एसके-4105
वेक्टर लैब्स सांसद-7402
Immpress एचआरपी विरोधी खरगोश आईजीजी किट वेक्टर लैब्स सांसद-7401
आंतों के ऊतकों पाउडर * * 5 वयस्क चूहों की छोटी आंतों संयुक्त और बर्फ के ठंडे पीबीएस की न्यूनतम मात्रा में homogenized थे। बर्फ के ठंडे एसीटोन 4 मात्रा में अच्छी तरह से मिला और 30 मिनट के लिए बर्फ पर incubated था जो homogenized आंत, करने के लिए जोड़ा गया था। इस centrifuged था और गोली बर्फ के ठंडे एसीटोन का उपयोग कर धोया था। यह आगे centrifuged था और जिसके परिणामस्वरूप गोली फिल्टर पेपर पर फैला है और सूखे की अनुमति दी। एक बार पूरी तरह सामग्री एक पैर और मोर्टार का उपयोग कर एक ठीक पाउडर के लिए जमीन थी सूखी।
कश्मीर ferricyanide सिग्मा पी-3667
कश्मीर ferrocyanide सिग्मा P3289 Levamisole सिग्मा L0380000
Methacarn * * 60% मेथनॉल: 30% क्लोरोफॉर्म: 10% एसिटिक एसिड
मेथनॉल फिशर साइंटिफिक एम / 4000/17
MgCl2 सिग्मा M8266
सामान्य बकरी सीरम वेक्टर लैब्स एस-1012 NGS
सामान्य खरगोश सीरम Dako X0902 एनआरएस
NTMT * * 100 मिमी NaCl, 100 मिमी Tris एचसीएल, 50 मिमी 2 MgCl, 0.1% Tween20, 2 मिमी Levamisole
पीएपी कलम वेक्टर एच 400
Paraformaldehyde सिग्मा P6148
पीबीटी * * 0.5 एम NaCl, 10 मिमी टीrisHCL पीएच 7.5, 0.1% बीच 20
पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन Gibco 15140-122 100x solutiuon।
बफर फॉस्फेट खारा (10x) फिशर साइंटिफिक BP3994 1x बनाने के लिए आसुत जल से 01:10 Dilluted
पीएलएल स्लाइड्स सिग्मा P0425-72EA पाली एल Lysine खुर्दबीन स्लाइड
Proteinase कश्मीर सिग्मा P2308
Proteinase कश्मीर समाधान * * 50 मिमी Tris, 5 मिमी EDTA में 200 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में Proteinase कश्मीर पतला।
Ralwax बीडीएच 36,154 7N
Reducer समाधान * * 1 ग्राम hydroquinone, 5 ग्राम सोडियम sulfite और 100 मिलीलीटर आसुत जल: 100 मिलीलीटर बनाने के लिए
RnaseA सिग्मा R6148 </ टीडी>
खारा * * आसुत जल में 0.9% सोडियम क्लोराइड
एसडीएस सिग्मा I3771
भेड़ सीरम सिग्मा S3772
सिल्वर नाइट्रेट सिग्मा एस / 1240-1246
रजत समाधान * * 10 मिलीलीटर एसीटेट बफर, 87 एमएल आसुत जल, 3 मिलीग्राम 1% चांदी नाइट्रेट: 100 मिलीलीटर बनाने के लिए
सोडियम एसीटेट फिशर साइंटिफिक एस / 2120/53
सोडियम क्लोराइड सिग्मा S6753 सोडियम क्लोराइड
सोडियम सल्फ़ाइट सिग्मा 239,321
एसएससी सिग्मा 93,017 20x खारा सोडियम साइट्रेट
सर्जिकल टेप फिशर साइंटिफिक 12960495
Tamoxifen सिग्मा T5648 टैम, यौगिक समाधान के बाहर छोड़ देगा के रूप में समाधान बहुत ज्यादा शांत करने के लिए अनुमति के बिना इंजेक्षन। समाधान फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है - दुकान का उपयोग करता है के बीच -20 डिग्री सेल्सियस पर, दो बार से अधिक गरम करना नहीं है।
टीबीएस / टी सेल सिग्नलिंग # 9997
Triethanolamine हाइड्रोक्लोराइड सिग्मा T1502
Tris एचसीएल Invitrogen 15567-027
Tween20 सिग्मा TP9416
VectaMount वेक्टर लैब्स एच-5000
Vectashield Hardset DAPI साथ बढ़ते मध्यम वेक्टर लैब्स एच-1500
एबीसी किट Vectastain Vectया लैब्स पी-4001
एक्स-लड़की Promega V3941
एक्स-लड़की लगानेवाला * * 2% formaldehyde, 1xPBS में 0.1% glutaraldehyde
एक्स-लड़की दाग * * एक्स-लड़की दाग; 50 मिलीलीटर समाधान बी (0.214 ग्राम MgCl2, 0.48 ग्राम कश्मीर ferricyanide, 500 मिलीलीटर पीबीएस में 0.734 ग्राम कश्मीर ferrocyanide) में 200 μl एक्स-लड़की (ए)। समाधान बी 4 डिग्री सेल्सियस पर अग्रिम oin बना हुआ है और संग्रहीत किया जा सकता
ज़ाइलीन फिशर साइंटिफिक एक्स / 0200/21

तालिका 1: सामग्री और तरीके

आरटी पर घ> 1/200, 30 मिनट
लक्ष्य बीटा-catenin लाइसोज़ाइम KI67 कस्पासे 3 Villin
प्राथमिक Ab के वाणिज्यिक स्रोत पारगमन लैब्स Neomarkers वेक्टर लैब्स अनुसंधान एवं विकास सिस्टम सांताक्रूज
कैटलॉग संख्या 610,154 आरबी 372 वीपी-K452 AF835 अनुसूचित जाति-7672
प्राथमिक एबी में उठाया माउस (एमएबी) खरगोश (पीएबी) माउस (एमएबी) खरगोश (पीएबी) बकरी (पीएबी)
प्रतिजन पुनर्प्राप्ति उबलते पानी स्नान / साइट्रेट बफर उबलते पानी स्नान / साइट्रेट बफर उबलते पानी स्नान / साइट्रेट बफर उबलते पानी स्नान / साइट्रेट बफर उबलते पानी स्नान / साइट्रेट बफर
Peroxidase ब्लॉक Bloxall या 2% एच 2 ओ 2, 45 सेकंड Bloxall या 1.5% एच 2 ओ 2, 30 मिनट Bloxall या 0.5% एच 2 ओ 2, 20 मिनट Bloxall या 2%एच 2 ओ 2, 45 सेकंड Bloxall या 3% एच 2 ओ 2, 20 मिनट
सीरम ब्लॉक 1% बीएसए, 30 मिनट 10% NGS, 30min 20% एनआरएस, 20 मिनट 10% NGS, 45 मिनट 10% एनआरएस, 30 मिनट
धो बफर पीबीएस टीबीएस / टी टीबीएस / टी पीबीएस टीबीएस / टी
प्राथमिक अटल बिहारी के लिए शर्तें 1/300, आरटी पर 2 घंटा 1/100, 1hr आरटी पर 1/50, 1hr आरटी पर 1/750, ओ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर 1/500, 1hr आरटी पर
माध्यमिक Ab Immpress एचआरपी विरोधी माउस आईजीजी किट Immpress एचआरपी विरोधी खरगोश आईजीजी किट Biotinylated खरगोश विरोधी माउस Biotinylated बकरी विरोधी खरगोश Biotinylated खरगोश विरोधी बकरी
माध्यमिक अटल बिहारी के लिए शर्तें आरटी पर 1 घंटे आरटी पर 30 मिनट आरटी पर 1/200, 30 मिनट आरटी पर 1/200, 30 मिनट
संकेत प्रवर्धन एन / ए एन / ए एबीसी किट एबीसी किट एबीसी किट
सिग्नल का पता लगाने ImmPACT थपका Peroxidase ImmPACT थपका Peroxidase ImmPACT थपका Peroxidase ImmPACT थपका Peroxidase ImmPACT थपका Peroxidase
इम्यूनोफ्लोरेसेंस एंटीबॉडी Alexafluor 488 Alexafluor 594 एन / ए एन / ए एन / ए
इम्यूनोफ्लोरेसेंस गुण उत्तेजना मैक्स 488 / उत्सर्जन मैक्स 525 उत्तेजना मैक्स 595 / उत्सर्जन मैक्स 617
आम फिल्टर सेट FITC टेक्सास रेड
सामग्री "> तालिका 2: आईएचसी एंटीबॉडी और शर्तें

Discussion

जीन और कोशिकाओं के समारोह टुकड़े करना सशर्त रचनात्मक-Lox ट्रांसजेनिक चूहों का प्रयोग आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है। इन मॉडलों की पहचान करने और विशेषताएँ स्टेम कोशिकाओं 2,4-6 और रोग 25 में उनकी भूमिका को समझने की आंत में बड़ी सफलता के साथ इस्तेमाल किया गया है। पूरी तरह से इन मॉडलों का दोहन करने के लिए सही ढंग से व्याख्या की जा करने के लिए डेटा सक्षम करने के लिए इस प्रणाली के लिए एक व्यापक लक्षण वर्णन की आवश्यकता है। इन प्रणालियों की पूरी समझ के कारण जीन शायद ही कभी एक एकान्त सेल प्रकार या स्थान, जैविक ज्ञान और रचनात्मक अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रणालियों की अक्षमता की कमी के विशिष्ट होने के लिए प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। यहाँ वर्णित विधियों हम प्रयोगात्मक डिजाइन और मौजूदा ज्ञान के आवेदन के माध्यम से इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए प्रदर्शन कैसे। हम यहाँ प्रस्तुत सामान्य हैं और मूरी की जांच किसी भी अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता तकनीक एक विशिष्ट अनुसंधान सवाल का जवाब करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया यद्यपिNE आंत।

आंतों के ऊतकों की तैयारी

मजबूत परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम का कड़ाई से पालन एक समय पर ढंग से और निर्धारण प्रोटोकॉल में संसाधित किया जा करने की जरूरत है जो ऊतकों की कटाई और प्रसंस्करण है। के रूप में लगभग सभी महत्वपूर्ण मुद्दों के बहाव के ऊतक बाहर सुखाने और / या अधूरा निर्धारण के साथ जुड़े कलाकृतियों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। समय ऊतक वास्तुकला और / या न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की गिरावट को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। अधूरा या अति उत्साही निर्धारण histochemical संकल्प की हानि हो सकती है। अपर्याप्त समय या लगानेवाला पैठ आईएचसी विश्लेषण पर एक "ज्वार निशान" के रूप में मनाया जा सकता है कि आंतों तहखाने के भीतर संकल्प के नुकसान में परिणाम कर सकते हैं अनुमति देने के लिए भी मोटी वर्गों के कारण अधूरा निर्धारण। इसके अलावा यह परमाणु β-catenin तुरंत समर्थक जब तक नाभिक से बाहर फैलाना कर सकते हैं के रूप में निर्धारण भी लंबे समय के लिए विस्तार नहीं करता है कि महत्वपूर्ण हैcessed और formalin निर्धारण निम्नलिखित एम्बेडेड मोम।

आईएससी आला में Paneth कोशिकाओं की भूमिका

यहां प्रस्तुत आंकड़ों को प्रभावी ढंग से आईएससी नुकसान के बाद वयस्क आंत में तहखाना उत्थान में Paneth कोशिकाओं के महत्व को दर्शाते हैं। हालांकि वहाँ आह-रचनात्मक कि गांव-CRE ईआर टी 2 लक्ष्यों ISCs की आबादी की जरूरत नहीं पड़ती है कि संभावना बनी हुई है। तियान एट अल। 26 सुंदर ढंग से Lgr5 हाय ISCs Lgr5 लो रिजर्व ISCs की आबादी से बदल रहे हैं कि प्रदर्शन किया। अब यह इन ISCs कारण रिजर्व आबादी स्रावी सेल व्यापारियों 6.7 के रूप में पहचान किया गया हो रही करने के लिए आह-रचनात्मक प्रणाली में बच रहे हैं कि संभावना लगती है। एक आईएससी राज्य को वापस करने के लिए आवश्यक है जब इन स्रावी सेल व्यापारियों के समर्थन में परिपक्व Paneth सेल के महत्व को जवाब दिया जाना बाकी है। Paneth कोशिकाओं मैं गठन के रूप मेंअनुसूचित जाति आला 8 और यह उनके नर्सिंग कार्यों को अपने स्वयं के व्यापारियों के लिए विस्तार होगा कि संभावना बनी हुई है कैलोरी की मात्रा 27 और सूजन से 28 आईएससी प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में भूमिका निभाते हैं।

नए तरीकों और तकनीकों के प्रभावी ढंग से मॉडल मानव कोलोरेक्टल कैंसर के लिए

आईएससी की खोज अब क्लार्क और 9 द्वारा समीक्षा की आंतों जीव विज्ञान और रोग, में जीन और कोशिकाओं की भूमिका की जांच के लिए नई माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, जो जीन की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया। इस तकनीक के लिए केवल सीमाओं रचनात्मक प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जीन की पहचान है। वर्तमान में ISCs नियमित रूप Lgr5 जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर सशर्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कर जांच कर रहे हैं। Lgr5 प्रमोटर से रचनात्मक व्यक्त जो चूहे APC, सबसे अधिक इस्तेमाल कोलोरेक्टल कैंसर में उत्परिवर्तित जीन (सीआरसी नष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है), मूल 25 की सेल के रूप में आईएससी का प्रदर्शन है। चुनिंदा हटाने से इन कोशिकाओं में अन्य सीआरसी जीन रोग प्रगति में अंतर्दृष्टि प्रदान करने और फैला हुआ है जैसे। PTEN 29। आईएससी समारोह में और अधिक जानकारी विशेष रूप से ablating Lgr5 एक मानव डिप्थीरिया विष रिसेप्टर का प्रयोग चूहों में कोशिकाओं -expressing के द्वारा प्राप्त किया जा रहा है (डीटीआर) जीन Lgr5 में ठिकाना 26 खटखटाया। अन्य रणनीतियों उत्परिवर्ती प्रोटीन 30 के चल रहे प्रतिवर्ती अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है जो Tet-ओ प्रणाली का उपयोग करें। विभिन्न कोशिकाओं 31 और स्थानों 32,33 में जीन (एस) को संशोधित करने के लिए इन उपकरणों का उपयोग कैंसर आरंभ कैसे समझते हैं, प्रगति और 34 metastasize करने के लिए प्रयोग किया जाता है। वैकल्पिक रूप से नींद की सुंदरता transposon प्रणाली का उपयोग कर उत्परिवर्तजनन सीआरसी के नए ड्राइवरों की पहचान है। चूहों, तकनीक और आनुवंशिक परिवर्तन रणनीतियों के सतत विकास के अधिक मरीज प्रासंगिक मॉडल विकसित करने के लिए जारी है।

नए मीटरethods आंतों epithelia और ISCs के लक्षण वर्णन के लिए विकसित किया गया है। प्रवाह का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता उपकला कोशिका प्रकार के अनुपात की विशेषता cytometry लेक्टिन और CD24 35 के अंतर अभिव्यक्ति पर आधारित है। संभवतः सबसे बड़ी समझ आईएससी जीव विज्ञान में प्रगति और बीमारी में उनकी भूमिका के पूर्व vivo organoid संस्कृति प्रणाली 36 का उपयोग किया जाएगा। इस प्रणाली के वे दोहराने के लिए और एक अधिक physiologically प्रासंगिक रास्ते में अंतर जहां 3 डी में संस्कृति के लिए सामान्य और घातक ISCs अनुमति देता है। यह इन व्यक्तिगत दवा 37 के लिए रास्ता साफ, इन विट्रो में रोगी के नमूने पर दवाओं के प्रत्यक्ष परीक्षण के लिए सक्षम हो जाएगा कि आशा की जाती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetate buffer * * To make 100 ml: 4.8 ml 0.2 M Acetic acid, 45.2 ml 0.2 M Sodium acetate & 50 ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue pH 2.5 * * To make 500 ml: 15 ml acetic acid, 5 g Alcian Blue & 485 ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7 g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340 mg/100 ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 min. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100 ml: 1 g Hydroquinone, 5 g sodium sulphite & 100 ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100 ml: 10 ml Acetate buffer, 87 ml distilled water, 3 ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1x PBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200 μl X-gal (A) in 50 ml solution B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferricyanide, 0.734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4 °C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 105 आंत Cre पर Lox माउस स्टेम सेल Paneth सेल ट्रांसजेनिक
सशर्त का उपयोग कर Murine आंत Regenerating में Paneth कोशिकाओं की भूमिका का विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल<em&gt; Cre पर Lox</em&gt; माउस मॉडल
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Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).

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