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Developmental Biology

Protocolli per l'analisi del ruolo delle cellule Paneth in Rigenerazione della murino Intestino con condizionale Published: November 21, 2015 doi: 10.3791/53429
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1European Cancer Stem Cell Research Institute, Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

Cellule intestinali staminali epiteliali (ISC) sono mescolati con le cellule Paneth. Queste cellule sono differenziate progenie della ISC, che supportano la ISC e fornire protezione antibatterica. Qui mostriamo come abbiamo utilizzato modelli transgenici condizionali mouse per stabilire che le cellule Paneth svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento degli epiteli intestinali.

Abstract

La superficie epiteliale intestinale di mammifero è un tessuto dinamico che rinnova ogni 3 - 7 giorni. La comprensione di questo processo di rinnovamento identificato una popolazione di cellule staminali in rapida ciclismo intestinali (ISC) caratterizzati dalla loro espressione del gene Lgr5. Questi sono supportati da una popolazione di cellule staminali quiescenti, caratterizzato da Bmi-1, in grado di sostituirle in caso di lesioni. Indagare le interazioni tra queste popolazioni è fondamentale per capire il loro ruolo nella malattia e il cancro. Le ISC esistono all'interno cripte sulla superficie intestinale, queste nicchie supportano l'ISC nel rifornire epiteli. L'interazione tra ISC attive e quiescenti probabilmente coinvolge altre cellule differenziate all'interno della nicchia, così come è già stato dimostrato che la '' staminalità '' del Lgr5 ISC è strettamente legata alla presenza dei loro vicini cellule Paneth. Utilizzando il mouse condizionale cre-loxmodelli abbiamo testato l'effetto di eliminare la maggior parte delle ISC attivi in ​​presenza o assenza di cellule Paneth. Qui si descrivono le tecniche e le analisi svolte per caratterizzare l'intestino e dimostrano che le cellule Paneth svolgono un ruolo fondamentale all'interno della nicchia ISC in favoreggiamento recupero dopo sostanziale insulto.

Introduction

La superficie luminale dell'intestino dei mammiferi caratteristiche ripetendo unità di cripte e dito come proiezioni, chiamato villi, che sporgono nel lume. Questa superficie è un foglio continuo di epiteli che subisce completa auto-rinnovo circa ogni 3 - 4 giorni 1. Questo tessuto dinamico è supportato da una popolazione in rapida ciclismo cellule staminali (ISC, conosciuta anche come la base cripta cellule colonnari), che inizialmente sono stati identificati per la loro espressione del gene Lgr5 2,3. Queste cellule esistono in una nicchia specializzata in fondo le cripte di Lieberkuhn. Inizialmente, la scoperta che ISC stavano rapidamente il ciclismo era discordante con l'idea prevalente che una cellula staminale era quiescente in natura. Precedente all'identificazione del Lgr5 + ISC è stato postulato che una popolazione di un'etichetta quiescente trattenere cellule alla posizione 4, rispetto alla base della cripta, sono stati i ISC 1. Recenti ricerche hcome ora riconciliati queste osservazioni dimostrando che in primo luogo vi è una piscina di ciclismo equipotenti ISC in ogni cripta cui destino sono regolati dai suoi vicini di 4,5. Nel caso in cui si perdono questi possono essere sostituiti da cellule quiescenti che normalmente si impegnano a lignaggio secretoria ma possibile ripristinare ISCs se la popolazione ISC è danneggiato 6.

Vicini ISC possono essere sia ISC o le loro cellule figlie. Le ISC producono cellule figlie naif che si moltiplicano e si differenziano in tipi di cellule specializzate che compongono il foglio epiteliale che riveste lume intestinale 1. La coppa, enteroendocrine, enterociti, ciuffo e cellule M migrano verso la superficie luminale dove forniscono varie funzioni di assorbimento e regolamentari, tuttavia, le cellule Paneth rimangono sul fondo della cripta dove esistono inframmezzati al CSI. Negli ultimi anni è stato dimostrato che una parte del daught naiveer cellule destinate a un lignaggio di secrezione sono etichetta riposo mantenendo cellule Lgr5 Lo capaci di un ritorno ad un ISC su 6,7 infortunio.

Per la sua importanza nella rigenerazione cripta una priorità fu posta sulla comprensione delle interazioni tra l'ISC ei suoi vicini, in particolare le cellule Paneth. Le cellule Paneth svolgono un ruolo cruciale nella nicchia che sostiene la ISC 8. Oltre ai prodotti battericidi cellule Paneth producono molecole di segnalazione che attivano le vie che regolano il rinnovo ISC o differenziazione. Precedenti studi hanno dimostrato che il Lgr5 + ISC può esistere solo quando potevano competere per i segnali di nicchia essenziali forniti dalla figlia cellule Paneth 8. Questi studi hanno esaminato il ruolo delle cellule Paneth sul normale Lgr5 + ISC e non in una situazione in cui sono danneggiati e richiedono la ricarica da una popolazione Lgr5 lo.

9,10. Spesso questi modelli utilizzano la tecnologia cre-lox modificare condizionale gene (s) 9,10. Cre (Cause ricombinazione) ricombinasi è un ricombinasi site specific della famiglia dell'integrasi, isolato dal batteriofago P1. Cre catalizza ricombinazione sito specifico tra definita 34 bp ' Lox P '(locus χ di P1 di crossover) siti. I topi sono geneticamente per contenere siti loxP che fiancheggiano le regioni di interesse che al momento espressione della Cre ricombinasi sono rimossi. Collegando l'espressione del gene Cre a una cella o di sviluppo promotore specifico permette di modifica da effettuare in modo spaziale 9,10, questo è particolarmente utile nel superare mutazioni letali embrionali. Inoltre collegando l'espressione Cre di un percorso del recettore,attivabile artificialmente, permette alterazioni temporali.

Grazie a questa tecnologia abbiamo inattivato il gene CatnB 11 nei epiteli intestinali. β-catenina, il prodotto del gene CatnB, è un regolatore chiave della via di segnale Wnt canonica che regola ISC omeostasi. Due studi precedenti utilizzando questa strategia hanno prodotto risultati contrastanti 12,13. Lo studio di févr et al. 12, hanno dimostrato la perdita di cellule staminali e omeostasi intestinale. Considerando che l'Irlanda et al. 14 studio ha riportato che a seguito di una riduzione della vitalità cellulare sull'asse cripta-villo fu ripopolata da cellule wild type che esprimono CatnB. La principale differenza in questi studi è stato il promotore usata per esprimere Cre nei epiteli intestinali. La FEVR et al., Studio ha utilizzato il promotore del gene villin legato al recettore degli estrogeni che può essere attivato somministrando tamoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. In contrasto con l'Irlanda et al., Utilizzato l'elemento promotore del gene del ratto del citocromo P450A1 (CYP1A1) per guidare l'espressione Cre in risposta alla xenobiotici β-naftoflavone (Ah-cre). Le caratteristiche di questi diversi sistemi generati due ipotesi per spiegare queste diverse osservazioni. Il primo che CatnB è più efficiente cancellata ISC utilizzando il sistema T2 vil-Cre-ER rispetto al Ah-cre, riducendo così il numero di ISC a livelli sub-ripopolamento. In alternativa era causata dalla differenza CatnB delezione nella popolazione di cellule differenziate. Le vil-Cre-ER obiettivi del sistema T2 tutte le cellule epiteliali della cripta e villi, mentre il sistema di Ah-cre si riferisce solo alle cellule non Paneth della nicchia ISC e la cripta. Questi sistemi forniti strumenti ideali per l'esame della behavior della ISC e la loro interazione con le cellule Paneth. Qui vi presentiamo diversi protocolli dettagliati in base a come abbiamo usato questi sistemi per determinare che le cellule Paneth svolgono un ruolo cruciale nel mediare la risposta al danno intestinale 17.

Protocol

Informazioni su tutto il materiale utilizzato è riportato nella tabella 1. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti sotto l'autorità di una licenza progetto britannico Home Office.

1. CatnB Soppressione utilizzando gli Ah-cre e Vil-Cre-ER T2 Sistemi

  1. Attraversare i ceppi di topi di generare 10-14 settimane di età coorti di Ah-cre + CatnB + / +, Ah-cre + CatnB flox / flox, vil-Cre-ER T2 CatnB + / + e vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox. Per l'analisi visiva della ricombinazione, tramite una macchia -Gal β, coorti dovrebbero contenere il reporter Rosa26R-lacZ 17. Coorti dovrebbe controllare per la presenza di geni e uso di agenti di induzione modificati, la dimensione delle coorti richiesti devono essere stimati sulla base di una analisi della potenza.
  2. Per indurre il transgene Ah-cre preparare β; -Naphthoflavone (BNF), o per il transgene vil-Cre-ER T2 tamoxifene (TAM) in olio di mais per dare una soluzione di lavoro di 10 mg / ml. NOTA: Gli agenti devono essere soppesati in una cappa aspirante utilizzando un'adeguata protezione personale.
  3. Soluzioni di calore in una bottiglia ambrata (BNF è fotosensibile) a 99,9 ° C sia per BNF o 80 ° C per TAM in un bagno d'acqua.
  4. Trasferire in un agitatore riscaldato fissata a 100 ° C per BNF, o 80 ° C per TAM, e agitare per 10 min.
  5. Per BNF ripetere 1,3-1,4 fino alla dissoluzione (può prendere> 1 ora).
  6. Aliquota in piccole bottiglie d'ambra (~ 5 ml) e poi congelare a -20 ° C. Le bottiglie devono essere eliminati dopo 3 cicli di gelo / disgelo. Prima di utilizzare agenti disgelo e riscaldare a temperatura adeguata, se essi sono scesi di soluzione. Lasciare raffreddare a <37 ° C prima dell'iniezione.
  7. Iniettare topi per via intraperitoneale (IP) con una dose di 80 mg / kg, per esempio a 25 g del mouse riceve 0,2 ml della appropagente di induzione riate. Per Ah-cre consegnare tre iniezioni in un periodo di 24 ore, per vil-Cre-ER T2 dare una iniezione al giorno per 4 giorni.

2. La dissezione di Intestino per Reporter visualizzazione e immunoistochimica (IHC)

  1. Euthanize il mouse utilizzando dislocazione cervicale senza previa anestesia secondo approvazione etica. Posizionare il mouse in posizione supina e bagnare il pelo utilizzando 70% EtOH, aprire la cavità intraperitoneale longitudinalmente lungo la linea mediana utilizzando una forbice.
  2. Fissare lo stomaco con una pinza e tagliare il collegamento con l'esofago. Rimuovere il piccolo intestino fino all'appendice tirando delicatamente lo stomaco. Rimuovere l'intestino crasso fino all'ano tirando delicatamente l'appendice.
  3. Una volta che gli intestini sono stati isolati rimuovere lo stomaco e l'appendice. Intestini sciacquare con 1x PBS utilizzando una siringa con un puntale tronco calcare. NOTA: Ogni intestino dovrebbe essere imediatamente preparate per una delle applicazioni a valle descritte di seguito.

3. formalina Fissazione di intestino

  1. Tagliare l'intestino arrossato in 3 sezioni di uguali dimensioni e l'etichetta prossimale, medio e distale. Tagliare ogni sezione in 1 cm pezzi. Prendete una piccola striscia di nastro adesivo chirurgico 2 cm x 2 cm. Posizionare tre a cinque pezzi 1 cm al centro del nastro chirurgico in una formazione piramide.
  2. Chiudere e sigillare il nastro intorno i pezzi in senso longitudinale, per dare un effetto "log pile". Posizionare il tessuto in un recipiente a fondo piatto contenente un grande eccesso di neutro fissativo formalina tamponata, almeno 10 volte il volume di fissativo al volume del tessuto. NOTA: Evitare di posizionare una quantità eccessiva di tessuto all'interno di un tubo per la fissazione, dividerlo in più contenitori.
  3. I campioni a 4 ° C per almeno 18 - 24 ore prima di embedding e di sezionamento. Per evitare la perdita di nucleare β-catenina, non aggiustarlo oltre 24 ore.Dopo il trasferimento fissaggio del tessuto di un contenitore a fondo piatto contenente un grande eccesso di 70% EtOH, almeno 10 volte il volume del tessuto.

4. Methacarn Fissazione di intestino

  1. Prima di dissezione preparare methacarn fissativo combinando 300 ml MeOH, 150 ml di cloroformio e 75 ml di acido acetico glaciale (4: 2: 1). Tagliare l'intestino arrossato in 3 sezioni di uguali dimensioni prossimali, medie e distali.
  2. Mettere ogni pezzo di lato intestino da parte su un pezzo di carta da filtro (15 cm x15 cm) e utilizzando un springbow forbici aprirlo 'en face'. Posizionare l'intestino e carta da filtro in un piatto di vetro contenente methacarn per 3-24 ore a temperatura ambiente. Dopo la fissazione raccogliere la fine di una sezione dell'intestino utilizzando una pinza.
  3. Avvolgere l'intestino intorno le pinze a formare una "swiss roll" e fissare il rotolo aprendo leggermente le pinze e mettere un ago da 25 G attraverso di essa. Collocare il tessuto in un recipiente a fondo piatto contenente a large eccesso di neutro fissativo formalina tamponata, almeno 10 volte il volume di fissativo al volume del tessuto e negozio per almeno 1 ora prima di procedere alla lavorazione.

5. intero monte LacZ visualizzazione (Modificata da El Marjou et al., 18)

  1. Preparare piastre cera combinando ralwax fuso con olio minerale a 10: 1. Versare in 15 piatti cm Petri e lasciare raffreddare. Preparare X-gal fissativo come da Tabella 1 e memorizzare sul ghiaccio.
  2. Rimuovere intero intestino e irrigare attraverso con 1x PBS freddo, come indicato alla Sezione 2. Fissare intestino da lavaggio con 25 ml di ghiacciata X-gal fissativo.
  3. Usando una forbice tagliare l'intestino in 3 - 5 sezioni uguali (massimo 5 per piastra). Posizionare ogni sezione sulla piastra cera e fissare ogni estremità in modo che la sezione è leggermente allungato con la più alta linea di mesenterica; tagliare qualsiasi mesentere eccesso. Utilizzando un paio di forbici springbow tagliare l'intestino in senso longitudinale e pin out lungo la strada.60;
  4. Inondare la piastra con X-gal fissativo per coprire le sezioni e lasciare per almeno 1 ora a 4 ° C. Rimuovere X-gal fissativo con una pipetta da 25 ml e lavare una volta con 30 ml di PBS 1x. Coprire le sezioni con 30 ml di soluzione demucifying DTT per 30-60 minuti a temperatura ambiente, in posizione ideale su una piattaforma oscillante.
  5. Rimuovere la soluzione demucifiying con una pipetta da 25 ml e inondare il piatto con 30 ml di PBS 1x. Usando una pipetta pasteur lavare sezioni intestino con PBS 1x nella piastra per rimuovere il muco.
  6. Rimuovere 1x PBS con una pipetta da 25 ml e inondazioni con 30 ml di macchia X-gal. Incubare una notte a RT al buio e scuotendo con cautela su una piattaforma oscillante.
  7. Dopo il controllo alla notte di incubazione che le sezioni hanno sviluppato un blu / macchia verde, se il colore di sfondo è ancora bianco, soluzione colorante fresca può essere aggiunto e monitorata fino colorazione si sviluppa. NOTA: una volta le sezioni sono macchiate quindi nessun ulteriore colorazione può essere tentata.
  8. Rimuovere la macchia X-galcon una pipetta e inondazioni piatto 25 ml con 30 ml di PBS 1x e lasciar riposare per 3 minuti con agitazione. Rimuovere le spine e pick up, con una pinza, la fine di una sezione dell'intestino. Avvolgere l'intestino intorno le pinze a formare una "Swiss roll", fissare il rotolo aprendo leggermente le pinze e mettere un ago da 25 G attraverso di essa.
  9. Posizionare il tessuto in un contenitore a bocca larga a fondo piatto contenente un grande eccesso di neutro fissativo formalina tamponata, almeno 10 volte il volume di fissativo al volume del tessuto. I campioni a 4 ° C per almeno 24 ore prima di incorporamento e sezionamento.

6. Estrazione di cripte da Intestino

  1. Isolare i primi 20 cm del piccolo intestino, come indicato alla Sezione 2. Posizionare l'intestino su una superficie di dissezione pulito e con una pinza e forbici rimuovere il grasso / mesentere attaccato. Utilizzando un paio di forbici springbow aprire l'intestino in senso longitudinale.
  2. Utilizzando un coperchio vetrino da microscopio, firmly raschiare lume intestinale per rimuovere villi e muco. Usando una forbice tagliare l'intestino nel ~ 5 parti mm e trasferire in un tubo da 50 ml con 25 ml 1x HBSS addizionato con penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 U / ml).
  3. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supporto antibiotico contenente passando i campioni attraverso un colino cella di 70 micron.
  4. Posizionare le sezioni intestinali in un nuovo tubo da 50 ml contenente 10 ml 1x HBSS e riposizionare il tappo.
  5. Capovolgere delicatamente due volte e rimuovere la 1x HBSS passando attraverso un filtro cella 70 micron. Lavare ulteriormente i pezzi intestinali ripetendo 6.4 & 6.5 tre volte e assicurarsi che la frazione finale è relativamente chiara.
  6. Trasferire il tessuto a un nuovo tubo da 50 ml contenente 10 ml di EDTA (8 mM) / 1x HBSS e lasciare a temperatura ambiente per 5 min. Agitare vigorosamente (20 - 30x) o vortice, passare a 70 micron colino cellula e del tessuto trasferimento pezzi per un nuovo tubo da 50 ml contenente EDTA (8 mm) / 1x HBSS. NOTA:Il flusso attraverso può o essere scartata o mantenute se è richiesta l'analisi dei villi epiteli.
  7. Incubare i pezzi di tessuto sul ghiaccio per 30 minuti, agitare vigorosamente il campione (20 - 30x) o vortice. Passare i campioni attraverso un colino cellula 70μm e mantenere il flusso attraverso come questo contiene le cripte.
  8. Trasferire i pezzi di tessuto di un nuovo tubo da 50 ml contenente 10 ml di HBSS 1x. Agitare vigorosamente (20 - 30x) o vortice, passare attraverso un colino cella di 70 micron e mantenere il flusso attraverso. Ripetere ancora una volta per garantire il massimo recupero delle cripte di pezzi intestinali. Combinare il flusso attraverso frazioni e centrifugare a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e conservare il pellet cripta. NOTA: I pellet possono essere utilizzati immediatamente per la coltura (se applicabile) o conservati a -80 ° C prima di procedure di estrazione del DNA / RNA / proteine ​​standard.

7. standard immunoistochimica Visualization

  1. Tagliare 5 μm sezioni di paraffina embedded sul tessuto poli-L-lisina (PLL) diapositive. Nota: Un protocollo standard per la colorazione con un anticorpo B-catenin seguito viene fornita, parametri per altri anticorpi sono riportati nella tabella 2.
  2. De-cera con 2x 3 min lavaggi in bagni di diapositive contenenti xilene fresco. Reidratare passando vetrini per 3 min attraverso bagni diapositiva contenente fresco: 100% EtOH (2x), 95% EtOH e 70% EtOH e infine in PBS 1x.
  3. Collocare i vetrini in un bagno diapositiva contenente tampone citrato (pH 6) e calore 99,9 ° C per 20 min per recuperare antigeni. Lasciare raffreddare i vetrini e poi lavare 3x 5 minuti in un bagno di diapositiva contenente 1xTBS / T per 5 min. Estrarre i vetrini da ultimo lavaggio, disegnare immediatamente attorno tessuto con una penna PAP, e coprire la sezione con un blocco commerciale perossidasi o 1,5% H 2 O 2 (in acqua distillata H 2 O).
  4. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (RT) poi lavare 3x in bagni diapositiva contenente 1x fresco TBS / T per 5 min. Dopo lavaggioing sezioni di copertura, con una pipetta, nel 5% Normal Coniglio Siero (NRS) / 1xTBS / T per 30 minuti a temperatura ambiente per bloccare non specifico idrofobico vincolante del primario.
    1. Rimuovere blocco NRS con una pipetta e copertura sezione Pasteur di anticorpo primario B-catenin diluito 1: 200 con 5% NRS. Lavare i vetrini per 3x 5 minuti in bagni di diapositive contenenti 1xTBS freschi / T. Nota - altri anticorpi richiedono l'ottimizzazione per la diluizione e la specificità. Al fine di garantire la specificità di un anticorpo, opportuni senza anticorpi e isotipo macchie di controllo devono essere eseguite. Un controllo isotipo è armonizzata con le specie ospiti e isotipo del primario.
  5. Visualizzare sia con un kit di rilevamento HRP commerciale o con un anticorpo secondario marcato appropriata fluorescenza (Tabella 2). NOTA: Lunghezza di sviluppo diverso per ogni anticorpo, per β-catenina 10-15 secondi è generalmente sufficiente. Per ottimizzare lo sviluppo di un anticorpo prima establish il tempo necessario per visualizzare le cellule positive con un vetrino di controllo positivo e quindi applicare questo per tutte le diapositive successive.
  6. Lavare i vetrini per 3x 5 minuti in bagni di diapositive contenenti fresco TBS / T. Diapositive Controcolorare immergendo in una vasca contenente ematossilina scivolo per ~ 45 secondi (non richiesto se si utilizza fluorescente anticorpi secondari). Mettere i vetrini in un bagno vetrino pulito e risciacquare con acqua corrente per ~ 1 min, garantendo la ematossilina non è completamente lavato fuori.
  7. Disidratare diapositive passando attraverso bagni di diapositive contenenti concentrazioni crescenti di alcool; 1x 30 secondi nel 70% EtOH, 1x 30 secondi nel 95% EtOH, 2x 30 sec lavaggi in 100% EtOH, 2x 2 min in xilene.
  8. Mount scivola sotto un coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio commerciale. NOTA: Se si utilizza l'anticorpo fluorescente montare con un supporto contenente DAPI per etichettare il nucleo.

8. istologica Identificazione delle specifiche IntestinaCellule epiteliali l

  1. Enterociti
    1. Preparare sezioni utilizzando sezione 7 con l'anticorpo e condizioni villin descritto nella Tabella 2.
  2. Cellule entero-endocrine (Grimelius macchia 18,19).
    1. Preparare sezioni seguendo i punti 7,1-7,2. Lavare i vetrini in un bagno di diapositiva contenente acqua ultrapura per 3 min. Trasferire i vetrini in un bagno di diapositiva contenente argento soluzione preriscaldata (Tabella 1) e incubare a 60 ° C per 3 ore.
    2. Rimuovere i vetrini dalla soluzione di argento e posto in un bagno di diapositiva contenente soluzione riduttore preriscaldato preparata di fresco (Tabella 2) a 45 ° C per 3 min. Rimuovere i vetrini e porre in un bagno diapositiva contenente acqua ultrapura fresca per 3 min. Seguire i passaggi 7,6-7,8 dalla sezione 7.
  3. Calice cellule (Alcian blu macchia).
    1. Preparare sezioni seguendo i passi 7.1-7.2 .. diapositive trasferimento di un bagno diapositiva contenente Alcian Blue pH 2.5 per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere alcian blu con vasca scivolo pipetta e posto sotto l'acqua corrente per 3-5 minuti. Seguire i passaggi 7,6-7,8. NOTA: la soluzione blu Alcian può essere mantenuto per un ulteriore uso.
  4. ISC.
    1. Per identificare le ISC seguono sezione 9.
  5. Cellule Paneth.
    1. Preparare sezioni seguente sezione 7 utilizzando l'anticorpo e condizioni lisozima descritto nella Tabella 2.

9. In Situ RNA Detection con la Murine Intestino 19-21

  1. Mettere 5 sezioni micron di formalina intestino fissa (sezione 3) su vetrini PLL. Preparare una digossigenina marcato sonda RNA linearizzato per la rilevazione di espressione Olfm4 21. Sparaffinatura e reidratare le sezioni di cui al punto 7. NOTA: Questo protocollo deve essere eseguita in un ambiente privo di RNAsi per prevenire il degrado della sonda RNA.
  2. Disegnare intorno tproblema con una penna PAP per minimizzare reagenti. Incubare sezioni in un bagno diapositiva con 6% H 2 O 2 (in distillata H 2 O) per 30 min. Lavare due volte in un bagno diapositiva con fresca 1x PBS per 3 min. Eliminare 1x PBS e, con una pipetta, sezione di copertura con paraformaldeide 4% per 20 min in ghiaccio.
  3. Lavare due volte in un bagno diapositiva con fresca 1x PBS per 3 min. Utilizzando un sezioni di copertura pipetta con la soluzione proteinasi K per 5 minuti Lavare in un bagno diapositiva con fresco 1x PBS per 3 min. Usando una pipetta sezioni post-fix coprendo in paraformaldeide al 4% per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Lavare in un bagno diapositiva con DEPC trattati H 2 0 per 2 min. Utilizzando un sezioni copertura pipetta in soluzione anidride acetica per 10 minuti con agitazione. Lavare in un bagno diapositiva con fresca 1x PBS / 3 min, seguiti da 1x salina / 3 min. Passare diapositive attraverso bagni contenenti concentrazioni crescenti di alcool; 1x 30 secondi nel 70% EtOH, 1x 30 secondi nel 95% EtOH, 2x 30 sec lavaggi in fresco 100% EtOH,2x 2 min in xilene dolce e lasciare asciugare all'aria.
  5. Diluire Olfm4 sonda 1: 100 in tampone di ibridazione e denaturate sonda riscaldamento a 80 ° C per 3 minuti. Applicare 100 ml di sonda per ogni sezione e coprire con parafilm per prevenire la disidratazione della diapositiva. Incubare per una notte in una camera umida buio a 65 ° C.
  6. Lavare in un bagno diapositiva con 5 × SSC a 65 ° C per 15 min. Lavare le sezioni in un bagno diapositiva fresco due volte con 50% formamide / 5 × SSC / 1% SDS per 30 minuti a 65 ° C. Lavare sezioni due volte in un bagno diapositiva fresco PBT per 10 min, il primo a 65 ° C e il secondo a RT. Utilizzando un sezioni di copertura pipetta con PBT contenente 25 mcg RNAse per 45 minuti a 37 ° C. Lavare le sezioni in un bagno diapositiva in PBT per 5 minuti a RT.
  7. Lavare le sezioni in un bagno diapositiva fresco due volte con 50% formamide / 5 × SSC per 30 minuti a 65 ° C. Per bloccare, le sezioni di copertura con una pipetta con siero di pecora 10% PBT e conservare in un buio, moiCamera st a temperatura ambiente per 2-3 ore.
  8. Preparare anticorpi diluendo fosfatasi alcalina anti-digossigenina coniugato anticorpale a 1: 500 con siero di pecora 10% in PBT contenente 5 mg / ml polvere topo intestinale. Incubare per 3 ore a 4 ° C al buio su una piattaforma oscillante. Spin giù per rimuovere la polvere intestinale in eccesso e aggiungere volumi 3x di siero di pecora 1% in PBT per il surnatante.
  9. Rimuovere isolato da diapositive con una pipetta e aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi per ogni sezione, coprire con parafilm e incubare in una camera umida buio a 4 ° C durante la notte. Lavare le sezioni in un bagno diapositiva 3 × fresca PBT per 5 min. Per bloccare Lavare le sezioni in un bagno diapositiva 3 × con tampone NTMT fresco per 5 min.
  10. Per visualizzare, con una pipetta coprire ogni sezione con BM viola e incubare al buio a temperatura ambiente per 24-72 ore fino a quando un colore sufficientemente forte si sviluppa. Lavare le sezioni in un bagno diapositiva volta in PBT e colorazione di contrasto immergendo in eosina per 1 min. Remove eccesso eosina per sezioni di lavaggio in un bagno scivolo sotto un acqua corrente per 3-5 minuti. Immergere i vetrini in xilene e lasciare asciugare all'aria. Montare sotto un coprioggetto utilizzando supporti commerciali.

10. istologica Caratterizzazione di epiteli intestinali

  1. Mettere 5 sezioni micron dal tessuto fisso (punto 3 e 4) su vetrini PLL. Analizzare ≥25 tutto casuale (o ≥50 metà) cripte ≥4 topi di ogni coorte per ciascuno dei seguenti parametri. NOTA: Per mantenere la coerenza analizzare cripte dalla stessa posizione di ogni dell'intestino (utilizzare solo l'estremità prossimale).
  2. Parametri cellulari da sezioni standard H & E macchiati (salvo diversa indicazione): numero Cripta, altezza, l'apoptosi e la mitosi.
    1. Numero Cripta.
      1. Utilizzare un basso ingrandimento di potenza (ad esempio 4X o 10X) per contare manualmente il numero di cripte in contatto con lo strato basale. Conte ≥10 trasversale prossimale dell'intestino settaioni di almeno 4 topi.
    2. Altezza Cripta.
      1. Utilizzare un ingrandimento ad alta potenza (ad esempio 20X o 40X) per contare manualmente il numero di cellule dal fondo della cripta alla cripta / villi asse (Figura 3b).
    3. L'apoptosi 22, 23.
      1. Metodo 1: Utilizzare un ingrandimento ad alta potenza (ad esempio 20X o 40X.) Per contare manualmente il numero di cellule apoptotiche in ogni cripta. Apoptosi delle cellule possono essere identificati da restringimento delle cellule, la condensazione della cromatina, la formazione di vesciche citoplasmatici e corpi apoptotici (Figura 3a).
      2. Metodo 2: Eseguire una macchia IHC (sezione 7) per caspasi-3 utilizzando condizioni descritte nella Tabella 2 Utilizzando un ingrandimento ad alta potenza (ad esempio 20X o 40X.) Contare manualmente il numero di cellule positive in ogni cripta per quantificare le cellule nel. fase esecutiva dell'apoptosi.
    4. Mitosi. Utilizzare un ingrandimento ad alta potenza (ad esempio 20X o 40X) per contare manualmente il numero di cellule mitotiche in ogni cripta. Cellule mitotiche contengono condensati materiale DNA e sono in genere simmetrici e ben formati (Figura 3b).
  3. Proliferazione.
    1. Eseguire un IHC (sezione 7) della macchia per Ki-67 con condizioni descritte nella tabella 2. Contare manualmente cellule positive per quantificare la proporzione di cellule proliferanti cripta.

Representative Results

Confrontando ISC ricombinazione efficienza nella Ah-cre e Vil-Cre-ER T2 Sistemi

L'uso di questi sistemi cre-lox per valutare il ruolo delle cellule Paneth, in ripopolare l'intestino seguente danni, caratterizzazione necessaria dell'efficienza ricombinazione all'interno della CSI. Utilizzando il reporter condizionale Rosa26R-lacZ abbiamo dimostrato che in entrambi i sistemi 3 giorni dopo l'induzione (dpi) c'è ~ 100% ricombinazione nel piccolo intestino (Figura 1a). Quantificazione la presenza dell'allele ricombinato da qPCR è stato confuso dalle differenze nei pattern di espressione Cre tra i sistemi. Il sistema T2 Vil-Cre-ER ha mostrato un aumento di 3.53 in presenza dell'allele ricombinato rispetto al sistema Ah-cre, a causa della sua espressione in una percentuale maggiore del epitheli16. Per ovviare a questo abbiamo adottato una strategia diversa che ci ha permesso di confrontare direttamente i sistemi. Siamo indotti i topi con i regimi di induzione diverse e analizzato a 30 dpi, momento in cui LacZ cripte positive e coriali rappresentano un evento di ricombinazione ISC. Usando questo approccio abbiamo dimostrato che in entrambi i sistemi, 3 iniezioni di agente che induce (consegnato IP a 80 mg / kg in 24 ore), ricombinate in un numero equivalente di ISC, nonostante livelli di ricombinazione iniziali di essere di gran lunga maggiore nel vil-Cre-ER T2 sistema 16 (Figura 1b-d). Inoltre, utilizzando il DNA estratto dalle cripte ricombinati, qPCR per gli alleli ricombinati dimostrato un aumento non significativo in ricombinazione con il sistema ER T2 Vil-Cre-, potenzialmente causa della ricombinazione nelle cellule Paneth non osservata utilizzando il sistema cre Ah- (Figura 1d). Inoltre, colorazione per tipi di cellule epiteli non ha indiCate qualsiasi modifica modello differenziazione, immagini rappresentative di ciascun tipo cellulare indagato è mostrato in figura 2e-2h.

Caratterizzazione di intestinale epiteli seguito CatnB Cancellazione

Quantificazione della perdita Cripta

Caratterizzare la cinetica di ricombinazione in questi sistemi Cre ci ha permesso di analizzare l'intestino del mouse quando i numeri equivalenti di ISC vengono ricombinati. Utilizzando il reporter LacZ entrambi i sistemi hanno mostrato una completa perdita di cellule (blu) ricombinati a 3 dpi (Figura 2a). Come riportato in precedenza tre giorni dopo la cancellazione delle CatnB topi Ah-CRE hanno mostrato perdita cripta parziale, mentre i topi T2 vil-Cre-ER hanno dimostrato la completa distruzione della cripta / villo asse 13,16,24 (Figura 2b-d). Dinamica dei epiteliale Ripopolamento

Utilizzando le tecniche di cui sopra hanno caratterizzato più parametri per permetterci di comprendere questa osservazione. Immagini rappresentative dei parametri e tipi cellulari analizzati utilizzando protocolli 7-10 sono indicati tra (Figura 3a e 3b). Brevemente, la perdita di cripte era coerente con i livelli elevati di apoptosi visualizzati in entrambi i sistemi (Figura 3e). Tuttavia, la mitosi, la proliferazione, altezza cellulari cripta cripta e di espressione (non mostrato) dati hanno indicato il sistema di Ah-cre potesse riprendersi, presumibilmente a causa di ripopolamento da ISC un-ricombinato (Figura 3c). In confronto netto, il vil-Cre-ER T2 non è riuscito a recuperare nonostante mantenendo crypt cellule epiteliali (Figura 3d).

Caratterizzazione di cellulari Fenotipi all'interno Cripta

Per capire perché le cripte da topi Ah-Cre potrebbero ripopolare mentre il vil-Cre-ER T2 non potremmo caratterizzato le cellule epiteliali tre giorni dopo la cancellazione di CatnB. Utilizzo di ibridazione in situ (sezione 9) e IHC analisi (sezione 7, 8 e 10) abbiamo dimostrato che le cellule cripta del vil-Cre-ER T2 CatnB Flox / topi Flox erano non-proliferativa e mancava l'espressione del marcatore ISC Olfm4 , a differenza delle cripte topi Ah-Cre (Figura 4c e f). Come la caratterizzazione iniziale aveva dimostrato che la ricombinazione in cripte era equivalente si è proceduto ad esaminare il ruolo delle cellule Paneth. Abbiamo eseguito un doppio fluorescente IHC contro CatnB e Lyz1 per identificare quali cellule aveva perso β-catenina e se erano celle Paneth (Figura 5a-5c). Come precedentemente descritto abbiamo Demonstrated che tutte le cellule crypt sono mirati utilizzando il sistema T2 vil-Cre-ER. In confronto il sistema di Ah-cre risparmiato le cellule Paneth e gli epiteli villi. Ulteriori cellule Paneth erano solo osserva apoptosi dopo CatnB eliminazione utilizzando il sistema T2 vil-Cre-ER (figura 5d e 5e).

Figura 1
Figura 1: Confronto tra la specificità e l'efficienza di Cre / Lox ricombinazione all'interno intestinale epiteli utilizzando gli Ah-cre e Vil-Cre-ER T2 Systems (a):. Visualizzazione di Ah-cre espressione LacZ reporter wholemount piccolo (SI; * estremità distale) e grandi (LI; * estremità distale) da un tipo di mouse selvaggio. (b): Risultati di qPCR cambiamento mostra piega per la ricombinato allele CatnB flox a 1 dpi per confrontare i regimi di induzione diversi Ah-cre CatnB flox / flox (BNF indotta) e vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox (TAM indotto ); * P> 0.05 (Mann-Whitney [2-tail] rispetto al controllo). (c) - (e):.. Wholemount tenue mostrando LacZ cripta positivo 30 dpi Panel (b) - (e) modificato da Parry et al 16 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Confronto tra il Ah-cre e Vil-Cre-ER T2 CatnB in tenue epiteli (a):. Wholemount piccolo intestino che mostra la perdita di cellule ricombinati in Ah-cre CatnB flox / flox LacZ + topi oltre 3 giorni. (b): Quantificazione di perdita cripta 3 giorni dopo la cancellazione di CatnB; * P> 0.05 (Mann-Whitney [2-tail] rispetto al controllo). (C & D): trasversali H & E sezioni di formalina dell'intestino fisso che dimostrano la perdita di cripte dopo CatnB eliminazione. (e) - (h) Esempio di tipi di cellule da topi di controllo: (e) cellule entero-endocriine, (f) cellule caliciformi, (g) CatnB IHC indicando un ISC (→) con nucleari B-catenina e (h) Paneth cellule. Panel (b) modificata da Parry et al. 16. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

gether.within-page = "always"> Figura 3
Figura 3: Caratterizzazione della insorgenza di fenotipo quando si utilizza il Ah-cre e Vil-Cre-ER T2 Sistemi di condizionale Eliminazione CatnB in un numero simile di ISC all'interno del Piccolo Intestino Epithelia (a & b) formalina macchiato sezioni fisse H & E indica l'area di cripta. altezza ([), un apoptotica (←) e la cellula mitotica (↓). Quantificazione del numero medio di cellule per cripta tra wild type (blu) e CatnB flox (arancione) i topi in tre punti temporali (dpi) (c) Altezza cripta (d), mitosi e (e) l'apoptosi (barre di errore indicano la deviazione standard ). Pannello (c) - (e) modificato da Parry et al 16.3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4:. Confronto delle caratteristiche ISC con Ah-cre e Vil-Cre-ER T2 Sistemi per condizionale Eliminazione CatnB nelle cellule epiteliali cripta epiteli Piccolo Intestino 3 giorni dopo l'eliminazione del CatnB utilizzando il Ah-cre (ac) o vil- Cre-ER T2 sistema (df). (A & D) H & E sezione che mostra le aree di perdita cripta; (B & D) Ki-67 IHC perdita dimostrazione di cellule proliferative utilizzando vil-Cre-ER T2; (C & F) Olfm4 in situ dimostrare presenza di ISC funzionali utilizzando Ah-cre. Panel (una) -. (f) modificato da Parry et al 16 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Caratterizzazione delle Cellule Paneth dopo CatnB Soppressione ottenuti sul sistema Vil-Cre-ER T2 e Ah-CRE (ac):. Immagini di immunofluorescenza di cripte che mostrano cella Paneth (rosso), B-catenina (verde) e il nucleo (blu ), freccia indicare membrana vincolata β-catenina; (de) IHC per caspasi-3 indica cellule apoptotiche Paneth sono assenti in Ah-cre (d) ma presente nel sistema Cre-Vil-ER T2 (e). Pannello (a) - (e) modificato daParry et al 16. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Immpress HRP IgG anti-topo Kit
Tampone acetato * * Per fare 100 ml: 4,8 ml 0.2 M acido acetico, 45,2 ml di 0,2 M di sodio acetato e 50 ml di acqua distillata
Acido acetico Fisher Scientific C / 0400 / PB17
L'anidride acetica Sigma A6404
Soluzione anidride acetica * * 2 M Anidride acetica in 0,1 M cloridrato di trietanolamina
Alcian Blu Sigma A5268
Alcian blu pH 2,5 * * Per fare 500 ml: 15 ml di acido acetico, acqua 5 g Alcian Blue & 485 ml di acqua distillata
fosfatasi alcalina anti-digossigenina coniugato Abcam ab119345
B (beta) -Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, iniettare senza permettere la soluzione di raffreddarsi troppo come composto cadrà dalla soluzione. Soluzione può essere riutilizzata - conservare a -20 ° C tra usi, non riscaldare più di due volte.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM viola Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Sieroalbumina bovina
Cloroformio Fisher Scientific C / 4920/17
Tampone Citrato / antigene Unmasking Soluzione Vector Labs H-3300
Olio di mais Sigma C8627
Soluzione Demucifiying * * Per 500 ml: 50 ml di glicerolo, 50 ml di 0,1 M Tris pH8.8, 100 ml di EtOH, 300 ml di soluzione fisiologica (0,9% NaCl in acqua), DTT 1,7 g. Demucifying soluzione può essere effettuato in anticipo e conservato, ma DTT sholud aggiunto appena prima incubazione (340 mg / 100 ml).
DEPC acqua trattata Life Technologies 750.023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5 M
Etanolo Fisher Scientific E / 0650DF / 17
Carta filtrante Che uomo 3000917
Formaldeide Sigma F8775
Formalina Sigma SLBL11382V Neutro formalina tamponata
Formammide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H 2 O 2 Sigma 216.763
Ematossilina Raymond A Agnello 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 +; -CaCl2)
Tampone di ibridazione * * 5 × SSC, 50% formammide, 5% SDS, 1 mg / ml di eparina, 1 mg / ml vitello tRNA fegato
Idrochinone Sigma H9003
ImmPACT DAB perossidasi Vector Labs SK-4105
Vector Labs MP-7402
Immpress HRP anti-coniglio IgG Kit Vector Labs MP-7401
Polvere di tessuto intestinale * * I piccoli intestini di 5 topi adulti sono stati combinati e omogeneizzato nel minimo volume di PBS ghiacciato. 4 volumi di acetone freddo ghiaccio sono stati aggiunti l'intestino omogeneizzato, che è stato accuratamente miscelato e incubato in ghiaccio per 30 min. Questo è stato centrifugato ed il pellet è stato lavato con acetone freddo ghiaccio. Questo è stato ulteriormente centrifugato ed il pellet risultante diffuse su carta da filtro e lasciato asciugare. Una volta asciugare accuratamente il materiale è stato macinato in polvere finissima con un pestello e mortaio.
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocianuro Sigma P3289 Levamisolo Sigma L0380000
Methacarn * * 60% metanolo: 30% Cloroformio: 10% di acido acetico
Metanolo Fisher Scientific M / 4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Siero di capra normale Vector Labs S-1012 NGS
Siero di coniglio normale Dako X0902 NRS
NTMT * * NaCl 100 mM, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 2 mM Levamisolo
PAP penna Vettore H-400
Paraformaldeide Sigma P6148
PBT * * 0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20
Penicillina / Streptomicina Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Tampone fosfato (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 con acqua distillata per fare 1x
Diapositive PLL Sigma P0425-72EA Vetrini per microscopio Poly-L-lisina
Proteinase K Sigma P2308
Soluzione proteinasi k * * Diluire Proteinase K a 200 mg / ml a 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Soluzione * * Per fare 100 ml: 1 g di idrochinone, 5 g di solfito di sodio e 100 ml di acqua distillata
RnaseA Sigma R6148 </ td>
Salino * * 0,9% di NaCl in acqua distillata
SDS Sigma I3771
Siero di pecora Sigma S3772
Nitrato d'argento Sigma S / 1240/46
Soluzione d'argento * * Per fare 100 ml: 10 ml di soluzione tampone, 87 ml di acqua distillata, 3 ml di 1% di nitrato d'argento
Acetato di sodio Fisher Scientific S / 2120/53
Cloruro di sodio Sigma S6753 NaCl
Solfito di sodio Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x citrato di sodio salino
Nastro chirurgico Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, iniettare senza permettere la soluzione di raffreddarsi troppo come composto cadrà dalla soluzione. Soluzione può essere riutilizzata - conservare a -20 ° C tra usi, non riscaldare più di due volte.
TBS / T Segnalazione cellulare # 9997
Trietanolammina cloridrato Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
Mezzo di montaggio Vectashield Hardset con DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain Kit ABC Vecto Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fissativo * * 2% di formaldeide, glutaraldeide allo 0,1% in 1XPBS
Macchia X-gal * * Macchia X-gal; 200 microlitri X-gal (A) in 50 ml di soluzione B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-ferricianuro, 0,734 g K-ferrocianuro in 500 ml PBS). Soluzione B può essere costituita oin anticipo e conservato a 4 ° C
Xilene Fisher Scientific X / 0200/21

Tabella 1: Materiali e Metodi

d> 1/200, 30 min a RT
Bersaglio beta-catenina Lisozima Ki67 Caspasi-3 Villin
Fonte commerciale di primaria Ab Trasduzione Labs NeoMarkers Vector Labs Sistemi di R & S Santa Cruz
Numero di catalogo 610.154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672
Primaria Ab cresciuto a Mouse (mAb) Coniglio (PAB) Mouse (mAb) Coniglio (PAB) Capra (PAB)
Recupero Antigen Bagno d'acqua bollente / Tampone Citrato Bagno d'acqua bollente / tampone citrato Bagno d'acqua bollente / tampone citrato Bagno d'acqua bollente / tampone citrato Bagno d'acqua bollente / tampone citrato
Blocco perossidasi Bloxall o 2% H 2 O 2, 45 sec Bloxall o 1,5% H 2 O 2, 30 min Bloxall o 0,5% H 2 O 2, 20 min Bloxall o 2%H 2 O 2, 45 sec Bloxall o 3% H 2 O 2, 20 min
Blocco Siero 1% BSA, 30 min 10% NGS, 30min 20% NRS, 20 min 10% NGS, 45 min 10% NRS, 30 min
Tampone di lavaggio PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T
Condizioni per primario Ab 1/300, 2 ore a temperatura ambiente 1/100, 1 ora a temperatura ambiente 1/50, 1 ora a temperatura ambiente 1/750, o / n a 4 ° C 1/500, 1 ora a temperatura ambiente
Ab secondario Immpress HRP IgG anti-topo Kit Immpress HRP anti-coniglio IgG Kit Coniglio biotinilato anti-topo Biotinilato di capra anti-coniglio Coniglio biotinilato anti-capra
Condizioni per l'Ab secondario 1 ora a RT 30min a temperatura ambiente 1/200, 30 minuti a temperatura ambiente 1/200, 30 minuti a temperatura ambiente
Amplificazione del segnale N / A N / A Kit ABC Kit ABC Kit ABC
Rilevamento del segnale ImmPACT DAB perossidasi ImmPACT DAB perossidasi ImmPACT DAB perossidasi ImmPACT DAB perossidasi ImmPACT DAB perossidasi
Immunofluorescenza AlexaFluor 488 AlexaFluor 594 N / A N / A N / A
Proprietà immunofluorescenza Eccitazione massima 488 / emissione Max 525 Eccitazione massima 595 / emissione Max 617
Insieme comune Filtro FITC Texas Red
content "> Tabella 2: IHC Anticorpi e Condizioni

Discussion

Utilizzando topi transgenici condizionali Cre-lox di sezionare la funzione dei geni e cellule è un approccio comunemente utilizzato. Questi modelli sono stati utilizzati con grande successo a livello intestinale per identificare e caratterizzare le cellule staminali 2,4-6 e capire il loro ruolo nella malattia 25. Per sfruttare appieno questi modelli richiede una caratterizzazione completa del sistema per consentire i dati devono essere interpretati correttamente. Una completa comprensione di questi sistemi è difficile da raggiungere a causa di geni raramente essere specifico per un tipo di cella d'isolamento o la posizione, una mancanza di conoscenza biologica e inefficienza dei sistemi utilizzati per indurre l'espressione Cre. I metodi qui descritti dimostrano come abbiamo superato questi problemi attraverso il design sperimentale e l'applicazione delle conoscenze esistenti. Anche se abbiamo usato questi metodi per rispondere a una domanda di ricerca specifica le tecniche presentate qui sono generiche e può essere sfruttata per qualsiasi ricerca indagando la muriintestino ne.

Preparazione del tessuto intestinale

Il passo fondamentale per garantire risultati affidabili è la raccolta e la lavorazione dei tessuti, che deve essere elaborato in modo tempestivo protocolli maniera e fissaggio rigorosamente rispettati. Come quasi tutti i problemi significativi a valle può essere attribuito ad artefatti associati con l'essiccamento del tessuto e / o di fissaggio incompleta. Sincronizzazione è cruciale per prevenire la degradazione di architettura del tessuto e / o di acidi nucleici e proteine. Fissazione incomplete o troppo zelanti può causare perdita di risoluzione istochimica. Fissazione incompleta a causa del tempo o le sezioni troppo spessi per consentire la penetrazione fissativo può causare la perdita di risoluzione entro cripte intestinali che possono essere osservati come un "segno di marea" all'analisi IHC insufficiente. Inoltre è importante che la fissazione non si estende troppo a lungo, come nucleare β-catenina può diffondere fuori dal nucleo meno immediatamente pronon trasformati e cera incorporati dopo fissazione in formalina.

Ruolo delle cellule Paneth nella nicchia ISC

I dati qui presentati mostrano efficacemente l'importanza delle cellule Paneth nella rigenerazione cripta nell'intestino adulto seguente perdita ISC. Tuttavia, vi è rimasta la possibilità che Ah-cre risparmia una popolazione di ISC che gli obiettivi T2 vil-Cre-ER. Tian et al. 26 elegantemente dimostrato che le ISC hi Lgr5 sono sostituiti da una popolazione di Lgr5 Lo ISC di riserva. Ora sembra probabile che queste ISC sono risparmiati nel sistema di Ah-cre a causa della popolazione di riserva essendo stato identificato come precursori delle cellule secretoria 6,7. L'importanza della cella Paneth matura nel sostenere questi precursori delle cellule di secrezione, se necessario, per ripristinare uno stato di ISC resta da risolvere. Come le cellule Paneth costituiscono l'hoSC nicchia 8 e svolgere ruoli nel regolare le risposte ISC di apporto calorico 27 e infiammazione 28 rimane probabile che le loro funzioni di cura si estenderanno alle loro precursori.

Nuovi approcci e tecnologie in modo efficace modello umano cancro colorettale

La scoperta del CSI ha portato alla identificazione di geni che ora vengono utilizzati per generare nuovi modelli di topo per studiare il ruolo dei geni e cellule in biologia e le malattie intestinali, recensito da Clarke et al 9. Le uniche limitazioni di questa tecnica è l'identificazione di geni per esprimere la proteina Cre. Attualmente ISC sono regolarmente esaminati utilizzando topi transgenici condizionali in base al pattern di espressione genica Lgr5. I topi che esprimono Cre dal promotore Lgr5 sono stati utilizzati per eliminare Apc, il gene più frequentemente mutato nel tumore del colon-retto (CRC), Dimostrando l'ISC come cellula di origine 25. Selettivamente eliminare altri geni CRC in queste cellule si permettono di approfondire la progressione della malattia e la diffusione ad es. PTEN 29. Una visione più completa funzione ISC è stato ripreso da specificamente ablazione Lgr5 esprimente cellule nei topi utilizzando un recettore della tossina difterica umano (DTR) gene buttato nel Lgr5 locus 26. Altre strategie utilizzano il sistema Tet-O che consente corso espressione reversibile delle proteine ​​mutanti 30. L'utilizzo di questi strumenti per modificare gene (s) in diverse cellule 31 e le posizioni 32,33 viene utilizzato per capire come avviare il cancro, il progresso e metastasi 34. In alternativa, mutagenesi utilizzando il sistema di bellezza trasposoni sonno è identificare nuovi driver di CRC. Il continuo sviluppo di topi, tecniche e strategie di alterazione genetica continua a sviluppare modelli provvisti di più pazienti.

Nuovo metodi sono stati sviluppati per la caratterizzazione dei epiteli intestinali e ISC. Caratterizzazione del rapporto di tipi di cellule epiteliali può essere raggiunto mediante citometria a flusso basato sulla espressione differenziale delle lectina e CD24 35. Potenzialmente il più grande progresso nella comprensione ISC biologia e il loro ruolo nella malattia saranno effettuati utilizzando la ex vivo organoide sistema di coltura 36. Questo sistema permette ISC normali e maligne alla cultura in 3D, dove si replicano e si differenziano in modo più fisiologicamente rilevanti. Si spera che questi permetteranno la verifica diretta delle droghe su campioni di pazienti in vitro, aprendo la strada per la medicina personalizzata 37.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetate buffer * * To make 100 ml: 4.8 ml 0.2 M Acetic acid, 45.2 ml 0.2 M Sodium acetate & 50 ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue pH 2.5 * * To make 500 ml: 15 ml acetic acid, 5 g Alcian Blue & 485 ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7 g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340 mg/100 ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 min. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100 ml: 1 g Hydroquinone, 5 g sodium sulphite & 100 ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100 ml: 10 ml Acetate buffer, 87 ml distilled water, 3 ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1x PBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200 μl X-gal (A) in 50 ml solution B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferricyanide, 0.734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4 °C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21

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References

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: http://www.molecularmovies.com/movies/view/96 (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
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Biologia dello Sviluppo Numero 105 Intestino Cre-Lox topo cellule staminali cellule di paneth transgenici
Protocolli per l&#39;analisi del ruolo delle cellule Paneth in Rigenerazione della murino Intestino con condizionale<em&gt; Cre-lox</em&gt; Modelli mouse
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Parry, L., Young, M., El Marjou, F., … More

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).

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