Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Protokoll för att analysera rollen av Paneth celler i Återskapa Murin tarm använder villkorad Published: November 21, 2015 doi: 10.3791/53429
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1European Cancer Stem Cell Research Institute, Cardiff University, 2Institut Curie

Summary

Intestinala epitelstamceller (ISCs) samsas med Paneth celler. Dessa celler differentieras avkomma av ISC, som stöder ISCs och ger antibakteriellt skydd. Här visar vi hur vi använt transgena modeller villkorliga musen för att fastställa att Paneth celler spelar en avgörande roll för att upprätthålla tarm epitel.

Abstract

Epitelyta däggdjurstarmen är en dynamisk vävnad som förnyar var 3 - 7 dagar. Att förstå denna förnyelse process identifierade en befolkning på snabbt cykla tarm stamceller (ISCs) kännetecknas av deras uttryck av Lgr5 genen. Dessa stöds av en vilande stamcellspopulation, präglad av BMI-1 expression, med förmåga att ersätta dem i händelse av skada. Undersöka samspelet mellan dessa grupper är avgörande för att förstå deras roller i sjukdomar och cancer. De ISCs finns inom kryptor på tarmytan, dessa nischer stöder ISC i påfyllning epitel. Samspelet mellan aktiva och vilande ISCs innebär sannolikt andra differentierade celler i den nisch, som det har tidigare visats att '' stemness '' av Lgr5 ISC är nära knuten till förekomsten av sina grann Paneth celler. Med hjälp av villkorlig cre-lox musmodeller vi testade effekten av att ta bort de flesta aktiva ISCs i närvaro eller frånvaro av Paneth-celler. Här beskriver vi de tekniker och analyser som gjorts för att karakterisera tarmen och visar att Paneth celler spelar en avgörande roll i ISC nisch i att bistå återhämtning efter betydande förolämpning.

Introduction

Luminalytan av däggdjurs tarmen funktioner upprepade enheter av kryptor och fingerliknande utsprång, kallas villi, som skjuter in i lumen. Denna yta är ett kontinuerligt ark av epitel som genomgår fullständig självförnyelse ungefär var 3 - 4 dagar 1. Denna dynamiska vävnad stöds av en population av snabbt cykla stamceller (ISCs; även känd som crypt bas kolumnära celler), som inledningsvis identifierades genom deras expression av Lgr5 genen 2,3. Dessa celler existerar i en nisch i botten av kryptor Lieberkuhn. Initialt upptäckten att ISCs ades snabbt cykla var disharmoniska med den rådande uppfattningen att en stamcell var vilande i naturen. Föregående till identifiering av Lgr5 + ISC det antogs att en population av vilande etikettkvarhållande celler vid 4 positionen, i förhållande till basen i kryptan, var ISCs 1. Ny forskning hsom nu förenas dessa observationer genom att visa att i första hand finns en pool av ekvipotent cykling ISCs i varje kryptan vars öde regleras av sina grannar 4,5. I de fall de förlorade dessa kan ersättas med vilande celler som normalt har åtagit sig att den sekretoriska linjen, men kan återgå till ISCs om ISC befolkningen skadas 6.

ISC grannar kan antingen vara ISCs eller deras dotterceller. De ISCs producerar naiva dotterceller som förökar sig och differentieras till de specialiserade celltyper som utgör epitelark vilka ledningar tarm lumen 1. Bägaren, enteroendocrine, enterocyter, tofs och M-celler migrerar uppåt till luminalytan där de ger olika absorberande och reglerande funktioner, dock Paneth cellerna kvar på botten i kryptan där de existerar samsas med ISCs. Under de senaste åren har det visat sig att en del av den naiva daughtER-celler avsedda för en sekretorisk härstamning är vilande etikettkvarhållande Lgr5 lo celler som kan återgå till en ISC vid skada 6,7.

På grund av dess betydelse i kryptan regenerering prioriteras placerades på att förstå samspelet mellan ISCs och dess grannländer, särskilt Paneth cellerna. De Paneth celler spelar en avgörande roll i den nisch som stöder ISCs 8. Utöver bakteriedödande produkter de Paneth cellerna producerar signalmolekyler som aktiverar banorna som styr ISC förnyelse eller differentiering. Tidigare studier visade att Lgr5 + ISCs endast skulle kunna existera när de kunde konkurrera om väsentliga nischsignaler som tillhandahålls av deras dotter Paneth-celler 8. Dessa studier undersökte rollen av Paneth celler på normal Lgr5 + ISCs och inte i en situation där de är skadade och kräver påfyllning från en Lgr5 lo befolkning.

9,10. Ofta dessa modeller använder cre-lox teknik för att villkorligt modifiera gen (er) 9,10. Cre (Orsaker rekombination) rekombinas är en platsspecifik rekombinas i integras familjen, isolerad från bakteriofag P1. Cre katalyserar platsspecifik rekombination mellan definierade 34 bp " Lox P "(locus χ av crossover P1) webbplatser. Möss genetiskt för att innehålla loxP-ställen som flankerar regioner av intresse, som vid uttryck av Cre-rekombinas är utskurna. Länkning av uttrycket av cre-genen till en cell eller utvecklingsspecifik promotor tillåter ändring göras i en spatial mode 9,10 är detta särskilt användbar i att övervinna embryonala letala mutationer. Vidare förbinder Cre uttryck för en receptor väg,som kan aktiveras på konstgjord väg, medger tids förändringar.

Med hjälp av denna teknik vi inaktiverade CatnB genen 11 i tarm epitel. β-catenin, den CatnB genprodukten, är en viktig reglerare av kanoniska Wnt signalväg som reglerar ISC homeostas. Två tidigare studier med denna strategi gett motstridiga resultat 12,13. Studien av et al. Fevr 12, demonstrerade förlust av stamceller och intestinala homeostas. Medan Irland et al. 14 studie rapporterade att efter en minskning av cellviabilitet kryptan-villus axel var nyinsatta från vildtypceller uttrycker CatnB. Den stora skillnaden i dessa studier var promotor som används för att uttrycka Cre i tarm epitel. Den Fevr et al., Använde studien villin genpromotorn kopplad till östrogenreceptorn som kan aktiveras genom att administrera tamoxifen (vil-Cre-ER T2) 15,16. I motsats Irland et al., Utnyttjade promotorelementet av rått cytokrom P450A1 (CYP1A1) genen för att driva Cre uttryckning som svar på den xenobiotiska β-naftoflavon (Ah-CRE). Egenskaperna hos dessa olika system genererat två hypoteser för att redogöra för dessa olika observationer. Den första att CatnB är mer effektivt bort i ISC hjälp av vil-Cre-ER T2 system jämfört med Ah-cre, och därigenom minska antalet ISCs till sub Insättning nivåer. Alternativt var på grund av differentiell CatnB deletion i differentierade cellpopulationen. De vil-Cre-ER målen T2 systemet alla epitelceller i kryptan och villus medan Ah-cre systemet riktar bara de icke-Paneth celler av ISC nisch och krypta. Dessa system, under förutsättning idealiska verktyg för att undersöka behavIOR av ISCs och deras samspel med Paneth cellerna. Här presenterar vi flera detaljerade protokoll som bygger på hur vi använt dessa system för att fastställa att Paneth celler spelar en avgörande roll när det gäller att förmedla tarm svar på skada 17.

Protocol

Information om allt material som används ges i tabell 1. Alla djurförsök utfördes under överinseende av en brittiska inrikesministeriet projektlicens.

1. CatnB Radering med hjälp av Ah-cre och Vil-Cre-ER T2 Systems

  1. Korsa musstammar för att generera 10-14 veckor gamla kohorter av Ah-cre + CatnB + / +, Ah-cre + CatnB flox / flox, vil-Cre-ER T2 CatnB + / + och vil-Cre-ER T2 CatnB Flox / flox. För visuell analys av rekombination via en β-gal fläck, skall kohorter innehålla Rosa26R-lacZ reporter 17. Kohorter bör kontrollera med avseende på förekomst av modifierade gener och användning av induktionsmedel, bör storleken av kohorter som krävs beräknas med hjälp av en maktanalys.
  2. För att inducera Ah-cre transgen förbereda β; -Naphthoflavone (BNF), eller för vil-Cre-ER T2 transgen tamoxifen (TAM) i majsolja för att ge en arbetslösning av 10 mg / ml. OBS: Medlen bör vägas i ett dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
  3. Värme lösningar i en bärnstensfärgad flaska (BNF är ljuskänsligt) till antingen 99,9 ° C för BNF eller 80 ° C för TAM i ett vattenbad.
  4. Överför till en upphettad omrörare inställd på 100 ° C i BNF, eller 80 ° C under TAM, och rör om under 10 minuter.
  5. För BNF upprepa 1,3-1,4 tills det är upplöst (kan ta> 1 timme).
  6. Alikvot i små bärnstensfärgade flaskor (~ 5 ml) och fryst sedan vid -20 ° C. Flaskor ska kasseras efter tre frysning / upptiningscykler. Före användningen tina medel och värma till lämplig temperatur, om de har fallit ut ur lösningen. Låt svalna till <37 ° C före injektionen.
  7. Injicera mössen intraperitonealt (IP) med en dos av 80 mg / kg, t ex en 25 g mus erhåller 0,2 ml av appropriate induktionsmedel. För Ah-cre leverera tre injektioner under 24 timmar period, vil-Cre-ER T2 ger en injektion per dag under 4 dagar.

2. Dissekering av Intestine för Reporter Visualisering och immunohistokemi (IHC)

  1. Euthanize musen med halsdislokation utan föregående bedövning i enlighet med etiskt godkännande. Placera musen i ryggläge och väta päls med användning 70% EtOH, öppna intra-peritoneala kaviteten i längdriktningen längs mittlinjen med användning av en sax.
  2. Säkra magen med en pincett och skilja de anslutningen till matstrupen. Ta bort tunntarmen till bilagan genom att försiktigt dra i magen. Ta bort tjocktarmen upp till anus genom att försiktigt dra i appendix.
  3. När tarmarna har isolerats bort magen och appendix. Spola tarmar med 1 x PBS med användning av en spruta med en trubbig ände pipettspets. OBS: Varje tarmen bör vara immediately beredda för en av nedströms tillämpningar som beskrivs nedan.

3. Formalin Fixering av Stine

  1. Skär spolas tarmen i 3 lika stora sektioner och etikett proximala, mellersta och distala. Skär varje avsnitt i 1 cm bitar. Ta en liten remsa av kirurgisk tejp 2 cm x 2 cm. Placera tre till fem 1 cm bitar på mitten av den kirurgiska tejpen i en pyramid bildning.
  2. Stäng och försegla tejpen runt bitarna i längsled, för att ge en "logg stapel" effekt. Placera vävnad i en flatbottnad behållare innehållande ett stort överskott av neutralt buffrad formalin fixativ, åtminstone 10x volymen av fixativ till volymen av vävnad. OBS: Undvik att placera stora mängder av vävnad i ett rör för fixering, dela upp den i flera behållare.
  3. Placera proverna vid 4 ° C i åtminstone arton - 24 h före inbäddning och snittning. För att förhindra förlust av kärn β-catenin, inte fixa än 24 timmar.Efter fixering överföringsvävnaden till en flatbottnad behållare innehållande ett stort överskott av 70% EtOH, åtminstone 10x volymen av vävnaden.

4. Methacarn Fixering av Stine

  1. Före dissekering förbereda methacarn fixativ genom att kombinera 300 ml MeOH, 150 ml kloroform och 75 ml isättika (4: 2: 1). Skär spolas tarmen i 3 lika stora sektioner proximala, mellersta och distala.
  2. Placera varje bit av tarmen sida vid sida på en bit filterpapper (15 cm x15 cm) och använder en springbow sax öppna upp "en face". Placera tarmen och filterpapper i en glasskål innehållande methacarn för tre - 24 h vid RT. Efter fixering plocka upp i slutet av en tarm behållaren med en tång.
  3. Vind tarmen runt tången för att bilda en "rulltårta" och säkra rullen genom lätt att öppna tången och sätta en 25 G-nål genom den. Placera vävnad i en flatbottnad behållare innehållande en laRGE överskott av neutralt buffrad formalin fixativ, åtminstone 10 x volymen av fixativ till vävnadsvolym och lagra under minst 1 timme innan man fortsätter med behandling.

5. Hela Mount LacZ Visualisering (Ändrad från El Marjou et al. 18)

  1. Förbered vax plattor genom att kombinera smält ralwax med mineralolja på 10: 1. Häll i 15 cm petriskålar och låt svalna. Förbered X-gal fixativ enligt tabell 1 och förvara på is.
  2. Ta bort hela tarmen och spola igenom med iskall 1x PBS, enligt avsnitt 2. Fix tarmen genom spolning med 25 ml iskall X-gal fixativ.
  3. Med hjälp av en sax klippa tarmen in 3 - 5 lika delar (max 5 per platta). Placera varje avsnitt på vax plattan och sätta fingret på varje ände så att sektionen är något sträckt med mesenteriala linjen uppåt; trimma eventuellt överskott tarmkäx. Med hjälp av en springbow sax klippa tarmen längdled och stift ut längs vägen.60;
  4. Svämma plattan med X-gal-fixativ för att täcka sektionerna och låt stå i minst en timme vid 4 ° C. Ta bort X-gal fixativ med hjälp av en 25 ml pipett och tvätta en gång med 30 ml 1x PBS. Täckdelarna med 30 ml DTT demucifying lösning för 30 - 60 min vid RT, helst på en gungande plattform.
  5. Ta demucifiying lösningen med en 25 ml pipett och översvämma plattan med 30 ml 1x PBS. Med användning av en pastörpipett tvätta tarmen sektioner med 1 x PBS i plattan för att avlägsna slem.
  6. Ta 1x PBS med en 25 ml pipett och översvämningar med 30 ml X-gal fläcken. Inkubera över natten vid RT i mörker under försiktig omröring på en gungande plattform.
  7. Efter inkubation över natten kontrollera att sektionerna har utvecklat en blå / grön fläck, om bakgrundsfärgen är fortfarande vitt, kan färsk färgningslösning tillsättas och övervakas till färgning utvecklas. OBS: När avsnitten har målat ingen ytterligare färgning kan prövas.
  8. Ta bort X-gal fläckmed hjälp av en 25 ml pipett och översvämningar platta med 30 ml 1x PBS och låt stå i tre minuter under försiktig omrörning. Ta bort stiften och plocka upp, med pincett, i slutet av en tarm sektion. Vind tarmen runt tången för att bilda en "rulltårta", säkra rullen genom lätt att öppna tången och sätta en 25 G-nål genom den.
  9. Placera vävnad i en stor öppning flatbottnad behållare som innehåller ett stort överskott av neutralt buffrad formalin fixativ, åtminstone 10x volymen av fixativ till volymen av vävnad. Placera proverna vid 4 ° C under minst 24 h före inbäddning och snittning.

6. Utvinning av Crypts från Intestine

  1. Isolera de första 20 cm av tunntarmen, enligt avsnitt 2. Placera tarmen på en ren dissekera yta och med hjälp av en pincett och sax avlägsna eventuella vidhängande fett / tarmkäx. Med hjälp av en springbow sax öppna tarmen längdled.
  2. Med hjälp av ett mikroskop locket, firmly skrapa tarmlumen för att avlägsna villi och slem. Med hjälp av en sax klippa tarmen in ~ 5 mm bitar och överför till en 50 ml rör med 25 ml 1x HBSS kompletterat med penicillin (100 U / ml) och streptomycin (100 U / ml).
  3. Inkubera i 10 min vid RT. Avlägsna antibiotikumet innehållande media genom att leda proven genom ett 70 | im cellfilter.
  4. Placera tarm sektioner i ett nytt 50 ml rör innehållande 10 ml 1x HBSS och tillbaka locket.
  5. Vänd försiktigt två gånger och avlägsna 1x HBSS genom att passera genom en 70 ìm cell sil. Ytterligare tvätta tarm stycken genom att upprepa 6.4 och 6.5 tre gånger och se till att den slutliga fraktionen är relativt klart.
  6. Överför vävnad till ett färskt 50 ml rör innehållande 10 ml EDTA (8 mM) / 1x HBSS och lämna vid RT under 5 minuter. Skaka kraftigt (20 - 30x) eller virvel, passera genom en 70 ìm cell sil och överföringsvävnadsbitar till ett nytt 50 ml rör innehållande EDTA (8 mM) / 1x HBSS. NOTERA:Flödet genom kan antingen kasseras eller behållas om det krävs analys av villi epitel.
  7. Inkubera vävnaden bitar på is under 30 minuter, skaka provet kraftigt (20 - 30x) eller virvel. Passera proverna genom en 70μm cell sil och behålla flödet genom eftersom det innehåller kryptor.
  8. Överför vävnaden bitar till ett nytt 50 ml rör innehållande 10 ml 1x HBSS. Skaka kraftigt (20 - 30x) eller virvel, passera genom en 70 ìm cell sil och behålla flödet genom. Upprepa en gång för att säkerställa maximal återhämtning av kryptor från tarm bitar. Kombinera flödet genom fraktioner och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Häll av vätskan och behålla kryptan pelleten. OBS: Pellet kan användas omedelbart för odling (i förekommande fall) eller lagrades vid -80 ° C före standardtekniker för DNA / RNA / protein extraktionsförfaranden.

7. Standard Immunohistokemisk Visualisering

  1. Skär 5 μm sektioner av paraffininbäddad vävnad på poly-L-lysin (PLL) glider. Obs: Ett standardprotokoll för färgning med en B-katenin antikropp ges nedan, är parametrar för andra antikroppar ges i tabell 2.
  2. De-vax med 2x 3 min tvättar i glid bad som innehåller färsk xylen. Rehydrera genom passage objektglasen i 3 min genom glid bad innehållande färska: 100% EtOH (2 x), 95% EtOH och 70% EtOH och slutligen in i 1 x PBS.
  3. Placera objektglasen i en glid bad innehållande citratbuffert (pH 6) och värm 99,9 ° C under 20 min för att hämta antigener. Låt objektglasen svalna och sedan tvätta 3x 5 min i ett bildspel bad innehållande 1xTBS / T under 5 min. Ta bort diabilder från sista tvättningen, omedelbart dra runt vävnad med en PAP penna, och täcker avsnitt med en kommersiell peroxidas block eller 1,5% H 2 O 2 (i destillerat H2O).
  4. Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur (RT) tvätta sedan 3x i glid bad innehållande färsk 1x TBS / T för 5 minuter. Efter tvätting täckdelarna, med hjälp av en pipett i 5% normalt kaninserum (NRS) / 1xTBS / T under 30 minuter vid RT för att blockera ospecifik hydrofob bindning av din primära antikropp.
    1. Avlägsna NRS block med en pasteurpipett och täckande sektionen i B-katenin primär antikropp utspädd 1: 200 med 5% NRS. Tvätta diabilder för 3x 5 min i glid bad innehåller färska 1xTBS / T. Obs - andra antikroppar kräver optimering för utspädning och specificitet. För att säkerställa specificiteten hos en antikropp, bör lämpliga inga antikroppar och isotyp kontrollfläckar utföras. En isotypkontroll är anpassad till värdarten och isotyp av din primära antikroppen.
  5. Visualisera med antingen ett kommersiellt HRP detektionskit eller med en lämplig fluorescensmärkt sekundär antikropp (tabell 2). OBS: Längd på utveckling är olika för varje antikropp, för β-catenin 10 - 15 sek är vanligen tillräcklig. För att optimera utvecklingen för en antikropp första establish den tid som krävs för att visualisera positiva celler med användning av en positiv kontroll objektglas och sedan använda denna för alla efterföljande bilder.
  6. Tvätta diabilder för 3x 5 min i glid bad innehåller färska TBS / T. Kontrast diabilder genom nedsänkning i ett bildspel bad innehållande haematoxylin för ~ 45 sekunder (krävs inte om du använder fluorescerande sekundära antikroppar). Sätt objektglasen i ett rent objektglas bad och skölj med rinnande kranvatten under ~ 1 minut, garantera hematoxylin är inte helt tvättas ur.
  7. Torka diabilder genom att passera genom glid bad innehållande ökande koncentrationer av alkoholer; 1x 30 s i 70% EtOH, 1x 30 s i 95% EtOH, 2x 30 sek tvättningar i 100% EtOH, 2x 2 min i xylen.
  8. Mount glider under täck med ett kommersiellt montering media. OBS: Om du använder fluorescensmärkt antikropp Fäste med en medium innehållande DAPI att märka kärnan.

8. Histologisk identifiering av specifika Intestinal epitelceller

  1. Enterocyterna
    1. Förbered sektioner med hjälp avsnitt 7 med villin antikroppen och villkor som beskrivs i tabell 2.
  2. Entero-endokrina celler (Grimelius färga 18,19).
    1. Förbered sektioner genom att följa steg 7,1-7,2. Tvätta objektglasen i ett bildspel bad innehållande ultrarent vatten i 3 min. Överför objektglasen till en glid bad innehållande förvärms silverlösning (tabell 1) och inkubera vid 60 ° C under 3 h.
    2. Ta bort bilderna från silverlösningen och plats i ett bildspel bad innehållande nygjord förvärmd reduktionslösning (Tabell 2) vid 45 ° C under 3 min. Ta glasen och placera in en bild bad innehållande färskt ultrarent vatten i 3 min. Följ steg 7,6-7,8 från avsnitt 7.
  3. Bägarceller (Alcian Blue-färgning).
    1. Förbered sektioner genom följande steg 7,1-7,2 .. Överför bilder till ett bildspel bad innehållande Alcian Blue pH 2,5 under 5 min vid RT. Ta Alcian blånad med en pipett och plats slide bad under rinnande vatten i 3 - 5 min. Följ steg 7,6-7,8. OBS: Alcian blue-lösning kan behållas för vidare användning.
  4. ISCs.
    1. För att identifiera de ISCs följer avsnitt 9.
  5. Paneth-celler.
    1. Förbered avsnitt efter avsnitt 7 med hjälp av lysozym antikropp och villkor som beskrivs i tabell 2.

9. In Situ-RNA Detektion med Murin Stine 19-21

  1. Placera 5 um sektioner från formalin fast tarmen (avsnitt 3) på PLL diabilder. Förbered en arise digoxigenin märkt RNA-sond för att detektera Olfm4 expression 21. Dewax och rehydrate sektioner enligt avsnitt 7. OBS: Detta protokoll bör utföras i en RNAse miljö för att förhindra nedbrytning av RNA-sond.
  2. Rita runt tproblem med en PAP-penna för att minimera reagens. Inkubera sektioner i en slid bad med 6% H2O 2 (i destillerat H2O) under 30 minuter. Tvätta två gånger i en slid bad med färsk 1x PBS i 3 minuter. Kasta 1x PBS och med hjälp av en pipett, täcksektion med 4% paraformaldehyd under 20 minuter på is.
  3. Tvätta två gånger i en slid bad med färsk 1x PBS i 3 minuter. Med hjälp av en pipett täckdelarna med proteinas K-lösning under 5 minuter Tvätta i en slid bad med färsk 1x PBS i 3 minuter. Användning av en pipett efter fix sektioner genom att täcka i 4% paraformaldehyd under 5 min vid RT.
  4. Tvätta i ett bildspel bad med DEPC behandlade H 2 0 för 2 min. Med hjälp av en pipett täckdelarna i ättiksyraanhydrid lösning för 10 min med omröring. Tvätta i ett bildspel bad med färsk 1x PBS / 3 min, följt av 1x saltlösning / 3 min. Passera glider genom bad innehållande ökande koncentrationer av alkoholer; 1x 30 sek i 70% EtOH, 1x 30 sekunder i 95% EtOH, 2x 30 sek tvättar i färska 100% EtOH,2x 2 min i färsk xylen och låt lufttorka.
  5. Späd Olfm4 sond 1: 100 i hybridiseringsbuffert och denaturera prob genom upphettning till 80 ° C under 3 minuter. Tillsätt 100 pl av sond till varje avsnitt och täck med parafilm för att förhindra uttorkning av bilden. Inkubera över natten i en mörk, fuktig kammare vid 65 C.
  6. Tvätta i ett bildspel bad med 5 x SSC vid 65 ° C under 15 minuter. Tvätta sektioner i en slid bad två gånger med färsk 50% formamid / 5 x SSC / 1% SDS under 30 minuter vid 65 C. Tvätta avsnitt två gånger i en bild bad i färskt PBT i 10 minuter, det första vid 65 ˚C och den andra vid RT. Med hjälp av en pipett täckdelarna med PBT innehållande 25 mikrogram RNas under 45 minuter vid 37 ° C. Tvätta sektioner i en slid bad i PBT under 5 min vid RT.
  7. Tvätta sektioner i en slid bad två gånger med färsk 50% formamid / 5 x SSC under 30 min vid 65 C. Blockera täckdelarna med hjälp av en pipett med 10% får serum i PBT och förvara i en mörk, moist kammare vid RT under 2 - 3 h.
  8. Förbered antikropp genom att späda anti-digoxigenin alkaliskt fosfatas konjugerad antikropp vid en: 500 med 10% fårserum i PBT innehållande 5 mg / ml mus tarm pulver. Inkubera under 3 h vid 4 ° C i mörker på en gungande plattform. Centrifugera ner för avlägsnande av överskott tarm pulver och tillsätt 3 x volymer av 1% fårserum i PBT till supernatanten.
  9. Ta kvarter från bilder med en pipett och tillsätt 100 pl av antikroppslösningen till varje avsnitt, täck med parafilm och inkubera i en mörk, fuktig kammare vid 4 ° C över natten. Tvätta sektioner i en slid badet 3 × med färskt PBT under 5 min. För att blockera delar tvätta i en bild bad 3 × med färska NTMT buffert under 5 min.
  10. Att visualisera med hjälp av en pipett täcker varje avsnitt med BM lila och inkubera i mörker vid rumstemperatur under 24-72 timmar tills en tillräckligt stark färg utvecklas. Tvätta sektioner i en slid badet en gång i PBT- och motfärga genom nedsänkning i eosin för en minut. Remove överskott eosin genom att tvätta avsnitt i en bild bad under rinnande vatten i 3-5 min. Doppa objektglasen i xylen och låt lufttorka. Montera under täck använder kommersiella medier.

10. Histologisk Karakterisering av Intestinal epitel

  1. Placera 5 um sektioner från den fasta vävnaden (avsnitt 3 & 4) på ​​PLL diabilder. Analysera ≥25 slumpmässig helhet (eller ≥50 halv) kryptor från ≥4 möss av varje årskull för var och en av följande parametrar. OBS: För att upprätthålla konsekvens analysera kryptor från samma plats varje tarmen (använd endast den proximala änden).
  2. Cellulära parametrar från standard H & E färgade snitt (om inte annat anges): Crypt antal, höjd, apoptos och mitos.
    1. Crypt nummer.
      1. Använd en låg effekt förstoring (t.ex. 4X eller 10X) för att manuellt räkna antalet kryptor i kontakt med basalskiktet. Count ≥10 tvärgående proximala tarmen sektjoner från minst 4 möss.
    2. Crypt höjd.
      1. Använd en högeffekts förstoring (t.ex. 20X eller 40X) för att manuellt räkna antalet celler från botten av kryptan till kryptan / villusen axel (figur 3b).
    3. Apoptos 22, 23.
      1. Metod 1: Använd en hög effekt förstoring (t.ex. 20X eller 40X.) För att manuellt räkna antalet apoptotiska celler i varje krypta. Apoptotiska celler kan identifieras genom cellkrympning, kromatinkondensation, bildning av cytoplasmiska blåsor och apoptotiska kroppar (fig 3a).
      2. Metod 2: Genomför en IHC fläck (punkt 7) för kaspas-3 med användning av betingelser som beskrivs i tabell 2 Använda en hög effekt förstoring (t.ex. 20X eller 40X.) Manuellt räkna antalet positiva celler i varje kryptan att kvantifiera cellerna i. verkställandefasen av apoptos.
    4. Mitos. Använd en hög effekt förstoring (t.ex. 20X eller 40X) för att manuellt räkna antalet mitotiska celler i varje krypta. Mitotiska celler innehåller kondenserad DNA-material och är vanligtvis symmetriska och välformade (figur 3b).
  3. Spridning.
    1. Gör en IHC (avsnitt 7) fläck för Ki-67 med användning av betingelser som beskrivs i tabell 2. Räkna manuellt positiva celler för att kvantifiera andelen kryptceller prolifererande.

Representative Results

Jämföra ISC Rekombination Effektivitet i Ah-cre och Vil-Cre-ER T2 Systems

Användning av dessa cre-lox system för att utvärdera rollen av Paneth-celler, i återbefolkning tarmen efter skada, krävs karakterisering av effektiviteten hos rekombination inom ISCs. Använda Rosa26R-lacZ villkorlig reporter vi visat att i båda systemen 3 dagar efter induktion (dpi) det finns ~ 100% rekombination i tunntarmen (Figur 1a). Kvantifiera närvaron av rekombinerade allelen av qPCR var förvirrad av skillnaderna i Cre uttrycksmönster mellan systemen. Den vil-Cre-ER T2 systemet visade en 3,53-faldig ökning i närvaro av det rekombinerade allelen jämfört med Ah-cre-systemet, på grund av dess expression i en större del av epithelien 16. För att övervinna detta har vi antagit en annan strategi som tillät oss att direkt jämföra systemen. Vi inducerade mössen med olika induktionsregimer och analyserades vid 30 dpi, vid vilken punkt LacZ positiva kryptor och villus utgör en ISC rekombination händelse. Med denna metod vi visat att i båda systemen, 3 injektioner av inducerande medel (levereras IP vid 80 mg / kg i 24 timmar), rekombinerade i ett motsvarande antal ISCs trots initiala rekombination nivåer är långt större i vil-Cre-ER T2 systemet 16 (Figur 1b-d). Vidare, med användning av DNA extraherat från de rekombinerade kryptor, qPCR för de rekombinerade alleler uppvisade en icke-signifikant ökning av rekombination med hjälp av vil-CRE- ER T2-system, eventuellt på grund av rekombination i Paneth-celler inte observeras när Ah-cre-systemet (fig 1d). Vidare, färgning för typer epitel cell inte indiCate någon ändring differentiering mönster, representativa bilder av varje celltyp undersökts visas i figur 2e-2h.

Karakterisering av Intestinal epitel efter CatnB Radering

Kvantifiering av Crypt Loss

Karaktärisera kinetik rekombination i dessa Cre system möjligt för oss att analysera musen tarmen när motsvarande antal ISCs rekombineras. Använda LacZ reporter båda systemen visade fullständig förlust av rekombinerade (blå) celler vid 3 dpi (Figur 2a). Som tidigare rapporterats tre dagar efter radering av CatnB Ah-CRE möss visade partiell crypt förlust, medan vil-Cre-ER T2 möss visade fullständig destruktion av kryptan / villusen axeln 13,16,24 (Figur 2b-d). Dynamics of Epithelial Återplantering

Med hjälp av tekniker ovan vi kännetecknad flera parametrar så att vi kan förstå denna observation. Representativa bilder av parametrarna och celltyper analyserades med hjälp av protokollen 7-10 ges i (figur 3a och 3b). I korthet, den förlust av kryptor var förenliga med de förhöjda nivåer av apoptos som visas i båda systemen (fig 3e). Men mitos, spridning, crypt cellulära höjd, crypt och uttryck (ej visad) data indikerade Ah-cre systemet kan återhämta sig, förmodligen på grund av återplantering av FN-rekombinerade ISCs (Figur 3c). I skarp jämförelse vil-Cre-ER T2 misslyckats med att återvinna trots behålla epitelceller kryptceller (figur 3d).

Karakterisering av Cellular Fenotyper inom Crypt

För att förstå varför kryptor från Ah-CRE möss kunde återbefolka medan vil-Cre-ER T2 inte kunde vi kännetecknas epitelcellerna tre dagar efter radering av CatnB. Använda in situ hybridisering (avsnitt 9) och IHC-analys (avsnitt 7, 8 & 10) vi visat att kryptceller i vil-Cre-ER T2 CatnB Flox / Flox möss icke-proliferativ och saknade uttryck av ISC markören Olfm4 till skillnad från de kryptor i Ah-Cre möss (Figur 4c & f). Som första karakterisering hade visat att rekombination i kryptor motsvarade vi fortsatte att undersöka betydelsen av Paneth cellerna. Vi gjorde en dubbel fluorescent IHC mot CatnB och Lyz1 att identifiera vilka celler hade förlorat β-catenin och om de var Paneth celler (Figur 5a-5c). Såsom tidigare beskrivits vi demonstrated att alla kryptceller är riktade med hjälp av vil-Cre-ER T2 systemet. I jämförelse slipper Ah-cre gäller system Paneth celler och villus epitel. Ytterligare Paneth celler var endast observerats genomgår apoptos efter CatnB deletion med hjälp av vil-Cre-ER T2 system (figur 5d och 5e).

Figur 1
Figur 1: Jämförelse av specificitet och effektivitet Cre / Lox Rekombination inom intestinala epitel med hjälp av Ah-cre och Vil-Cre-ER T2 Systems (a). Visualisering av Ah-cre LacZ reporter uttryck i wholemount små (SI; * bortre änden) och stora (LI, * bortre änden) från en vild typ mus. (b): Resultat av qPCR visar faldig förändring för återförenas CatnB flox allelen vid 1 dpi för att jämföra olika induktionsregimer i Ah-cre CatnB flox / flox (BNF inducerad) och vil-Cre-ER T2 CatnB flox / flox (TAM-inducerad ); * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-svans] jämfört med kontrollen). (c) - (e):.. Wholemount tunntarmen som visar LacZ positiv crypt 30 dpi Panel (b) - (e) ändras från Parry et al 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2: Jämförelse av den Ah-cre och Vil-Cre-ER T2 CatnB i Tunntarm epitel (a):. Wholemount tunntarm som visar förlust av rekombinerade celler i Ah-cre CatnB flox / flox LacZ + möss under 3 dagar. (b): Kvantifiering av crypt förlust 3 dagar efter strykningen av CatnB; * P> 0,05 (Mann-Whitney [2-svans] jämfört med kontrollen). (c & d): Tvär H & E delar av formalinfixerade tarmen visar förlust av kryptor efter CatnB radering. (e) - (h) Exempel på celltyper från kontrollmöss: (e) entero-endocriine celler, (f) bägarceller, (g) CatnB IHC indikerar en ISC (→) med nukleära B-catenin & (h) Paneth celler. Panel (b) ändras från et al. Parry 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

gether.within-page = "always"> Figur 3
Figur 3: Karakterisering av Uppkomsten av Fenotyp när du använder Ah-cre och Vil-Cre-ER T2 System för Villkor Radera CatnB i liknande Antalet ISCs i tunntarmen epitel (a & b) H & E färgade formalinfixerade sektioner med indikation om var kryptan. höjd ([), en apoptotisk (←) och mitotiska cell (↓). Kvantifiering av det genomsnittliga antalet celler per krypta mellan vildtyp (blå) och CatnB Flox (orange) möss vid tre tidpunkter (dpi) (c) crypt höjd, (d) mitos och (e) apoptos (felstaplarna indikerar standardavvikelse ). Panel (c) - (e) ändras från Parry et al 16.3429fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4:. Jämförelse av ISC egenskaper med hjälp av Ah-cre och Vil-Cre-ER T2 System för Villkor Radera CatnB i tunntarmen epitel Epithelial kryptceller 3 dagar efter strykningen av CatnB använda Ah-cre (ac) eller vil- Cre-ER T2 (df) systemet. (A & D) H & E sektion visar områden crypt förlust; (b & d) Ki-67 IHC demonstrerar förlust av proliferativa celler med hjälp av vil-Cre-ER T2; (c & f) Olfm4 in situ visar närvaro av funktionella ISCs använder Ah-cre. Panel (a) -. (f) ändras från Parry et al 16 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5: Karakterisering av Paneth-celler efter CatnB Radering med användning av de Vil-Cre-ER T2 och Ah-cre system (ac):. Immunfluorescens bilder av kryptor visar Paneth cellen (röd), B-catenin (grön) och kärnan (blå ), pil indikerar membranbundna β-catenin; (de) IHC för caspas-3 indikerande apoptotiska Paneth celler är frånvarande i den Ah-cre (d), men som föreligger i vil-Cre-ER T2 systemet (e). Panel (a) - (e) modifierad frånParry et al 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Immpress HRP Anti-mus-IgG Kit
Acetatbuffert * * För att göra 100 ml: 4,8 ml 0,2 M ättiksyra, 45,2 ml 0,2 M natriumacetat och 50 ml destillerat vatten
Ättiksyra Fisher Scientific C / 0400 / PB17
Ättiksyraanhydrid Sigma A6404
Ättiksyraanhydrid lösning * * 2 M ättiksyraanhydrid i 0,1 M trietanolamin-hydroklorid
Alcian Blue- Sigma A5268
Alcian Blue-PH 2,5 * * För att göra 500 ml: 15 ml ättiksyra, 5 g Alcian Blue & 485 ml destillerat vatten
anti-digoxigenin alkalinfosfatas konjugerad antikropp Abcam ab119345
B (beta) -Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, injicera utan att lösningen svalna alltför mycket som föreningen kommer att falla ut ur lösningen. Lösningen kan återanvändas - förvara vid -20 ° C mellan användningarna, inte värma mer än två gånger.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM lila Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovint serumalbumin
Kloroform Fisher Scientific C / 4920/17
Citrat buffert / Antigen demaskera Solution Vector Labs H-3300
Majsolja Sigma C8627
Demucifiying lösning * * För 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0,1 M pH 8,8, 100 ml EtOH, 300 ml saltlösning (0,9% NaCl i vatten), DTT 1,7 g. Demucifying lösning kan göras i förväg och lagras, men DTT sholud sättas strax före inkubation (340 mg / 100 ml).
DEPC-behandlat vatten Life Technologies 750.023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0,5 M
Etanol Fisher Scientific E / 0650DF / 17
Filtrerpapper Whatman 3000917
Formaldehyd Sigma F8775
Formalin Sigma SLBL11382V Neutral buffrad formalin
Formamid Sigma F5786
Glutaraldehyd Sigma G6257
H2O 2 Sigma 216.763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2 ^; -CaCl2)
Hybridiseringsbuffert * * 5 x SSC, 50% formamid, 5% SDS, 1 mg / ml heparin, 1 mg / ml kalvlever tRNA
Hydrokinon Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidas Vector Labs SK-4105
Vector Labs MP-7402
Immpress HRP-anti-kanin-IgG-Kit Vector Labs MP-7401
Tarmvävnad pulver * * De små inälvorna av 5 vuxna möss kombinerades och homogeniserades i minsta möjliga volym iskall PBS. 4 volymer iskall aceton sattes till den homogeniserade tarmen, som blandades grundligt och inkuberades på is under 30 minuter. Detta centrifugerades och pelleten tvättades med hjälp av iskall aceton. Detta centrifugerades ytterligare och den resulterande pelleten spreds på filterpapper och fick torka. När torka materialet maldes till ett fint pulver med användning av en mortelstöt och mortel.
K-ferricyanid Sigma P-3667
K-ferrocyanid Sigma P3289 Levamisol Sigma L0380000
Methacarn * * 60% metanol: 30% kloroform: 10% Ättiksyra
Metanol Fisher Scientific M / 4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normalt getserum Vector Labs S-1012 NGS
Normalt kaninserum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween 20, 2 mM Levamisol
PAP penna Vektor H-400
Paraformaldehyd Sigma P6148
PBT * * 0,5 M NaCl, 10 mM trisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20
Penicillin / streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Fosfatbuffrad saltlösning (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 med destillerat vatten för att göra 1x
PLL diabilder Sigma P0425-72EA Poly-L-lysin objektglas
Proteinas K Sigma P2308
Proteinas K-lösning * * Späd proteinas K vid 200 | ig / ml i 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36.154 7N
Reducer Lösning * * För att göra 100 ml: 1 g hydrokinon, 5 g natriumsulfit och 100 ml destillerat vatten
RNasA Sigma R6148 </ td>
Salin * * 0,9% NaCl i destillerat vatten
SDS Sigma I3771
Fårserum Sigma S3772
Silvernitrat Sigma S / 1240/46
Silverlösning * * För att göra 100 ml: 10 ml acetatbuffert, 87 ml destillerat vatten, 3 ml 1% silvernitrat
Natriumacetat Fisher Scientific S / 2120/53
Natriumklorid Sigma S6753 NaCI
Natriumsulfit Sigma 239.321
SSC Sigma 93.017 20x salin natriumcitrat
Kirurgisk tejp Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, injicera utan att lösningen svalna alltför mycket som föreningen kommer att falla ut ur lösningen. Lösningen kan återanvändas - förvara vid -20 ° C mellan användningarna, inte värma mer än två gånger.
TBS / T Cell Signalering # 9997
Trietanolaminhydroklorid Sigma T1502
Tris-HCl Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
Vectashield Hardset monterings Medium med DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vecteller Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixativ * * 2% formaldehyd, 0,1% glutaraldehyd i 1xPBS
X-gal stain * * X-gal färgning; 200 jil X-gal (A) i 50 ml lösning B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-ferricyanid, 0,734 g K-ferrocyanid i 500 ml PBS). Lösning B kan göras upp oin förväg och lagrades vid 4 ° C
Xylen Fisher Scientific X / 0200/21

Tabell 1: Material och metoder

d> 1/200, 30 min vid RT
Mål beta-catenin Lysozym Ki67 Caspas-3 Villin
Kommersiell källa för primär Ab Transduction Labs Neomarkers Vector Labs FoU-Systems Santa Cruz
Katalognummer 610.154 RB-372 VP-K452 AF835 SC-7672
Primär Ab upp i Mus (mAb) Kanin (pAb) Mus (mAb) Kanin (pAb) Get (pAb)
Antigenåtervinning Kokande vattenbad / citratbuffert Kokande vattenbad / citrat-buffert Kokande vattenbad / citrat-buffert Kokande vattenbad / citrat-buffert Kokande vattenbad / citrat-buffert
Peroxidas-block Bloxall eller 2% H2O 2, 45 sek Bloxall eller 1,5% H2O 2, 30 min Bloxall eller 0,5% H2O 2, 20 min Bloxall eller 2%H2O 2, 45 sek Bloxall eller 3% H2O 2, 20 min
Serumblocket 1% BSA, 30 min 10% NGS, 30min 20% NRS, 20 min 10% NGS, 45 min 10% NRS, 30 min
Tvättbuffert PBS TBS / T TBS / T PBS TBS / T
Villkor för primär Ab 1/300, 2 h vid RT 1/100, 1 h vid RT 1/50, 1 h vid RT 1/750, O / N vid 4 ° C 1/500, 1 h vid RT
Sekundär Ab Immpress HRP Anti-mus-IgG Kit Immpress HRP-anti-kanin-IgG-Kit Biotinylerad kanin anti-mus Biotinylerad get anti-kanin Biotinylerad kanin anti-get
Villkor för sekundär Ab 1 h vid RT 30min vid RT 1/200, 30 min vid RT 1/200, 30 min vid RT
Signalförstärkning N / A N / A ABC-kit ABC-kit ABC-kit
Signaldetektion ImmPACT DAB Peroxidas ImmPACT DAB Peroxidas ImmPACT DAB Peroxidas ImmPACT DAB Peroxidas ImmPACT DAB Peroxidas
Immunofluorescens-antikropp Alexafluor 488 Alexafluor 594 N / A N / A N / A
Immunfluorescensegenskaper Exciterings Max 488 / Emission Max 525 Excitation Max 595 / Emission Max 617
Vanliga Filter Set FITC Texas Red
innehåll "> Tabell 2: IHC Antikroppar och villkor

Discussion

Använda villkor CRE-flytande transgena möss för att dissekera funktionen hos gener och celler är ett vanligt förekommande tillvägagångssätt. Dessa modeller har använts med stor framgång i tarmen för att identifiera och karakterisera stamceller 2,4,6 och förstå deras roll i sjukdoms 25. För att till fullo utnyttja dessa modeller kräver en omfattande karakterisering av systemet för att göra det möjligt för data som skall tolkas korrekt. En fullständig förståelse av dessa system är svårt att uppnå på grund av gener sällan vara specifika för en ensam celltyp eller plats, brist på biologisk kunskap och ineffektivitet av de system som används för att framkalla Cre uttryck. De metoder som beskrivs här visar hur vi övervinna dessa frågor genom experimentell utformning och tillämpning av befintlig kunskap. Även om vi använde dessa metoder för att besvara en specifik frågeställning de tekniker som presenteras här är generiska och kan utnyttjas för all forskning undersöker murine tarmen.

Framställning av tarmvävnad

Det avgörande steg för att säkerställa robusta resultat är skörd och bearbetning av vävnaden, som måste behandlas i tid och fixeringsprotokoll strikt efterlevs. Som nästan alla viktiga frågor nedströms kan tillskrivas artefakter i samband med vävnaden uttorkning och / eller ofullständig fixering. Timing är avgörande för att förhindra nedbrytning av vävnadsarkitektur och / eller nukleinsyror och proteiner. Ofullständig eller övernitisk fixering kan leda till förlust av histokemisk upplösning. Ofullständig fixering på grund av tidsbrist eller sektioner för tjock för att tillåta fixerings penetration kan leda till förlust av upplösning inom tarm kryptor som kan observeras som en "tide mark" på IHC analys. Vidare är det viktigt att fixeringen inte sträcker sig för länge, eftersom kärn β-catenin kan diffundera ut ur kärnan inte direkt probearbetas och vax inbäddade efter formalin fixering.

Roll Paneth celler i ISC Niche

De data som presenteras här visar effektivt hur viktigt det är Paneth celler i kryptan förnyelse i den vuxna tarmen efter ISC förlust. Men det återstod möjligheten att Ah-cre reservdelar en population av ISCs att vil-Cre-ER T2 mål. Tian et al., 26 elegant visat att Lgr5 hi ISCs är ersatta med en population av Lgr5 lo reserv ISCs. Det verkar nu sannolikt att dessa ISCs besparas i Ah-cre systemet på grund av reserv befolkningen som har identifierats som sekretorisk cellprekursorer 6,7. Betydelsen av den mogna Paneth cell för att stödja dessa sekretoriska cellprekursorer när det behövs för att återgå till en ISC tillstånd återstår att besvara. Som Paneth-celler utgör jagSC nisch 8 och spela roller i reglering av ISC svar på kaloriintag 27 och inflammation 28 förblir sannolikt att deras vårdfunktioner kommer att sträcka sig till sina egna föregångare.

Nya strategier och teknik för att effektivt Model Human kolorektal cancer

Upptäckten av ISC ledde till identifiering av gener som nu används för att generera nya musmodeller för att undersöka rollerna av gener och celler i tarm biologi och sjukdom, som granskats av Clarke et al, 9. De enda begränsningar för denna teknik är att identifiera gener som uttrycker Cre-proteinet. För närvarande ISCs rutinmässigt undersöks med hjälp av villkorade transgena möss som bygger på Lgr5 genuttrycksmönstret. Möss som uttrycker Cre från Lgr5 promotorn har använts för att ta bort Apc, den gen som oftast muterad i kolorektal cancer (CRC), Vilket visar ISC som cellen ursprungs 25. Selektivt ta bort andra CRC gener i dessa celler ger insikt i sjukdomsförloppet och sprida exempel. PTEN 29. Ytterligare inblick i ISC funktion hämtas genom att specifikt ablation Lgr5 uttryckande celler i möss med användning av en human difteritoxinreceptor (DTR) gen knackade i Lgr5 locus 26. Andra strategier använder Tet-O-systemet som möjliggör fortsatt reversibel uttryck av muterade proteiner 30. Med hjälp av dessa verktyg för att ändra gen (er) i olika celler 31 och platser 32,33 används för att förstå hur cancer initiera, framsteg och metastasera 34. Alternativt kan mutagenes med hjälp av Törnrosa transposon systemet är att identifiera nya förare av CRC. Den fortsatta utvecklingen av möss, tekniker och genetisk förändring strategier fortsätter att utvecklas mer tålmodiga relevanta modeller.

Nya metoder har utvecklats för karakterisering av intestinala epitel och ISCs. Karakterisering av förhållandet av epiteliala celltyper kan nås genom användning flödescytometri baserad på det differentiella uttrycket av lektin och CD24 35. Potentiellt största framstegen förstå ISC biologi och deras roll i sjukdoms kommer att göras med hjälp av ex vivo organoida odlingssystem 36. Detta system gör det möjligt för normala och maligna ISCs till kultur i 3D, där de replikera och skilja på ett mer fysiologiskt relevant sätt. Förhoppningen är att dessa kommer att möjliggöra direkt testning av droger på patientprover in vitro, vilket banar väg för personlig medicin 37.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetate buffer * * To make 100 ml: 4.8 ml 0.2 M Acetic acid, 45.2 ml 0.2 M Sodium acetate & 50 ml distilled water
Acetic acid Fisher Scientific C/0400/PB17
Acetic anhydride Sigma A6404
Acetic anhydride solution * * 2 M Acetic anhydride in 0.1 M triethanolamine hydrochloride
Alcian Blue Sigma A5268
Alcian Blue pH 2.5 * * To make 500 ml: 15 ml acetic acid, 5 g Alcian Blue & 485 ml distilled water
anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody Abcam ab119345
B(beta)-Naphthoflavone Sigma N3633 BNF, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
Bloxall Vector Labs SP-6000
BM purple Roche 11442074001
BSA Sigma A4503 Bovine serum albumin
Chloroform Fisher Scientific C/4920/17
Citrate Buffer/Antigen Unmasking Solution Vector Labs H-3300
Corn oil Sigma C8627
Demucifiying solution * * For 500 ml: 50 ml glycerol, 50 ml Tris 0.1M pH8.8, 100 ml EtOH, 300 ml saline (0.9% NaCl in water), DTT 1.7 g.  Demucifying solution can be made in advance and stored, but DTT sholud be added just before incubation (340 mg/100 ml).
DEPC treated water Life Technologies 750023
DTT Sigma 101509944
EDTA Sigma O3690 0.5M
Ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17
Filter paper Whatman 3000917
Formaldehyde Sigma F8775
Formalin  Sigma SLBL11382V Neutral buffered formalin
Formamide Sigma F5786
Glutaraldehye Sigma G6257
H2O2 Sigma 216763
Haematoxylin Raymond A Lamb 12698616
HBSS Gibco 14175-053 HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Hybridisation buffer * *  5× SSC, 50% formamide, 5% SDS, 1 mg/ml heparin, 1 mg/ml calf liver tRNA
Hydroquinone Sigma H9003
ImmPACT DAB Peroxidase Vector Labs SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG Kit Vector Labs MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG Kit Vector Labs MP-7401
Intestinal tissue powder * * The small intestines of 5 adult mice were combined and homogenised in the minimum volume of ice cold PBS. 4 volumes of ice cold acetone were added to the homogenised intestine, which was mixed thoroughly and incubated on ice for 30 min. This was centrifuged and the pellet was washed using ice cold acetone. This was further centrifuged and the resulting pellet spread onto filter paper and allowed to dry. Once thoroughly dry the material was ground to a fine powder using a pestle and mortar. 
K-ferricyanide Sigma P-3667
K-ferrocyanide Sigma P3289
Levamisole Sigma L0380000
Methacarn * * 60% Methanol:30% Chloroform:10% Acetic acid
Methanol Fisher Scientific M/4000/17
MgCl2 Sigma M8266
Normal goat serum Vector Labs S-1012 NGS
Normal rabbit serum Dako X0902 NRS
NTMT * * 100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween20, 2 mM Levamisole
PAP pen Vector H-400
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBT * * 0.5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH7.5, 0.1% Tween 20
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 100x solutiuon.
Phosphate buffered saline (10x) Fisher Scientific BP3994 Dilluted 1:10 with distilled water to make 1x
PLL slides Sigma P0425-72EA Poly-L-lysine microscope slides
Proteinase K Sigma P2308
Proteinase k solution * * Dilute Proteinase K at 200 µg/ml in 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax BDH 36154 7N
Reducer Solution * * To make 100 ml: 1 g Hydroquinone, 5 g sodium sulphite & 100 ml distilled water
RnaseA Sigma R6148
Saline * * 0.9% NaCl in distilled water
SDS Sigma I3771
Sheep serum Sigma S3772
Silver nitrate Sigma S/1240/46
Silver solution * * To make 100 ml: 10 ml Acetate buffer, 87 ml distilled water, 3 ml 1% silver nitrate
Sodium acetate Fisher Scientific S/2120/53
Sodium Chloride Sigma S6753 NaCl
Sodium sulfite Sigma 239321
SSC Sigma 93017 20x saline sodium citrate
Surgical tape Fisher Scientific 12960495
Tamoxifen Sigma T5648 TAM, inject without allowing the solution to cool too much as compound will drop out of solution. Solution can be re-used – store at -20 °C between uses, do not reheat more than twice.
TBS/T Cell Signalling #9997
Triethanolamine hydrochloride Sigma T1502
Tris-HCL Invitrogen 15567-027
Tween20 Sigma TP9416
VectaMount Vector Labs H-5000
VectaShield Hardset mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1500
Vectastain ABC Kit Vector Labs PK-4001
X-gal Promega V3941
X-gal fixative * * 2% formaldehyde, 0.1% glutaraldehyde in 1x PBS
X-gal stain * * X-gal stain; 200 μl X-gal (A) in 50 ml solution B (0.214 g MgCl2, 0.48 g K-ferricyanide, 0.734 g K-ferrocyanide in 500 ml PBS).  Solution B can be made up oin advance and stored at 4 °C
Xylene Fisher Scientific X/0200/21

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. Am J Anat. 141 (4), 537-561 (1974).
  2. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  3. Clevers, H. The gut, a clonal conveyor belt. , Available from: http://www.molecularmovies.com/movies/view/96 (2015).
  4. Snippert, H., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  5. Lopez-Garcia, C., Klein, A. M., Simons, B. D., Winton, D. J. Intestinal stem cell replacement follows a pattern of neutral drift. Science. 330 (6005), 822-825 (2010).
  6. Buczacki, S. J., et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5. Nature. 495 (7439), 65-69 (2013).
  7. Basak, O., et al. Mapping early fate determination in Lgr5+ crypt stem cells using a novel Ki67-RFP allele. EMBO J. 33 (18), 2057-2068 (2014).
  8. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).
  9. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Molecular oncology. 7 (2), 178-189 (2013).
  10. Sauer, B., Henderson, N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85 (14), 5166-5170 (1988).
  11. Brault, V., et al. Inactivation of the beta-catenin gene by Wnt1-Cre-mediated deletion results in dramatic brain malformation and failure of craniofacial development. Development. 128 (8), 1253-1264 (2001).
  12. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/β-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Molecular and Cellular Biology. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  13. Ireland, H., et al. Inducible Cre-mediated control of gene expression in the murine gastrointestinal tract: effect of loss of beta-catenin. Gastroenterology. 126 (5), 1236-1246 (2004).
  14. Kemp, R., et al. Elimination of background recombination: somatic induction of Cre by combined transcriptional regulation and hormone binding affinity. Nucleic Acids Res. 32 (11), e92 (2004).
  15. Madison, B. B., et al. Cis elements of the villin gene control expression in restricted domains of the vertical (crypt) and horizontal (duodenum, cecum) axes of the intestine. J Biol Chem. 277 (36), 33275-33283 (2002).
  16. Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Evidence for a crucial role of paneth cells in mediating the intestinal response to injury. Stem Cells. 31 (4), 776-785 (2013).
  17. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
  18. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  19. Guillemot, F., Nagy, A., Auerbach, A., Rossant, J., Joyner, A. L. Essential role of Mash-2 in extraembryonic development. Nature. 371 (6495), 333-336 (1994).
  20. Gregorieff, A., et al. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology. 129 (2), 626-638 (2005).
  21. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  22. Merritt, A., Allen, T., Potten, C., Hickman, J. Apoptosis in small intestinal epithelial from p53-null mice: evidence for a delayed, p53-independent G2/M-associated cell death after gamma-irradiation. Oncogene. 14 (23), 2759-2766 (1997).
  23. Marshman, E., Ottewell, P., Potten, C., Watson, A. Caspase activation during spontaneous and radiation-induced apoptosis in the murine intestine. J Pathol. 195 (3), 285-292 (2001).
  24. Fevr, T., Robine, S., Louvard, D., Huelsken, J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells. Mol Cell Biol. 27 (21), 7551-7559 (2007).
  25. Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
  26. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  27. Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486 (7404), 490-495 (2012).
  28. Adolph, T. E., et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation. Nature. 503 (7475), 272-276 (2013).
  29. Marsh, V., et al. Epithelial Pten is dispensable for intestinal homeostasis but suppresses adenoma development and progression after Apc mutation. Nat Genet. 40 (12), 1436-1444 (2008).
  30. Jardé, T., et al. In vivo and in vitro models for the therapeutic targeting of Wnt signaling using a Tet-OΔN89β-catenin system. Oncogene. 32 (7), 883-893 (2013).
  31. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  32. Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., Karsenty, G. Mouse alpha1(I)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn. 224 (2), 245-251 (2002).
  33. Hinoi, T., et al. Mouse model of colonic adenoma-carcinoma progression based on somatic Apc inactivation. Cancer Res. 67 (20), 9721-9730 (2007).
  34. Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
  35. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nat Cell Biol. 14 (4), 401-408 (2012).
  36. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  37. van de Wetering, M., et al. Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank of Colorectal Cancer Patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).

Tags

Utvecklingsbiologi tarm Cre-Lox mus stamcells Paneth cell transgena
Protokoll för att analysera rollen av Paneth celler i Återskapa Murin tarm använder villkorad<em&gt; Cre-lox</em&gt; Musmodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., … More

Parry, L., Young, M., El Marjou, F., Clarke, A. R. Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models. J. Vis. Exp. (105), e53429, doi:10.3791/53429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter