Abstract
פיברובלסטים הם סוג תא העיקרון אחראי להפרשת מטריקס ומהווה מרכיב קריטי של איברים ורקמות רבים. פיזיולוגיה והפתולוגיה פיברובלסטים בבסיס ספקטרום של גופים קליניים, כולל fibroses באיברים רבים, הכוויות הבאות צלקות hypertrophic, אובדן תפקוד לב לאחר איסכמיה, והיווצרות של סרטן סטרומה. עם זאת, fibroblasts יישאר סוג גרוע מאופיין של תא, במידה רבה בשל ההטרוגניות הטבועה בם. שיטות קיימות לבידוד של fibroblasts דורשות זמן בתרבית תאים שעמוקים משפיע פנוטיפ תא והתנהגות. כתוצאה מכך, מחקרים רבים חוקרים ביולוגיה פיברובלסטים להסתמך על מניפולציה במבחנה ולא מדויק ללכוד פיברובלסטים התנהגות in vivo. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד של fibroblasts מעור הגב של עכברים בוגרים שאינו דורש תרבית תאים, וכך preserving תעתיק הפיזיולוגי ופרופיל proteomic של כל תא. האסטרטגיה שלנו מאפשרת להדרה של שושלות שאינן mesenchymal באמצעות שער שלילי שושלת (לין -) ולא אסטרטגית בחירה חיובית, כדי למנוע מראש את הבחירה או העשרה של תת-אוכלוסייה של fibroblasts להביע סמני משטח ספציפיים ולהיות כוללניים ככל האפשר ברחבי זה הטרוגנית סוג תא.
Introduction
Fibroblasts לעתים קרובות מוגדר כמורפולוגית תאים דמוי כישור שלדבוק מצעי פלסטיק. פיברובלסטים הם סוג תא העיקרון אחראי לסינתזה ושיפוץ מטריקס באיברים עובריים ומבוגרים 1. פיברובלסטים הם כך קריטיים להתפתחות יונקים ולתרום באופן משמעותי לסביבה תאית המשפיעה על ההתנהגות של שכנות סוגי תאים הנמצאים בכל רקמות ואיברים.
פיברובלסטים הם גם סוג התא העיקרי מאחורי קבוצה מגוונת של מצבים רפואיים הגורמים לניטל קליני עצום. פעילות פיברובלסטים פתולוגיים פוגעת בתפקוד רקמה נורמלי וכוללת רקמה והאיבר סיסטיק (כגון ריאות וכבד), הצטלקות הבאה ריפוי פצע עורית, טרשת עורקים, טרשת מערכתית, והיווצרות הפלאק טרשתי לאחר פציעת כלי דם 2-5. ריפוי פצעים בפרט, שתי בחריפות וכרונית, כרוך דeposition של רקמת צלקת שלא דומה לי ולא פונקציות כמו הרקמה הנורמלית המקיפות אותו, ומוביל לתחלואה משמעותית על פני מדינות פתולוגיים שונות. בעקבות פציעה, יש מעבר של fibroblasts לmyofibroblasts, אשר לאחר מכן להפריש מרכיבי ECM מבניים, להפעיל אפקטים אוטוקריני על סוגי תאים שכנים, ולהחזיר את היציבות מכאנית על ידי הפקדת רקמת צלקת 6.
ברקמות עורית קיימים שונות משמעותיות באיכות תיקון פצע על פני זמן התפתחותי ובין אתרים אנטומיים. בשני השלישים הראשונים של חיי העובר מרפא ללא צלקות; עם זאת, מהשליש השלישי ובכל רחבי בגרות, בני האדם לרפא עם צלקת. אתר ספציפי, בנוסף לגיל ספציפי, הבדלים בריפוי פצע קיימים. פצעים בחלל הפה לשפץ עם היווצרות צלקת מינימאלית 7,8, ואילו בתצהיר רקמת צלקת בתוך פצעי cutaneous הוא משמעותי 9. מחלוקת נמשכת גoncerning ההשפעה היחסית של הסביבה לעומת המאפיינים הפנימיים של fibroblasts המקומי בתוצאה של ריפוי פצע בלגבי שני גיל ומיקום 10,11. בהתחשב בהבדלים המשמעותיים בריפוי של עכבר אוראלי לעומת הדרמיס עורית ועוברי מוקדם יותר (E15) לעומת מאוחר יותר עוברי דרמיס (E18), סביר להניח כי הבדלים מהותיים באוכלוסיות של fibroblasts בגילים התפתחותיים מסוימים ובין אתרים אנטומיים שונים קיימים .
בשנת 1986, הרולד פ דבוז'ק הניח גידולים פצעים שלא מחלים 12. דבוז'ק הגיע למסקנה כי גידולים להתנהג כמו פצעים בגוף ולגרום לסטרומה על ידי הפעלת ריפוי פצע תגובה של המארח. מאז מחקרים רבים חקרו את התרומה של fibroblasts להתקדמות של קרצינומה של 13-15, אבל כמו במקרה של ריפוי פצע, הזהות ומקור עוברי של פיברובלסטים שתורמים לתא סטרומה של CA עוריתrcinomas לא הוגדר כראוי. התשובה לשאלה זו נושאת את הרלוונטיות רפואיות שניתן מחקרים האחרונים חושפים פיברובלסטים הקשורים גידול כמטרה פוטנציאלית יעילה לטיפול אנטי-סרטני 16.
זיהוי ולהבא בידוד שושלות פיברובלסטים ניחן בפוטנציאל fibrogenic in vivo הוא צעד חיוני לקראת יעילות המניפולציה תגובתם לפגיעה במגוון רחב של מצבי מחלה אקוטיים וכרוניים. בשינה 1987, קורמאק הפגין שתי תת-אוכלוסיות של fibroblasts, אחד המתגורר בתוך פפילרי ואחד בתוך הדרמיס רשתי 17,18. תת-אוכלוסייה שלישית נמצאה קשור לזקיקי שיער באזור papilla עורי של 19,20 הזקיק. כאשר בתרבית, הבדלי התערוכה תת פיברובלסטים אלה בפוטנציאל צמיחה, מורפולוגיה, וגורם / ציטוקינים צמיחת פרופילי 21-24.
עד כה, מחקרים שבחן פיברובלסטים הואterogeneity במידה רבה לא הצליח לאפיין כראוי גיוון התפתחותיים ותפקודי בקרב fibroblasts in vivo. זה, בחלקו, הוא תוצאה של הסתמכות על אוכלוסיות פיברובלסטים תרבותיים והשפעת homogenizing של תרבית תאים או בחירה חיובית על בסיס קולט משטח עצמי לא בא לידי ביטוי בכל fibroblasts 25. מחקר שנערך לאחרונה מהמעבדה שלנו הוכיח סמן משטח עמוק ושינוי תעתיק בfibroblasts חסר תרבות התרבותית לעומת מבודד על ידי המתודולוגיה הבידוד מבוסס FACS מוצגת בכתב היד הזה 26.
בהמשך לכך, זיהינו שושלת פיברובלסטים ספציפית בתוך הדרמיס הגב עכברי וקבענו כי שושלת זו, שהוגדרה על ידי ביטוי עוברי של Engrailed-1, היא אחראית בעיקר על תצהיר רקמות חיבור בעור הגב. פונקציות השושלת במהלך שני צורות אקוטיות וכרוניות של סיסטיק כוללים ריפוי פצע, היווצרות סטרומה סרטן, וקרינה מושרה סיסטיק 27. האפיון של שושלות שונות פיברובלסטים יש השלכות קריטיות עבור טיפולים שמטרת ויסות התנהגות fibrogenic.
במקום להשתמש בפרוטוקולים קיימים המסתמכים על מניפולציה במבחנה כדי להשיג תא בידוד 28,29, פרוטוקול הקציר (איור 1) המפורטים כאן יעזור לי ניתוחים אינפורמטיבי תשואה של fibroblasts שיותר מדויק ללכוד פנוטיפ והתנהגות in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה כדלקמן שיטות שאושרו על ידי הפנל המנהלי באוניברסיטת סטנפורד במעבדת טיפול בבעלי חיים.
1. עיכול של הדרמיס Murine
- להרדים עכברים על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר הרדמה עם זריקת intraperitoneal של 100 מ"ג / קילוגרם קטמין + 20 מ"ג / קילוגרם xylazine + 3 מ"ג / קילוגרם acepromazine.
הערה: ניתן להשתמש בגילים ורקעים שונים. - להתגלח ולְהַשִׁיר שֵׂעַר עור הגב. כ יכולים להיות מבודד 100,000 תאים מחתיכה 60 מ"מ x 100 מ"מ של עור גב.
- להטביע את העכבר באתנול 70% ומקום על משטח נקי, סטרילי לייבוש.
- מייד לקצור עור עכבר גב באמצעות מספריים לנתח סטרילי. בנקבות עכברים, להימנע מלכלול את רקמת השד.
- החל בסיס הזנב, להשתמש במלקחיים לאוהל את העור ולעשות חתך רוחבי לפני לנתח לאורך מטוס העל-fascial.
- להימנע בזהירות לרבות כל שומן תת עורי בזמן קצירהעור. בדוק את העור שנקטפו לכל שומן תת עורי ולגרד אותה בזהירות את שימוש בקצה הקהה של אזמל.
- יש לשטוף את העור שנקטפו בבטאדין ואחריו פי 5 שוטף PBS על קרח.
הערה: חשוב לשמור על העור קרוב לסטרילי ככל האפשר, כדי למנוע זיהום. - לרכך את העור באמצעות סכיני גילוח ולנתח מספריים בצלחת סטרילית עד המדגם הוא של עקביות אחידה עם 2-3 חתיכות מ"מ.
- הכן 50 מיליליטר צינורות חרוטי המכילים 20 מיליליטר IV collagenase בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר בDMEM. מחלקים את העור לצינורות על בסיס חמישה עכברים לכל צינור.
- להתסיס דגימות במרץ בעוד דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באו אמבט מים או בתנור.
- הסר דגימות מהחממה ולעבור מזרק 10 מיליליטר ללא מחט 3-5x במנדף סטרילי.
- מניחים את הדגימות בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס ולנער במרץ לעוד 30 דקות.
- במנדף סטרילי, פיפטה הדגימות למעלה ולמטה 3-5x בעזרת פיפטה 10 מיליליטר. פיפטה המדגם דרך מסנן 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש.
- עובר 20 מיליליטר של 10% DMEM FBS דרך אותו המסנן למקסם את תשואת תא ולהביא את הנפח הכולל עד 40 מיליליטר. צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית, טיפול מצוין ראשון להסיר את שכבת השומן העליונה לפני שנותר supernatant.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להפחית את זיהום adipocyte. - Resuspend את כדורים ב 20 מיליליטר 10% DMEM FBS.
- להעביר את ההשעיה התא / DMEM דרך מסנן 70 מיקרומטר.
- יש לשטוף את המסנן עם 10 מיליליטר 10% DMEM FBS ו צנטריפוגות ההשעיה המסוננת ב 300 גרם במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית, לוקח שוב טיפול לראשון להסיר כל שכבת שומן שנותרה.
- אם יש זיהום משמעותי RBC (גלולה היא בעליל אדומה), מחדש להשעות את כדוריםב 20 מיליליטר חיץ תמוגה ACK ודגירה של 5 דקות על RT. אחרת דלג לשלב 24.
- הוסף נפח שווה (20 מיליליטר) של חיץ FACS (PBS, 10% FBS, 0.1% אזיד הנתרן), ואז לערבב, ולשמור בצד aliquot 5 מיליליטר כשליטה בלא כתם. צנטריפוגה המדגם שנותר ב 300 גרם במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר supernatant ולשים גלולה על קרח. התאים עשויים להיות קפוא למטה בשלב זה אם זמן FACS אינו זמין.
2. בידוד של fibroblasts על ידי FACS
- הפוך 500 μl של תערובת דגירה נוגדן שושלת לכל גלולה. לעשות זאת על ידי הוספה ראשונה 475 μl של חיץ FACS המכיל DNase (10 מיקרוגרם / מיליליטר) לצינור, ולאחר מכן הוספת CD31 fluorophore מצומדות (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (01:50), Ter -119 (1: 200), וEpCAM (1: 100) נוגדנים כדי להשיג את הדילול המתאים לכל נוגדן.
- להשעות מחדש כל גלולה ב500 μl של תערובת דגירה נוגדן שושלת דגירה השעיה זו על קרח במשך 20 דקות.
- הוסף 5מיליליטר FACS מאגר המכיל DNase (10 מיקרוגרם / מיליליטר) למדגם ולערבב בעדינות. צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 8 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant ולשטוף את התא גלולה עם חיץ FACS 5 מ"ל מכיל DNase (10 מיקרוגרם / מיליליטר) ו צנטריפוגות באמצעות אותם התנאים כמו בשלב 26.
- Resuspend גלולה ב500 μl חיץ FACS המכיל DNase (10 מיקרוגרם / מיליליטר) ולשים בצד aliquot 50 μl כביקורת צבע כדאיות.
- להוסיף צבע כדאיות של בחירת המדגם שנותר בריכוז מצויינים לצבע שבחר.
- ביצוע ניתוח FACS 31 ומיון לכדאיות Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / טר-119- תאים / EpCAM- (ראה איור 2 א). מיין ישירות למאגר FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוקפה של גישה זו (איור 1) אומת במספר הדרכים, שניתן לבחון בפירוט בפרסום האחרון שלנו 27. אלה כוללים immunocytochemistry של תאים ממוינים ותא המוני וניתוח תעתיק תא בודד של תאים טריים מסודרים. מיון fibroblasts ישירות ולא להסתמך על תרבות בצורה מדויקת יותר לוכד הפנוטיפ שלהם in vivo. שימוש בגישה שלילית שושלת דלדול (איור 2 א) ולא גישת סלקציה חיובית מונעת מראש בחירה לאוכלוסיות מסוימות. הערך של גישה זו הודגם לאחרונה על ידי Rinkevich et al. 27, זיהוי הנוכחות של fibroblasts החיובי CD26 ברמה של הדרמיס בעבר לא תאר.
כדי לוודא שהתהליך של fibroblasts culturing מוביל לשינויים משמעותיים בביטוי גנים, השתמשנו microarrays להשוות fibroblasts התרבותי לfibroblasts חסר תרבות. אנו תרבית פיברובלסטיםשבודדו על ידי שתי טכניקות, פרוטוקול הקציר החי המפורט בכתב היד הזה ופרוטוקול explant רקמות ידוע 28. ניתוח microarray כל-transcriptome גילה כי fibroblasts התרבית שבודד על ידי הקציר החי (C.LH) ועל ידי explant רקמות מתודולוגיות (C.TE) יש מידה רבה של דמיון ברמה transcriptome-רחבה עם מקדם מתאם פירסון רגע המוצר (r ) של 0.92 (איור 2). לשם השוואה, fibroblasts התרבותי שונה משמעותי מfibroblasts החי נקטף חסר תרבות (U.LH). השוואה בין C.LH לעומת U.LH הניבה r של 0.61, בעוד שהשוואה של C.TE לעומת U.LH הניבה r של 0.64 (איור 2). תוצאות אלו להקים את החשיבות של ניתוח fibroblasts נקטף חי ולא fibroblasts התרבותי. לניתוח של הבדלי תעתיק וproteomic בין fibroblasts התרבותי ולא תרבותי המבודדים באמצעות פרוטוקול זה מלא יותר, מתייחס לולמסלי <em> et al. 26
סקירת איור 1. בידוד פיברובלסטים. ייצוג סכמטי של המעורבים בפרוטוקול בידוד מבוסס FACS זה הצעדים הראשוניים. שימוש חוזר באישור ולמסלי, GG et al. שידור חי פיברובלסטים קציר מגלה Shift מרקר Surface במבחנה. הנדסת רקמות. חלק ג ', שיטות, doi:. 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. cytometry הזרימה וMicroarray ניתוח. () FACS אסטרטגית gating מראה מבחר של תאים בודדים (חלקה שמאלית), מבחר לתאי קיימא המבוסס על STA יודיד propidiumining (חלקה אמצעית), ובחירה של fibroblasts (חלקה מימין) על הבסיס שלילי שושלת לCD31, CD45, Tie2, Ter119, וEpCAM. (ב) הניתוח microarray של חסר תרבות חי שנקטפו (U.LH) לעומת התרבית חי שנקטפו (C.LH) לעומת פיברובלסטים רקמות בתרבית explant (C.TE). דמיון של ביטוי גנים בין U.LH (n = 3), C.LH (n = 3), וC.TE (n = 3) אוכלוסיות פיברובלסטים כפי שנמדד על ידי מקדם פירסון מוצר רגע המתאם (r). [C.LH לעומת C.TE: r = 0.92]; [C.LH לעומת U.LH: r = 0.61]; [C.TE לעומת U.LH: r = 0.64]. שימוש חוזר באישור ולמסלי, GG et al. שידור חי פיברובלסטים קציר מגלה Shift מרקר Surface במבחנה. הנדסת רקמות. חלק ג ', שיטות, doi:. 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה מציע אמצעי לבודד fibroblasts על ידי מיון מבוסס FACS, בהשוואה לשיטות קיימות, אשר גם לבחור עבור תת-אוכלוסייה או דורשים זמן בתרבית תאים לפני ניתוחים שלאחר מכן. הזמן הנדרש מקצירה של העור למיון של fibroblasts הוא כ 6 שעות; עם זאת, מספר העכברים המשמש בקציר ישפיע הערכה זו.
כמה נקודות בפרוטוקול דורשות טיפול מיוחד. הראשון הוא הגבלת זיהום adipocyte על ידי הסרת השומן מהעור לפני העיכול והסרת השכבה העליונה של השומנים supernatant הבאים עיכול וצנטריפוגה במהלך תהליך הבידוד. זה יכול להיות גם מועיל לשינוי לצינורות טריים לאחר התאים pelleted כחלק מרכיבי השומנים לדבוק קירות הפלסטיק של הצינורות ועלולים לזהם כביסות גלולה שלאחר מכן. נקודה שנייה כרוכה טיפול קפדני לדרמיס הנפרד מהאפידרמיסלאורך צומת אפידרמיס-עורי. למרות זיהום תאי האפידרמיס יוסר על ידי אסטרטגית דלדול FACS, מאמץ להגביל זיהום כאן עדיין צריך להיעשות.
המגבלות של גישה זו כוללות נוכחות הפוטנציאלית של זיהום תאים לא נתפסו על ידי פנל השושלת הנוכחי. בעת בחירת fluorophore מצומדת לנוגדני השושלת (CD31, CD45, Tie2, Ter119, EpCAM), חייבים חוקרים דואגים לשקול אחר סמן משטח מנתח הם עשויים לרצות לבצע. כתמים נוספים חייבים להיות בערוצים שונים מfluorophore נוגדן שושלת בחר. באופן כללי, מצאנו PacBlue להיות המצומד אידיאלי שמשמר מגוון רחב של אורכי גל זמינים לניתוח נוסף. התאמת צבע הכדאיות לfluorophore נוגדן השושלת משמרת מגוון נוסף של אורכי גל. לדוגמא, DAPI צבע הכדאיות מרגש ומאיר באורכי גל דומים לPacBlue. באופן זה, כל PO DAPIתאים חיוביים sitive ונוגדן שושלת ניתן למנוע ביעילות באמצעות שער בודד, ומשאירים רק fibroblasts קיימא כאוכלוסיית היעד. צריך גם לציין כי תאים נחשפים FBS במהלך הליך הבידוד לכמויות מוגבלות של זמן וביטוי גני השפעות צפוי זה, במידה ידועה.
היכולת למיין עד בכלל לכל אוכלוסיות פיברובלסטים מהווה הזדמנות באמת לחקור את ההטרוגניות של סוג תא זה הבין היטב. זו יש יישום בהקשר של פיזיולוגיה נורמלית, כמו גם מגוון רחב של מחלות שקשורים סיסטיק מוגזם וחריגה התנהגות פיברובלסטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מהמענק NIH R01 GM087609 (לHPL), מתנות מאינגריד Lai וביל שו לכבוד אנתוני שו (לHPL), HL099776 U01 מענק NIH (לMTL), המעבדה Hagey ל ילדים רפואת רגנרטיבית וקרן האלון (לMTL, GCG וHPL). GGW נתמכה על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, תכנית הכשרת המדען הרפואי סטנפורד, וGM07365 מענק הכשרת NIGMS. ZNM נתמכה על ידי כירורגיה פלסטי קרן מחקר המלגה גרנט וקרן משפחת Hagey. MSH נתמכה על ידי מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (CIRM) מענק הכשרת עמית קליני TG2-01159, האגודה האמריקנית לניתוחים לסתות (Asms) / לסתות מנתחי קרן (MSF) מענק מחקר פרס, וההשתלות והנדסת רקמות מלגת פרס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. Ham's Histology. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
