Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS

Published: January 7, 2016 doi: 10.3791/53430
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2,3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Surgery, John A. Burns School of Medicine, University of Hawai'i
* These authors contributed equally

Abstract

الليفية هي نوع من الخلايا المسؤولة عن إفراز المبدأ المصفوفة خارج الخلية وهي عنصر حاسم في كثير من الأعضاء والأنسجة. علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الليفية تكمن وراء مجموعة من الكيانات السريرية، بما في ذلك fibroses في أجهزة متعددة، تندب الضخامي الحروق التالية، وفقدان وظيفة القلب بعد نقص التروية، وتشكيل سدى السرطان. ومع ذلك، لا تزال الخلايا الليفية نوع رديء تتميز الخلايا، إلى حد كبير بسبب عدم التجانس الكامنة. الطرق الحالية لعزل الخلايا الليفية تتطلب وقتا في الثقافة الخلية التي تؤثر تأثيرا عميقا النمط الظاهري الخلية والسلوك. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الدراسات التحقيق الليفية البيولوجيا تعتمد على التلاعب في المختبر وليس لالتقاط بدقة سلوك الخلايا الليفية في الجسم الحي. للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطوير بروتوكول القائم على FACS لعزل الخلايا الليفية من الجلد الظهرية من الفئران الكبار التي لا تتطلب زراعة الخلايا، وبالتالي preserviنانوغرام النسخي فيزيولوجي و ملفه الشخصي البروتين من كل خلية. يسمح استراتيجيتنا لاستبعاد الأنساب غير الوسيطة عبر بوابة السلبية النسب (لين -) بدلا من استراتيجية انتقاء إيجابي لتجنب الاختيار أو تخصيب جزء من السكان من الخلايا الليفية التعبير عن علامات سطح معينة وتكون شاملة قدر الإمكان عبر هذا غير متجانسة نوع من الخلايا.

Introduction

في كثير من الأحيان يتم تعريف الخلايا الليفية شكليا باسم خلايا مغزلية الشكل التي تلتزم ركائز بلاستيكية. الليفية هي نوع من الخلايا المبدأ مسؤولة عن تجميع وإعادة عرض المصفوفة خارج الخلية في الجنينية والكبار الأجهزة 1. الليفية هي بالتالي حاسمة للتنمية الثدييات وتساهم إلى حد كبير في الوسط خارج الخلية التي تؤثر على سلوك أنواع الخلايا الموجودة في كل الأنسجة والأعضاء المجاورة.

الليفية هي أيضا نوع من الخلايا الرئيسي وراء مجموعة متنوعة من الظروف الطبية التي تسبب عبئا هائلا السريري. النشاط الليفية مرضية يضعف وظيفة الأنسجة الطبيعية، وتشمل الأنسجة وتليف الجهاز (مثل الرئة والكبد)، تندب التالية الجلدي التئام الجروح، وتصلب الشرايين، والتصلب الجهازي، وتشكيل لويحات التصلبية بعد إصابة الأوعية الدموية 2-5. التئام الجروح على وجه الخصوص، سمية حادة ومزمنة، ينطوي دeposition من ندبا أن لا يشبه ولا الوظائف مثل الأنسجة الطبيعية المحيطة به، ويؤدي إلى اعتلال كبير في جميع أنحاء دول مرضية مختلفة. بعد الإصابة، هناك انتقال الخلايا الليفية إلى myofibroblasts، والتي تفرز من ثم مكونات ECM الهيكلية، وتظهر الآثار نظير الصماوي على أنواع الخلايا المجاورة، واستعادة الاستقرار الميكانيكي عن طريق إيداع ندبا 6.

في الأنسجة الجلدية يوجد تفاوت كبير في نوعية إصلاح الجرح عبر الزمن التنموي وبين المواقع التشريحية. في الثلث الأولين من الحياة يشفى الجنين بدون تندب. ومع ذلك، من المرحلة الثالثة من الحمل على وطوال فترة البلوغ، والبشر شفاء مع ندبة. موقع معين، بالإضافة إلى سن معينة، والاختلافات في التئام الجروح وجود لها. جروح في تجويف الفم اعادة تشكيلها مع الحد الأدنى من تشكيل ندبة 7،8، بينما ترسب ندبا داخل الجروح الجلدية مهم 9. استمر الجدل جoncerning التأثير النسبي للبيئة مقابل الخصائص الجوهرية للالليفية المحلية على نتيجة التئام الجروح في ما يخص كلا من العمر والمكان 10،11. نظرا للاختلافات كبيرة في الشفاء من الماوس عن طريق الفم مقابل الأدمة الجلدية والجنينية السابقة (E15) مقابل في وقت لاحق الجنينية (E18) الأدمة، فمن المرجح أن الاختلافات الجوهرية في السكان من الخلايا الليفية في سن معينة التنموية وبين مختلف المواقع التشريحية وجود .

في عام 1986، افترض هارولد F. دفوراك الأورام هي الجروح التي لا تلتئم 12. اختتم دفوراك أن الأورام تتصرف مثل الجروح في الجسم وتحفز سدى من خلال تفعيل التئام الجروح استجابة المضيف. وقد حقق العديد من الدراسات منذ مساهمة الليفية في تطور سرطان 13-15، ولكن كما هو الحال في التئام الجروح، والهوية والمنشأ الجنينية من الخلايا الليفية التي تساهم في المقصورة اللحمية من كاليفورنيا الجلديةrcinomas لم يتم تعريفها على نحو كاف. الجواب على هذا السؤال يحمل أهمية الطبية نظرا الدراسات الحديثة تعريض الخلايا الليفية المرتبطة ورم كهدف محتمل فعال لعلاج مضاد للسرطان 16.

تحديد وعزل مستقبلي الأنساب الليفية هبوا إمكانية التليف في الجسم الحي هو خطوة أساسية نحو فعال التلاعب استجابتها للإصابة عبر مجموعة واسعة من الحالات المرضية الحادة والمزمنة. في عام 1987، أظهرت كورماك اثنين من مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الليفية، أحد المقيمين داخل حليمي واحد داخل الأدمة الشبكية 17،18. تم العثور على جزء من السكان الثالث المرتبطة بصيلات الشعر في المنطقة الحليمة الأدمية من 19،20 المسام. عندما مثقف، هذه الاختلافات فرعية الليفية المعرض في إمكانات النمو والصرف، وعامل النمو / السيتوكينات لمحات 21-24.

حتى الآن، ودراسات فحص الخلايا الليفية انهterogeneity فشلت إلى حد كبير لتوصيف واف التنوع التنموي وظيفية بين الخلايا الليفية في الجسم الحي. هذا هو، في جزء منه، هو نتيجة الاعتماد على السكان الليفية مثقف وتأثير المجانسة من زراعة الخلايا أو اختيار إيجابية على أساس مستقبلات سطح النفس لا التي عبر عنها جميع الخلايا الليفية 25. أظهرت دراسة حديثة من مختبرنا علامة السطحية العميقة والتحول النسخي في تربيتها مقابل الخلايا الليفية غير مثقف معزولة بسبب منهجية العزلة القائم على FACS المعروضة في هذه المخطوطة 26.

وفي وقت لاحق، حددنا نسب الخلايا الليفية معين داخل الأدمة ظهري الفئران وقرر أن هذه النسب، التي يحددها التعبير الجنينية من Engrailed-1، هو المسؤول الأول عن ترسب النسيج الضام في الجلد الظهري. وظائف النسب خلال أشكال حادة ومزمنة من التليف بما في ذلك التئام الجروح، وتشكيل سدى السرطان، والإشعاع المستحث التليف 27. توصيف سلالات الخلايا الليفية مميزة له آثار حاسمة لعلاجات تهدف إلى تحوير السلوك التليف.

بدلا من استخدام البروتوكولات الحالية التي تعتمد على التلاعب في المختبر لتحقيق زنزانة انفرادية 28،29، فإن بروتوكول الحصاد (الشكل 1) تفصيله هنا تساعد العائد التحليلات الإعلامية من الخلايا الليفية التي تستحوذ على نحو أدق النمط الظاهري والسلوك في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع الأساليب التي أقرها الفريق الإداري جامعة ستانفورد في مختبر رعاية الحيوان.

1. الهضم الفئران الأدمة

  1. الموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم بعد التخدير مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين 100 ملغ / كغ + زيلازين 20 مغ / كغ + آسيبرومازين 3 ملغ / كغ.
    ملاحظة: مختلف الأعمار والخلفيات يمكن استخدامها.
  2. حلاقة ويزيل الشعر على الجلد الظهرية. حوالي 100،000 الخلايا يمكن عزلها عن قطعة من الجلد الظهري 60 مم × 100 مم.
  3. غمر الماوس في 70٪ من الإيثانول ومكان على سطح نظيف، عقيمة لتجف.
  4. حصاد فورا جلد ظهري الماوس باستخدام مقص تشريح العقيمة. في إناث الفئران، وتجنب بما في ذلك الأنسجة الثديية.
  5. البدء في قاعدة الذيل، واستخدام ملقط لخيمة البشرة واجراء خفض عرضية قبل تشريح على طول الطائرة فوق واللفافي.
  6. تجنب بعناية بما في ذلك أي الدهون تحت الجلد في حين الحصادالجلد. فحص الجلد المقطوع لأي الدهون تحت الجلد وكشط بعناية تشغيله باستخدام حافة حادة من مشرط.
  7. شطف الجلد المقطوع في betadine تليها 5X يغسل PBS على الجليد.
    ملاحظة: من المهم للحفاظ على بشرة أقرب إلى عقيمة ممكن لتجنب التلوث.
  8. تخطر على الجلد باستخدام شفرات الحلاقة ومقص تشريح في طبق العقيمة حتى تكون العينة من التجانس التام مع 2-3 ملم قطعة.
  9. إعداد أنابيب مخروطية 50 مل تحتوي على 20 مل كولاجيناز الرابع بتركيز 1 ملغ / مل في DMEM. تقسيم الأدمة في أنابيب على أساس خمسة فئران في أنبوب.
  10. تستنهض الهمم عينات بقوة في حين يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إما في حمام مائي أو الفرن.
  11. إزالة عينات من الحاضنة ويمر عبر حقنة 10 مل بدون إبرة 3-5x في غطاء العقيمة.
  12. وضع العينات مرة أخرى في حاضنة عند 37 درجة مئوية ويهز بقوة لمدة 30 دقيقة أخرى.
  13. في غطاء العقيمة، ماصة للعينات صعودا وهبوطا 3-5x باستخدام ماصة 10 مل. ماصة العينة من خلال مرشح 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
  14. تمرير 20 مل من 10٪ FBS DMEM من خلال مرشح واحد لتعظيم العائد الخلية وجلب الحجم الإجمالي إلى 40 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
  15. إزالة طاف باستخدام ماصة زجاجية معقمة، مع الحرص الشديد على إزالة أول طبقة الدهون العليا قبل طاف المتبقية.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة للحد من التلوث خلية شحمية.
  16. Resuspend والكريات في 20 مل 10٪ FBS DMEM.
  17. تمرير تعليق خلية / DMEM خلال 70 ميكرون التصفية.
  18. شطف تصفية مع 10 مل 10٪ FBS DMEM وأجهزة الطرد المركزي تعليق تصفيتها في 300 غ لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
  19. إزالة طاف باستخدام ماصة زجاجية معقمة، مع الحرص مرة أخرى لإزالة أول أي طبقة الدهون المتبقية.
  20. إذا كان هناك تلوث كبير RBC (بيليه أحمر واضح)، اعادة تعليق الكرياتفي 20 مل العازلة ACK تحلل واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. تخطي ذلك إلى الخطوة 24.
  21. إضافة حجم مساو (20 مل) من FACS العازلة (PBS، و 10٪ FBS، 0.1٪ أزيد الصوديوم)، ثم خلط، ويوضع جانبا قسامة 5 مل كعنصر تحكم غير ملوثين. الطرد المركزي العينة المتبقية في 300 غ لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
  22. إزالة طاف ووضع بيليه على الجليد. قد يتم تجميد الخلايا في أسفل هذه النقطة إذا كان الوقت FACS غير متوفر.

2. عزل الخلايا الليفية التي FACS

  1. جعل 500 ميكرولتر من نسب الأجسام المضادة مزيج الحضانة لكل بيليه. القيام بذلك عن طريق إضافة أول 475 ميكرولتر من العازلة FACS تحتوي على الدناز (10 ميكروغرام / مل) إلى أنبوب، وبعد ذلك يضيف-fluorophore مترافق CD31 (1: 100)، CD45 (1: 200)، Tie2 (01:50)، تير -119 (1: 200)، وEpCAM (1: 100) الأجسام المضادة لتحقيق التخفيف منها لكل الأجسام المضادة.
  2. إعادة تعليق كل بيليه في 500 ميكرولتر من نسب الأجسام المضادة مزيج حضانة واحتضان هذا التعليق على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  3. إضافة 5مل FACS تحتوي على الدناز (10 ميكروغرام / مل) على عينة وتخلط بلطف العازلة. أجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. إزالة طاف ويغسل بيليه الخلية مع FACS 5ML العازلة التي تحتوي على الدناز (10 ميكروغرام / مل) وأجهزة الطرد المركزي التي تستخدم نفس الشروط كما في الخطوة 26.
  5. Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر FACS العازلة التي تحتوي على الدناز (10 ميكروغرام / مل)، وضعت جانبا قسامة 50 ميكرولتر كوسيلة لمراقبة صلاحية الصبغة.
  6. إضافة الجدوى صبغ الاختيار على عينة المتبقية في تركيز المحددة للصبغة المختار.
  7. إجراء تحليل FACS 31 والفرز لقابلية Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / تير-119- الخلايا / EpCAM- (انظر الشكل 2A). ترتيب مباشرة في عازلة FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم التحقق من صحة هذا النهج (الشكل 1) في عدد من الطرق، التي يمكن دراستها في التفاصيل في موقعنا نشر مؤخرا 27. وتشمل هذه مناعية الخلايا مرتبة وخلية الإعلام وحيد الخلية تحليل النسخي الخلايا مرتبة حديثا. فرز الخلايا الليفية مباشرة بدلا من الاعتماد على الثقافة بشكل أكثر دقة يلتقط في الجسم الحي على النمط الظاهري. باستخدام نهج النسب السلبية استنزاف (الشكل 2A) بدلا من نهج اختيار إيجابي يتجنب ما قبل اختيار لمجموعات سكانية فرعية معينة. وقد تجلى قيمة هذا النهج مؤخرا Rinkevich وآخرون 27، وتحديد وجود الخلايا الليفية إيجابية CD26 على مستوى الأدمة سابقا وليس وصفها.

للتأكد من أن عملية زراعة الخلايا الليفية تؤدي إلى تغييرات كبيرة في التعبير الجيني، استخدمنا المجهرية للمقارنة بين الخلايا الليفية إلى الخلايا الليفية مثقف جاهل. نحن مثقف الخلايا الليفيةالتي تم عزلها من قبل اثنين من التقنيات، وبروتوكول الحصاد الحية المفصلة في هذا المخطوط والمعروفة الأنسجة بروتوكول يزدرع 28. وكشف تحليل ميكروأري كامل Transcriptome على أن الخلايا الليفية مثقف معزولة من قبل الحصاد الحية (C.LH) ويزدرع الأنسجة (C.TE) منهجيات لديها درجة عالية من التشابه على مستوى Transcriptome على صعيد مع معامل بيرسون حظة المنتج الارتباط (ص ) 0.92 (الشكل 2B). وعلى سبيل المقارنة، اختلفت الليفية مثقف كثيرا عن حي الليفية غير مثقف تحصد (U.LH). مقارنة بين C.LH مقابل U.LH أسفرت آر 0.61، في حين أن المقارنة بين C.TE مقابل U.LH أسفرت آر 0.64 (الشكل 2B). هذه النتائج تضع أهمية تحليل الخلايا الليفية حصادها مباشرة بدلا من الخلايا الليفية مثقف. للاطلاع على تحليل أكثر اكتمالا من الخلافات النسخي والبروتين بين الخلايا الليفية مثقف وغير مثقف معزولة باستخدام هذا البروتوكول، تشير إلى والمسلي <م> وآخرون 26

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على الخلايا الليفية العزلة. تمثيل تخطيطي من الخطوات الأولية المشاركة في هذا البروتوكول العزلة القائم على FACS. إعادة استخدامها بإذن من المسلي، GG آخرون لايف الخلايا الليفية الحصاد يكشف السطحية علامة تحول في المختبر. هندسة الأنسجة. جزء C، طرق، دوى: 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. التدفق الخلوي وتحليل ميكروأري. (A) FACS استراتيجية النابضة تظهر مجموعة من الخلايا واحد (مؤامرة اليسار)، واختيار لخلايا قابلة للحياة على أساس يوديد propidium ستاining (مؤامرة المتوسطة)، واختيار الخلايا الليفية (مؤامرة اليمنى) على أساس النسب السلبية لCD31، CD45، Tie2، Ter119، وEpCAM. (B) تحليل ميكروأري من جاهل لايف المقطوع (U.LH) مقابل مثقف لايف المقطوع (C.LH) مقابل الأنسجة مثقف النباتى (C.TE) الخلايا الليفية. التشابه في التعبير الجيني بين U.LH (ن = 3)، C.LH (ن = 3)، وC.TE (ن = 3) السكان الليفية مقاسا بيرسون المنتج لحظة معامل الارتباط (ص). [C.LH مقابل C.TE: ص = 0.92]. [C.LH مقابل U.LH: ص = 0.61]. [C.TE مقابل U.LH: ص = 0.64]. إعادة استخدامها بإذن من المسلي، GG آخرون لايف الخلايا الليفية الحصاد يكشف السطحية علامة تحول في المختبر. هندسة الأنسجة. جزء C، طرق، دوى: 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول صفها في هذه المخطوطة يوفر وسيلة لعزل الخلايا الليفية عن طريق الفرز على أساس FACS، بالمقارنة مع الطرق القائمة، والتي إما تحديد لجزء من السكان أو تتطلب وقتا في ثقافة الخلية قبل التحليلات اللاحقة. الوقت اللازم من حصاد الجلد لفرز الخلايا الليفية ما يقرب من 6 ساعات. ومع ذلك، فإن عدد الفئران المستخدمة في الحصاد يؤثر هذا التقدير.

تتطلب العديد من النقاط في بروتوكول عناية خاصة. الأول هو الحد من التلوث خلية شحمية عن طريق إزالة الدهون من البشرة قبل عملية الهضم وإزالة طبقة الدهون العليا من طاف بعد الهضم والطرد المركزي أثناء عملية العزل. قد يكون من المفيد أيضا لتغيير أنابيب جديدة بعد مكعبات الخلايا إلى بعض المكونات الدهنية تلتصق على جدران بلاستيكية للأنابيب وربما تلوث غسل بيليه اللاحقة. والنقطة الثانية تتضمن بعناية فائقة لالأدمة منفصلة من البشرةعلى طول تقاطع البشرة، الأدمة. على الرغم من تلويث خلايا البشرة سوف يتم التوقف عن استراتيجية استنزاف FACS، لا يزال ينبغي بذل جهد للحد من التلوث هنا.

وتشمل القيود المفروضة على هذا النهج وجود محتمل للتلوث الخلايا لا استولت عليها لوحة النسب الحالية. عند اختيار fluorophore مترافق الأجسام المضادة النسب (CD31، CD45، Tie2، Ter119، EpCAM)، يجب على الباحثين أن تحرص على النظر في البعض يحلل علامة السطحية التي قد ترغب في القيام بها. يجب أن تكون البقع إضافية في قنوات مميزة من اختيار fluorophore نسب الأجسام المضادة. بشكل عام، وجدنا PacBlue أن يكون المترافقة المثالي الذي يحافظ على مجموعة واسعة من الأطوال الموجية المتاحة لمزيد من التحليل. مطابقة الصبغة قابلية للfluorophore نسب الأجسام المضادة يحافظ على مجموعة إضافية من الأطوال الموجية. على سبيل المثال، دابي الجدوى صبغ يثير وتتفلور في موجات مشابهة لPacBlue. بهذه الطريقة، كل ص دابيخلايا إيجابية sitive ونسب الأجسام المضادة يمكن القضاء على نحو فعال باستخدام بوابة واحدة، ولم يتبق سوى الليفية قابلة للحياة السكان المستهدفين. كما تجدر الإشارة أن تتعرض الخلايا لFBS خلال إجراء العزل لكميات محدودة من الزمن وهذا المرجح التعبير التأثيرات الجينية، إلى درجة غير معروفة.

القدرة على فرز جامعا لجميع السكان الليفية تمثل فرصة لاستجواب حقا عدم التجانس هذا نوع من الخلايا غير مفهومة. وهذا له تطبيق في سياق علم وظائف الأعضاء العادي فضلا عن مجموعة متنوعة من الأمراض التي تنطوي على تليف المفرط والسلوك المنحرف الخلايا الليفية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من منحة مقدمة من المعاهد الوطنية للصحة المنحة R01 GM087609 (لهبل)، وهي هدية من انغريد لاي وبيل شو تكريما لأنتوني شو (لهبل)، NIH منحة U01 HL099776 (لMTL)، ومختبر Hagey ل طب الأطفال الطب التجديدي، ومؤسسة أوك (لMTL، GCG وHPL). وأيد GGW من كلية ستانفورد للطب، وبرنامج التدريب ستانفورد عالم الطبية، ومنحة تدريبية NIGMS GM07365. وأيد ZNM من قبل جراحة التجميل مؤسسة أبحاث زمالة غرانت وصندوق الأسرة Hagey. وأيد MSH من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) زميل السريرية منحة تدريبية TG2-01159، والجمعية الأمريكية لجراحي الوجه والفكين (ASMS) / الوجه والفكين الجراحين مؤسسة (MSF) جائزة منحة بحثية، وزراعة الأنسجة وجائزة الهندسة الزمالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
  2. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
  3. Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
  4. Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
  5. Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
  6. Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
  7. Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
  8. Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
  9. Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
  10. Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
  11. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  12. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
  13. Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
  14. Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
  15. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  16. Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
  17. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
  18. Cormack, D. H. Ham's Histology. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
  19. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
  20. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
  21. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
  22. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
  23. Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
  24. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
  25. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
  26. Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
  27. Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
  28. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
  29. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
  30. Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
  31. Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 107، الخلايا الليفية، والحصاد، غير مثقف، مثقف، والعزلة الخلية، زراعة الخلايا، التدفق الخلوي، النسب، FACS
الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. … More

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter