Abstract
Фибробласты принцип тип клеток отвечает за секретирующие внеклеточный матрикс и являются важным компонентом многих органов и тканей. Фибробластов физиологии и патологии лежат спектр клинических лиц, в том фиброзов в различных органах, гипертрофических рубцов следующих ожогов, потери сердечной функции после ишемии, и формирование рака стромы. Тем не менее, фибробласты остаются плохо охарактеризованы тип клеток, в основном из-за присущей им неоднородности. Существующие методы выделения фибробластов требует времени в культуре клеток, что глубоко влияет клеток фенотип и поведение. Следовательно, многие исследования следственные фибробластов биологии полагаться на манипуляции в пробирке и не точно запечатлеть поведение фибробластов в естественных условиях. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали протокол FACS основе для изоляции фибробластов из спинной кожи взрослых мышей, которые не требуют культуры клеток, тем самым preserviнг физиологическую транскрипции и протеомный профиль каждой ячейки. Наша стратегия позволяет исключения, не мезенхимальных линий через клонов отрицательной ворот (Лин -), а не позитивной стратегии выбора, чтобы избежать предварительного отбора или обогащения субпопуляции фибробластов выражения конкретных поверхностных маркеров и быть как можно более через это гетерогенная тип клеток.
Introduction
Фибробласты часто определяется морфологически веретенообразных клеток, которые придерживаются пластиковых подложках. Фибробласты принцип тип клеток отвечает за синтез и реконструкции внеклеточного матрикса в эмбриональных и взрослых органов 1. Фибробласты, таким образом, решающее значение для развития млекопитающих и вносят существенный вклад в внеклеточной среде, которая влияет на поведение соседних типов клеток, присутствующих в каждой ткани и органа.
Фибробласты также основной тип клеток за разнообразный набор медицинских условий, которые вызывают огромный клинический бремя. Патологические активности фибробластов ухудшает нормальную функцию ткани и включает в себя тканей и органов фиброз (например, легких и печени), рубцевание следующую кожного заживления ран, атеросклероз, системный склероз, и формирование атероматозных бляшек после травмы сосудов 2-5. Заживление ран, в частности, как остро и хронически, включает Deposition рубцовой ткани, что ни походит ни функционирует подобно нормальной ткани, окружающей его, и приводит к значительной заболеваемости в самых разнообразных патологических состояниях. После травмы, происходит переход фибробластов в миофибробластами, который затем выделяют структурные компоненты ECM, оказывают воздействие на паракринные соседних типов клеток, и восстановить механическую стабильность путем осаждения рубцовой ткани 6.
В кожных тканей существует значительное изменение в качество заживления ран через время развития, а также между анатомических участков. В первых двух триместров жизни плод лечит без рубцов; Однако, начиная с третьего триместра на протяжении взрослой жизни и, люди исцелить со шрамом. Сайт-специфическая, в дополнение к возрасту конкретного различия в заживлении ран существует. Раны в ротовой полости переделывать с минимальным образованием рубцов 7,8, в то время как осаждение рубцовой ткани в кожных ран значительным 9. Споры сохраняется грoncerning относительное влияние окружающей среды по сравнению с внутренними свойствами местных фибробластов на исход заживления ран в отношении как возраст и место 10,11. Учитывая значительные различия в исцелении мыши устной против кожных дермы и ранее эмбриональных (E15) против позже эмбриональных (E18) дермы, вполне вероятно, что внутренние различия в популяциях фибробластов в определенном возрасте развития и среди различных анатомических существует ,
В 1986 году Гарольд Ф. Дворжак положено опухоли раны, которые не заживают 12. Dvorak к выводу, что опухоли ведут себя как раны в организме и вызывают их стромы путем активации заживления раны ответ хозяина. Многочисленные исследования, так как исследовали вклад фибробластов к прогрессированию рака 13-15, но как и в случае заживления раны, идентичности и эмбрионального происхождения фибробластов, которые способствуют стромы отсеке кожного CArcinomas не были должным образом определены. Ответ на этот вопрос носит медицинскую значимость данной недавние исследования, разоблачающие опухолеассоциированные фибробластов как потенциально эффективного мишени для противораковой терапии 16.
Выявление и перспективно изоляции фибробластов клоны наделены фиброгенной потенциала в естественных условиях является важным шагом на пути к эффективной манипуляции их ответ на повреждение в широком диапазоне острых и хронических болезненных состояний. В 1987 году Кормак продемонстрировал два субпопуляции фибробластов, один проживающий в папиллярного и один в ретикулярной дермы 17,18. Третий субпопуляции был найден, связанные с волосяных фолликулов в волосяной сосочек области фолликула 19,20. При культивировании, эти различия фибробластов подтипы проявляют в потенциал роста, морфологии и факторов роста / цитокинов анкеты 21-24.
На сегодняшний день, исследования по изучению фибробластов онterogeneity в значительной степени удалось адекватно характеризуют развития и функционального разнообразия среди фибробластов в естественных условиях. Это, в частности, является результатом зависимости от культивируемых популяций фибробластов и гомогенизации эффекта клеточной культуре или позитивной селекции на основе поверхностного рецептора себя не экспрессируется всеми фибробластов 25. Недавнее исследование, из нашей лаборатории показали глубокое поверхностный маркер и транскрипции сдвиг в культуре фибробластов против некультурных изолированных на FACS на основе методологии, представленной в изоляции этой рукописи 26.
Впоследствии, мы определили конкретный фибробластов происхождение в пределах мышиных спинных дермы и решил, что это линия, определяется эмбриональной экспрессии Engrailed-1, в первую очередь отвечает за отложение соединительной ткани в коже спинной. Линии функции при острых и хронических форм фиброза в том числе заживление ран, образование стромы рака, иизлучение фиброз 27. Характеристика различных фибробластов линий имеет критические последствия для лечения, направленных на модуляции фиброгенную поведение.
Вместо того чтобы использовать существующие протоколы, которые полагаются на манипуляции в пробирке для достижения изоляции клеток 28,29, протокол урожай (Рисунок 1) подробно здесь, поможет урожая информативные анализы фибробластов, которые более точно захватить фенотип и поведение в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует методике, утвержденной Административным панели Стэнфордского университета на лабораторных животных.
1. Пищеварение мышиных дермы
- Эвтаназии мышей путем смещени шейных позвонков после анестезии путем внутрибрюшинной инъекции кетамина 100 мг / кг + ксилазина 20 мг / кг + Ацепромазин 3 мг / кг.
Примечание: Различные возрастов и профессий могут быть использованы. - Бритье и удалять волосы кожу спинной. Приблизительно 100000 клеток могут быть выделены из куска кожи спинного 60 мм х 100 мм.
- Погрузите мышь в 70% этанола и место на чистой, стерильной поверхности, чтобы высохнуть.
- Сразу урожай кожу спинной мыши с помощью стерильных ножниц рассекает. В самок мышей, в том числе избежать в ткани молочной железы.
- Запуск основания хвоста, использовать пинцет, чтобы палатку кожу и сделать поперечный разрез, прежде чем рассекает по сверх-фасциальных плоскости.
- Тщательно избежать любого в том числе подкожного жира при уборкекожа. Осмотрите собранный кожу для любого подкожного жира и тщательно очистить его с помощью тупого края скальпелем.
- Промыть кожу заготовленной в бетадином последующим 5x PBS моет на льду.
Примечание: Важно, чтобы сохранить кожу как можно ближе к стерильным, как это возможно, чтобы избежать загрязнения. - Фарш кожу с помощью лезвия и анатомические ножницы в стерильную чашку, пока образец не имеет однородной консистенции с 2-3 мм кусочки.
- Подготовка 50 мл конические пробирки, содержащие 20 мл коллагеназы IV при концентрации 1 мг / мл в DMEM. Разделить дермы в трубы на основе пяти мышей в трубке.
- Перемешивают энергично образцы, а инкубацию при 37 ° С в течение 1 ч в любом водяной бане или печи.
- Удалить образцы из инкубатора и проходят через 10 мл шприца без иглы 3-5x в стерильной крышкой.
- Поместите образцы обратно в инкубатор при 37 ° С и энергично встряхивают в течение еще 30 мин.
- В стерильных капот, Пипетки образцы вверх и вниз с помощью 3-5x 10 мл пипетки. Пипетировать образца через 100 мкм фильтр в новую 50 мл коническую пробирку.
- Проход 20 мл 10% FBS среде DMEM через тот же фильтр, чтобы максимизировать выход клеток и довести общий объем до 40 мл. Центрифуга при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант, используя стерильный стеклянную пипетку, принимая большую заботу, чтобы сначала удалить верхний слой жира до оставшихся супернатант.
Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для снижения загрязнения адипоцитов. - Ресуспендируют гранул в 20 мл 10% FBS DMEM.
- Пропускают клеток / DMEM суспензии через фильтр 70 мкм.
- Промыть фильтр 10 мл 10% FBS среде DMEM и центрифуги отфильтрованный суспензии при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант, используя стерильный стеклянную пипетку, снова заботиться в первую очередь удалите оставшуюся жировой слой.
- Если существует значительный загрязнение эритроцитов (а осадок заметно красное), повторно приостанавливать гранулыв 20 мл буфера для лизиса АСК и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. В противном случае перейдите к шагу 24.
- Добавить равный объем (20 мл) FACS буфера (PBS, 10% FBS, 0,1% азида натрия), затем смешать и держать в стороне 5 мл аликвоту в качестве неокрашенных контроля. Центрифуга оставшуюся образца при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант и поставить шарик на льду. Клетки могут быть заморожены вниз на этом этапе, если FACS время не доступно.
2. Выделение фибробластов по FACS
- Сделайте 500 мкл антител линия инкубации смеси для каждого таблетки. Для этого сначала добавлением 475 мкл FACS буфера, содержащего ДНКазы (10 мкг / мл) в пробирку, а затем добавить флуорофора-сопряженных CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie-2 (1:50), трет -119 (1: 200), и EpCam (1: 100) антитела, чтобы достичь соответствующего разведения для каждого антитела.
- Повторное приостановить осадок в каждой 500 мкл инкубационного линия антител смеси и инкубируют эту подвеску на льду в течение 20 мин.
- Добавить 5мл FACS буфера, содержащего ДНКазы (10 мкг / мл) к образцу и осторожно перемешать. Центрифуга при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
- Удалить супернатант и мыть осадок клеток 5 мл FACS с буфером, содержащим ДНКазы (10 мкг / мл) и центрифугируют при тех же условиях, что и в шаге 26.
- Ресуспендируют гранул в 500 мкл FACS буфера, содержащего ДНКазы (10 мкг / мл) и отложить в сторону 50 мкл аликвоты в качестве контроля жизнеспособности красителя.
- Добавить жизнеспособность красителя выбора для оставшейся выборки в концентрации, указанной для выбранного красителя.
- Выполните FACS анализ 31 и сортировки для жизнеспособности Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Тер-119- / EpCAM- клеток (рис 2А). Сортировать прямо в FACS буфера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Справедливость такого подхода (рис 1) была проверена в ряде способов, которые могут быть рассмотрены подробно в нашей недавней публикации 27. Они включают в себя иммуноцитохимии отсортированных клеток и общей камере и одной клеточной транскрипции анализа отсортированный клеток. Сортировка фибробласты напрямую, а не полагаться на культуру более точно отражает фенотип их в естественных условиях. Использование клонов негативный подход истощения (рис 2А), а не позитивный подход избегает выбора предварительного выбора для конкретных групп населения. Значение этого подхода недавно была продемонстрирована Ринкевич соавт. 27, идентификации присутствия CD26 положительных фибробластов на уровне дермы, ранее не описанным.
Чтобы подтвердить, что процесс культивирования фибробластов приводит к значительным изменениям в экспрессии генов, мы использовали микрочипы для сравнения культивируемые фибробласты некультурных фибробластов. Мы культивировали фибробластыкоторые были изолированы от двух методов, живой протокола сбора, описанной в этой рукописи и известной ткани эксплантатов протокола 28. Всего-транскриптом анализ микрочипов показал, что фибробласты, выделенные культивированные в живом урожая (C.LH) и тканей эксплантов (C.TE) методологии имеют высокую степень сходства в транскриптом всей уровне с коэффициентом Пирсона корреляции (г ) 0,92 (фиг.2В). Для сравнения, культивируемые фибробласты значительно отличались от живых собранных некультурных фибробластов (U.LH). Сравнение C.LH против U.LH дали такое г 0,61, в то время как сравнение C.TE против U.LH дали такое г 0,64 (рис 2B). Эти результаты важность анализа живой собранные фибробласты, а не культивируемых фибробластах. Для более полного анализа транскрипционных и протеомных различий между культивируемых фибробластов и некультурных изолированных с помощью этого протокола, обратитесь к Walmsley <EM> и др. 26
Рисунок 1. Обзор фибробластов изоляции. Схематическое изображение основных этапов в данном протоколе изоляции FACS основе. Подержанные с разрешения Walmsley, Г. Г. и др. В прямом эфире фибробластов урожая показывает поверхностный маркер сдвиг в пробирке. Тканевой инженерии. Часть С, методы, DOI:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Проточная цитометрия и микрочипов анализа. (А) FACS-стробирования стратегия показывает выбор отдельных клеток (левый участок), выбор для живых клеток на основе йодида ГНА пропидияоцен- ками (средний участок), и выбор фибробластов (правый график) на основе клонов негатива для CD31, CD45, Tie2, Ter119 и ЕрСАМ. (Б) микрочипов анализ некультурных Живая заготовленной (U.LH) в сравнении с культивированный Живая заготовленной (C.LH) по сравнению с культивированный тканей эксплантов (C.TE) фибробластов. Сходство экспрессии генов между U.LH (N = 3), C.LH (п = 3), и C.TE (п = 3) популяции фибробластов, измеренные по продукта момент коэффициента корреляции Пирсона (г). [C.LH против C.TE: г = 0,92]; [C.LH против U.LH: г = 0,61]; [C.TE против U.LH: г = 0,64]. Подержанные с разрешения Walmsley, Г. Г. и др. В прямом эфире фибробластов урожая показывает поверхностный маркер сдвиг в пробирке. Тканевой инженерии. Часть С, методы, DOI:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный в этой рукописи предлагает средства, чтобы изолировать от фибробластов FACS-сортировки на основе, по сравнению с существующими методами, которые либо выбрать для субпопуляции или требуют времени в культуре клеток, прежде чем последующих анализов. Время, необходимое от уборки кожи сортировке фибробластов составляет примерно 6 ч; Тем не менее, количество мышей использовали в урожай будет влиять эту оценку.
Несколько точек в протоколе требуют особого ухода. Первый ограничивает загрязнение адипоцитов путем удаления жира с кожи до переваривания и удаления верхней липидного слоя супернатанта после расщепления и центрифугированием в течение процесса выделения. Он также может быть полезным, чтобы изменить свежие пробирки после Клетки осаждают как некоторые липидные компоненты придерживаться пластиковых стенках трубок и может загрязнить последующие гранул стирок. Второй момент заключается тщательностью, чтобы отдельные дермы из эпидермисапо эпидермального-кожного контакта. Несмотря на то, загрязняя клеток эпидермиса будут удалены стратегии истощения FACS, попытка ограничить загрязнение здесь еще предстоит сделать.
Ограничения этого подхода включают потенциальное наличие загрязняющих клетки не захваченных текущей панели клонов. При выборе флюорофор конъюгированный к роду антител (CD31, CD45, Tie-2, Ter119, ЕрСАМ), исследователи должны позаботиться, чтобы рассмотреть другие поверхности маркер анализирует их, возможно, пожелает выполнить. Дополнительные пятна должны быть в отдельных каналов из выбранного флуорофора линия антител. В общем, мы обнаружили, PacBlue идеальным конъюгат, который сохраняет широкий диапазон доступных длин волн для дальнейшего анализа. Соответствие жизнеспособность красителя флуорофора линия антител сохраняет дополнительный диапазон длин волн. Например, DAPI жизнеспособность красителя волнует и флуоресцирует при аналогичных длинах волн в PacBlue. Таким образом, все DAPI POsitive и происхождение антител положительные клетки могут быть эффективно устранить с помощью одного ворота, оставив только жизнеспособные фибробласты в качестве целевого населения. Следует также отметить, что клетки подвергаются воздействию FBS в течение процедуры выделения для ограниченного количества времени, и это, вероятно экспрессии генов влияет, в неизвестном степени.
Возможность включительно сортировать для всех групп населения фибробластов представляет возможность по-настоящему допросить неоднородность этого плохо понимал типа клеток. Это приложение в контексте нормальной физиологии, а также различные заболевания, которые связаны чрезмерного фиброза и девиантным поведением фибробластов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантом NIH грант R01 GM087609 (до HPL), подарок от Ингрид Лай и Билл Шу в честь Энтони Шу (в HPL), NIH грант U01 HL099776 (к MTL), в Hagey лаборатории Детская регенеративной медицины и Дуб Фонд (для MTL, GCG и HPL). GGW поддержали Стэнфордской школы медицины, программы обучения Стэнфордского медицинского ученого, и NIGMS субсидия на обучение GM07365. Znm при поддержке Фонда пластической хирургии исследовательский грант Грант и Семейный фонд Hagey. MSH при поддержке Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) Клиническая сотрудник учебного пособия TG2-01159, Американского общества челюстно-лицевых хирургов (ASMS) / челюстно-лицевых хирургов Foundation (MSF) исследований выдаче гранта, и трансплантации и тканевой инженерии стипендий премии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. Ham's Histology. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
