Abstract
Fibroblaster är principen celltyp ansvariga för att utsöndra extracellulära matrisen och är en kritisk komponent i många organ och vävnader. Fibroblast fysiologi och patologi bakom ett spektrum av kliniska enheter, inklusive fibroser i flera organ, hypertrofisk ärrbildning efter brännskador, förlust av hjärtfunktionen efter ischemi, och bildandet av cancer stroma. Men fibroblaster fortfarande en dåligt karakteriserad typ av cell, till stor del på grund av deras inneboende heterogenitet. Befintliga metoder för isolering av fibroblaster kräver tid i cellkultur som i grunden påverkar cellfenotyp och beteende. Följaktligen många studier som undersöker fibroblast biologi åberopa in vitro manipulering och inte korrekt fångar fibroblast beteende in vivo. För att övervinna detta problem har vi utvecklat en FACS-baserat protokoll för isolering av fibroblaster från den dorsala huden hos vuxna möss som inte kräver cellkultur, vari preserving den fysiologiska transkriptions- och proteomik profilen för varje cell. Vår strategi tillåter uteslutning av icke-mesenkymala härstamningar via en härstamning negativ grind (Lin -) snarare än en positiv selektion strategi för att undvika urvals eller anrikning av en subpopulation av fibroblaster som uttrycker specifika ytmarkörer och vara så inkluderande som möjligt över denna heterogena celltyp.
Introduction
Fibroblaster ofta definieras morfologiskt som spindelformade celler som följer plastsubstrat. Fibroblaster är principen celltyp ansvarig för syntetisering och remodeling den extracellulära matrisen i embryonala och vuxna organ 1. Fibroblaster är således kritisk för utveckling däggdjurs- och bidrar väsentligt till den extracellulära miljön som påverkar beteendet hos angränsande celltyper som förekommer i varje vävnad och organ.
Fibroblaster är också den huvudsakliga celltyp bakom en mångfald av medicinska tillstånd som orsakar enorma klinisk börda. Patologisk fibroblast aktivitet försämrar normal vävnadsfunktion och inkluderar vävnads- och organfibros (såsom lunga och lever), ärrbildning efter kutan sårläkning, ateroskleros, systemisk skleros, och bildning av ateromatösa plack efter blodkärlsskada 2-5. Sårläkning i synnerhet, både akut och kroniskt innebär deposition av ärrvävnad som varken Liknar eller fungerar som den normala vävnaden som omger den, och leder till hög sjuklighet över olika patologiska tillstånd. Efter skada, finns det en övergång av fibroblaster till myofibroblaster, som sedan utsöndrar strukturella ECM-komponenter, utöva parakrina effekter på granncelltyper, och återställa mekanisk stabilitet genom att deponera ärrvävnad 6.
I kutana vävnader finns det betydande variationer i kvaliteten på sårläkning över utvecklings tid och mellan anatomiska platser. I de två första trimestern av livet fostret läker utan ärrbildning; Men från den tredje trimestern på och under hela vuxenlivet, människor läka med ett ärr. Platsspecifik, förutom åldersspecifika, existerar skillnader i sårläkning. Sår i munhålan renovera med minimal ärrbildning 7,8, medan ärrvävnad avsättning inom kutana sår är betydande 9. Kontroverser kvarstår concerning den relativa påverkan av miljön kontra inneboende egenskaper lokala fibroblaster om resultatet av sårläkning när det gäller både ålder och plats 10,11. Med tanke på de betydande skillnader i läkning av musen oral kontra kutana dermis och tidigare embryonala (E15) vs. senare embryonala (E18) dermis, är det troligt att inneboende skillnader i befolkningen i fibroblaster vid vissa utvecklingstiden och mellan olika anatomiska platser finns .
År 1986, belägen Harold F. Dvorak tumörer är sår som inte läker 12. Dvorak slutsatsen att tumörer beter sig som sår i kroppen och inducera deras stroma genom att aktivera sårläkningssvaret hos värden. Ett flertal studier har sedan undersökt bidraget av fibroblaster till progressionen av karcinom 13-15, men som i fallet med sårläkning, identiteten och embryonala ursprung fibroblaster som bidrar till den stromala utrymmet i kutan carcinomas har inte varit tillräckligt definierade. Svaret på denna fråga har medicinsk betydelse med tanke på nya studier utsätta tumörassocierade fibroblast som en potentiellt effektiv måltavla för cancerbehandling 16.
Identifiera och prospektivt isolera fibroblast linjerna utrustade med fibrinogen potential in vivo är ett viktigt steg mot ett effektivt sätt manipulera sitt svar på skada inom ett brett spektrum av akuta och kroniska sjukdomstillstånd. År 1987 Cormack visade två subpopulationer av fibroblaster, en bosatt inom papillär och en inom de retikulära dermis 17,18. En tredje subpopulation påträffades i samband med hårsäckarna i dermalpapillen regionen follikeln 19,20. När de odlas dessa fibroblast subtyper uppvisar skillnader i tillväxtpotential, morfologi och tillväxtfaktor / cytokiner profiler 21-24.
Hittills studier som undersöker fibroblast hanterogeneity har till stor del misslyckats med att ge en god beskrivning utvecklings och funktionell mångfald bland fibroblaster in vivo. Detta är delvis en följd av ett beroende av odlade fibroblastceller populationer och homogeniserande effekten av cellkultur eller positiv selektion på basis av en själv ytreceptor inte uttrycks av alla fibroblaster 25. En färsk studie från vårt laboratorium visade en djup ytmarkör och transkriptions förskjutning i odlade vs. obildade fibroblaster isolerade genom FACS-baserade isolering metod som presenteras i detta manuskript 26.
Därefter identifierade vi en särskild fibroblast härstamning inom de murina rygg dermis och fastställt att denna härstamning, som definieras av embryonala uttryck av engrailed-1, är i första hand ansvarig för bindvävs nedfall i rygghuden. Härstamning fungerar under både akuta och kroniska former av fibros, inklusive sårläkning, cancer stroma bildning, ochstrålningsinducerad fibros 27. Karakteriseringen distinkta fibroblaster linjer har kritiska konsekvenser för behandlingar som syftar till att modulera fibrinogen beteende.
Istället för att använda befintliga protokoll som förlitar sig på in vitro manipulation för att uppnå cellisolering 28,29, kommer skörden protokollet (Figur 1) beskrivs här hjälpa avkastning informativa analyser av fibroblaster som mer exakt fånga fenotyp och beteende in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer metoder som godkänts av Stanford University administrativa panel för Laboratory Animal Care.
1. Spjälkning av murina Dermis
- Euthanize möss genom cervikal dislokation efter anestesi med en intraperitoneal injektion av ketamin 100 mg / kg + xylazin 20 mg / kg + acepromazin 3 mg / kg.
Obs: Olika åldrar och bakgrunder kan användas. - Raka och Vaxning varar rygghuden. Cirka 100.000 celler kan isoleras från en bit rygghuden 60 mm x 100 mm.
- Sänk musen i 70% etanol och placera på en ren, steril yta för att torka.
- Omedelbart skörda rygg mushud med steril dissekera sax. I honmöss, undvika inklusive bröstvävnad.
- Starta svansroten, använder pincett för tält upp huden och gör en tvärgående snitt innan dissekera längs över fascia planet.
- Försiktigt undvika inklusive eventuella underhudsfett medan skördhuden. Undersök skördade huden för alla underhudsfett och försiktigt skrapa bort det med hjälp av den trubbiga kanten av en skalpell.
- Skölj den skördade huden Betadine följt av 5x PBS tvättar på is.
Obs: Det är viktigt att hålla huden så nära sterilt som möjligt för att undvika kontaminering. - Finhacka huden med rakblad och dissekera sax i en steril skål tills provet är en enhetlig konsistens med 2-3 mm bitar.
- Bered 50 ml koniska rör som innehåller 20 ml kollagenas IV vid en koncentration av 1 mg / ml i DMEM. Dela upp dermis i rören på grundval av fem möss per rör.
- Agitera prover kraftigt under inkubering vid 37 ° C under 1 h i antingen ett vattenbad eller ugn.
- Avlägsna prov från inkubatorn och passera genom en 10 ml spruta utan nål 3-5x i en steril huva.
- Placera proverna tillbaka i inkubatorn vid 37 ° C och skaka kraftigt under ytterligare 30 min.
- I en steril huva, Pipett proverna upp och ner 3-5x användning av en 10 ml pipett. Pipet provet genom en 100 pm filter in i en ny 50 ml koniska rör.
- Pass 20 ml 10% FBS DMEM genom samma filter för att maximera cellutbyte och att den totala volymen till 40 ml. Centrifugera vid 300 g under 8 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten med en steril glaspipett, med stor omsorg att först ta bort det översta fettlagret innan återstående supernatant.
Obs: Detta steg är avgörande för att minska föroreningen adipocyt. - Resuspendera pellets i 20 ml 10% FBS DMEM.
- Passera cell / DMEM suspensionen genom ett 70 pm filter.
- Skölj filtret med 10 ml 10% FBS DMEM och centrifugera den filtrerade suspensionen vid 300 g under 8 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten med en steril glaspipett, återigen noga med att först ta bort eventuell kvarvarande fettlager.
- Om det råder betydande RBC förorening (pelleten är synligt rött), återsuspendera pelletsi 20 ml ACK lysisbuffert och inkubera under 5 min vid RT. Annars går du till steg 24.
- Tillsätt en lika volym (20 ml) av FACS-buffert (PBS, 10% FBS, 0,1% natriumazid), blanda, och hålla undan en 5 ml alikvot som en ofärgad kontroll. Centrifugera det återstående provet vid 300 g under 8 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och sätta pelleten på is. Cellerna kan frysas ned på denna punkt om FACS tid inte är tillgänglig.
2. Isolering av fibroblaster genom FACS
- Gör 500 il härstamning antikropps inkubation mix för varje pellet. Gör detta genom att först sätta 475 | il FACS-buffert innehållande DNas (10 | j, g / ml) till ett rör, och därefter tillsats av fluorofor-konjugerad CD31 (1: 100), CD45 (en: 200), Tie2 (01:50), Ter -119 (1: 200), och EpCAM (1: 100) antikroppar för att uppnå respektive utspädning för varje antikropp.
- Återsuspendera varje pelleten i 500 pl härstamning antikropps inkubation blanda och inkubera denna suspension på is under 20 minuter.
- Lägg 5ml FACS-buffert innehållande DNas (10 | ig / ml) till provet och blanda försiktigt. Centrifugera vid 300 g under 8 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och tvätta cellpelleten med 5ml FACS buffert innehållande DNas (10 | ig / ml) och centrifugera med användning av samma betingelser som i steg 26.
- Resuspendera pelleten i 500 l FACS buffert innehållande DNas (10 ng / ml) och lägga undan en 50 ul alikvot som en lönsamhetsfärgkontroll.
- Lägg lönsamheten färgämne val till det återstående provet i den koncentration som anges för den valda färgen.
- Utför FACS-analys 31 och sortering för Viability Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- celler (se figur 2A). Sortera direkt i FACS-buffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Giltighetstiden för denna strategi (Figur 1) har verifierats i ett antal olika sätt, som kan granskas i detalj i vår senaste publikation 27. Dessa inkluderar immunocytokemi av sorterade celler och mass cell och enda cell transkriptions analys av nyligen sorterade celler. Sortering fibroblaster direkt i stället för att förlita sig på kultur mer exakt fångar deras in vivo fenotyp. Med användning av en härstamning negativ utarmningsmetod (fig 2A) i stället för en positiv selektions tillvägagångssätt undviker förhand välja för särskilda subpopulationer. Värdet av detta tillvägagångssätt har nyligen visats av Rinkevich et al. 27, att identifiera närvaron av CD26 positiva fibroblaster på en nivå av dermis inte tidigare beskrivits.
För att bekräfta att processen att odla fibroblaster leder till betydande förändringar i genuttryck, använde vi microarrays att jämföra odlade fibroblaster till obildade fibroblaster. Vi odlade fibroblastersom isolerades genom två tekniker, levande skörd protokollet beskrivs i detta manuskript och en välkänd vävnad Explantation protokoll 28. Hela-transkriptomanalys microarray analys visade att odlade fibroblaster isolerade genom levande skörd (C.LH) och vävnads Explantation (C.TE) metoder har en hög grad av likhet med en transkriptom-nivå med en Pearson produktmomentkorrelationskoefficient (r ) av 0,92 (fig 2B). Som jämförelse, odlade fibroblaster skilde sig avsevärt från levande skördade obildade fibroblaster (U.LH). En jämförelse mellan C.LH kontra U.LH gav ett r av 0,61, medan en jämförelse av C.TE kontra U.LH gav ett r av 0,64 (fig 2B). Dessa resultat fastställa vikten av att analysera levande skördade fibroblaster snarare än odlade fibroblaster. För en mer fullständig analys av transkriptions- och proteomik skillnader mellan odlade och obildade fibroblaster isolerade med hjälp av detta protokoll, se Walmsley <em> et al. 26
Figur 1. Översikt över Fibroblast Isolering. Schematisk framställning av de primära stegen som är involverade i denna FACS-baserade isoleringsprotokoll. Används med tillstånd från Walmsley, GG et al. Live Fibroblast Harvest avslöjar ytmarkör Shift in vitro. Tissue engineering. Del C, Methods, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Flödescytometri och microarray analys. (A) FACS grindstrategi visar valet av enskilda celler (vänster tomt), val för levande celler baserade på propidiumjodid staining (mitten tomt), och val av fibroblaster (höger plot) på grundval av härstamning negativitet för CD31, CD45, Tie2, Ter119 och EpCAM. (B) microarray analys av okultiverade Live skördade (U.LH) kontra odlade Live Skördas (C.LH) kontra odlad vävnad explantation (C.TE) Fibroblaster. Likhet av genexpression mellan U.LH (n = 3), C.LH (n = 3), och C.TE (n = 3) fibroblast populationer mätt genom Pearsons produktmomentkorrelationskoefficient (r). [C.LH vs. C.TE: r = 0,92]; [C.LH vs U.LH: r = 0,61]; [C.TE vs U.LH: r = 0,64]. Används med tillstånd från Walmsley, GG et al. Live Fibroblast Harvest avslöjar ytmarkör Shift in vitro. Tissue engineering. Del C, Methods, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs i detta manuskript erbjuder ett sätt att isolera fibroblaster genom FACS-baserad sortering, i jämförelse med befintliga metoder, som antingen välja en underpopulation eller kräver tid i cellodling före efterföljande analyser. Den tid som krävs från avverkning av huden för sortering av fibroblaster är ungefär 6 h; kommer emellertid antalet möss som användes i skörde påverka denna uppskattning.
Flera punkter i protokollet kräver särskild omsorg. Det första är att begränsa föroreningen adipocyt genom avlägsnande av fett från huden före digerering och avlägsnande av det övre lipidskiktet supernatant efter digerering och centrifugering under isoleringsprocessen. Det kan också vara till hjälp för att ändra till nya rör efter det att cellerna pelleteras eftersom vissa lipidkomponenter följer plastväggarna hos rören och kan förorena efterföljande pellettvättningar. En andra punkten innebär minutiös omsorg för att separera dermis från epidermislängs den epidermala-dermala förbindelsen. Även om kontamine epidermalceller kommer att tas bort av FACS utarmning strategin bör ett försök att begränsa föroreningar här fortfarande göras.
Begränsningarna i denna strategi inkluderar potentiella närvaron av förorenande celler som inte fångas av den nuvarande linjen panelen. När du väljer fluoroforen konjugerad till linje antikroppar (CD31, CD45, Tie2, Ter119, EpCAM), måste forskarna noga med att överväga andra ytmarkör analyserar de kanske vill utföra. Ytterligare fläckar måste vara i olika kanaler från den valda linjen antikropps fluorofor. I allmänhet fann vi PacBlue vara ett idealiskt konjugat som bevarar ett brett utbud av tillgängliga våglängder för vidare analys. Matchande livskraft färgämnet till härstamning antikropps fluoroforen bevarar en ytterligare våglängdsområde. Exempelvis exciterar livskraft färgämne DAPI och fluorescerar vid liknande våglängder till PacBlue. På detta sätt, alla DAPI pokänslig och härstamning antikroppspositiva celler kan effektivt elimineras med hjälp av en enda grind, vilket innebär att endast livskraftiga fibroblaster som målgruppen. Det bör också noteras att celler exponeras för FBS under isoleringsförfarandet för begränsade mängder tid och detta sannolikt influenser genuttryck, till en okänd grad.
Förmågan att sin helhet sortera alla fibroblast populationer utgör en möjlighet att verkligen förhöra heterogenitet detta dåligt förstådd celltyp. Detta kan tillämpas inom ramen för normal fysiologi, liksom en mängd olika sjukdomar som involverar överdriven fibros och avvikande fibroblast beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av anslag från NIH bidrag R01 GM087609 (till HPL), en gåva från Ingrid Lai och Bill Shu för att hedra Anthony Shu (till HPL), NIH bidrag U01 HL099776 (till MTL), den Hagey Laboratoriet för Pediatric regenerativ medicin och The Oak Foundation (till MTL, GCG och HPL). GGW stöddes av Stanford School of Medicine, Stanford Medical Scientist Training Program, och NIGMS utbildningsbidrag GM07365. Znm stöddes av plastikkirurgi Foundation Research Fellowship Grant och Hagey Family Fund. MSH stöddes av California Institute för regenerativ medicin (CIRM) Clinical Fellow utbildningsbidrag TG2-01159, American Society of Maxillofacial Surgeons (Asms) / käkkirurger Foundation (MSF) Research Grant Award, och Transplant och Tissue Engineering Fellowship Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. Ham's Histology. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
