Abstract
Les fibroblastes sont le type de cellules sécrétant principe responsable de la matrice extracellulaire et sont une composante essentielle de nombreux organes et tissus. Fibroblastes et la pathologie sous-tendent la physiologie un spectre d'entités cliniques, y compris les fibroses dans plusieurs organes, les cicatrices hypertrophiques brûlures suivantes, la perte de la fonction cardiaque après une ischémie, et la formation de stroma du cancer. Cependant, les fibroblastes restent un type mal caractérisé de la cellule, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. Les procédés existants pour l'isolement des fibroblastes en culture ont besoin de temps de cellule qui influence profondément phénotype et le comportement cellulaire. Par conséquent, de nombreuses études sur la biologie fibroblastes reposent sur la manipulation in vitro et ne reflètent pas fidèlement le comportement des fibroblastes in vivo. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un protocole à base de FACS pour l'isolement des fibroblastes de la peau du dos de souris adultes qui ne nécessite pas de culture cellulaire, ainsi preserving de la transcription physiologique et le profil protéomique de chaque cellule. Notre stratégie permet exclusion des lignées non-mésenchymateuses par une porte de lignée négative (Lin -) plutôt que d'une stratégie de sélection positive pour éviter de pré-sélection ou à l'enrichissement d'une sous-population de fibroblastes exprimant des marqueurs de surface spécifiques et être aussi inclusif que possible sur ce hétérogène type de cellule.
Introduction
Les fibroblastes sont souvent morphologiquement définies comme des cellules en forme de fuseau qui adhèrent à des substrats en matière plastique. Les fibroblastes sont le type cellulaire principe responsable de la synthèse et le remodelage de la matrice extracellulaire dans des organes embryonnaires et adultes 1. Les fibroblastes sont donc cruciale pour le développement des mammifères et contribuent sensiblement au milieu extracellulaire qui influe sur le comportement des types présents dans chaque tissus et des organes de cellule voisine.
Les fibroblastes sont aussi le type de cellule principale derrière un ensemble diversifié de conditions médicales qui causent énorme fardeau clinique. L'activité des fibroblastes pathologique altère la fonction tissulaire normale et comporte des tissus et de la fibrose d'organes (tels que le poumon et le foie), la cicatrisation suivant la cicatrisation cutanée des plaies, l'athérosclérose, la sclérose systémique, et la formation de plaques d'athérome après une lésion de vaisseau sanguin 05/02. La cicatrisation des plaies, en particulier, à la fois aiguë et chronique, implique deposition de tissu cicatriciel que ni ressemble ni fonctions comme le tissu normal environnant, et conduit à une morbidité significative dans divers états pathologiques. À la suite de blessures, il existe une transition de fibroblastes de myofibroblastes, qui sécrètent des composants structuraux puis ECM, exercent des effets paracrines sur des types de cellules voisines, et rétablir la stabilité mécanique par dépôt de tissu cicatriciel 6.
Dans les tissus cutanés, il existe une variation significative de la qualité de la réparation des plaies à travers le temps de développement et entre les sites anatomiques. Dans les deux premiers trimestres de la vie du fœtus guérit sans laisser de cicatrices; Toutefois, à partir du troisième trimestre de la grossesse et de l'âge adulte, les humains guérir avec une cicatrice. Spécifique au site, en plus de la fonction de l'âge, les différences dans la cicatrisation des plaies existent. Les plaies dans la cavité buccale avec un minimum de remodeler la formation de cicatrices 7,8, tandis que le dépôt de tissu cicatriciel à l'intérieur de plaies cutanées 9 est significatif. La controverse persiste cONCERNANT l'influence relative de l'environnement par rapport aux propriétés intrinsèques des fibroblastes locaux sur les résultats de la cicatrisation des plaies en ce qui concerne à la fois l'âge et l'emplacement 10,11. Compte tenu des différences significatives dans la guérison des souris par voie orale contre derme cutanées et embryonnaire antérieure (E15) vs tard embryonnaire (E18) derme, il est probable qu'il existe des différences intrinsèques dans les populations de fibroblastes à certains âges de développement et parmi les différents sites anatomiques .
En 1986, Harold F. Dvorak posé tumeurs sont des plaies qui ne guérissent pas 12. Dvorak a conclu que les tumeurs se comportent comme des blessures dans le corps et induisent leur stroma par l'activation de la cicatrisation des plaies réponse de l'hôte. De nombreuses études ont depuis étudié la contribution des fibroblastes à la progression de carcinomes 13-15, mais comme dans le cas de la cicatrisation des plaies, l'identité et l'origine embryonnaire des fibroblastes qui contribuent au compartiment stromal cutanée de carcinomas n'a pas été suffisamment défini. La réponse à cette question porte pertinence médicale donnée études récentes exposant le fibroblaste associé à une tumeur comme une cible potentiellement efficace pour la thérapie anti-cancer 16.
Identifier et isoler de façon prospective les lignées de fibroblastes dotés d'un potentiel fibrogène in vivo est une étape essentielle vers manipuler efficacement leur réponse à une blessure dans un large éventail d'états pathologiques aigus et chroniques. En 1987, Cormack a démontré deux sous-populations de fibroblastes, un résidant dans la papillaire et un dans le derme réticulaire 17,18. Un troisième sous-population a été trouvée associée à follicules pileux dans la région de la papille dermique du follicule de 19,20. Lorsqu'elle est cultivée, ces différences sous-types de fibroblastes d'exposition dans le potentiel de croissance, la morphologie, et des facteurs de croissance / cytokines profils 21-24.
À ce jour, les études examinant fibroblastes ilterogeneity ont largement échoué à caractériser adéquatement la diversité de développement et fonctionnelle entre les fibroblastes in vivo. Ceci est, en partie, est le résultat d'une dépendance à l'égard des populations de fibroblastes en culture et l'effet d'homogénéisation de la culture cellulaire ou la sélection positive sur la base d'un récepteur de surface libre ne sont pas exprimés par les fibroblastes 25. Une étude récente de notre laboratoire a démontré un marqueur de surface profonde et changement de transcription dans les fibroblastes cultivés contre incultes isolés par la méthode d'isolation à base de FACS présenté dans ce manuscrit 26.
Par la suite, nous avons identifié une lignée de fibroblastes spécifique dans le derme dorsales murines et déterminé que cette lignée, défini par l'expression embryonnaire de Engrailed-1, est principalement responsable pour le dépôt de tissu conjonctif dans la peau du dos. Les fonctions de la lignée pendant deux formes aiguës et chroniques de la fibrose, notamment la cicatrisation, la formation de stroma du cancer, etrayonnement induit une fibrose 27. La caractérisation des lignées distinctes fibroblastes a des conséquences critiques pour les thérapies visant à moduler le comportement fibrogénique.
Plutôt que d'utiliser les protocoles existants qui reposent sur la manipulation in vitro pour obtenir l'isolement cellulaire 28,29, le protocole de récolte (Figure 1) détaillé ici aidera rendement analyses informatives de fibroblastes qui captureront plus exactement phénotype et le comportement in vivo.
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Protocol
Ce protocole fait suite à des méthodes approuvées par la commission administrative Université de Stanford sur Laboratory Animal Care.
1. Digestion des murins derme
- Euthanasier souris par dislocation cervicale après anesthésie par une injection intraperitoneale de kétamine 100 mg / kg de xylazine + 20 mg / kg + acépromazine 3 mg / kg.
Remarque: différents âges et milieux peuvent être utilisés. - Rasage et épiler la peau du dos. Environ 100.000 cellules peuvent être isolées à partir d'un morceau de peau du dos 60 mm x 100 mm.
- Immerger la souris dans 70% d'éthanol et le placer sur une surface propre, stérile pour les sécher.
- Immédiatement récolter la peau dorsale de souris à l'aide des ciseaux de dissection stériles. Chez les souris femelles, éviter d'inclure le tissu mammaire.
- Démarrage de la base de la queue, utiliser une pince pour tente la peau et faire une coupe transversale avant de disséquer le long du plan supra-aponévrotique.
- Eviter soigneusement y compris toute graisse sous-cutanée pendant la récoltela peau. Examiner la peau prélevée pour toute graisse sous-cutanée et grattez soigneusement le tout en utilisant le bord tranchant d'un scalpel.
- Rincer la peau récoltées dans la bétadine suivie par 5x lavages PBS sur la glace.
Remarque: Il est important de garder la peau au plus près stérile que possible pour éviter toute contamination. - Émincer la peau en utilisant des lames de rasoir et la dissection des ciseaux dans un plat stérile jusqu'à l'échantillon est d'une consistance uniforme avec 2-3 mm morceaux.
- Préparer des tubes coniques de 50 ml contenant 20 ml de collagénase IV à une concentration de 1 mg / ml dans du DMEM. Diviser le derme dans les tubes sur la base de cinq souris par tube.
- Agiter vigoureusement échantillons tout en incubation à 37 ° C pendant 1 h dans une baignoire d'eau ou au four.
- Retirer les échantillons de l'incubateur et passer à travers une seringue de 10 ml sans aiguille 3-5x dans une hotte stérile.
- Placer les échantillons de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C et agiter vigoureusement pendant encore 30 min.
- Dans une hotte stérile, Une pipette les échantillons de haut en bas 3-5x utilisant une pipette de 10 ml. Pipeter l'échantillon à travers un filtre de 100 um dans un nouveau 50 ml tube conique.
- Faire passer 20 ml de DMEM 10% de FBS à travers le même filtre pour maximiser le rendement de la cellule et porter le volume total à 40 ml. Centrifugeuse à 300 g pendant 8 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette en verre stérile, en prenant grand soin d'enlever d'abord la couche supérieure de la graisse avant surnageant restant.
Remarque: Cette étape est essentielle pour réduire la contamination de l'adipocyte. - Remettre en suspension les culots dans 20 ml de DMEM 10% de FBS.
- Passez la suspension de cellules / DMEM à travers un filtre de 70 um.
- Rincez le filtre avec 10 ml 10% de FBS DMEM et centrifuger la suspension filtrée à 300 g pendant 8 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant à l'aide d'une pipette en verre stérile, en prenant également soin d'enlever d'abord toute couche de graisse restante.
- Si la contamination est importante RBC (le culot est visiblement rouge), remettre en suspension les pastillesdans 20 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Sinon, passez à l'étape 24.
- Ajouter un volume égal (20 ml) de tampon FACS (PBS, 10% de FBS, de l'azoture de sodium à 0,1%), puis mélanger et garder de côté une aliquote de 5 ml comme un témoin non coloré. Centrifuger l'échantillon restant à 300 g pendant 8 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant et de mettre granulés sur la glace. Les cellules peuvent être congelées à ce stade si le temps FACS ne sont pas disponibles.
2. Isolement des fibroblastes par FACS
- Faire 500 pi d'anticorps de la lignée mélange d'incubation pour chaque pastille. Pour ce faire, en ajoutant d'abord 475 pi de tampon pour FACS contenant de la DNase (10 ug / ml) dans un tube, puis en ajoutant fluorophore conjugué à CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200), et EpCAM (1: 100) pour obtenir l'anticorps respectif pour chaque dilution d'anticorps.
- Re-suspendre chaque culot dans 500 pl d'anticorps de lignée incubation et incuber ce mélange suspension sur de la glace pendant 20 min.
- Ajouter 5ml FACS tampon contenant de la DNase (10 ug / ml) à l'échantillon et mélanger doucement. Centrifugeuse à 300 g pendant 8 min à 4 ° C.
- Eliminer le surnageant et laver le culot cellulaire avec un tampon FACS contenant 5 ml de DNase (10 ug / ml) et centrifugation dans les mêmes conditions que dans l'étape 26.
- Reprendre le culot dans un tampon FACS contenant 500 ul de DNase (10 ug / ml) et mettre de côté une partie aliquote de 50 ul en tant que témoin viabilité de colorant.
- Ajouter la viabilité colorant de choix pour l'échantillon restant dans la concentration indiquée pour le colorant choisi.
- Effectuer une analyse FACS 31 et de tri pour la viabilité Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- cellules (voir figure 2A). Trier directement dans le tampon FACS.
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Representative Results
La validité de cette approche (Figure 1) a été vérifiée dans un certain nombre de façons, qui peuvent être examinés en détail dans notre publication récente 27. Ceux-ci comprennent immunocytochimie des cellules triées et la masse cellulaire et unique analyse transcriptionnelle de la cellule des cellules fraîchement triées. Tri fibroblastes directement plutôt que de compter sur la culture avec plus de précision capte leur phénotype in vivo. En utilisant une approche de la lignée négative de l'épuisement (figure 2A) plutôt que sur une approche de sélection positive évite pré-sélection pour certaines sous-populations. La valeur de cette approche a été récemment démontrée par Rinkevich et al. 27, l'identification de la présence de fibroblastes positives CD26 au niveau du derme précédemment ne sont pas décrites.
Pour confirmer que le processus de fibroblastes en culture conduit à d'importants changements dans l'expression des gènes, nous avons utilisé des puces de comparer les fibroblastes cultivés à des fibroblastes incultes. On a cultivé des fibroblastesqui ont été isolés par deux techniques, le protocole de récolte en direct détaillé dans ce manuscrit et un tissu d'expiant protocole bien connu 28. L'analyse des microréseaux entier transcriptome révélé que les fibroblastes cultivés isolés par la récolte en direct (C.LH) et en expiant de tissu (C.te) méthodologies ont un degré élevé de similitude au niveau du transcriptome à l'échelle avec un coefficient de Pearson de moment de produit de corrélation (r ) de 0,92 (figure 2B). Par comparaison, les fibroblastes cultivés différaient significativement à partir de fibroblastes vivants récoltés incultes (U.LH). Une comparaison entre C.LH contre U.LH a abouti à un r de 0,61, alors que la comparaison des C.te contre U.LH a abouti à un r de 0,64 (figure 2B). Ces résultats établissent l'importance d'analyser les fibroblastes récoltés en direct plutôt que les fibroblastes cultivés. Pour une analyse plus complète des différences entre la transcription et de la protéomique fibroblastes cultivés et incultes isolé en utilisant ce protocole, reportez-vous à Walmsley <em> et al. 26
Figure 1. Vue d'ensemble des fibroblastes isolement. Représentation schématique des principales étapes dans ce protocole d'isolement basé FACS. Réutilisées avec l'autorisation de Walmsley, GG et al. Vivez fibroblastes récolte révèle Surface Marker Maj en ingénierie tissulaire in vitro.. Partie C, Méthodes, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. cytométrie en flux et l'analyse de puces à ADN. (A) FACS stratégie de gating montrant sélection des cellules individuelles (parcelle de gauche), la sélection pour les cellules viables sur la base de l'iodure de propidium staining (tracé au milieu), et la sélection des fibroblastes (des parcelles à droite) sur la base de la lignée négativité pour CD31, CD45, Tie2, Ter119 et EpCAM. (B) biopuces Analyse des Uncultured vivants récoltés (U.LH) versus Cultured vivants récoltés (C.LH) versus tissu cultivé explantation (C.te) fibroblastes. Similarité de l'expression génique entre U.LH (n = 3), C.LH (n = 3), et C.te (n = 3) les populations de fibroblastes tel que mesuré par le coefficient de corrélation produit-moment de Pearson (r). [C.LH vs C.te: r = 0,92]; [C.LH U.LH rapport: r = 0,61]; [C.te vs U.LH: r = 0,64]. Réutilisées avec l'autorisation de Walmsley, GG et al. Vivez fibroblastes récolte révèle Surface Marker Maj en ingénierie tissulaire in vitro.. Partie C, Méthodes, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit dans ce manuscrit offre un moyen d'isoler les fibroblastes par tri à base de FACS, par rapport aux méthodes existantes, qui soit sélectionner une sous-population ou nécessitent du temps dans la culture cellulaire avant les analyses ultérieures. Le temps nécessaire à partir de la récolte de la peau pour le tri des fibroblastes est d'environ 6 h; toutefois, le nombre de souris utilisées dans la récolte aura une influence sur cette estimation.
Plusieurs points du protocole nécessitent un soin particulier. La première est de limiter la contamination de l'adipocyte par élimination des graisses de la peau avant la digestion et l'enlèvement de la couche supérieure de lipides de surnageant et la centrifugation après digestion pendant le processus d'isolement. Il peut également être utile pour passer à de nouveaux tubes après les cellules sont sédimentées comme des composants lipidiques adhèrent aux parois des tubes en plastique et peuvent contaminer les lavages ultérieurs à granulés. Un second point implique un soin méticuleux à derme de l'épiderme séparésle long de la jonction dermo-épidermique. Bien que les cellules épidermiques contaminer sera supprimé par la stratégie de l'épuisement FACS, un effort pour limiter la contamination ici doit encore être faite.
Les limites de cette approche comprennent la présence potentielle de contamination des cellules non appréhendés par le panneau de la lignée actuelle. Lors du choix du fluorophore conjugué aux anticorps de la lignée (CD31, CD45, Tie2, Ter119, EpCAM), les chercheurs doivent prendre soin d'examiner d'autres analyses marqueur de surface, ils pourraient vouloir réaliser. Taches supplémentaires doivent être en canaux distincts du fluorophore d'anticorps de la lignée choisie. En général, nous avons trouvé PacBlue être un conjugué idéal qui préserve une large gamme de longueurs d'ondes disponibles pour une analyse ultérieure. Correspondant à la teinture de la viabilité du fluorophore anticorps lignée conserve une gamme supplémentaire de longueurs d'onde. Par exemple, la viabilité de colorant DAPI excite et émet une fluorescence à des longueurs d'onde similaires à PacBlue. De cette manière, tous DAPI pocellules positives sibles et anticorps de la lignée peuvent être efficacement éliminés en utilisant une seule porte, ne laissant que les fibroblastes viables que la population cible. Il convient également de noter que les cellules sont exposées à de FBS pendant la procédure d'isolement de quantités limitées de temps et cette expression de gènes susceptibles d'influences, à un degré inconnu.
La possibilité de trier inclusivement pour toutes les populations de fibroblastes représente une opportunité d'interroger vraiment l'hétérogénéité de ce type de cellule mal compris. Ceci a une application dans le contexte de la physiologie normale ainsi que d'une variété de maladies impliquant une fibrose excessive des fibroblastes et le comportement aberrant.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par une subvention du NIH R01 GM087609 (à HPL), un cadeau d'Ingrid Lai et Bill Shu en l'honneur d'Anthony Shu (à HPL), subvention du NIH U01 HL099776 (MTL), le Laboratoire Hagey pour pédiatrique médecine régénérative et la Fondation Oak (MTL, GCG et HPL). GMV a été soutenu par l'École de médecine de Stanford, le Programme de formation scientifique médicale de Stanford, et la subvention de formation NIGMS GM07365. ZNM a été soutenu par la chirurgie plastique Research Foundation Fellowship Grant et le Fonds de la famille Hagey. MSH a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) la formation Fellow clinique de subvention TG2-01159, l'American Society of maxillo-chirurgiens (ASMS) / maxillo-faciale chirurgiens Foundation (MSF) Subvention de recherche, et de la transplantation et de génie tissulaire Fellowship Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
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