Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

FACS द्वारा murine चमड़े तंतुकोशिका अलगाव

doi: 10.3791/53430 Published: January 7, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Fibroblasts बाह्य मैट्रिक्स स्रावित के लिए जिम्मेदार सिद्धांत सेल प्रकार रहे हैं और कई अंगों और ऊतकों का एक महत्वपूर्ण घटक है। Fibroblast फिजियोलॉजी और विकृति कई अंगों में fibroses, हाईपरट्राफिक में घाव के निशान निम्नलिखित जलता है, ischemia निम्नलिखित हृदय समारोह की हानि, और कैंसर स्ट्रोमा के गठन सहित नैदानिक ​​संस्थाओं की एक स्पेक्ट्रम कायम करना। हालांकि, fibroblasts के कारण बड़े पैमाने पर अपने निहित विविधता, सेल के एक खराब विशेषता प्रकार रहते हैं। Fibroblasts की अलगाव के लिए मौजूदा तरीकों को गहराई से सेल phenotype और व्यवहार को प्रभावित करती है कि सेल संस्कृति में समय की आवश्यकता है। नतीजतन, fibroblast जीव विज्ञान की जांच कई अध्ययनों में इन विट्रो हेरफेर पर भरोसा करते हैं और सही vivo में fibroblast व्यवहार पर कब्जा नहीं है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हम preservi जिससे सेल संस्कृति की आवश्यकता नहीं है कि वयस्क चूहों के पृष्ठीय त्वचा से fibroblasts की अलगाव के लिए एक FACS आधारित प्रोटोकॉल विकसितशारीरिक ट्रांसक्रिप्शनल और प्रत्येक कोशिका के प्रोटिओमिक प्रोफ़ाइल एनजी। हमारी रणनीति एक वंश नकारात्मक गेट के माध्यम से गैर mesenchymal प्रजातियों के बहिष्कार के लिए अनुमति देता है (लिन -) बल्कि विशिष्ट सतह मार्करों व्यक्त fibroblasts की एक उप-जनसंख्या के पूर्व चयन या संवर्धन से बचने और इस विषम भर में संभव के रूप में समावेशी होने के लिए एक सकारात्मक चयन रणनीति से सेल प्रकार।

Introduction

Fibroblasts अक्सर प्लास्टिक substrates के लिए पालन करना है कि धुरी के आकार कोशिकाओं के रूप में आकृति विज्ञान परिभाषित कर रहे हैं। Fibroblasts synthesizing और भ्रूण और वयस्क अंगों 1 में बाह्य मैट्रिक्स remodeling के लिए जिम्मेदार सिद्धांत सेल प्रकार हैं। Fibroblasts स्तनधारी विकास के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण हैं और प्रत्येक ऊतक और अंग में मौजूद प्रकार की कोशिकाओं को पड़ोसी के व्यवहार को प्रभावित करती है कि बाह्य वातावरण के लिए काफी योगदान करते हैं।

Fibroblasts भी भारी नैदानिक ​​बोझ का कारण है कि चिकित्सा की स्थिति की एक विविध सेट के पीछे प्रिंसिपल सेल प्रकार हैं। वैकृत fibroblast गतिविधि सामान्य ऊतक समारोह को बाधित और त्वचा संबंधी घाव भरने, atherosclerosis, प्रणालीगत काठिन्य, और रक्त वाहिनियों की चोट 2-5 के बाद atheromatous सजीले टुकड़े के गठन के बाद ऊतक (जैसे फेफड़े और यकृत के रूप में) अंग फाइब्रोसिस, scarring भी शामिल है। विशेष रूप से घाव भरने, दोनों तीव्रता और लंबे समय से, घ शामिलसामान्य ऊतकों की तरह न तो जैसा दिखता है और न ही कार्यों यह आसपास, और विविध वैकृत राज्यों में महत्वपूर्ण रुग्णता की ओर जाता है कि निशान ऊतक के eposition। चोट के बाद, फिर, संरचनात्मक ईसीएम घटकों छिपाना प्रकार की कोशिकाओं को पड़ोसी पर पैराक्राइन प्रभाव डालती है, और निशान ऊतक 6 जमा करके यांत्रिक स्थिरता बहाल जो myofibroblasts को fibroblasts की एक संक्रमण, वहाँ है।

त्वचीय ऊतकों में विकास समय के पार घाव की मरम्मत की गुणवत्ता में और शारीरिक साइटों के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता मौजूद है। जीवन के पहले दो trimesters में भ्रूण scarring के बिना भर देता है; बहरहाल, पर और वयस्कता के दौरान तीसरी तिमाही से, एक निशान के साथ चंगा मानव। साइट विशेष, उम्र विशेष के अलावा, घाव भरने में मतभेद मौजूद हैं। त्वचा संबंधी घाव के भीतर निशान ऊतक बयान 9 महत्वपूर्ण है, जबकि मौखिक गुहा में घाव, कम से कम निशान गठन 7.8 के साथ फिर से तैयार करना। विवाद सी बनी रहती हैउम्र और स्थान 10,11 दोनों के संबंध में घाव भरने के परिणाम पर स्थानीय fibroblasts की आंतरिक गुणों बनाम पर्यावरण के सापेक्ष प्रभाव oncerning। त्वचीय डर्मिस और पहले भ्रूण (E15) बनाम मौखिक माउस के उपचार में महत्वपूर्ण मतभेद को देखते हुए बनाम बाद में भ्रूण (E18) डर्मिस, यह निश्चित विकासात्मक उम्र में और विभिन्न शारीरिक साइटों के बीच fibroblasts की आबादी में आंतरिक मतभेद मौजूद है कि संभावना है ।

1986 में, हेरोल्ड एफ ड्वोरक ट्यूमर 12 से ठीक नहीं है कि घाव हैं मंजूर किया। ड्वोरक ट्यूमर शरीर में घाव की तरह व्यवहार करते हैं और मेजबान की प्रतिक्रिया घाव भरने को सक्रिय करने से उनकी स्ट्रोमा प्रेरित कि संपन्न हुआ। कई अध्ययनों के बाद से कार्सिनोमा 13-15 की प्रगति के लिए fibroblasts की योगदान की जांच की है, लेकिन घाव भरने, पहचान और त्वचा संबंधी सीए की स्ट्रोमल डिब्बे में योगदान देने वाले fibroblasts की भ्रूण मूल के मामले मेंrcinomas पर्याप्त रूप से परिभाषित नहीं किया गया है। इस सवाल का जवाब विरोधी कैंसर चिकित्सा 16 के लिए एक संभावित प्रभावी लक्ष्य के रूप में ट्यूमर जुड़े fibroblast प्रकाश में लाने के हाल के अध्ययनों से दिए गए चिकित्सा प्रासंगिकता भालू।

पहचान करना और भावी विवो में fibrogenic क्षमता के साथ संपन्न fibroblast प्रजातियों को अलग-थलग प्रभावी रूप से तीव्र और जीर्ण रोग राज्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में चोट के लिए उनकी प्रतिक्रिया में हेर-फेर करने की दिशा में एक आवश्यक कदम है। 1987 में, Cormack मस्सेदार और जालीदार डर्मिस 17,18 के भीतर एक के भीतर रहने वाले fibroblasts की दो उप-जनसंख्या, एक प्रदर्शन किया। एक तीसरा उप-जनसंख्या कूप 19,20 के त्वचीय papilla क्षेत्र में बालों के रोम के साथ जुड़े पाया गया था। जब सुसंस्कृत, विकास क्षमता, आकृति विज्ञान, और विकास के कारक / साइटोकिन्स में इन fibroblast उपप्रकार प्रदर्शनी मतभेद 21-24 प्रोफाइल।

तिथि करने के लिए, fibroblast की जांच के अध्ययन वहterogeneity काफी हद तक पर्याप्त रूप से इन विवो में fibroblasts के बीच विकास और कार्यात्मक विविधता को चिह्नित करने में नाकाम रहे हैं। इस भाग में, सुसंस्कृत fibroblast आबादी पर निर्भरता नहीं है और सभी fibroblasts 25 द्वारा व्यक्त की एक आत्म सतह रिसेप्टर के आधार पर सेल संस्कृति या सकारात्मक चयन के homogenizing प्रभाव का एक परिणाम है। हमारी प्रयोगशाला से एक ताजा अध्ययन में एक गहरा सतह मार्कर और इस पांडुलिपि 26 में प्रस्तुत FACS आधारित अलगाव कार्यप्रणाली से अलग बनाम सुसंस्कृत असभ्य fibroblasts में ट्रांसक्रिप्शनल पारी का प्रदर्शन किया।

बाद में, हम murine पृष्ठीय डर्मिस के भीतर एक विशिष्ट fibroblast वंश की पहचान और Engrailed -1 की भ्रूण अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित इस वंश, पृष्ठीय त्वचा में संयोजी ऊतक बयान के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार है कि निर्धारित। घाव भरने, कैंसर स्ट्रोमा गठन, और सहित फाइब्रोसिस की तीव्र और जीर्ण रूपों दोनों दौरान वंश कार्योंविकिरण फाइब्रोसिस 27 प्रेरित किया। अलग fibroblast प्रजातियों के लक्षण वर्णन fibrogenic व्यवहार नियमन करने के उद्देश्य से उपचार के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।

बल्कि सेल अलगाव 28,29 प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में गड़बड़ी पर भरोसा करते हैं कि मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग करने से, यहाँ विस्तृत फसल प्रोटोकॉल (चित्रा 1) अधिक सही विवो में phenotype और व्यवहार पर कब्जा कि fibroblasts की उपज जानकारीपूर्ण विश्लेषण में मदद मिलेगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु की देखभाल पर स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय प्रशासनिक पैनल द्वारा अनुमोदित तरीके इस प्रकार है।

Murine डर्मिस की 1. पाचन

  1. Ketamine 100 मिलीग्राम / किग्रा + xylazine 20 मिलीग्राम / किग्रा + acepromazine 3 मिलीग्राम / किलो के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ संज्ञाहरण के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों euthanize।
    नोट: विभिन्न उम्र और पृष्ठभूमि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. दाढ़ी और पृष्ठीय त्वचा बाल हटाना। लगभग 100,000 कोशिकाओं पृष्ठीय त्वचा का एक टुकड़ा x 100 मिमी से 60 मिमी से अलग किया जा सकता है।
  3. सुखाने के लिए एक साफ, बाँझ सतह पर 70% इथेनॉल और जगह में माउस डूब।
  4. इसके तत्काल बाद बाँझ विदारक कैंची का उपयोग पृष्ठीय माउस त्वचा फसल। मादा चूहों में स्तन के ऊतकों सहित बचें।
  5. पूंछ के आधार शुरू, तम्बू त्वचा संदंश का उपयोग करने और पूर्व प्रावरणीय विमान के साथ विदारक से पहले एक अनुप्रस्थ काट कर।
  6. ध्यान से कटाई करते समय किसी भी वसा सहित बचनेत्वचा। किसी भी वसा के लिए काटा त्वचा की जांच करने और ध्यान से एक छुरी की कुंद धार का प्रयोग यह परिमार्जन।
  7. बर्फ पर पीबीएस washes 5x द्वारा पीछा betadine में काटा त्वचा कुल्ला।
    नोट: यह संक्रमण से बचने के लिए संभव के रूप में बाँझ के करीब के रूप त्वचा रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  8. रेज़र ब्लेड का उपयोग कर और नमूना 2-3 मिमी टुकड़े के साथ एक समान निरंतरता की है जब तक एक बाँझ पकवान में कैंची विदारक त्वचा कीमा।
  9. DMEM में 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में 50 मिलीलीटर 20 मिलीलीटर collagenase चतुर्थ युक्त शंक्वाकार ट्यूबों तैयार। ट्यूब प्रति पांच चूहों के आधार पर ट्यूबों में डर्मिस फूट डालो।
  10. एक पानी के स्नान या ओवन में या तो 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating सख्ती जबकि नमूने आंदोलन।
  11. इनक्यूबेटर से नमूने निकालें और एक बाँझ हुड में एक सुई 3-5x के बिना एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से गुजरती हैं।
  12. 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस इनक्यूबेटर में नमूने रखें और एक और 30 मिनट के लिए सख्ती से हिला।
  13. एक बाँझ हुड मेंएक 10 एमएल पिपेट का उपयोग ऊपर और 3-5x नीचे नमूने विंदुक। एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से नमूना पिपेट।
  14. सेल उपज को अधिकतम और 40 एमएल के लिए कुल मात्रा लाने के लिए एक ही फिल्टर के माध्यम से 10% FBS के DMEM के 20 मिलीलीटर से गुजरती हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  15. पहले सतह पर तैरनेवाला शेष करने से पहले ऊपरी मोटी परत को हटाने के लिए महान ख्याल रख रही है, एक बाँझ गिलास पिपेट का उपयोग तैरनेवाला निकालें।
    नोट: यह कदम वसाकोशिका प्रदूषण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  16. 20 मिलीलीटर 10% FBS के DMEM में छर्रों Resuspend।
  17. एक 70 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सेल / DMEM के निलंबन से गुजरती हैं।
  18. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 ग्राम पर 10 मिलीलीटर 10% FBS के DMEM के साथ फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज फ़िल्टर्ड निलंबन कुल्ला।
  19. फिर से पहले किसी भी शेष मोटी परत को दूर करने के ख्याल रख रही है, एक बाँझ गिलास पिपेट का उपयोग तैरनेवाला निकालें।
  20. महत्वपूर्ण आरबीसी संदूषण अगर वहाँ (गोली दिख लाल है), छर्रों फिर से निलंबितऔर 20 मिलीलीटर एसीके lysis बफर में आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। अन्यथा 24 कदम के लिए छोड़।
  21. FACS बफर (पीबीएस, 10% FBS, 0.1% सोडियम azide) के एक बराबर मात्रा (20 एमएल) जोड़ें, तो मिश्रण है, और एक अस्थिर नियंत्रण के रूप में एक तरफ एक 5 मिलीलीटर विभाज्य रखने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 ग्राम पर शेष नमूना अपकेंद्रित्र।
  22. तैरनेवाला निकालें और बर्फ पर गोली डाल दिया। FACS के समय उपलब्ध नहीं है तो कोशिकाओं को इस बिंदु पर नीचे जमे हुए किया जा सकता है।

FACS द्वारा fibroblasts की 2. अलगाव

  1. प्रत्येक गोली के लिए वंश एंटीबॉडी ऊष्मायन मिश्रण के 500 μl बनाओ। , CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), टेर: पहले एक ट्यूब के लिए DNase (10 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त FACS बफर के 475 μl जोड़ने, और फिर fluorophore संयुग्मित CD31 (100 1) जोड़कर यह कर -119 (1: 200), और EpCAM (1: 100) एंटीबॉडी प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए संबंधित कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए।
  2. वंश एंटीबॉडी ऊष्मायन मिश्रण के 500 μl में प्रत्येक गोली पुनः निलंबित और 20 मिनट के लिए बर्फ पर इस निलंबन सेते हैं।
  3. 5 जोड़ेंनमूने के लिए DNase (10 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त और धीरे मिश्रण मिलीलीटर FACS बफर। 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  4. तैरनेवाला निकालें और कदम 26 में के रूप में 5ml FACS DNase युक्त बफर (10 माइक्रोग्राम / एमएल) और एक ही शर्तों का उपयोग सेंट्रीफ्यूज के साथ सेल गोली धो लें।
  5. DNase (10 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त 500 μl FACS बफर में गोली Resuspend और एक व्यवहार्यता डाई नियंत्रण के रूप में एक तरफ एक 50 μl विभाज्य डाल दिया।
  6. चुना डाई के लिए संकेत दिया एकाग्रता में शेष नमूना के लिए पसंद की व्यवहार्यता डाई जोड़ें।
  7. FACS विश्लेषण 31 प्रदर्शन और व्यवहार्यता Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / टेर-119- / EpCAM- कोशिकाओं (2A चित्रा देखें) के लिए छँटाई। क्रमबद्ध सीधे FACS बफर में।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस दृष्टिकोण (चित्रा 1) की वैधता हमारे हाल के प्रकाशन के 27 में विस्तार से जांच की जा सकती है, जो तरीके की एक संख्या में सत्यापित किया गया है। ये हल कोशिकाओं और बड़े पैमाने पर सेल और हौसले से हल कोशिकाओं के एकल कक्ष ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के immunocytochemistry शामिल हैं। Fibroblasts छंटनी सीधे के बजाय और अधिक सही संस्कृति पर भरोसा कर उनके vivo फेनोटाइप कब्जा। बल्कि एक सकारात्मक चयन दृष्टिकोण की तुलना में एक वंश नकारात्मक कमी दृष्टिकोण (2A चित्रा) का प्रयोग विशेष रूप से उप-जनसंख्या के लिए पूर्व चयन से बचा जाता है। इस दृष्टिकोण के मूल्य हाल ही में पहले से वर्णित नहीं डर्मिस के स्तर पर CD26 सकारात्मक fibroblasts की उपस्थिति की पहचान करने, Rinkevich एट अल। 27 के द्वारा प्रदर्शन किया गया था।

संवर्धन fibroblasts की प्रक्रिया जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन की ओर जाता है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए, हम असभ्य fibroblasts को सुसंस्कृत fibroblasts तुलना करने के लिए प्रोटीन का इस्तेमाल किया। हम fibroblasts सुसंस्कृतकि दो तकनीकों, इस पांडुलिपि और एक अच्छी तरह से जाना जाता है ऊतक explant प्रोटोकॉल 28 में विस्तृत लाइव फसल प्रोटोकॉल से अलग थे। पूरे transcriptome माइक्रोएरे विश्लेषण लाइव फसल (C.LH) द्वारा और ऊतक explant द्वारा पृथक सुसंस्कृत fibroblasts (C.TE) के तरीके में एक पियर्सन उत्पाद पल सहसंबंध गुणांक के साथ एक transcriptome चौड़ा स्तर (आर में समानता की एक उच्च डिग्री है कि पता चला ) 0.92 से (चित्रा 2 बी)। तुलना करके, सुसंस्कृत fibroblasts लाइव काटा असभ्य fibroblasts (U.LH) से काफी भिन्न है। U.LH बनाम C.TE की तुलना 0.64 (चित्रा 2 बी) के एक अनुसंधान झुकेंगे जबकि U.LH बनाम C.LH के बीच एक तुलना, 0.61 की एक अनुसंधान झुकेंगे। इन परिणामों के सुसंस्कृत fibroblasts के बजाय लाइव काटा fibroblasts का विश्लेषण करने के महत्व को स्थापित करना। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलग-थलग सभ्य और असभ्य fibroblasts के बीच ट्रांसक्रिप्शनल और प्रोटिओमिक मतभेद की एक और पूरी विश्लेषण के लिए, Walmsley <करने के लिए देखेंउन्हें> एट अल। 26

आकृति 1
तंतुकोशिका अलगाव की चित्रा 1. अवलोकन। इस FACS आधारित अलगाव प्रोटोकॉल में शामिल प्राथमिक कदम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। Walmsley से अनुमति के साथ पुन: उपयोग, जी जी एट अल। तंतुकोशिका हार्वेस्ट विट्रो। ऊतक इंजीनियरिंग में सतह मार्कर शिफ्ट का पता चलता है रहते हैं। भाग सी, तरीके, डोई:। 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. फ्लो और माइक्रोएरे विश्लेषण। Propidium आयोडाइड स्टेशन पर आधारित व्यवहार्य कोशिकाओं के लिए एकल कक्षों के चयन (बाएं साजिश), चयन दिखा (ए) FACS gating रणनीतिining (मध्य साजिश), और CD31, CD45, Tie2, Ter119, और EpCAM के लिए वंश नकारात्मकता के आधार पर fibroblasts (सही साजिश) का चयन। (बी) संवर्धित लाइव काटा बनाम असभ्य लाइव काटा (U.LH) के माइक्रोएरे विश्लेषण सुसंस्कृत ऊतक Explant (C.TE) Fibroblasts बनाम (C.LH)। U.LH (एन = 3), C.LH के बीच जीन अभिव्यक्ति की समानता (एन = 3), और C.TE (एन = 3) पियर्सन उत्पाद-पल सहसंबंध गुणांक (आर) के आधार पर आकलित fibroblast आबादी। [C.LH C.TE बनाम: आर = 0.92]; [C.LH U.LH बनाम: आर = 0.61]; [U.LH बनाम C.TE: आर = 0.64]। Walmsley से अनुमति के साथ पुन: उपयोग, जी जी एट अल। तंतुकोशिका हार्वेस्ट विट्रो। ऊतक इंजीनियरिंग में सतह मार्कर शिफ्ट का पता चलता है रहते हैं। भाग सी, तरीके, डोई:। 10.1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल एक उप-जनसंख्या के लिए चुन सकते हैं या बाद के विश्लेषण से पहले सेल संस्कृति में समय की आवश्यकता है, जो या तो मौजूदा तरीकों की तुलना में, FACS आधारित छँटाई द्वारा fibroblasts को अलग-थलग करने के लिए एक साधन प्रदान करता है। fibroblasts की छँटाई करने के लिए त्वचा की कटाई से आवश्यक समय लगभग 6 घंटा है; हालांकि, फसल में इस्तेमाल चूहों की संख्या इस अनुमान को प्रभावित करती है।

प्रोटोकॉल में कई बिंदुओं विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है। पहले अलगाव की प्रक्रिया के दौरान पाचन और centrifugation निम्नलिखित पाचन और सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी लिपिड परत को हटाने से पहले त्वचा से वसा को हटाने के द्वारा वसाकोशिका संदूषण सीमित है। कुछ लिपिड घटकों ट्यूब की प्लास्टिक की दीवारों का पालन करना और बाद में गोली धोने दूषित हो सकता है के रूप में कोशिकाओं pelleted होने के बाद यह भी ताजा ट्यूबों को बदलने के लिए सहायक हो सकता है। एक दूसरे बिंदु एपिडर्मिस से अलग डर्मिस करने के लिए सावधानीपूर्वक देखभाल शामिलएपिडर्मल-त्वचीय जंक्शन साथ। एपिडर्मल कोशिकाओं को दूषित FACS कमी रणनीति से हटा दिया जाएगा हालांकि, यहां प्रदूषण को सीमित करने के प्रयास अभी भी बनाया जाना चाहिए।

इस दृष्टिकोण की सीमाओं वर्तमान वंश पैनल द्वारा कब्जा नहीं कोशिकाओं contaminating के संभावित मौजूदगी में शामिल हैं। वंश एंटीबॉडी (CD31, CD45, Tie2, Ter119, EpCAM) संयुग्मित फ्लोरोफोरे के चयन, शोधकर्ताओं अन्य सतह मार्कर वे प्रदर्शन करने के लिए चाहते हो सकता है का विश्लेषण करती है पर विचार करने के लिए ध्यान रखना चाहिए। अतिरिक्त दाग चुना वंश एंटीबॉडी fluorophore से अलग चैनलों में होना चाहिए। सामान्य में, हम आगे के विश्लेषण के लिए उपलब्ध तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला को बरकरार रखता है कि एक आदर्श रूप साधना होने की PacBlue पाया। वंश एंटीबॉडी फ्लोरोफोरे के व्यवहार्यता डाई मिलान तरंग दैर्ध्य के एक अतिरिक्त सीमा को बरकरार रखता है। उदाहरण के लिए, व्यवहार्यता डाई DAPI उत्तेजित और PacBlue करने के लिए इसी तरह की तरंग दैर्ध्य में fluoresces। इस तरीके में, सभी DAPI पुलिसsitive और वंश एंटीबॉडी सकारात्मक कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से लक्षित जनसंख्या के रूप में केवल व्यवहार्य fibroblasts छोड़ रहा है, एक भी गेट का उपयोग कर समाप्त किया जा सकता है। यह भी कोशिकाओं एक अज्ञात डिग्री करने के लिए, समय की सीमित मात्रा में हैं और इस संभावना को प्रभावित करती है जीन अभिव्यक्ति के लिए अलगाव की प्रक्रिया के दौरान एफबीएस को उजागर कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

सम्मिलित रूप से सभी fibroblast आबादी के लिए तरह की क्षमता वास्तव में इस खराब समझ सेल प्रकार की विविधता से पूछताछ करने के लिए एक अवसर का प्रतिनिधित्व करता है। यह सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान के संदर्भ में आवेदन के साथ ही अत्यधिक फाइब्रोसिस और न्यायपालिका fibroblast व्यवहार शामिल है कि रोगों की एक किस्म है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

यह काम (एचपीएल) के लिए एनआईएच अनुदान R01 GM087609, (MTL करने के लिए) (एचपीएल) के लिए एंथनी शू, एनआईएच अनुदान U01 HL099776 के सम्मान में इंग्रिड लाइ और बिल शू से एक उपहार है, Hagey प्रयोगशाला के लिए से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था बाल चिकित्सा पुनर्योजी चिकित्सा और ओक फाउंडेशन (MTL करने के लिए, GCG और एचपीएल)। GGW मेडिसिन के स्टैनफोर्ड स्कूल, स्टैनफोर्ड चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम के द्वारा समर्थित है, और NIGMS प्रशिक्षण अनुदान GM07365 था। ZNM प्लास्टिक सर्जरी फाउंडेशन रिसर्च फैलोशिप अनुदान और Hagey परिवार फंड द्वारा समर्थित किया गया। एमएसएच पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) क्लीनिकल फैलो प्रशिक्षण अनुदान TG2-01159, मैक्सिलोफेशियल सर्जन के अमेरिकन सोसायटी (ASMS) / मैक्सिलोफेशियल सर्जन फाउंडेशन (एमएसएफ) अनुसंधान अनुदान पुरस्कार, और प्रत्यारोपण और ऊतक इंजीनियरिंग फैलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
  2. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
  3. Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
  4. Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
  5. Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
  6. Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
  7. Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
  8. Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
  9. Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
  10. Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
  11. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  12. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
  13. Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
  14. Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
  15. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  16. Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
  17. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
  18. Cormack, D. H. Ham's Histology. J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
  19. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
  20. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
  21. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
  22. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
  23. Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
  24. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
  25. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. e4425 (2013).
  26. Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. (2014).
  27. Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. (2015).
  28. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (2010).
  29. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
  30. Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
  31. Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. (2015).
FACS द्वारा murine चमड़े तंतुकोशिका अलगाव
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).More

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter