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Developmental Biology

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

doi: 10.3791/53430 Published: January 7, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

I fibroblasti sono il tipo cellulare principio responsabili della secrezione della matrice extracellulare e sono una componente critica di molti organi e tessuti. Fibroblasti fisiologia e patologia alla base uno spettro di entità cliniche, inclusi fibrosi in organi multipli, cicatrici ipertrofiche seguenti ustioni, perdita della funzione cardiaca dopo ischemia, e la formazione di stroma cancro. Tuttavia, i fibroblasti rimangono un tipo di cellula poco caratterizzato, in gran parte a causa della loro eterogeneità. Metodi esistenti per l'isolamento dei fibroblasti richiedono tempo in coltura cellulare che influenza profondamente il fenotipo e il comportamento delle cellule. Di conseguenza, molti studi che hanno valutato fibroblasti biologia basano su manipolazioni in vitro e non colgono accuratamente il comportamento dei fibroblasti in vivo. Per superare questo problema, è stato sviluppato un protocollo basato FACS-per l'isolamento dei fibroblasti dalla pelle dorsale di topi adulti che non richiede di coltura cellulare, così preserving trascrizionale fisiologico e il profilo proteomico di ogni cellula. La nostra strategia consente di esclusione di lignaggi non mesenchimali attraverso un cancello negativo lignaggio (Lin -) piuttosto che una strategia di selezione positiva di evitare la preselezione o l'arricchimento di una sottopopolazione di fibroblasti che esprimono marcatori di superficie specifici ed essere il più inclusivo possibile attraverso questo eterogeneo tipo di cellula.

Introduction

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I fibroblasti sono spesso definiti morfologicamente come cellule fusiformi che aderiscono a substrati plastici. I fibroblasti sono il tipo cellulare principio responsabile per la sintesi e il rimodellamento della matrice extracellulare in embrionali e adulte organi 1. I fibroblasti sono quindi fondamentali per lo sviluppo dei mammiferi e contribuiscono in maniera sostanziale l'ambiente extracellulare che influenza il comportamento della vicina tipi presenti in ogni tessuto e organo cellulari.

I fibroblasti sono anche il tipo di cellula principale dietro un insieme eterogeneo di condizioni mediche che causano enorme peso clinico. Attività dei fibroblasti patologica ostacola la funzione tessuto normale e comprende tessuti e fibrosi organi (come il polmone e fegato), cicatrici dopo la guarigione della ferita cutanea, arteriosclerosi, sclerosi sistemica, e la formazione di placche ateromatose dopo la lesione dei vasi sanguigni 2-5. La guarigione delle ferite, in particolare, sia acuta e cronica, coinvolge deposition di tessuto cicatriziale che né assomiglia né funzioni come il tessuto normale circostante, e porta ad una significativa morbilità attraverso diversi stati patologici. Dopo lesioni, vi è una transizione di fibroblasti di miofibroblasti, che poi secernono componenti ECM strutturali, esercitano effetti paracrini sulla vicina tipi cellulari, e ripristinare la stabilità meccanica depositando tessuto cicatriziale 6.

Nei tessuti cutanei esiste significativa variazione della qualità di riparazione della ferita nel tempo di sviluppo e tra siti anatomici. Nei primi due trimestri di vita del feto guarisce senza lasciare cicatrici; tuttavia, dal terzo trimestre su e tutta l'età adulta, gli esseri umani a guarire con una cicatrice. , Oltre a specifiche età, esistono differenze nella guarigione delle ferite site-specific. Le ferite del cavo orale rimodellare con una minima formazione di cicatrici 7,8, mentre la deposizione di tessuto cicatriziale all'interno ferite cutanee è significativo 9. Polemica persiste concerning l'influenza relativa dell'ambiente contro le proprietà intrinseche dei fibroblasti locali sul risultato della guarigione delle ferite per quanto riguarda sia l'età e la posizione 10,11. Date le differenze significative nella guarigione del mouse orale contro derma cutanee e embrionale prima (E15) vs. dopo embrionale (E18) derma, è probabile che esistono differenze intrinseche nelle popolazioni di fibroblasti a una certa età e di sviluppo tra i vari siti anatomici .

Nel 1986, Harold F. Dvorak postulato tumori sono ferite che non guariscono 12. Dvorak concluso che i tumori si comportano come ferite nel corpo e inducono loro stroma attivando la cicatrizzazione risposta dell'ospite. Numerosi studi hanno indagato poiché il contributo dei fibroblasti alla progressione dei carcinomi 13-15, ma come nel caso di guarigione delle ferite, l'identità e l'origine embrionale dei fibroblasti che contribuiscono al compartimento stromale ca cutanearcinomas non è stato adeguatamente definito. La risposta a questa domanda porta rilevanza medica dato recenti studi che denunciano la fibroblasti associati al tumore come un obiettivo potenzialmente efficace per la terapia anti-cancro 16.

Identificare e prospetticamente isolare i lignaggi di fibroblasti dotati di potenziale fibrogenica in vivo è un passo essenziale verso manipolare efficacemente la loro risposta al danno in una vasta gamma di patologie acute e croniche. Nel 1987, Cormack ha dimostrato due sottopopolazioni di fibroblasti, uno residente nel papillare e uno all'interno del derma reticolare 17,18. Una terza sottopopolazione è stata trovata associata a follicoli piliferi nella regione papilla dermica del 19,20 follicolo. Quando coltivate, queste differenze sottotipi di fibroblasti mostrano in un potenziale di crescita, morfologia, e fattore di crescita / citochine Profili 21-24.

Ad oggi, gli studi esaminando fibroblasti luiterogeneity hanno ampiamente fallito per un'adeguata caratterizzazione diversità evolutiva e funzionale tra fibroblasti in vivo. Questo è, in parte, è il risultato di una dipendenza da popolazioni di fibroblasti in coltura e l'effetto omogeneizzante della coltura cellulare o selezione positiva sulla base di un recettore di superficie sé non espressa da tutti fibroblasti 25. Un recente studio condotto dal nostro laboratorio ha dimostrato un marcatore di superficie profonda e spostamento trascrizionale in coltura contro fibroblasti incolti isolati dalla metodologia isolamento basato FACS-presentato in questo manoscritto 26.

Successivamente, abbiamo identificato uno specifico lignaggio fibroblasti nel derma dorsali murine e determinato che questo lignaggio, definita da espressione embrionale engrailed-1, è il primo responsabile per la deposizione di tessuto connettivo nella pelle dorsale. Le funzioni di derivazione durante entrambe le forme acute e croniche di fibrosi tra cui la guarigione delle ferite, cancro formazione stroma, eradiazione indotta fibrosi 27. La caratterizzazione di linee di fibroblasti distinti ha implicazioni fondamentali per terapie volte a modulare comportamento fibrogenica.

Invece di utilizzare protocolli esistenti che si basano su di manipolazione in vitro per ottenere l'isolamento cellulare 28,29, il protocollo di raccolta (figura 1) qui descritto aiuterà rendimento analisi informative di fibroblasti che catturano più accuratamente fenotipo e il comportamento in vivo.

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Protocol

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Questo protocollo segue metodi approvati dal Pannello di Amministrazione dell'Università di Stanford sulla cura degli animali da laboratorio.

1. Digestione di murini Derma

  1. Euthanize topi per dislocazione cervicale dopo anestesia con una iniezione intraperitoneale di ketamina 100 mg / kg + xilazina 20 mg / kg + Acepromazine 3 mg / kg.
    Nota: I vari età e provenienza possono essere utilizzati.
  2. Shave e depilare la pelle dorsale. Circa 100.000 cellule possono essere isolate da un pezzo di pelle dorsale 60 mm x 100 mm.
  3. Immergere il mouse in 70% di etanolo e posto su una superficie sterile pulito ad asciugare.
  4. Immediatamente raccogliere pelle del mouse dorsale con delle forbici dissezione sterili. Nei topi femmina, evitare di includere il tessuto mammario.
  5. Avvio della base della coda, utilizzare pinze per tenda la pelle e fare un taglio trasversale prima dissezione lungo il piano sovra-fasciale.
  6. Evitare accuratamente tra cui il grasso sottocutaneo durante la raccoltala pelle. Esaminare la pelle raccolta per il grasso sottocutaneo e raschiare con attenzione fuori utilizzando il bordo smussato di un bisturi.
  7. Sciacquare la pelle raccolti in betadine seguito da 5x lavaggi PBS sul ghiaccio.
    Nota: E 'importante mantenere la pelle come vicino sterile possibile per evitare la contaminazione.
  8. Tritare la pelle con lame di rasoio e dissezione forbici in un piatto sterile fino a quando il campione è di una consistenza uniforme con 2-3 pezzi mm.
  9. Preparare 50 ml provette coniche contenenti 20 ml di collagenasi IV ad una concentrazione di 1 mg / ml in DMEM. Dividere il derma nei tubi sulla base di cinque topi per provetta.
  10. Agitare vigorosamente campioni mentre incubando a 37 ° C per 1 ora a scelta in bagnomaria o microonde.
  11. Rimuovere campioni dall'incubatore e passare attraverso una siringa da 10 ml senza ago 3-5x in una cappa sterile.
  12. Porre i campioni di nuovo nel incubatore a 37 ° C e agitare vigorosamente per altri 30 min.
  13. In una cappa sterile, Pipetta i campioni su e giù per 3-5x con una pipetta 10 ml. Pipettare il campione attraverso un filtro 100 micron in una nuova provetta da 50 ml.
  14. Far passare 20 ml di 10% FBS DMEM attraverso lo stesso filtro per massimizzare la resa delle cellule e portare il volume totale a 40 ml. Centrifugare a 300 g per 8 minuti a 4 ° C.
  15. Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro sterile, facendo molta attenzione prima rimuovere lo strato superiore di grasso prima di surnatante rimanente.
    Nota: Questo passaggio è fondamentale per ridurre la contaminazione degli adipociti.
  16. Risospendere il pellet in 20 ml DMEM 10% FBS.
  17. Passare la sospensione cellulare / DMEM attraverso un filtro 70 micron.
  18. Lavare il filtro con 10 ml di DMEM 10% FBS e centrifugare la sospensione filtrata a 300 g per 8 minuti a 4 ° C.
  19. Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro sterile, sempre avendo cura di togliere prima ogni strato di grasso residuo.
  20. Se vi è una contaminazione significativa RBC (il pellet è visibilmente rosso), risospendere il pelletin 20 ml di tampone di lisi ACK e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. In caso contrario, passare al punto 24.
  21. Aggiungere un volume uguale (20 ml) di tampone FACS (PBS, 10% FBS, 0,1% di sodio azide), quindi mescolare e tenere da parte una aliquota di 5 ml come controllo non colorato. Centrifugare il campione rimanente a 300 g per 8 minuti a 4 ° C.
  22. Rimuovere il surnatante e mettere pellet su ghiaccio. Le cellule possono essere congelati fino a questo punto se il tempo FACS non è disponibile.

2. Isolamento di fibroblasti da FACS

  1. Rendere 500 ml di anticorpi lignaggio mix di incubazione per ogni pallina. A tale scopo, prima di aggiungere 475 ml di tampone FACS contenente DNasi (10 mg / ml) in una provetta, e quindi aggiungendo fluoroforo-CD31 coniugato (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (01:50), Ter -119 (1: 200), e EpCAM (1: 100) per ottenere anticorpi rispettiva diluizione per ciascun anticorpo.
  2. Risospendere ogni pellet in 500 ml di anticorpo lineage miscela di incubazione e incubare questa sospensione in ghiaccio per 20 min.
  3. Aggiungere 5ml FACS tampone contenente DNasi (10 mg / ml) al campione e mescolare delicatamente. Centrifugare a 300 g per 8 minuti a 4 ° C.
  4. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare con tampone FACS contenente 5 ml DNasi (10 ug / ml) e centrifugare utilizzando le stesse condizioni come al punto 26.
  5. Risospendere il pellet in 500 microlitri tampone FACS contenente DNasi (10 ug / ml) e messo da parte un'aliquota di 50 microlitri come controllo redditività colorante.
  6. Aggiungere redditività tintura di scelta per il campione rimanente nella concentrazione indicata per il colorante prescelta.
  7. Effettuare analisi FACS 31 e smistamento per la vitalità di coloranti / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- cellule (vedi Figura 2A). Ordina direttamente nel buffer FACS.

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Representative Results

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La validità di questo approccio (Figura 1) è stata verificata in un numero di modi, che possono essere esaminati in dettaglio nella nostra recente pubblicazione 27. Questi includono immunocitochimica di cellule ordinati e delle cellule di massa e singola cella di analisi trascrizionale di cellule appena ordinati. Ordinamento fibroblasti direttamente piuttosto che fare affidamento sulla cultura in modo più accurato cattura la loro fenotipo in vivo. Utilizzando un approccio lignaggio negativo esaurimento (Figura 2A), piuttosto che un approccio selezione positiva evita di pre-selezione per particolari sottopopolazioni. Il valore di questo approccio è stato recentemente dimostrato da Rinkevich et al. 27, che identifica la presenza di fibroblasti CD26 positive a livello del derma precedenza non descritti.

Per confermare che il processo di coltura di fibroblasti porta a significativi cambiamenti nell'espressione genica, abbiamo utilizzato microarray per confrontare fibroblasti coltivati ​​ai fibroblasti incolte. Abbiamo coltivato fibroblastiche sono stati isolati da due tecniche, il protocollo di raccolta diretta dettagliato in questo manoscritto e un noto tessuto protocollo espianto 28. Whole-trascrittoma microarray analisi ha rivelato che colture di fibroblasti isolati dalla raccolta diretta (C.LH) e da espianto dei tessuti (C.te) metodologie hanno un alto grado di somiglianza a un livello in tutto il trascrittoma con un coefficiente di Pearson momento prodotto di correlazione (r ) di 0,92 (Figura 2B). In confronto, colture di fibroblasti differivano significativamente da fibroblasti dal vivo raccolte incolti (U.LH). Un confronto tra C.LH contro U.LH ha prodotto un r di 0,61, mentre un confronto di C.te contro U.LH ha prodotto un r di 0,64 (Figura 2B). Questi risultati stabiliscono l'importanza di analizzare fibroblasti dal vivo raccolte anziché fibroblasti in coltura. Per un'analisi più completa delle differenze trascrizionali e proteomica tra colture di fibroblasti e incolte isolati che utilizzano questo protocollo, fare riferimento a Walmsley <em> et al. 26

Figura 1
Figura 1. Panoramica di isolamento Fibroblasto. Rappresentazione schematica delle fasi principali coinvolti in questo protocollo isolamento basato FACS-. Riutilizzati con il permesso di Walmsley, GG et al. Vivi Fibroblast Harvest rivela superficiale Maiusc Marker in vitro. L'ingegneria dei tessuti. Parte C, Metodi, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Citometria a Flusso e analisi microarray. (A) FACS strategia di gating mostrando selezione di singole cellule (grafico a sinistra), la selezione per cellule vitali sulla base di ioduro di propidio STAvorazio (terreno di mezzo), e la selezione dei fibroblasti (trama a destra) sulla base di stirpe negatività per CD31, CD45, Tie2, Ter119 e EpCAM. (B) Analisi microarray di Uncultured live raccolto (U.LH) rispetto coltivata in diretta raccolto (C.LH) rispetto tessuto coltivata Espianto (C.te) fibroblasti. Somiglianza di espressione genica tra U.LH (n = 3), C.LH (n = 3), e C.te (n = 3) le popolazioni di fibroblasti, come misurato dal coefficiente di correlazione prodotto-momento di Pearson (r). [C.LH vs C.te: r = 0.92]; [C.LH vs U.LH: r = 0.61]; [C.te vs U.LH: r = 0.64]. Riutilizzati con il permesso di Walmsley, GG et al. Vivi Fibroblast Harvest rivela superficiale Maiusc Marker in vitro. L'ingegneria dei tessuti. Parte C, Metodi, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Il protocollo descritto in questo manoscritto offre un mezzo per isolare i fibroblasti mediante selezione basata FACS, in confronto ai metodi esistenti, che permettono di selezionare una sottopopolazione o richiedono tempo di coltura cellulare prima analisi successive. Il tempo richiesto dalla raccolta della pelle a cernita dei fibroblasti è di circa 6 ore; tuttavia, il numero di topi utilizzati nel raccolto influenzerà questa stima.

Diversi punti del protocollo richiedono particolare attenzione. La prima è la limitazione della contaminazione da adipociti rimozione del grasso dalla pelle prima digestione e rimozione dello strato lipidico superiore del surnatante dopo la digestione e centrifugazione durante il processo di isolamento. Può anche essere utile per cambiare nuove provette dopo le cellule sono in pellet come alcuni componenti lipidici aderiscono alle pareti dei tubi in plastica e possono contaminare i successivi lavaggi pellet. Un secondo punto riguarda la cura meticolosa di derma separati da dell'epidermidelungo la giunzione epidermico-cutanea. Anche se la contaminazione cellule epidermiche verrà rimosso dalla strategia esaurimento FACS, uno sforzo per limitare la contaminazione qui deve ancora essere reso.

I limiti di questo approccio comprendono la potenziale presenza di contaminanti cellule non evidenziati dal pannello di stirpe corrente. Quando si sceglie il fluoroforo coniugato con gli anticorpi lignaggio (CD31, CD45, Tie2, Ter119, EpCAM), i ricercatori devono aver cura di prendere in considerazione altre marcatore di superficie analisi si potrebbe desiderare di eseguire. Macchie aggiuntive devono essere in canali distinti dal fluoroforo anticorpi stirpe eletta. In generale, abbiamo trovato PacBlue essere un coniugato ideale che conserva una vasta gamma di lunghezze d'onda disponibili per ulteriori analisi. Adattamento del colorante vitalità al fluoroforo anticorpi lignaggio conserva una ulteriore gamma di lunghezze d'onda. Ad esempio, il DAPI viabilità tintura emoziona e fluorescenza a lunghezze d'onda simili a PacBlue. In questo modo, tutto DAPI pocellule positive sitive e anticorpi lignaggio possono essere efficacemente eliminate con una sola porta, lasciando solo i fibroblasti vitali come la popolazione target. Va inoltre osservato che le cellule sono esposte a FBS durante la procedura di isolamento per importi limitati di tempo e questo probabilmente espressione genica influenze, in misura sconosciuta.

La possibilità di ordinare, globalmente per tutte le popolazioni di fibroblasti rappresenta un'opportunità per interrogare veramente l'eterogeneità di questo tipo di cellule poco conosciuta. Questo ha applicazione nel contesto della fisiologia normale così come una varietà di malattie che coinvolgono la fibrosi eccessivo e fibroblasti comportamento aberrante.

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Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione da NIH concedere R01 GM087609 (a HPL), un regalo da Ingrid Lai e Bill Shu in onore di Anthony Shu (a HPL), NIH concedere U01 HL099776 (a MTL), il Laboratorio Hagey per Pediatrica Medicina rigenerativa e la Fondazione Rovere (a MTL, GCG e HPL). GGW è stato sostenuto dalla Stanford School of Medicine, il Programma di Formazione Stanford Medical Scientist, e borsa di formazione NIGMS GM07365. Znm è stato sostenuto dalla chirurgia plastica Research Foundation Fellowship Grant e il Fondo Famiglia Hagey. MSH è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow concessione formazione TG2-01159, l'American Society of maxillofacciale Chirurghi (ASMS) / maxillofacciale Chirurghi Foundation (MSF) Research Grant Award, e il trapianto e Tissue Engineering Fellowship Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

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References

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Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).More

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