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Developmental Biology

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

doi: 10.3791/53430 Published: January 7, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

線維芽細胞は、細胞外マトリックスを分泌する責任原則細胞型であり、多くの臓器や組織の重要なコンポーネントです。線維芽細胞の生理学および病理学は、複数の器官における線維症、肥厚性瘢痕以下の火傷、虚血後の心機能の喪失、および癌間質の形成を含む臨床実体、のスペクトルを基礎となっています。しかし、線維芽細胞は、主として、その固有の不均一性、細胞の特徴付けが乏しいタイプ残ります。線維芽細胞の単離のための既存の方法は、深く細胞表現型と動作に影響を与える細胞培養の時間を要します。その結果、線維芽細胞の生物学を研究する多くの研究 、in vitroでの操作に依存していると正確に生体内で線維芽細胞の挙動を捕捉しません。この問題を克服するために、我々はpreserviそれによって、細胞培養を必要とせず、成体マウスの背部皮膚からの線維芽細胞を単離するためのFACSベースのプロトコルを開発しました生理的な転写および各セルのプロテオミクスプロファイルをngの。特定の表面マーカーを発現する線維芽細胞の亜集団の事前選択または濃縮を回避し、この異機種全体で可能な限り包括的であることをむしろポジティブ選択戦略よりも-私たちの戦略は、系統陰性ゲート(林)を介して非間葉系統の排除を可能にしますセルタイプ。

Introduction

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線維芽細胞は、しばしば、プラスチック基板に接着する紡錘状細胞と形態学的に定義されています。線維芽細胞は、胚および成体の臓器1における細胞外マトリックスの合成と改造を担当する原則細胞型です。線維芽細胞は、哺乳類の発生することが重要であり、各組織や臓器に存在する隣接セルの種類の動作に影響を与える細胞外環境に大きく貢献しています。

線維芽細胞はまた、膨大な臨床負担を引き起こす医学的条件の多様なセットの背後の主要な細胞型です。病理学的線維芽細胞の活性は、正常組織の機能を損ない、皮膚の創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、全身性硬化症、および血管損傷2-5後のアテローム斑の形成後の組織及び(例えば肺や肝臓など)臓器線維症、瘢痕化が含まれます。特に、創傷治癒は、両方のは、急性および慢性的に、Dを含み、そのことを周囲の正常組織のようなどちらも似ているにも機能し、多様な病理学的状態全体でかなりの罹患率につながる瘢痕組織のeposition。損傷後、次に、構造ECM成分を分泌する細胞型に隣接パラクリン効果を発揮し、瘢痕組織6を堆積させることによって機械的安定性を復元する筋線維芽細胞への線維芽細胞の移行があります。

皮膚組織の発達時間全体の傷の修復の質と解剖学的部位との間に有意な変動が存在します。人生の最初の2つの学期では胎児が瘢痕化せずに治癒します。しかし、上と成人期を通じて第三期から、傷を癒す人間。部位特異的な、年齢別に加えて、創傷治癒の違いが存在します。皮膚創傷内の瘢痕組織沈着が9重要である一方で、口腔内の傷は、最小限の瘢痕形成7,8を改造します。論争は、cを持続します年齢や場所10,11の両方に関しては、創傷治癒の結果に地元の線維芽細胞の固有の特性に対する環境の相対的な影響をoncerning。皮膚の真皮およびそれ以前の胚(E15)対以降の胚(E18)真皮対経口マウスの治癒に大きな違いを考えると、それは特定の発達年齢で、様々な解剖学的部位の中の線維芽細胞の集団における本質的な違いが存在している可能性があります。

1986年、ハロルドF.ドヴォルザークは、腫瘍が12を治癒しない傷ある仮定しました。ドヴォルザークは、腫瘍が体に傷のように動作し、ホストの創傷治癒応答を活性化することにより、それらの間質を誘導することを結論付けました。多くの研究があるため、癌腫13-15の進行への線維芽細胞の寄与を調べたが、創傷治癒、アイデンティティと皮膚のCAの間質コンパートメントに貢献する線維芽細胞の胚起源の場合のようにしていますrcinomasは十分に定義されていません。この質問への答えは、抗癌治療のための潜在的に16有効な標的として腫瘍関連線維芽細胞を曝露する最近の研究で与えられた医学的関連を負いません。

特定と将来を見越して、生体内で線維形成の可能性に恵まれ、線維芽細胞系統の単離を効果的に急性および慢性疾患状態の広い範囲にわたって損傷に対するそれらの応答を操作に向けて不可欠なステップです。 1987年には、コーマックは乳頭と真皮網状層17,18内の1内に存在する線維芽細胞の2亜集団、1つを示しました。三亜集団は、卵胞19,20の乳頭地域の毛包に関連する発見されました。培養した場合、これらの線維芽細胞サブタイプの展示成長性の違い、形態、および成長因子/サイトカインは21-24プロファイル

現在までに、研究では、線維芽細胞、彼を調べますterogeneityは、主に適切に生体内での線維芽細胞間の発達と機能的多様性を特徴づけるために失敗しています。これは、部分的には、培養線維芽細胞集団への依存ではなく、すべての線維芽細胞25で表される自己表面レセプターに基づいて、細胞培養または正の選択の均一化効果の結果です。私たちの研究室からの最近の研究では、深遠な表面マーカーと、この原稿26で提示FACSに基づく分離方法によって単離された未培養線維芽細胞対培養において転写シフトを示しました。

その後、我々は、マウスの背側真皮内の特定の線維芽細胞系統を同定し、 エングレイルド-1の胚式で定義されたこの系統は、背部皮膚における結合組織沈着の主な原因であることを決定しました。創傷治癒、癌間質形成を含む線維症の急性および慢性型の両方の間の系統機能、放射線は、線維症27を誘導しました。明確な線維芽細胞系統の特徴付けは、線維形成の動作を調節することを目的と治療のための重要な意味を持っています。

むしろ細胞単離28,29を達成するために、in vitroでの操作に依存している既存のプロトコルを使用するよりも、ここでは詳述収穫プロトコル( 図1)は、より正確に生体内での表現型と行動を捕獲線維芽細胞の収量有益な分析をするのに役立ちます。

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Protocol

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このプロトコルは、実験動物管理のスタンフォード大学紛争処理パネルにより承認された方法に従います。

マウス真皮の1消化

  1. ケタミンを100mg / kgのキシラジン+ 20ミリグラム/ kgのアセプロマジン+ 3 10mg / kgの腹腔内注射による麻酔後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
    注意:様々な年齢や背景を使用することができます。
  2. 背部皮膚を剃ると毛を抜きます。約100,000個の細胞は、背側の皮膚の一片×100mmの60ミリメートルから単離することができます。
  3. 70%エタノールでマウスを水没し、乾燥さ清潔、無菌面に置きます。
  4. すぐに無菌解剖ハサミを使用して、背側マウスの皮膚を収穫。雌マウスでは、乳房組織を含めないようにしてください。
  5. 尾の付け根から開始して、10トンまでの皮膚のに鉗子を使用し、超筋膜面に沿って切開する前に、横方向のカットを行います。
  6. 収穫しながら、任意の皮下脂肪を含め慎重に避けます肌。任意の皮下脂肪のために採取した皮膚を調べ、慎重にメスの鈍いエッジを使用してそれを削り取ります。
  7. 氷上でPBS洗浄を5倍に続いてベタジンで収穫皮膚を洗い流します。
    注:これは、汚染を回避することができる無菌の近くの皮膚を維持することが重要です。
  8. かみそりの刃を使用して、サンプル2-3ミリの作品との均一な一貫性になるまで滅菌皿にはさみを解剖皮膚をみじん切り。
  9. DMEM中1mg / mlの濃度で50ミリリットルを20ミリリットルのコラゲナーゼIVを含むコニカルチューブを準備します。チューブあたり5匹のマウスに基づいてチューブに真皮を分割します。
  10. 水浴またはオーブンのいずれかで37℃で1時間インキュベートしながら、積極的にサンプルを攪拌。
  11. インキュベーターからサンプルを取り出して、無菌フード内で針3-5xずに10ミリリットルの注射器を通過します。
  12. 37℃でバックインキュベーターにサンプルを配置し、さらに30分間激しく振ります。
  13. 無菌フードに10mlのピペットを用いてピペット上下3-5xサンプル。新しい50mlコニカルチューブに100μmのフィルターを通して試料をピペット。
  14. 細胞収率を最大化し、40ミリリットルの全量を同じフィルターを通して、10%FBSを含むDMEMの20ミリリットルを渡します。 4℃で8分間300gで遠心分離します。
  15. 最初前残りの上清に、上部の脂肪層を除去するために細心の注意を取って、滅菌ガラスピペットを用いて上清を除去します。
    注:このステップは、脂肪細胞の汚染を低減することが重要です。
  16. 20ミリリットルの10%FBS DMEM中でペレットを再懸濁します。
  17. 70μmのフィルターを通して細胞/ DMEM懸濁液を渡します。
  18. 10ミリリットル、10%FBS DMEMでフィルターを洗浄し、4℃で8分間300グラムで濾過サスペンションを遠心します。
  19. 再び第1残りの脂肪層を除去するために世話をして、滅菌ガラスピペットを用いて上清を除去します。
  20. 重要なRBC汚染がある場合(ペレットが目に見えて赤である)、ペレットを再懸濁20 mlのACK溶解緩衝液中で室温で5分間インキュベートします。それ以外の場合は24に進みます。
  21. FACS緩衝液(PBS、10%FBS、0.1%アジ化ナトリウム)の等量(20 ml)を追加し、その後混合し、非染色コントロールとして確保5mLのアリコートを維持します。 4℃で8分間300gで、残りのサンプルを遠心します。
  22. 上清を除去し、氷の上にペレットを入れました。 FACS時間が利用できない場合、細胞は、この時点で凍結してもよいです。

FACSによる線維芽細胞の単離2。

  1. 各ペレットの系統抗体インキュベーションミックスの500μLを加えます。第1のチューブにDNアーゼ(10μg/ ml)を含むFACS緩衝液475μLを加え、その後、(1:100)、フルオロフォアコンジュゲートCD31を追加することでこれを行い、CD45(1:200)、Tie2の(1:50)、テル-119(1:200)、およびEpCAMの(1:100)抗体は、各抗体に対するそれぞれの希釈を達成します。
  2. 系統抗体インキュベーションミックス500μlの各ペレットを再懸濁し、20分間氷上でこの懸濁液をインキュベートします。
  3. 5を追加サンプルにDNアーゼ(10μg/ ml)を含む、穏やかに混合mlのFACSバッファー。 4℃で8分間300gで遠心分離します。
  4. 上清を除去し、ステップ26と同様の条件を用いて、DNアーゼ(10μg/ ml)および遠心分離を含む5ミリリットルFACS緩衝液で細胞ペレットを洗浄します。
  5. DNアーゼ(10μg/ ml)を含む500μlのFACS緩衝液中にペレットを再懸濁し、生存率染料コントロールとして確保50μlのアリコートを入れました。
  6. 選択された染料のために示されている濃度の残りのサンプルに選択の生存率染料を追加します。
  7. FACS分析31を行い、生存率染料/ CD31- / CD45 - / Tie2- /テル-119- / EpCAM-細胞( 図2A参照 )のソート。ソート直接FACS緩衝液に。

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Representative Results

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このアプローチ( 図1)の有効性は、我々の最近の刊行物27に詳細に検討することができる多くの方法で確認されました。これらは、ソートされた細胞と細胞塊の免疫細胞化学と新鮮にソートされた細胞の単一細胞の転写の分析が含まれます。線維芽細胞のソートではなく、直接、より正確文化に頼ることはそれらのインビボ表現型をキャプチャします。系統陰性枯渇のアプローチ( 図2A)よりもむしろポジティブ選択法を使用すると、特定の部分母集団の事前選択を避けることができます。このアプローチの価値は、最近Rinkevich らによって実証された。27、以前に記載されていない真皮のレベルでCD26陽性の線維芽細胞の存在を同定します。

培養線維芽細胞の処理は、遺伝子発現の有意な変化をもたらすことを確認するために、我々は、未培養線維芽細胞を培養した線維芽細胞を比較するためにマイクロアレイを使用します。我々は培養線維芽細胞それは、二つの技術、本稿でよく知られた組織外植片のプロトコル28で詳述ライブ収穫プロトコルにより単離しました。全トランスクリプトームのマイクロアレイ解析は、ライブ収穫(C.LH)によって、および組織外植片により単離し、培養線維芽細胞(C.TE)方法はピアソンの積率相関係数とトランスクリプトーム全体のレベル(rにおける類似度が高いことを明らかにしました)0.92( 図2B)。比較すると、培養線維芽細胞は、ライブ収穫非培養線維芽細胞(U.LH)から大幅に異なっていました。 U.LH対C.TEの比較は0.64( 図2B)のRをもたらしながらU.LH対C.LHとの比較では、0.61のRが得られました。これらの結果は、培養線維芽細胞ではなく生収穫した線維芽細胞を分析することの重要性を確立します。このプロトコルを用いて単離し、培養し、未培養線維芽細胞との間の転写およびプロテオミクスの違いのより完全な分析のために、<Walmsleyを参照してください。em>のら26

図1
線維芽細胞の分離の図1.概要。このFACSベースの分離プロトコルに関係する主要なステップの概略図。 Walmsleyから許諾を得て再掲し、GG 線維芽細胞の収穫 、インビトロ。 組織工学における表面マーカーのシフトを明らかにライブ。パートC、方法 、DOI:10.1089 / ten.TEC.2014.0118(2014)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2.フローサイトメトリーおよびマイクロアレイ解析。ヨウ化プロピジウムのSTAに基づいて、生細胞のための単一細胞の選択(左のプロット)、選択されていることを示す(A)のFACSゲーティング戦略ining(中段)、およびCD31、CD45、Tie2の、TER119、およびEpCAMのための系統陰性に基づいて線維芽細胞(右のプロット)の選択。(B)培養ライブ収穫対非培養ライブ収穫(U.LH)のマイクロアレイ解析培養組織外植片(C.TE)線維芽細胞対(C.LH)。 U.LH(n = 3)を、C.LH(N = 3)、およびC.TE(n = 3)をピアソンの積率相関係数(R)によって測定されるような線維芽細胞集団間の遺伝子発現の類似性。 【C.LH C.TE対:R = 0.92]。 【C.LH U.LH対:R = 0.61]。 【U.LH対C.TE:R = 0.64]。 Walmsleyから許諾を得て再掲し、GG 線維芽細胞の収穫 、インビトロ。 組織工学における表面マーカーのシフトを明らかにライブ。パートC、方法 、DOI:10.1089 / ten.TEC.2014.0118(2014)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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この原稿に記載されているプロトコルは、亜集団のために選択するか、その後の分析の前に、細胞培養時間を必要とするいずれかの既存の方法に比較して、FACSベースの選別により、線維芽細胞を単離するための手段を提供しています。線維芽細胞のソートに皮膚の収穫からの所要時間は約6時間です。しかし、収穫に使用したマウスの数は、この推定値に影響を与えます。

プロトコルのいくつかの点は特に注意が必要です。最初は、分離プロセス中に消化し、遠心分離後に消化し、上清の上部の脂質層の除去の前に皮膚から脂肪を除去することによって脂肪細胞の汚染を制限しています。また、いくつかの脂質成分は、チューブのプラスチック壁に付着し、その後のペレット洗浄液を汚染する可能性があるように、細胞をペレット化した後、新鮮なチューブに変更することが有用であろう。第二の点は、表皮から真皮別々に細心の注意を必要とします表皮真皮境界部に沿って。表皮細胞を夾雑FACS枯渇戦略によって除去されるが、ここでは汚染を制限するための努力がまだなされるべきです。

このアプローチの限界は、現在の系統パネルによって捕捉されなかった細胞を汚染する可能性の存在が含まれます。系統抗体(CD31、CD45、Tie2の、TER119、EpCAMを )に結合蛍光団を選択すると、研究者は他の表面マーカーは、彼らが実行したいことがあり分析を検討するように注意する必要があります。追加の汚れは、選択された系統の抗体の蛍光体とは別のチャンネルでなければなりません。一般に、我々はPacBlueは、さらなる分析のために利用可能な波長の広い範囲を保持する理想的な複合体であることが判明しました。系統抗体蛍光団に生存性色素を一致させることは、波長の追加の範囲を維持します。例えば、生存性色素DAPIを励起し、PacBlueに類似の波長で蛍光を発します。このように、すべてのDAPI POsitiveおよび系統抗体陽性細胞が効果的に標的集団としてのみ実行可能な線維芽細胞を残して、単一のゲートを使用して除去することができます。それはまた、細胞が未知の程度まで、時間の限られた量と、この可能性の影響を与える遺伝子発現のための単離手順中にFBSに曝されることに留意すべきです。

包括的にすべての線維芽細胞集団のためにソートする機能は、本当にこのあまり理解細胞型の不均一性を調べるための機会を表しています。これは、正常な生理機能との関連で、アプリケーションだけでなく、過剰な線維症および異常な線維芽細胞の挙動を伴う種々の疾​​患を持っています。

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Acknowledgments

この作品は(HPL)は、NIH助成金R01 GM087609、(MTL)は(HPL)にアンソニー・シュウ、NIHのグラントU01のHL099776に敬意を表しイングリッド・ライ、ビルシュウからの贈り物、Hagey研究所のための助成金によって部分的にサポートされていました小児再生医療とオーク財団(MTLに、GCGおよびHPL)。 GGWは医学のスタンフォードスクール、スタンフォード医学者研修プログラム、およびNIGMS訓練助成金GM07365によってサポートされていました。 ZNMは整形外科財団研究員助成とHageyファミリー基金によってサポートされていました。 MSHは再生医療のためのカリフォルニア工科大学(CIRM)臨床フェロー研修助成金TG2-01159、顎顔面外科学会(ASMS)/顎顔面外科財団(MSF)研究助成賞、および移植とティッシュ・エンジニアリングフェローシップ賞によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

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References

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FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離
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Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).More

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