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Developmental Biology

Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS

doi: 10.3791/53430 Published: January 7, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela secreção de matriz extracelular e são um componente essencial de muitos órgãos e tecidos. Fibroblastos fisiologia e patologia subjacente um espectro de entidades clínicas, incluindo fibroses em múltiplos órgãos, cicatrizes hipertróficas seguintes queimaduras, perda da função cardíaca após isquemia, e a formação de estroma cancro. No entanto, os fibroblastos continuam a ser um tipo de célula mal caracterizada, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. Métodos para o isolamento de fibroblastos existentes requerem tempo em cultura de células que influencia profundamente o comportamento das células e fenótipo. Consequentemente, muitos estudos que investigam a biologia de fibroblastos confiar manipulação in vitro e não capturar com precisão o comportamento de fibroblastos in vivo. Para superar este problema, desenvolveu-se um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos a partir de pele dorsal de ratinhos adultos que não necessita de cultura de células, assim preserving a transcrição fisiológico e proteômica perfil de cada célula. Nossa estratégia permite a exclusão de linhagens não-mesenquimais através de um portão negativo linhagem (Lin -) em vez de uma estratégia de seleção positiva para evitar a pré-selecção ou enriquecimento de uma subpopulação de fibroblastos expressando marcadores de superfície específicos e ser o mais abrangente possível através deste heterogêneo tipo de célula.

Introduction

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Os fibroblastos são frequentemente definidas morfologicamente como células fusiformes que aderem aos substratos de plástico. Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela síntese e remodelação da matriz extracelular em embrionárias e adultas órgãos 1. Os fibroblastos são, portanto, essencial para o desenvolvimento dos mamíferos e contribuir substancialmente para o meio extracelular, que influencia o comportamento do vizinho tipos de células presentes em cada tecido e órgão.

Os fibroblastos são também o tipo de célula principal por trás de um conjunto diversificado de condições médicas que causam enorme fardo clínico. Actividade patológica de fibroblastos prejudica a função do tecido normal e inclui tecido e fibrose dos órgãos (tais como fígado e pulmão), a cicatrização a seguir a cicatrização cutânea da ferida, aterosclerose, esclerose sistémica, e a formação de placas de ateroma após a lesão do vaso sanguíneo 2-5. Cicatrização de feridas em particular, tanto de forma aguda e crônica, envolve deposition de tecido cicatricial que nem se assemelha nem funções como o tecido normal circundante ele, e leva a morbidade significativa em diversos estados patológicos. Após lesão, existe uma transição de fibroblastos para miofibroblastos, em seguida, que segregam os componentes da ECM estruturais, exercem efeitos parácrinos em tipos de células vizinhas, e restabelecer a estabilidade mecânica através do depósito de tecido cicatricial 6.

Em tecidos cutâneos existe variação significativa na qualidade de reparação de feridas através do tempo de desenvolvimento e entre os locais anatômicos. Nos dois primeiros trimestres de vida do feto cura sem cicatrizes; No entanto, a partir do terceiro trimestre e em toda a vida adulta, cura dos humanos com uma cicatriz. , Para além específica para a idade, cicatrização de feridas em diferenças existem específica do local. Feridas na cavidade oral remodelar com formação de cicatriz mínima 7,8, enquanto a deposição de tecido cicatricial dentro de feridas cutâneas é significativa 9. A controvérsia persiste concerning a influência relativa do ambiente contra as propriedades intrínsecas dos fibroblastos locais sobre os resultados da cicatrização de feridas em relação à idade e localização 10,11. Dadas as diferenças significativas na cicatrização de rato oral versus derme cutâneas e embrionário antes (E15) vs. depois embrionário (E18) derme, é provável que existem diferenças intrínsecas nas populações de fibroblastos em determinadas idades e de desenvolvimento entre os vários locais anatômicos .

Em 1986, Harold F. Dvorak postulou tumores são feridas que não cicatrizam 12. Dvorak concluir-se que os tumores se comportam como feridas no corpo e induzir a sua estroma através da activação da ferida resposta do hospedeiro de cura. Numerosos estudos têm investigado uma vez que a contribuição de fibroblastos para a progressão de carcinomas 13-15, mas, como no caso da cicatrização de feridas, a identidade e origem embrionária dos fibroblastos que contribuem para o compartimento estromal da CA cutânearcinomas não foi adequadamente definido. A resposta a esta questão não tem relevância médica dada estudos recentes expondo a fibroblastos associado ao tumor como um alvo potencialmente eficaz para a terapia anti-câncer 16.

Identificar e prospectivamente isolar linhagens de fibroblastos dotados de potencial fibrogenic in vivo é um passo essencial para efetivamente manipular sua resposta à lesão através de uma ampla gama de estados agudos e crônicos. Em 1987, Cormack demonstrou duas subpopulações de fibroblastos, uma residindo dentro de uma e a papilar na derme reticular 17,18. Uma terceira subpopulação foi encontrado associado com folículos pilosos na região papila dérmica do folículo 19,20. Quando cultivadas, essas diferenças subtipos de fibroblastos apresentam em potencial de crescimento, morfologia e crescimento / fator de citocinas perfis 21-24.

Até o momento, estudos examinando fibroblastos eleterogeneity pela maior parte não caracterizar adequadamente a diversidade de desenvolvimento e funcional entre fibroblastos in vivo. Isto é, em parte, é um resultado de uma dependência de populações fibroblastos cultivadas e o efeito de homogeneização de cultura de células ou selecção positiva sobre a base de um receptor da superfície da auto não expresso por todos os fibroblastos 25. Um estudo recente de nosso laboratório demonstraram um marcador de superfície profunda e mudança de transcrição em fibroblastos incultos cultivadas vs. isoladas pela metodologia de isolamento à base de FACS apresentada neste manuscrito 26.

Subsequentemente, foi identificada uma linhagem de fibroblastos específica no interior da derme dorsal de murino e determinaram que esta linhagem, definida pela expressão embrionária de Engrailed-1, é o principal responsável pela deposição de tecido conjuntivo na pele dorsal. As funções de linhagem durante ambas as formas aguda e crônica da fibrose incluindo a cicatrização de feridas, formação de estroma câncer, eradiação induzida fibrose 27. A caracterização de linhagens de fibroblastos distintas tem implicações críticas para terapias destinadas a modulação do comportamento fibrogenic.

Ao invés de usar protocolos existentes que se baseiam em manipulação in vitro, para obter o isolamento de células 28,29, o protocolo de colheita (Figura 1) descrito aqui vai ajudar análises informativos rendimento de fibroblastos que capturam mais precisamente fenótipo e o comportamento in vivo.

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Protocol

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Este protocolo segue métodos aprovados pelo Painel Administrativo da Universidade de Stanford em Laboratory Animal Care.

1. Digestão de murinos Derme

  1. Eutanásia ratinhos por deslocamento cervical depois de anestesia com uma injecção intraperitoneal de cetamina 100 mg / kg + xilazina 20 mg / kg de acepromazina + 3 mg / kg.
    Nota: Várias idades e origens podem ser usados.
  2. Raspar e depilar a pele dorsal. Aproximadamente 100.000 células podem ser isoladas a partir de um pedaço de pele dorsal 60 mm x 100 mm.
  3. Mergulhe o mouse em etanol 70% e coloque em uma superfície limpa e estéril para secar.
  4. Colher imediatamente a pele do rato dorsal usando tesouras de dissecção estéreis. Em camundongos fêmeas, evitar incluindo o tecido mamário.
  5. A partir da base da cauda, ​​utilize uma pinça para tenda a pele e fazer um corte transversal antes de dissecar ao longo do plano supra-fascial.
  6. Evitar cuidadosamente incluindo qualquer gordura subcutânea durante a colheitaa pele. Examine a pele colhidas para qualquer gordura subcutânea e cuidadosamente raspá-lo usando a ponta chanfrada de um bisturi.
  7. Lavar a pele colhidas em betadine seguido de 5x lavagens PBS em gelo.
    Nota: É importante manter a pele tão perto quanto possível estéril para evitar contaminação.
  8. Picar a pele usando lâminas de barbear e tesouras de dissecação em um prato estéril até que a amostra é de uma consistência uniforme com 2-3 mm peças.
  9. Preparar tubos de 50 mL cónico contendo 20 ml de colagenase IV a uma concentração de 1 mg / ml em DMEM. Dividir a derme para os tubos na base de cinco ratinhos por tubo.
  10. Agitar vigorosamente enquanto incubando amostras a 37 ° C durante 1 hora em banho-maria ou uma ou forno.
  11. Retirar amostras da incubadora e passar através de uma seringa de 10 ml, sem uma agulha 3-5x num hote estéril.
  12. Coloque as amostras de volta na incubadora a 37 ° C e agitar vigorosamente durante mais 30 min.
  13. Em um capuz estéril, Pipetar as amostras cima e para baixo 3-5x com uma pipeta 10 ml. Pipetar a amostra através de um filtro de 100 um para um novo tubo de 50 ml.
  14. Passa 20 ml de meio DMEM FBS a 10% através do mesmo filtro de maximizar o rendimento celular e levar o volume total a 40 ml. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  15. Remover o sobrenadante com uma pipeta de vidro estéril, tomando muito cuidado para primeiro remover a camada superior de gordura antes da restante sobrenadante.
    Nota: Esta etapa é fundamental para reduzir a contaminação dos adipócitos.
  16. Ressuspender as pelotas em 20 ml de DMEM FBS a 10%.
  17. Passar a suspensão de célula / meio DMEM por meio de um filtro de 70 um.
  18. Lavar o filtro com 10 ml de DMEM FBS a 10% e centrifuga-se a suspensão foi filtrada a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  19. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de vidro estéril, mais uma vez tendo o cuidado de remover qualquer primeira camada de gordura restante.
  20. Se há contaminação significativa de RBC (o sedimento é visivelmente vermelho), re-suspender as pelotasem 20 ml de tampão de lise ACK e incubar durante 5 min à TA. Caso contrário, pule para a etapa 24.
  21. Adicionar um volume igual (20 ml) de tampão de FACS (PBS, 10% de FBS, 0,1% de azida de sódio), em seguida, misturar, e de lado manter uma alíquota de 5 ml, como um controlo não corado. Centrifuga-se o restante amostra a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  22. Remover o sobrenadante e colocar pellet no gelo. As células podem ser congeladas para baixo neste ponto, se o tempo de FACS não está disponível.

2. Isolamento de fibroblastos por FACS

  1. Faça 500 mL de mistura de incubação de anticorpos para cada linhagem pellet. Para fazer isso, em primeiro lugar a adição de 475 ul de tampão FACS contendo ADNase (10 ug / ml) para um tubo, e em seguida, adicionando-fluororo conjugado CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200), e EpCAM (1: 100) de anticorpos para alcançar a respectiva diluição para cada anticorpo.
  2. Re-suspender cada sedimento em 500 ul de mistura de incubação de anticorpo e linhagem esta suspensão incubar em gelo durante 20 min.
  3. Adicionar 5ml de FACS tampão contendo DNase (10 ug / ml) à amostra e misturar suavemente. Centrifugar a 300 g durante 8 min a 4 ° C.
  4. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento de células com tampão de SCAF contendo 5 ml de ADNase (10 ug / ml) e centrifuga-se utilizando as mesmas condições que no passo 26.
  5. Ressuspender o sedimento em tampão FACS contendo 500 ul de ADNase (10 ug / ml) e posto de lado de uma alíquota de 50 ul de controlo como um corante de viabilidade.
  6. Adicionar corante de viabilidade de escolha para a amostra que permanece na concentração indicada para o corante escolhido.
  7. Realizar análise FACS 31 e triagem para a viabilidade Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- células / EpCAM- (ver Figura 2A). Ordenar directamente em tampão de SCAF.

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Representative Results

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A validade desta abordagem (Figura 1) foi verificada em um número de maneiras, que podem ser examinados em pormenor na nossa publicação recente 27. Estes incluem imunocitoquímica de células classificadas e célula de massa e análise de transcrição única célula de células recém-ordenados. Classificando fibroblastos diretamente, em vez de depender de cultura com mais precisão capta a sua in vivo fenótipo. Usando uma abordagem de linhagem negativa depleção (Figura 2A), em vez de uma abordagem de selecção positiva evita pré-seleção para determinadas subpopulações. O valor desta abordagem foi recentemente demonstrada por Rinkevich et al. 27, identificando a presença de CD26 fibroblastos positivos a um nível da derme previamente não descritos.

Para confirmar que o processo de fibroblastos a cultura de conduz a mudanças significativas na expressão gênica, usamos microarrays para comparar a cultura de fibroblastos fibroblastos incultos. Nós cultivados fibroblastosque foram isolados por duas técnicas, o protocolo de colheita vivo detalhado neste manuscrito e um protocolo de explante de tecido 28 bem conhecido. Microarray Whole-transcriptoma revelou que os fibroblastos em cultura isoladas pela colheita vivo (C.LH) e por explante de tecido (C.TE) metodologias têm um elevado grau de semelhança ao nível de toda a transcriptoma com um coeficiente de correlação produto-momento de Pearson (r ) de 0,92 (Figura 2B). Em comparação, a cultura de fibroblastos diferiu significativamente a partir de fibroblastos incultos colhidas ao vivo (U.LH). Uma comparação entre C.LH contra U.LH produziu um r de 0,61, enquanto que uma comparação de C.TE contra U.LH produziu um r de 0,64 (Figura 2B). Estes resultados estabelecem a importância de analisar os fibroblastos ao vivo colhidas ao invés de cultura de fibroblastos. Para uma análise mais completa das diferenças de transcrição e proteômica entre fibroblastos cultos e incultos isolado utilizando este protocolo, consulte o Walmsley <26 em> et al.

figura 1
Figura 1. Visão Geral do Isolamento de fibroblastos. Representação esquemática dos passos principais envolvidos neste protocolo de isolamento à base de FACS. Reutilizado com permissão de Walmsley, GG et al. Vive Fibroblast Colheita revela marcador deslocamento de superfície em engenharia de tecidos in vitro.. Parte C, Métodos, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. citometria de fluxo e Microarray Analysis. (A) FACS estratégia gating mostrando a selecção de células individuais (gráfico da esquerda), selecção de células viáveis ​​com base no iodeto de propidio STAining (trama do meio) e seleção de fibroblastos (enredo direita) com base na linhagem negatividade para CD31, CD45, Tie2, Ter119, e EpCAM. (B) Análise de Microarray Uncultured vivos colhidos (U.LH) versus Cultivadas vivos colhidos (C.LH) versus tecido cultivado explante (C.TE) fibroblastos. Similaridade de expressão do gene entre U.LH (n = 3), C.LH (n = 3), e C.TE (n = 3) populações de fibroblastos tal como medida pelo coeficiente de correlação produto-momento de Pearson (r). [C.LH vs. C.TE: r = 0,92]; [C.LH vs. U.LH: r = 0,61]; [C.TE vs. U.LH: r = 0,64]. Reutilizado com permissão de Walmsley, GG et al. Vive Fibroblast Colheita revela marcador deslocamento de superfície em engenharia de tecidos in vitro.. Parte C, Métodos, doi:. 10,1089 / ten.TEC.2014.0118 (2014) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O protocolo descrito neste manuscrito oferece um meio para isolar fibroblastos pela triagem baseada em FACS, em comparação com os métodos existentes, o que quer para seleccionar uma subpopulação ou necessitam de tempo em cultura de células antes de análises subsequentes. O tempo necessário desde a colheita da pele para a triagem de fibroblastos é de cerca de 6 horas; No entanto, o número de ratos utilizados na colheita vai influenciar esta estimativa.

Vários pontos do protocolo requer um cuidado especial. A primeira é a redução da contaminação por adipócitos a remoção da gordura da pele, antes da digestão e a remoção da camada superior do sobrenadante lípido a seguir à digestão e centrifugação durante o processo de isolamento. Também pode ser útil para alterar a tubos frescos após as células são sedimentadas como alguns componentes lipídicos aderir às paredes dos tubos de plástico e podem contaminar as lavagens subsequentes com pellets. Um segundo ponto envolve cuidado meticuloso para separar a epiderme da dermeao longo da junção dérmico-epidérmica. Embora contaminantes células epidérmicas serão removidos pela estratégia de depleção de FACS, um esforço para limitar a contaminação aqui ainda deve ser feita.

As limitações dessa abordagem incluem a presença potencial de contaminar células não captadas pelo painel linhagem atual. Ao escolher o fluoróforo conjugado com os anticorpos da linhagem (CD31, CD45, Tie2, Ter119, EpCAM), os pesquisadores devem ter o cuidado de considerar outro marcador de superfície analisa eles podem querer realizar. Manchas adicionais devem estar em canais distintos da fluorophore anticorpo linhagem escolhida. Em geral, achamos PacBlue ser um conjugado ideal que preserva uma ampla gama de comprimentos de onda disponíveis para análise posterior. Combinando o corante de viabilidade para o fluoróforo anticorpo linhagem preserva uma gama de comprimentos de onda adicionais. Por exemplo, o corante de viabilidade DAPI excita e fluoresce a comprimentos de onda similares aos PacBlue. Desta maneira, todos PO DAPIcélulas positivas de anticorpo e linhagem sível pode ser eficazmente eliminado utilizando uma única porta, deixando apenas os fibroblastos viáveis ​​como a população alvo. Deve também notar-se que as células são expostas a FBS durante o procedimento de isolamento de quantidades limitadas de tempo e isso influencia a expressão do gene provavelmente, a um grau desconhecido.

A capacidade de classificar inclusive para todas as populações de fibroblastos representa uma oportunidade para interrogar verdadeiramente a heterogeneidade desse tipo de célula mal compreendida. Isto tem aplicação no âmbito da fisiologia normal bem como uma variedade de doenças que envolvem fibrose excessiva e comportamento aberrante de fibroblastos.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão do NIH subvenção R01 GM087609 (para HPL), um presente de Ingrid Lai e Bill Shu em honra de Anthony Shu (para HPL), NIH concessão U01 HL099776 (para MTL), o Laboratório Hagey para Pediatric Regenerative Medicine e The Oak Foundation (para MTL, GCG e HPL). GGW foi apoiado pela Escola de Medicina de Stanford, o Programa de Formação de Stanford Medical Scientist, e bolsa de formação NIGMS GM07365. Znm foi apoiado pela Fundação de Pesquisa de Cirurgia Plástica Fellowship Grant eo Fundo Família Hagey. MSH foi apoiado pelo Instituto Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM) Fellow Clínica formação TG2-01159 concessão, a Sociedade Americana de Cirurgiões Maxilo (ASMS) / Cirurgiões Buco Maxilo Facial Foundation (MSF) Research Award Grant, e de Transplante e Engenharia de Tecidos Prémio Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Forceps Kent Scientific INS650916
Micro-scissors Kent Scientific INS600127
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
Nair (depilatory cream) Church and Dwight Co. 22600267058
Collagenase IV Gibco 17104-019
Elastase Abcam ab95133
DMEM Life Technologies A14430-01
Fetal Bovine Serum Gibco 16000-044
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
40 μm filters Fisher Scientific 08-771-1
70 μm filters Fisher Scientific 08-771-2
100 μm filters Fisher Scientific 08-771-19
CD31 BioLegend 102421
CD45 BioLegend 103125
Tie2 BioLegend 124005
Ter-119 BioLegend 116233
EpCAM (CD326) eBioscience 48-5791
DAPI Invitrogen D3571
propidium iodide (PI viability stain) BioLegend 421301

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References

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Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).More

Walmsley, G. G., Maan, Z. N., Hu, M. S., Atashroo, D. A., Whittam, A. J., Duscher, D., Tevlin, R., Marecic, O., Lorenz, H. P., Gurtner, G. C., Longaker, M. T. Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS. J. Vis. Exp. (107), e53430, doi:10.3791/53430 (2016).

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