Summary
Den funktionella beteende av celler i odling kan förbättras genom odling i mer in vivo -liknande 3-dimensionella odlingsmiljöer 16-21. Detta manuskript beskriver installation och drift av en ihålig fiber bioreaktor system för in vivo-liknande däggdjursvävnadskultur.
Introduction
Vävnadskultur är en etablerad teknik för tillväxt och / eller underhåll av celler som har använts i över 100 år 1,2. Bekvämligheten med att studera celler och svar ex vivo har långtgående fördelar tillåter experiment som annars skulle vara extremt utmanande om inte omöjligt, till exempel generering av genetiskt modifierade cellinjer och användningen av reporterceller i hög genomströmning screeningsanalyser 3. Mer nyligen vävnadskultur har gett upphov till området för vävnadsteknik, för genereringen av in vitro-modeller och för regenerativ medicin. Med dessa program, har intresset för dynamiska tre-dimensionell (3D) odlingssystem ökat avsevärt.
3D odlingsmetoder (som definieras här som en 3D-kultur substrat och / eller införandet av rikt dynamiska flöde) bättre rekapitulera arkitektur den cellulära miljön in vivo, viktigt för att uppnå enmer fysiologisk liknande funktion. Möjligheten att utvinna, växa, differentiera och transplantationsceller i syfte att reparera sjuka och skadade vävnaden är ett ämnesområde som har en enorm potential för patientnytta och kommersiell möjlighet. Till exempel användning av autologa keratinocyter för behandling av brännskador (se 4) och användningen av cellbaserade terapier för behandling av stroke (se 5). Likaså har marknaden för in vitro-modeller spänner läkemedelsutveckling till stratifierade medicin applikationer. Konventionen i vävnadskultur är tillväxten av fastsittande eller förankringstyper beroende cell på två-dimensionella (2D) ytan av en vävnadsodlingskolv. Även för närvarande accepteras som guldmyntfoten i en miljö forskning har nyligen intresse i vävnadstekniska tillämpningar betonade att nuvarande 2D vävnadsodlingsmiljö är otillräcklig för den önskade skala upp i cellproduktionen 6.
För vidhäftande celltyper en scaffold krävs, vilket kommer att variera beroende på slutanvändningen, när det gäller både den kemiska sammansättningen och mekaniska egenskaper. Vissa system använder ställningar samt plåtinsatser består av mycket porös matris bildad av hög inre fas emulsion mall (se 7) eller elektrospunna fibrer (se 8) kräver minimal anpassning av konventionella 2D odlingstekniker. Celler kan ympas på mikrobärare av olika kompositioner och odlas i omrörda tankar som levererar näringsämnen och signalmolekyler, och transportera bort slaggprodukter (masstransport) genom en dynamisk väl blandad miljö 9. Men dessa system begränsade i sin in vivo-liknande miljö och ytterligare förbättringar kan göras när det gäller att skala upp kostnaderna. Ihåliga fibrer bioreaktorer (HFBs) är en 3D-kultursystem som består av fibrer fixerade i en modul med celler typiskt ympats på utsidan av de porösa fibrerna och media som levereras genom fiberlumen (översikt i en0) (Figur 1). HFBs erbjuder en in vivo-liknande miljö med fibrerna härma blod kapillärer och skärm cellerna från skjuvspänningar i samband med dynamisk media leverans, samtidigt som definieras skjuvning som skall tillämpas på celler de via vätskeflöde genom sidoportar, om så önskas. Detta skapar ett mångsidigt odlingssystem med överlägsen masstransport där hög celltätheter kan nås 11. HFB systemet lämpar sig väl för underhåll av förankringsberoende celltyper och har använts för att odla en mängd olika celler inklusive råtta pankreatiska Langerhanska öar 12, mus β-TC-3 insulinom cellinje 12, primära mänskliga hepatocyter 13, humant ben märg mononukleära celler 14, Madin Darby njurceller från hund (MDCK) 15 och Caco-2-celler 16 för att nämna några.
Förutom system fördelarna med massöverföring och skala upp celler odlas i 3D tissue kultursystem tenderar att vara mer in vivo -liknande i morfologi och mer mottaglig för experimentella signaler. Till exempel råtta primära hepatocyter visar en mer kubiskt morfologi, ökad lönsamhet, ökad induktion av cytokrom-P450-enzymaktivitet och ökad känslighet för paracetamol toxicitet när den odlas i en kommersiellt tillgänglig polystyren byggnadsställning i förhållande till celler som odlas i 2D kultur 17. Med användning av samma scaffold den hepatokarcinom cellinjen HepG2 har också visat sig öka albuminproduktion 18 och visa en mer in vivo -liknande svar på metotrexat jämfört med 2D odlade celler 19. Primära humana hepatocyter visade fördröjd dedifferentiering högre cytokrom-P450-aktivitet och ökad clearance för 4/5 testade föreningar i en perfusion kultursystem 20. Human neurala stamceller som härrör neuroner och glia odlade i en kommersiellt tillgänglig polystyren schavotten uppvisade både hög (aktionspotential) och låg frequeNCY (lokal fältpotential) spontan aktivitet medan ingen neuronal aktivitet detekterades i 2D odlade celler 21. Caco-2-celler visade ökad differentiering i en HFB jämfört med 2D kultur mäts genom ökad alkalinfosfatas, γ-glutamyltransferas och P-glykoprotein aktivitet och högre uttryck av F-aktin och zona occludens-1 protein 16. Trots fördelarna rutinen odling av celler i andra fall än ett 2D-vävnadsodlingskolv yta system fortfarande inte praktiseras i många laboratorier, även om antalet publikationer citerar 3D cellodling växer (8-faldig ökning av de senaste 10 åren. Källa : PubMed 'Resultat Year "verktygs undersöktes med 3D-kultur").
Detta manuskript beskriver installation och driftsförhållanden av en HFB system för däggdjurscellkultur och visar dess användbarhet i odling av hepatokarcinom HepG2 / C3A. Syftet med denna metod är att odla cellerna ien mer in vivo -liknande kultursystem som bibehåller tillräckligt enkelhet att göra det mottagligt för dem som är nya till 3D-odlingssystem. Tanken bakom att använda HFBs i ansökan beskriver här, som är att förbättra förutsägbarheten i lever modeller är att det är teoretiskt möjligt att efterlikna en leversinuskurva i HFB miljön 22. Detta är för närvarande inte möjligt med andra odlingssystem.
Protocol
1. Fibrer
- Tillverkning fibrerna genom fasinversion spin gjutning (spinning). Detaljer om denna metod kan hittas i 23,24.
OBS: För detta arbete fibrerna tillverkas i huset med hjälp av ett icke-nedbrytbart proprietary polymer, NMP som lösningsmedel och H2O som icke-lösningsmedlet. Detaljer på andra lämpliga polymerer kan återfinnas i diskussionen. De fibrer som används i systemet som beskrivs här är 1.05mm ytterdiameter med en 600-700 um lumen diameter. Fibrerna är porösa med pordiametrar mäter 2,28 um ± 1,5 pm (medelvärde ± standardavvikelse). Detta är utformad för att separera celler från media foder i fiber lumen, replikera leversinus eller kärl av andra vävnader. Fibrer kan också köpas från membran leverantörer som Pall.
2. Modul Fabrication
OBS: De moduler som används i denna studie är gjorda av en mm tjockt borsilikatglas med 2 sidoöppningar(Figur 2A). Fibrerna i modulen som beskrivs här har en yttre ytarea av 4,95 cm 2 vilket motsvarar ungefär hälften av en brunn i en 6-brunnsplatta.
- Siliconize moduler före första användningen genom att belägga insidan med Sigmacote (tabell 1) och gör det möjligt att torka i ett dragskåp. Autoklav (121 ° C, 1 atm, 20 min) för att öka livslängden av behandlingen.
- Med användning av ett skalpellsnitt 75 mm långa fibrer och sätt tre fibrerna till varje modul lämnar ~ 7 mm överskottslängd vid varje ände (figur 3A).
- Plats ~ 0,5 ml av silikonlim (tabell 1) in i en vägningsskål. Använda en P200 pipettspets för att plocka upp en liten mängd silikon och arbeta limmet in i modulens ändar runt fibrerna för att bilda en 3-5 mm kontakt (figur 3B). Låt torka> 3 timmar.
- Med hjälp av en skalpell skära silikon jäms med glasmodul ändarna (figur 3C).
- wrap enliten mängd (~ 4 skikt) av polytetrafluoreten (PTFE) tejp runt en sidoport.
3. Systeminställningar och sterilisering
OBS: pumpslangen och moduler med fibrer inte autoklaveras och steriliseras med 70% etanol. Författarna rekommenderar kalibrering av pumpslangen med pumpen som skall användas. Proceduren nedan utförs i ett dragskåp med laminärt flöde.
- Autoklav (som avsnitt 2.1) alla autoklaver komponenter före installation.
- Inrätta
- Placera 10 ml 70% etanol i behållaren flaskan och set-up behållarflaskan, Q-serien mössa, matningsrör, pump och pumpslangen (tabell 1) såsom i fig 4.
- Löst placera en ändkåpa över PTFE-tejpade sidoport. Skjut ändarna av L / S16 modulkontakter över modulen slutar och fri sidoöppning. Anslut en 40 mm sektion av L / S13 slang till modulkontakten närmast den utjämnade sidoport (tabell 1) såsom i fig 2B
- Ansluta modulen till pumpslangen, vilket garanterar att orientera modulen så den kapslade sidoöppningen är närmast pumpen.
- Anslut permeatet linjen och retentat linje med modulkontakter och L / S14 av Y-kontakten på behållaren flaskan (tabell 1). Säkerställa att den set-up liknar schemat i figur 4.
- Sterilisering
- Pumpa etanol genom modulen vid 800 pl / h (267 l / h per fiber) för tillräckligt med tid att behandla unautoclaved komponenter för> 30 min (justera gånger om andra steriliseringsmetoder används, se 25).
- Tvätta
- Att tvätta etanolen ur systemet, först stänga av pumpen och töm slangen. Först loss pumpslangen från moduladapterslangen. Håll modulen aloft att dränera etanolen ur fibrerna och retentatet linje, tillbaka in i reservoaren flaskan. Ta bort sidoport ändlocket från modulen rinna the etanol från själva modulen, och permeatet linjen. Sätta tillbaka sidoporten ändkåpan. Vända flödet av medier på pumpen för att dränera pumpen rör och matarledning av etanol. Stänga av pumpen, och sätt tillbaka pumpslangen till modulen adaptern.
- Skruva etanol flaskan från locket och ersätta med en flaska innehållande 10 ml av celltillväxtmedium (såsom EMEM, GMEM, DMEM eller RPMI) utan serum. Pumpa mediet genom systemet vid 800 | j, l / h tills retentatet raden är full av media. Kläm retentatet linjen för att tvinga trängning av media genom fibrerna att tvätta modulen. Tvätta i ~ 2 timmar.
4. sådd
OBS: Medierna och tillägg som används i detta protokoll bör vara de som fastställts för den önskade celltypen. Hänvisas till litteraturen, European CoUection of Cell Cultures (ECACC) och American Type Culture Collection (ATCC) för ytterligare information. Innan denna metod celler bör vara maintagranskat enligt etablerade protokoll för den önskade celltypen. För detta arbete var hepatokarcinom HepG2 / C3A subklon underhålls enligt distributörer rekommendationer (ATCC).
OBS! Sådd Protokollet presenteras nedan tjänar också till att pre-kultur modulen med cellodlingsmediet före celltillväxt. Om en mer omfattande pre-kultur krävas då detta bör genomföras innan sådd modulen genom att dränera tvätt media från systemet, ersätter med tillväxtmedia och genomsyrar detta genom modulen för några timmar. Se avsnitt 7.5.2.1 för mer information om hur du byter media i systemet.
- Förbereda en enkelcellsuspension genom trypsinering enligt etablerade protokoll för den önskade celltypen. Ett allmänt protokoll för en T75 kultur är som följer:
OBS: Antalet celler som ska användas i sådd steget bör bestämmas empiriskt för önskad celltyp. Bioreaktorerna beskrivs här sås på en 35-faldigt högre cells densitet (celler / cm 2) än vad som används i 2D vävnadsodlingsplast för en 7-dagars kultur.- Tvätta cellerna genom tillsats av 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), aspirera, tillsätt sedan 3 ml 0,05% trypsin etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (tillräckligt för att täcka cellerna) och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 5 min.
- Harvest celler i 7 ml tillväxtmedia som kompletterats med 10% fetalt bovint serum (FBS) för att neutralisera trypsin. Blanda väl, tillsätt 10 pl till kammaren av en hemocytometer och räkna cellerna.
- Centrifugera vid 200 xg under 5 min för att pelletera cellerna.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna på 4x10 6 / ml i tillväxtmedium kompletterat som krävs för den önskade celltypen.
- Stäng av pumpen och töm matarröret och modul som i 3.4.1.
- Lossa modulen från modulkontakter och fästa modul gavlar (tabell 1) försteriliserade i 70% etanol, lämnar en sidoport gratis. </ Li>
- Överför ~ 500 pl av cellsuspensionen (2x10 6 celler) (4.1.4) till modulen med hjälp av en spruta 18 G nål och en ml, var noga med att undvika bubbelbildning och att inte skada fibrerna.
- Cap sidoporten med hjälp av en ändkåpa. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 2-4 h med manuell vridning av modulen genom 180 ° var 5 min. Alternativt modulerna kan fästas på ett rör rotator med en intermittent blandning inställning (tabell 1).
- Efter sådd, bifoga en ändkåpa på en injektionsport (tabell 1) pre-steriliserades i 70% etanol, och bifoga detta till PTFE-tejpade sidoport. Ta bort den andra sidoöppningen ändkåpa och långsamt dränera cellerna genom insprutning av luft i den bifogade injektionsöppningen med en spruta 27 G-nål och 1 ml.
- Ersätta injektionsöppningen med en ändkåpa. Sakta fylla modulen med media som använder fria sidoport och en 18 G nål med en 1 ml spruta. remove modul gavlar och fästa modulen till röret med hjälp av modulkontakter.
- Ersätta tvättmedieflaska med ett innehållande 50 ml tillväxtmedium och kosttillskott enligt det förfarande som beskrivs i 7.5.2.1. Pumpa tillväxtmediet genom systemet vid 800 | j, l / timme.
5. Proliferation
OBS: De fibrer som används i forskningssystemet som beskrivs här är inställda på att tränga på ~ 80 l / h, med en 800 ul / h matningshastighet.
- Använda fibrerna för att odla cellerna under perioder på upp till 7 dagar i en fuktad inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2.
OBS: Övervakning av näringsämnen och metaboliter under tillväxtfasen kan ge användbar information på proliferationen, metabolisk upptag och utmatning av cellerna och närings och metabolitnivåer i media. Till exempel glukos användning och laktatproduktion. Kit är tillgängliga från olika leverantörer som kan kvantifiera dessa faktorer från media (se
6. Excision
OBS: Fibrer kan skäras ut från modulen vid slutet av ett experiment för analys.
- Koppla och dränera HFB.
- Sätt en skalpell / mikro kniv (tabell 1) kniven mellan glaset och silikon. Vrid modulen för att skära bort silikonet från glaset. Upprepa denna procedur i båda ändar av modulen.
- Använda bladet krok ut silikonpropp från ena änden och försiktigt dra. Se till att fibrerna kommer med det. 7. Cell Analys
- cellantal
OBS: För C3A celler som används i denna studie någon tidpunkter inom 7 dagars tillväxtperiod är lämpliga för användning i denna beräkning som tillväxttakten inte väsentligen förändras under de celltätheter uppnås inom denna tidsram.- Efter excision (§ 6) doppa fibrerna i PBS för att tvätta och skär dem i ett 1,5 ml rör innehållande 0,5 ml Tris EDTA (TE) buffert. Utsätta detta för två frys-upptiningscykler i en -80 ° C frys. Mät DNA-innehåll med hjälp av PicoGreen och bestämma cellantalet genom att jämföra detta värde med en standardkurva gjord med den önskade celltypen 26.
- Cellförökningshastigheter
- Använda cellantalet beräknat på två olika tidpunkter beräkna den specifika tillväxthastigheten μ (ekvation 1) där Ln (X1) är den naturliga logaritmen av antalet celler vid den första tidpunkten och Ln (X2) är den naturliga logaritmen av cellen antal vid den andra tidpunkten.
μ = (Ln (X2) -ln (X1)) / tid (h) (1)
Från detta beräkna populationsdubbleringstider (dT) (ekvation 2) där μ är den specifika tillväxthastigheten.
dT = Ln2 / μ (2)
- Använda cellantalet beräknat på två olika tidpunkter beräkna den specifika tillväxthastigheten μ (ekvation 1) där Ln (X1) är den naturliga logaritmen av antalet celler vid den första tidpunkten och Ln (X2) är den naturliga logaritmen av cellen antal vid den andra tidpunkten.
- cellviabilitet
- Efter excision (§ 6) doppa fibrerna i PBS för att tvätta och skär dem i en 1,5 ml rör innehållande 500 pl 0,05% trypsin etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Inkubera vid 37 ° C under 10 min.
- Blanda och tillsätt 10 pl av cellsuspensionen till 10 l trypan blå. Belastning 10 pl på en hemocytometer och räkna antalet döda (blå) och levande celler.
- imaging
- Efter excision doppa fibrerna i PBS för att tvätta och använda sax för att klippa dem i mindre längder i en 24-brunnar. Tillsätt 400 | il 4% paraformaldehyd (i PBS) och inkubera vid RT i 20 min.
- Tvätta med PBS genom att pipettera 400 | j, l på och av. Upprepa this steg med färsk PBS.
- Tillsätt 400 pl 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) utspädd i PBS till ca. 100 ng / ml och inkubera vid RT i 20 min. Skyddas från ljus.
- Tvätta med PBS två gånger (som 7.3.2) och en gång med H2O Lägg till en fluorescensmonteringsmedium för att täcka fibern och bilden omedelbart för att samla in data innan proverna torra (DAPI ex / em, 359/461 nm).
- Ta bilder på olika fokalplan och använda "fokus stapla" programvara (t.ex. stack fokuse plugin för ImageJ nedan) för att göra en sammansatt bild som visar en kraftigt utökad skärpedjup. Detta krävs eftersom fibrerna inte är platta.
- Hämta ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) och "stack-fokuse" plugin (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html).
- I ImageJ öppna bilder som ska staplas. Sedan i menyn "Image" gå till "Stacks" - "Bilder att stapla". I "Plugins-menyn gå till" Stack focuser'. Ange en n för nxn kärna. Försök och misstag med "n" kan krävas för att generera en bild med lite "brus". Värden mellan 11 och 77 tenderar att fungera bra.
- albuminsekretion
OBS: Detta är en hepatocyte cellfunktionstest och inte en allmän test av cellfunktion.- Fröceller (HepG2 / C3A) på 2D vävnadsodlingsplast vid 10.667 / cm 2 och som har odlats under 6 dagar. Seed HFBs som beskrivs i avsnitt 4 och växa under 6 dagar.
- Efter denna proliferation period ändra odlingsmedia (EMEM + 10% FBS, 1 x glutamin & 1x penicillin / streptomycin) för vävnadsodlingsplast och HFB till ett serumfritt Williams E-medium kompletterat med 1x glutamin och 1x penicillin / streptomycin under 24 h:
- Töm slangen och HFB modul att följa stegen som anges i 3.4.1. Skruva reservoaren flaskan och ersätta denna med en flaska innehållande Williams E media. Pumpa detta genom HFB på 800 | j, l / timme.
- Efter 24 timmar, ta medieprover. Kvantifiera utsöndrat albumin med ELISA enligt tillverkarens instruktioner (Tabell 1). Späd medie prov 1 på 10 till 1 i 40 före användning för att få albuminkoncentrationer inom området för standardkurvan.
Representative Results
Cellsådd är ett kritiskt steg. Förmågan hos celler att vidhäfta till fibern i en 3D-set-up är avsevärt mindre än den som sågs för 2D vävnadsodlingsplast. Detta beror sannolikt på den minskade kontakttiden mellan cell och substrat. I HFB cellerna faller genom modulen under de statiska faser sådd. Dessa är betydligt kortare i tiden jämfört med en kontinuerlig statisk fas används i 2D. Celler har att göra anslutningar till substratet i denna tid. Dessutom, på grund av den krökta naturen hos fibrerna det inte finns någon plan yta för cellerna att vila och göra anslutningar som det finns i 2D kultur. Medan detta kan förvärras av kemin hos fibern som användes vi vet inte detta vara fallet för polymeren som användes i denna studie (data ej visade). Ökning av sådd tid och cellsåddtäthet leder till bildandet av cellaggregat som faller genom modulen under de statiska faser vid en snabbare råt än enskilda celler och ytterligare reducerar kontakttiden mellan celler och substrat. Att öka den tid leder också till gulfärgning av media som det finns en hög täthet av celler och ingen mediautbytes under detta steg. Användning av de betingelser som beskrivs i avsnitt 4 cellsådd andelen ~ 15% är genomgående uppnås med HepG2 / C3A-celler (Figur 5A). Medan detta kan anses vara en låg fraktion det finns tillräckligt med celler för att generera väl befolkade fibrer i några dagar (Figurerna 5B och 6); efter en sju dagars proliferation period celltätheten nådde i HFB närmar 3x10 5 / cm2. Detta är en lämplig densitet för många analyser som utnyttjar hepatocyter och kan anses vara att nå konfluens.
Spridningen priser uppnås i HFB är långsammare jämfört med vad som uppnås i 2D cellkultur (Figur 5C). Detta är unsannolikt på grund av förlust av celler i den dynamiska flödet av systemet som cellräkningar i medierna är låg (genomsnitt ± SEM: 20,343 celler ± 3674 celler per 24 h vid konfluens, vilket är 4% av de totala celler) och denna ökar inte när genomträngningshastigheten vrids upp till 400 | j, l / h (data ej visade). Det är också osannolikt att bero på en minskning i livsduglighet och efterföljande förlust av celler (se Figur 5D och nedan). Det kan förklaras, åtminstone delvis av det faktum denna cellinje var klonalt härledd från HepG2 och selekterades på dess förmåga att visa kontaktinhibition av cellproliferation. Cellerna i HFB sås ut med 6x densiteten för de 2D celler som kan leda till långsammare proliferationshastigheter.
Livskraft förblir hög under hela HFB med celler som uppvisar> 90%. Samtidigt som det finns en liten minskning i livsduglighet vid utloppsänden i förhållande till inloppet detta inte befanns vara signifikant (t-test p = 0,22).
Övervakning av glukosförbrukning och mjölksyraproduktion har använts för att avstämma mediematningshastigheten och medievolymen i systemet. Använda 800 l / h och en total medievolymen av 50 ml glukos och mjölksyranivåerna hålls ovanför och under (respektive) som ses i standard vävnadsodlingsplast kultur.
Albumin utsöndring är en viktig leverfunktion utförs av hepatocyter. Det utsöndras i serum där det spelar flera roller inom transport och homeostas. Den albuminutsöndring av celler som odlas i HFB är 15 gånger högre än i celler odlade på 2D (Figur 7). Detta visar att cellerna är funktionella i HFB och åtminstone i fallet med albuminsekretion, är denna funktion förhöjda i HFB.
jpg "/>
Figur 1. In vivo -liknande miljö av en HFB. Celler ympas på utsidan av de porösa fibrerna. Media levereras genom fiberlumen, imitera en blod kapillär. (A) längdsnitt av en fiber (ej skalenlig). (B) Tvärsnitt av en reaktor 3 fiber. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. HFB modul. (A) Dimensionerna hos modul som används i denna studie. Dimensionerna valdes för att passa 3 fibrer och uppfylla behoven hos den aktuella forskningsprojekt. Olika storlekar kan tillverkas och anpassas för enskilda system och fibrer. (B) Ett fotografi av den module med bifogade gavel och modulkontakter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Modul tillverkning. (A) Fibrer skärs till rätt storlek och sattes in i modulen. (B) Fibrer limmas in i modulen, fick torka. (C) Ändarna skärs i jämnhöjd med glaset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. HFB system som upprättats. Pilar indikerar riktningen för medieflödet. Röd = matningsrör. Gul = pump tuvara. Vit = HFB modul. Grön = retentat rör med klämma. Blå = genomsyrar röret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Sådd, spridning, livskraft och biokemisk analys. (A) Procent av celler seedade. Svarta diamanter representerar individuella HFBs. Den röda stapeln är medelvärdet. (B) Celler densiteter vid sådd och efter en 7-dagars spridning period. 2D cellantal bestämdes genom trypsinisering och räkning med hjälp av en hemocytometer. HFB cellantal bestämdes med användning av PicoGreen analysen och en standardkurva som framställts av C3A-celler 26. n = 5-6. Barer = SEM. (C) Population dubbleringstider. n = 5-7. Barer = SEM. (D) Viabilitet bestäms genom trypen blå uteslutning vid slutet av en 7-dagars proliferation. Inlet, centrala och utlopp representerar regioner inom HFB. n = 3-5. Barer = SEM. (E & F) Glukos konsumtion och mjölksyraproduktion. Nivåer övervakas reservoarflaskan (inlopp) samt retentat och permeat butiker och compered rutin kultur på vävnadsodlingsplast (media ändrats på dag tre och fem). n = 3-5. Barer = SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Bilder av celler odlade på fibrer i en HFB. Celler såddes och odlades under 48 h före fibrerna skars ut, tvättades i PBS, fixerades i 4% paraformaldehyd, tvättades i PBS och kärnorna färgade med DAPI. Varje bild är en komposit av 12 "fokus staplas" IMAringar i syfte att öka skärpedjupet för den resulterande bilden. Områden med högre och lägre celldensitet finns längs fibern vid denna tidpunkt och visas. Där nuvarande fiber gränser betecknas med en röd streckad linje. Bilderna togs på ett inverterat fluorescensmikroskop. Image = 10X mål. Bar = 200 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Albumin utsöndring. Celler såddes på vävnadsodlingsplast vid 10.667 / cm 2 och i HFB som beskrivs i avsnitt 4. Celler frodats under 6 dagar. Efter denna spridning period vävnadsodlingsplast och HFB odlingsmedier byttes till ett serumfritt Williams E-medium kompletterat med glutamin och penicillin / streptomycin under 24 h. Mediumprover togs och ett albumin kvantifieras genom ELISA enligt tillverkarens instruktioner (tabell 1). n = 5-6. Barer = SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sektion | Namn på utrustning | Företag | Katt. Nej. | Anmärkningar | Bilder |
| 2 | Glas HFB Module | Soham Scientific | --- | Anpassade objektet. | |
| 2,1 | Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | ||
| 2,3 | Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicett lim. | |
| 2,5 | PTFE-tejp | Sigma-Aldrich | Z104388 | ||
| 3.2.1 | reservoarflaska | Fiskare | 11972619 | ||
| Q-serien cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE skruvgängorna på adaptrarna och passande mutter. Fäst till Q-serien cap. Fäst ett 8,5 cm sektion av den medföljande PTFE slang under 1 mm adapter och en 4 cm avsnittet under 3 mm adapter. |  | |
| Adapter, Man, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, Man, 3,0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | |||
| passande mutter | Kinesis | U-350 | |||
| neopren slangar | Fiskare | 10366344 | Fäst Hepa-filter till 6 cm neopren slangar och bifoga detta till "passande mutter. Fäst en 2x 30 mm sektioner av L / S14 slang till de två översta hullingar av Y-kontakten och en 3 cm sektion av L / S16 slangen till botten. Bifoga till hull av 3 mm ID-adapter. (Avsnitt 3.2.1) |  | |
| HEPA-vent | Fiskare | 11374634 | |||
| Y-koppling, hullingförsedda | Cole Parmer | OU-06.295-10 | |||
| L / S16 silikonslang | Cole Parmer | OU-96.410-16 | |||
| L / S14 silikonslang | Cole Parmer | WZ-96410-14 | |||
| L / S13 silikonslang | Cole Parmer | OU-96.410-13 | 80 cm för att ansluta 1,0 mm hullingförsedda adaptern på Q-serien locket till pump badkar Ing = Matarrör. | ||
| WM 205U / CA pump | Fiskare | 1248-6300 | |||
| WM pumpslangen, PVC, blå-orange, 0,25 mm hål | Fiskare | 12416310 | PTFE skruvgängan av den manliga adaptern och anslut hona. Arbeta pumpslangen över en av hullingarna. Upprepa detta set-up i den andra änden av slangen. (Avsnitt 3.2.1) |  | |
| Adapter, Man, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, Kvinna, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | |||
| 3.2.2 | Kvinna luerlocket | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Sido port gavlar. | blefig4.jpg "/>  |
| L / S13 silikonslang | Cole Parmer | OU-96.410-13 | 40 mm avsnitt för att ansluta pumpslangen till en modulkontakten. | ||
| L / S16 silikonslang | Cole Parmer | OU-96.410-16 | 3x 30 mm L / S16 monteras på 3x reducerare = modulkontakter. (Avsnitt 3.2.2) | ||
| Hullingförsedda Reducer 1/8 "x 1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | |||
| 3.2.4 | L / S13 silikonslang | Cole Parmer | OU-96.410-13 | 55 cm sektion för att ansluta retentatet till L / S14 av Y-kontakten på Q-serien cap. |  |
| L / S13 silikonslang | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm sektion för att ansluta permeatet till L / S14 av Y-kontakten på Q-serien cap. | ||
| Rak hullingförsedda union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Fäst till slutet av L / S13 som kommer att ansluta till L / S14 av Y-kopplingen. | ||
| 3.4.2 | Klämma | VWR | 229-0609 | ||
| 4,3 | 4 mm silikonslang | Fiskare | FB68858 | Vik över en 40 mm sektion av rör och säkra med ett buntband = Modul ändlocket. (Avsnitt 4.3) |  |
| Buntband | Fiskare | 12326377 | |||
| 4,4 | MACSmix röret rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | En anpassning kan behövas ATTACh modulerna. | |
| 4,5 | Leur Injection port | tistel Scientific | IB-10820 | Fästa ändkåpan till injektionsporten. (Avsnitt 4.5) | |
| Kvinna luerlocket | Cole Parmer | WZ-45508-64 | |||
| 5 | L-mjölksyra kit | Megazyme | K-LATE | ||
| 5 | D-glukos-kit | Megazyme | K-gluk | ||
| 6,2 | Skalpell / micro kniv | InterFocus | 10315-12 | ||
| 7.4.3 | albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 |
Tabell 1. Komponenter i HFB set-up.
Discussion
Detta manuskript beskriver installation och drift av en fiber bioreaktor ihålig (HFB) system för däggdjurscellkultur och dess användbarhet demonstreras i prolifererande den hepatocyt HepG2 / C3A. Systemet är utformat för att passa på hyllan i en standardinkubator och dess set-up är tillräckligt enkel för att utföras av en behörig cellbiolog bekant med aseptisk teknik.
De fibrer som används i forskningssystemet som beskrivs här framställs i huset genom fasinversion spinngjutning (spinning) med hjälp av ett icke-nedbrytbart egen polymer. Det är möjligt att göra fibrer genom spinning från en mängd olika material som är lämpliga för cellodling, både bionedbrytbara och icke-bionedbrytbara, t ex; polykaprolakton (PCL) 27, poly-L-laktid-syra (PLLA) 28, poly (mjölk-sam-glykolsyra) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 och polyetereterketon (PEEK) 13. Var och en har olika egenskaper ennd bör väljas utifrån de behov av systemet. Kontrollera kompatibiliteten för sysselsatta fiber med etanol som används i steriliseringssteget. PLGA är känd för att mjuk med etanol kräver en alternativ behandling såsom antibiotika / antimykotika lösning 25.
Dimensionerna på glas moduler som används här valdes baserat på behoven hos den aktuella forskningen. Olika storlekar kan göras av varje ansedda glasblåsning företag. En övervägande i modulstorlek är antalet celler, som är kopplad till antalet fibrer i modulen och sannolika flödeshastigheter. Ju fler celler som finns i modulen den högre flödeshastigheterna kommer att behöva vara för att upprätthålla gynnsamma odlingsbetingelser vid utflödesänden av bioreaktorn. Detta kommer att nå en gräns som någon gång och några försök och misstag kan krävas med övervakning av medie villkor i modulen permeatet. Matematisk modellering kan ge några insikter de erforderliga modul dimensioner och flödeshastigheter 22.
Dimensionerna för den apparat som används här är utformat för att passa på en inkubator hylla. Längden på slangen dikteras av den längd som behövs för att nå mellan kontakterna samtidigt tillåter tillräckligt förflyttning av komponenter för att möjliggöra installation och drift. Om tidsförloppet Provtagning krävs, till exempel i övervakningen av medieförhållanden i modulen permeat sedan injektionsöppningar kan sättas till retentatet och permeatet linjer för att underlätta detta.
En förutsättning för ett cellodlingssystem är att hålla celler levande och i de flesta fall växer. Mot bakgrund av studier som visar en mer in vivo -liknande fenotyp i celler odlade i 3D odlingssystem verkar också viktigt att skapa en miljö som nära efterliknar in vivo miljö stött av cellerna. Denna sista punkt är ofta försummas i 2D cellodling till förmån för bekvämlighet denna kultur system erbjuder. Than HFB härmar in vivo kapillära nätverk genom att leverera näringsämnen till cellerna genom lumen av fibrer. De avfallsprodukter är också bort från systemet av den dynamiska flödet. Detta skapar en in vivo-liknande system för cellodling och en som nära efterliknar in vivo miljön ses av hepatocyter, vilket gör detta system ett bättre val jämfört med 2D vävnadsodlingsplast för odling dessa celler. Detta bekräftas av det faktum att cellerna utsöndrar 15 gånger mängden albumin, en viktig leverfunktion, i HFB odlingssystemet jämfört med de som odlas på 2D vävnadsodlingsplast.
Medan HFB systemet lämpar sig för de flesta om inte alla förankringsberoende celltyper, här är ett exempel för hepatocyter eftersom det finns ett verkligt behov av att kunna kultur funktionell, mer in vivo-liknande hepatocyter för användning inom läkemedelsutveckling av läkemedelsindustrin och i bioartificiella lever anordningar för extrakorpo stödlever felpatienter. Behovet av mer funktionella celler sträcker sig utanför dessa exempel, i synnerhet som området regenerativ medicin kommer in i en fas av translations arbete. Fördelarna med en mer in vivo -liknande odlingsmiljö bör inte förbises.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Custom Item. (Section 2) |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
| Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
| PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
| Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 3.0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6 cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm to connect the 1.0 mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
| WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
| WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25 mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Female, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
| Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
| 4 mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
| Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
| D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
| Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
| Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |
References
- Lewis, W. H. Experimental evidence in support of the theory of outgrowth of the axis cylinder. American J Anat. 6 (1), 461-471 (1906).
- Harrison, R. G. The development of peripheral nerve fibers in altered surroundings. Wilhelm Roux Arch Entwickl Mech Org. 30 (2), 15-33 (1910).
- Ding, L., et al. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for Embryonic Stem Cell identity. Cell Stem Cell. 4 (5), 403-415 (2009).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering -In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4), 352-366 (2011).
- Sinden, J. D., Vishnubhatla, I., Muir, K. W. Prospects for stem cell-derived therapy in stroke. Prog Brain Res. 201, 119-167 (2012).
- Ouyang, A., Yang, S. -T. A two-stage perfusion fibrous bed bioreactor system for mass production of embryonic stem cells. Expert Opin Biol Ther. 8 (7), 895-909 (2008).
- Carnachan, R. J., Bokhari, M., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Taloring the morphology of emulsion-templated porous polymers. Soft Matter. 2 (7), 608-616 (2006).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34 (21), 5088-5106 (2013).
- Storm, M. P., Orchard, C. B., Bone, H. K., Chaudhuri, J. B., Welham, M. J. Three-dimensional culture systems for the expansion of pluripotent embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 107 (4), 683-695 (2010).
- Wung, N., Acott, S. M., Tosh, D., Ellis, M. J. Hollow fibre membrane bioreactors for tissue engineering applications. Biotechnol Lett. 36 (12), 2357-2366 (2014).
- Ellis, M., Jarman-Smith, M., Chaudhuri, J. B. Bioreactor systems for tissue engineering: A four-dimensional challenge. Bioreactors for tissue engineering; principles, design and operation. Chaudhuri, J., Al-Rubeai, , Springer. Chapter 1 1-18 (2005).
- Silva, A. I., Mateus, M. Development of a polysulfone hollow fibre vascular bio-artificial pancreas device for in vitro studies. J Biotechnol. 139 (3), 236-249 (2009).
- De Bartolo, L., et al. Human hepatocyte functions in a crossed hollow fiber membrane bioreactor. Biomaterials. 30 (13), 2531-2543 (2009).
- Schmelzer, E., Finoli, A., Nettleship, I., Gerlach, J. C. Long-term three-dimensional perfusion culture of human adult bone marrow mononuclear cells in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 112 (4), 801-810 (2015).
- Tapia, F., et al. Production of high-titer human influenza A virus with adherent and suspension MDKC cells cultured in a single-use hollow fiber bioreactor. Vaccine. 32 (8), 1003-1011 (2014).
- Deng, X., Zhang, G., Shen, C., Yin, J., Meng, Q. Hollow fiber culture accelerates differentiation of Caco-2 cells. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (15), 6943-6955 (2013).
- Schutte, M., et al. Rat primary hepatocytes show enhanced performance and sensitivity to acetaminophen during three-dimensional culture on a polystyrene scaffold designed for routine use. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 475-486 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge. J Anat. 211 (4), 567-576 (2007).
- Vivares, A., et al. Morphological behaviour and metabolic capacity of cryopreserved human primary hepatocytes cultivated in a perfused multiwell device. Xenobiotica. 45 (1), 29-44 (2015).
- Smith, I., et al. Human neural stem cell-derived cultures in three-dimensional substrates form spontaneously functional neuronal networks. J Tissue Eng Regen Med. , Epub ahead of print (2015).
- Davidson, A. J., Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. A theoretical approach to Zonation in a bioartificial liver. Biotechnol Bioeng. 109 (1), 234-243 (2012).
- Mulder, M. The basic principles of membrane technology. 2nd ed. , Kluwer Academic Publishers. Chapter 3 section 4 (1996).
- Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. Poly(lactic-co-glycolic acid) hollow fibre membranes for use as a tissue engineering scaffold. Biotechnol Bioeng. 96 (1), 177-187 (2007).
- Shearer, H., Ellis, M. J., Perera, S. P., Chaudhuri, J. B. Effects of common sterilization methods on the structure and properties of poly(D,L lactic-co-glycolic acid) scaffolds. Tissue Eng. 12 (10), 2717-2727 (2006).
- Forsey, R. W., Chaudhuri, J. B. Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds. Biotechnol Lett. 31 (6), 819-823 (2009).
- Williamson, M. R., Coombes, A. G. A. Gravity spinning of polycaprolactone fibres for applications in tissue engineering. Biomaterials. 25 (3), 459-465 (2004).
- El-Salmawy, A., et al. Preparation and properties of pronectin F-coated biodegradable hollow fibres. J Artif Organs. 8 (4), 245-251 (2005).
- Meneghello, G., et al. Fabrication and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid)/polyvinyl alcohol blended hollow fibre membranes for tissue engineering applications. J Memb Sci. 344 (1-2), 55-61 (2009).
