Summary
Das funktionale Verhalten der Zellen in Kultur können -ähnlichen 3-dimensional Kulturumgebungen 16-21 in mehr in vivo durch Züchten verbessert werden. Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser - Bioreaktor - System für In - vivo - -ähnlichen Säugetiergewebekultur.
Introduction
Gewebekultur ist eine etablierte Technik für das Wachstum und / oder die Wartung von Zellen , die 1,2 seit über 100 Jahren verwendet worden. Die Bequemlichkeit des Studierens Zellen und Antworten ex vivo Experimenten hat weitreichende Vorteile , so dass die sonst sehr schwierig sein würde , wenn nicht unmöglich, beispielsweise die Erzeugung gentechnisch veränderter Zellinien und die Verwendung von Reporterzellen in Hochdurchsatzscreening - Assays 3. In jüngerer Zeit Gewebekultur hat zu dem Gebiet des Tissue Engineering gegeben, für die Erzeugung von in vitro - Modellen und regenerative Medizin. Mit diesen Anwendungen Interesse an dynamischen 3-dimensionale (3D) Kultursysteme ist deutlich gewachsen.
3D - Kulturmethoden (hier definiert als 3D - Kultursubstrat und / oder die Einführung von dynamischen Richtungsfluss) besser rekapitulieren die Architektur der in vivo zellulären Umgebung, wichtig für eine Erreichungphysiologischere artige Funktion. Die Fähigkeit, zu extrahieren, zu wachsen, zu differenzieren und Transplantation Zellen mit dem Ziel, kranken und beschädigtes Gewebe zu reparieren ist ein Bereich der Studie, die ein großes Potenzial für Patienten Nutzen und kommerziellen Chancen hat. Beispielsweise die Verwendung von autologer Keratinozyten zur Behandlung von Verbrennungen (siehe 4) und die Verwendung von zellbasierten Therapien zur Behandlung von Schlaganfall (siehe 5). Ebenso erstreckt sich der Markt für in - vitro - Modellen der Wirkstoffforschung zu geschichtete medizinische Anwendungen. Die Konvention in der Gewebekultur ist das Wachstum von adhärenten oder Verankerung abhängige Zelltypen auf dem 2-dimensionalen (2D) Oberfläche einer Gewebekulturflasche. Während derzeit als Goldstandard in einem Forschungs Einstellung akzeptiert, hat kürzlich Interesse an der Tissue - Engineering - Anwendungen die Tatsache hervorgehoben , dass die aktuellen 2D - Gewebekulturumgebung für die erforderliche Scale-up in der Zellproduktion 6 unzureichend ist.
Für adhärenten Zelltypen eine scaffold ist erforderlich, die auf Endanwendung variieren je, sowohl in Bezug auf die chemische Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften. Einige Systeme verwenden Gerüste sowie Platteneinsätzen aus hochporösen Matrix , die aus hohen inneren Phasenemulsion Templat gebildet (siehe 7) oder elektrogesponnenen Fasern (siehe 8) mit minimaler Anpassung von herkömmlichen 2D - Kulturtechniken. Die Zellen können auf Mikroträgern unterschiedlicher Zusammensetzung ausgesät werden und in Rührkessel gezüchtet , das 9 Nährstoffen und Signalmoleküle und wegtragen Abfallprodukte (Massentransport) durch eine dynamische und gemischte Umgebung liefern. Jedoch sind diese Systeme in ihrer in vivo -ähnlichen Umgebung beschränkt und weitere Verbesserungen hinsichtlich Kosten hergestellt werden maßstäblich-up. Hohlfaser - Bioreaktoren (HFBS) sind eine 3D - Kultursystem , das mit Zellen von Fasern in ein Modul befestigt bestehen typischerweise an der Außenseite der porösen Fasern ausgesät und Medien durch die Faserlumen abgegeben (Übersicht in 10) (Abbildung 1). HFBS bieten eine in vivo -ähnlichen Umgebung mit den Fasern Blutkapillaren und Abschirmen der Zellen von den Scherspannungen , die mit dynamischen Medienzuführungs nachahmt, während gleichzeitig definierten Scher an Zellen die über eine Fluidströmung durch die Seitenanschlüsse angelegt werden , falls gewünscht. Dies schafft eine vielseitige Kultursystem mit überlegenen Massentransport in dem hohe Zelldichten 11 erreicht werden kann. Das HFB - System ist gut geeignet für die Pflege von verankerungsabhängigen Zelltypen und wurde zur Kultur eine Vielzahl von Zellen , einschließlich Rattenpankreas Langerhans'schen Inseln 12, Maus β-TC-3 - Insulinom - Zelllinie 12, primäre humane Hepatozyten 13, menschlichen Knochen verwendet worden , marrow mononukleären Zellen 14, Madin Darby Hundenierenzellen (MDCK) 15 und Caco-2 - Zellen 16 ein paar zu nennen.
Zusätzlich zu den Systemvorteile der Massentransfer und Scale-up, gezüchteten Zellen in 3D tissue Kultursysteme sind in der Regel in vivo -like in Morphologie und stärker auf experimentelle Hinweise zu sein. Beispielsweise Ratten primären Hepatozyten zeigen eine quaderförmige Morphologie, erhöhte Lebensfähigkeit, größere Induktion von Cytochrom-P450 - Enzymaktivität und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Paracetamol Toxizität , wenn sie in einem handelsüblichen Polystyrolgerüst Vergleich zu Zellen in Kultur 2D 17 angebaut. Mit dem gleichen Gerüst der hepatocarcinoma Zelllinie auch eine zu erhöhen Albuminproduktion 18 und zeigen in vivo -ähnlichen Reaktion auf Methotrexat im Vergleich zu 2D - kultivierten Zellen 19 gezeigt HepG2 wurde. Primäre humane Hepatozyten zeigten verzögerte Entdifferenzierung, höhere Cytochrom-P450 - Aktivität und erhöhte Clearance für 4/5 Verbindungen in einem Perfusionskultursystem getestet 20. Menschliche neurale Stammzellen abgeleiteten Neuronen und Glia kultiviert in einem handelsüblichen Polystyrolgerüst zeigten beide hoch (Aktionspotential) und Nieder frequency (lokale Feldpotential) spontane Aktivität während keine wurde die neuronale Aktivität in den 21 kultivierten Zellen 2D nachgewiesen. Caco-2 - Zellen zeigten eine verbesserte Differenzierung in einer HFB Vergleich zu 2D - Kultur durch erhöhte alkalische Phosphatase gemessen, γ-Glutamyltransferase und P-Glycoprotein - Aktivität und eine höhere Expression von F-Actin und zona occludens-1 - Protein 16. Trotz der Vorteile, andere die Routine Kultivierung von Zellen in Systemen als eine 2D-Gewebekulturflasche Oberfläche ist immer noch nicht in vielen Labors praktiziert wird, obwohl die Anzahl von Veröffentlichungen zitiert 3D-Zellkultur wächst (8-fachen Anstieg in den letzten 10 Jahren. Quelle : PubMed Werkzeug "Ergebnisse von Year 'sondiert mit" 3D-Kultur ").
Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und Betriebsbedingungen eines HFB System für Säugerzellkultur und zeigt ihre Nützlichkeit der hepatocarcinoma HepG2 / C3A in die Kultivierung. Das Ziel dieser Methode ist es, die Zellen in Kultureine in vivo -ähnlichen Kultursystem , das genügend Einfachheit behält , um sie zugänglich neue für diejenigen, die auf 3D - Kultursystemen. Das Grundprinzip hinter HFBS in der Anwendung beschreiben hier, was die Vorhersagbarkeit der Leber Modelle zu verbessern , ist , dass es theoretisch möglich ist , eine hepatische sinusoid innerhalb der HFB - Umgebung 22 zu imitieren. Dies ist derzeit nicht möglich, mit anderen Kultursystemen.
Protocol
1. Fibers
- Herstellung der Fasern durch Phasenumkehr Schleudergießen (Spinnen). Details zu dieser Methode kann in 23,24 zu finden.
HINWEIS: Bei dieser Arbeit werden die Fasern werden im Haus hergestellt , das eine biologisch nicht abbaubare proprietären Polymer verwendet, NMP als Lösungsmittel und H 2 O als das Nicht-Lösungsmittel. Details von anderen geeigneten Polymeren können in der Diskussion finden. Die Fasern in dem System verwendet wird hier beschriebenen 1,05 mm Außendurchmesser mit einer 600-700 um Lumendurchmesser. Die Fasern sind porös mit einem Porendurchmesser 2,28 & mgr; m ± 1,5 & mgr; m (Mittelwert ± Standardabweichung) zu messen. Dies dient dazu, Zellen aus der Medienzufuhr in das Faserlumen zu trennen, die Lebersinusoid oder Gefäße anderer Gewebe zu replizieren. Die Fasern können auch aus Membranlieferanten wie Pall erworben werden.
2. Module Fabrication
HINWEIS: Die Module in dieser Studie verwendet werden, von 1 mm dicken Borosilikatglas mit 2 Seitenöffnungen gemacht(2A). Die Fasern in dem Modul hier beschriebenen einen äußeren Oberflächenbereich von 4,95 cm 2 , die das Äquivalent von etwa der Hälfte einer Vertiefung einer 6-Well - Platte ist.
- Silikonisieren Module vor dem ersten Gebrauch durch Beschichten der inneren Oberfläche mit Sigmacote (Tabelle 1) und damit in einem Abzug trocknen. Autoklav (121 ° C, 1 atm, 20 min), um die Lebensdauer der Behandlung zu erhöhen.
- Verwendung eines Skalpellschnitt 75 mm langen Fasern und legen drei Fasern in jedes Modul an jedem Ende (3A) ~ 7 mm Überlänge zu verlassen.
- Ort ~ 0,5 ml Silikonkleber (Tabelle 1) in ein Wägeschiffchen. Verwenden Spitze eine P200 Pipette eine kleine Menge Silikon zu holen und arbeiten , um den Klebstoff in die Enden des Moduls um die Fasern eine 3-5 - mm - Stecker (3B) zu bilden. Lassen Sie für> 3 Stunden trocknen lassen.
- Mit einem Skalpell geschnitten das Silikon bündig mit den Glasmodul Enden (3C).
- Wickeln Sie einkleine Menge (~ 4-Schichten) aus Polytetrafluorethylen (PTFE) Band um einen Seitenanschluss.
3. System-Setup und Sterilisation
HINWEIS: Pumpenschläuche und Module mit Fasern nicht autoklaviert und sterilisiert 70% Ethanol verwendet wird. Die Autoren empfehlen, die Pumpenschläuche mit der Pumpe Kalibrierung verwendet zu werden. Das folgende Verfahren wird in einem Laminar-Flow-Haube durchgeführt.
- Autoklav (wie Abschnitt 2.1) alle autoklavierbar Komponenten vor dem Set-up.
- Konfiguration
- Platz 10 ml 70% Ethanol in die Vorratsflasche und Set-up der Vorratsflasche, Q-Serie Kappe, Futterrohr, Pumpe und Pumpenschlauch (Tabelle 1) , wie in Abbildung 4.
- Locker legen eine Endkappe über die PTFE-Klebeband Seitenöffnung. Schieben Sie die Enden der L / S16 Modulanschlüsse über den Modulenden und freien Seite Port. Verbinden einen 40 mm Abschnitt L / S13 Schlauch an den Modulanschluss am nächsten zu dem verkappten Seitenöffnung (Tabelle 1) , wie in 2B
- Verbinden des Moduls mit dem Pumpenschlauch, um sicherzustellen, das Modul zu orientieren, so dass die verkappten Seitenöffnung am nächsten zu der Pumpe ist.
- Schließen Sie die Permeatleitung und Retentat Leitung zu den Modulverbinder und dem L / S14 des Y-Anschluss auf der Vorratsflasche (Tabelle 1). Stellen Sie sicher , dass die Einrichtung die Schaltpläne in Abbildung 4 ähnelt.
- Sterilisation
- Pumpe Ethanol durch das Modul bei 800 & mgr; l / h (267 & mgr; l / h pro Faser) für genügend Zeit unautoclaved Komponenten für> 30 min zu behandeln (justieren Zeiten , wenn andere Sterilisationsverfahren verwendet werden, siehe 25).
- Waschen
- Zum Waschen des Ethanols aus dem System, schalten Sie zuerst die Pumpe und die Schläuche entleeren. Zuerst nehmen Sie den Pumpenschlauch aus dem Moduladapter Schläuche. Halten Sie aloft das Modul das Ethanol aus dem Fasern und Retentatleitung abzulassen, zurück in die Vorratsflasche. Entfernen Sie die Seitenöffnung Endkappe aus dem Modul th abzulassene Ethanol aus dem Modul selbst, und die Permeatleitung. Bringen Sie die Seitenöffnung Endkappe. Kehren Sie den Fluss von Medien an der Pumpe den Pumpenschlauch und Zuleitung von Ethanol zu entleeren. Schalten Sie die Pumpe, und befestigen Sie den Pumpenschlauch mit dem Modul-Adapter.
- Lösen Sie die Ethanolflasche aus dem Deckel und ersetzen mit einer Flasche mit 10 ml Zellwachstumsmedium (wie EMEM, GMEM, DMEM oder RPMI) ohne Serum. Pumpe das Medium durch das System bei 800 & mgr; l / h, bis die Retentatleitung ist voll von Medien. Klemmen Sie die Retentatleitung zu zwingen Durchdringung der Medien durch die Fasern des Moduls zu waschen. Waschen Sie für ~ 2 Std.
4. Seeding
HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Medien und Ergänzungen sollten diejenigen sein, die für den gewünschten Zelltyp festgelegt werden. Bitte beachten Sie die Literatur, die Europäische Sammlung von Zellkulturen (ECACC) und American Type Culture Collection (ATCC) für weitere Informationen. Vor dieser Methode Zellen sollte maintained nach der gewünschten Zelltyp zu etablierten Protokollen. Für diese Arbeit wurden die hepatocarcinoma HepG2 / C3A Subklon nach den Verteilern Empfehlungen gehalten (ATCC).
HINWEIS: Das Protokoll seeding unten vorgestellt dient das Modul mit Zellkulturmedium zu Vorkultur vor der Zellwachstum. Sollte eine weitergehende Vorkultur erforderlich sein, dann sollten diese vor durchgeführt werden, um das Modul zu Impfen durch die Waschmedien aus dem System entleeren und ersetzt mit Wachstumsmedien und durchdringt diese durch das Modul für ein paar Stunden. Abschnitt 7.5.2.1 für Details auf Medien im System zu ersetzen.
- Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension durch Trypsinisierung nach etablierten Protokollen für den gewünschten Zelltyp. Ein allgemeines Protokoll für eine T75-Kultur ist wie folgt:
HINWEIS: Die Anzahl der Zellen in der Impfschritt verwenden sollte für den gewünschten Zelltyp empirisch ermittelt werden. Die Bioreaktoren hier beschrieben sind, bei einer 35-fach höheren cel ausgesätls Dichte (Zellen / cm 2) als für eine 7 - Tage - Kultur in 2D Gewebekulturkunststoff verwendet.- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml Phosphat - gepufferter Salzlösung (PBS), absaugen, dann 3 ml 0,05% Trypsin Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (genug , um die Zellen zu bedecken) und inkubiere bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 min.
- Ernte Zellen in 7 ml Wachstumsmedium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, um das Trypsin zu neutralisieren. Gut mischen, mit 10 & mgr; l in die Kammer eines Hämocytometer und die Zellen zu zählen.
- Zentrifuge bei 200 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
- Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen bei 4x10 6 / ml in Wachstumsmedien ergänzt wie für den gewünschten Zelltyp erforderlich.
- Schalten Sie die Pumpe ab und lassen Sie das Zuführungsrohr und Modul wie in 3.4.1.
- Nehmen Sie das Modul aus dem Modulverbinder und befestigen Modul Endkappen (Tabelle 1) vorsterilisiert in 70% Ethanol, so dass eine Seitenöffnung frei. </ Li>
- Übertragung von ~ 500 & mgr; l der Zellsuspension (2x10 6 Zellen) (4.1.4) an das Modul eine 18 G Nadel und 1 ml Spritze, dabei eine Blasenbildung zu vermeiden , und nicht um die Fasern zu beschädigen.
- Verschließen Sie die Seitenöffnung mit einer Endkappe. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2-4 h bei manueller Drehung des Moduls um 180 ° alle 5 min. Alternativ können die Module mit einem intermittierenden Mischstellung (Tabelle 1) mit einem Rohr Rotator befestigt werden.
- Nach der Aussaat, befestigen Sie eine Endkappe auf eine Injektionsöffnung (Tabelle 1) vorsterilisiert in 70% Ethanol, und befestigen Sie diese an den PTFE-verschweißte Seitenöffnung. Entfernen Sie die andere Seite Port Endkappe und langsam die Zellen ablaufen, indem Luft in die angeschlossene Injektionsöffnung unter Verwendung einer 27 G-Nadel und 1-ml-Spritze injiziert wird.
- Ersetzen Sie die Injektionsöffnung mit einer Endkappe. Füllen Sie langsam das Modul mit den Medien den freien Seitenanschluss und eine 18 G-Nadel mit einer 1 ml-Spritze. Remounter Verwendung der Modulverbinder ve die Modul Endkappen und das Modul an den Schlauch anschließen.
- Ersetzen Sie die Waschmedien-Flasche mit einem Gehalt an 50 ml Wachstumsmedium und Ergänzungen nach dem beschriebenen Verfahren in 7.5.2.1. Pumpe das Wachstumsmedium durch das System bei 800 & mgr; l / Std.
5. Proliferation
HINWEIS: Die Fasern in der Forschungssystem verwendet hier beschrieben eingestellt sind bei ~ 80 & mgr; l / h Permeat, mit einem 800 & mgr; l / h Beschickungsrate.
- Verwenden , um die Fasern , die die Zellen für einen Zeitraum von bis zu 7 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 eingestellt zu werden.
HINWEIS: Überwachung von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten während der Wachstumsphase können nützliche Informationen über die Proliferation, metabolische Aufnahme und Ausgabe der Zellen und Nährstoff- und Metabolitenspiegel in den Medien bereitzustellen. Zum Beispiel für die Verwendung und die Laktatproduktion Glukose. Kits sind erhältlich von verschiedenen Anbietern, die diese Faktoren von Medien Quantifizieren können (siehe
6. Excision
HINWEIS: Die Fasern können aus dem Modul am Ende eines Experiments zur Analyse ausgeschnitten werden.
- Ziehen Sie und die HFB abtropfen lassen.
- Legen Sie ein Skalpell / Mikro Messer (Tabelle 1) Klinge zwischen dem Glas und Silikon. Schalten Sie das Modul, um das Silikon aus dem Glas wegzuschneiden. Wiederholen Sie diesen Vorgang an beiden Enden des Moduls.
- Mit der Klinge Haken aus dem Silikon-Stecker an einem Ende und ziehen Sie vorsichtig. Stellen Sie sicher, dass die Fasern mit ihm gekommen. 7. Zellanalyse
- Die Zellzahlen
HINWEIS: Für die C3A in dieser Studie verwendeten Zellen beliebige Zeitpunkte innerhalb der 7-tägigen Wachstumsphase geeignet sind für die Verwendung in dieser Berechnung als Wachstumsraten im Wesentlichen nicht über die Zelldichten in diesem Zeitraum erreicht wechseln.- Nach Exzision (§ 6), um die Fasern in PBS tauchen sie in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 0,5 ml Tris-EDTA (TE) Puffer zu waschen und schneiden. Betreff dies zu zwei Gefrier-Auftau-Zyklen in einem -80 ° C Gefrierschrank. Messen Sie den DNA - Gehalt unter Verwendung von PicoGreen und bestimmen die Zellzahlen durch diesen Wert mit einer Standardkurve verglichen , die mit dem gewünschten Zelltyp 26.
- Zellproliferationsraten
- Verwendung der Zellzahlen bei zwei unterschiedlichen Zeitpunkten berechnet berechnen, ist die spezifische Wachstumsrate μ (Gleichung 1) wobei Ln (X1) ist der natürliche Logarithmus der Zellzahl bei dem ersten Zeitpunkt und Ln (X2) der natürliche Logarithmus der Zelle Nummer am zweiten Zeitpunkt.
μ = (Ln (X2) -Ln (X1)) / Zeit (Std) (1)
Daraus errechnen die Bevölkerung Verdopplungszeiten (dT) (Gleichung 2) wobei μ die spezifische Wachstumsrate ist.
dT = Ln2 / μ (2)
- Verwendung der Zellzahlen bei zwei unterschiedlichen Zeitpunkten berechnet berechnen, ist die spezifische Wachstumsrate μ (Gleichung 1) wobei Ln (X1) ist der natürliche Logarithmus der Zellzahl bei dem ersten Zeitpunkt und Ln (X2) der natürliche Logarithmus der Zelle Nummer am zweiten Zeitpunkt.
- Zellengesundheit
- Nach Exzision (§ 6), um die Fasern in PBS tauchen sie in ein 1,5-ml-Röhrchen (EDTA), die 500 & mgr; l 0,05% Trypsin zu waschen und schneiden. für 10 min bei 37 ° C inkubieren.
- Mischen Sie und fügen Sie 10 ul Zellsuspension zu 10 ul Trypanblau. Last 10 & mgr; l auf ein Hämozytometer und zählen die Anzahl der Toten (blau) und lebendig Zellen.
- Imaging
- Nach Exzision tauchen die Fasern in PBS Schere zu waschen und verwenden sie in kleinere Längen in eine 24-Well-Platte zu schneiden. Werden 400 & mgr; l 4% Paraformaldehyd (in PBS) und 20 Minuten lang bei RT inkubieren.
- Waschen mit PBS von 400 Pipettieren ul ein- und ausgeschaltet. Wiederholen Sie this Schritt mit frischem PBS.
- In 400 ul 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in PBS verdünnt ca. 100 ng / ml und für 20 min bei RT inkubiert. Vor Licht schützen.
- Waschen mit PBS zweimal (wie 7.3.2) und einmal mit H 2 O. Fügen Sie ein Fluoreszenz Eindeckmediums die Faser und Bild zu decken sofort Daten, bevor die Proben zu sammeln, trocken (DAPI ex / em; 359/461 nm).
- Nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Brennebenen und verwenden "Focus Stacking" Software (zB Stack OAZ - Plugin für ImageJ, unten) ein zusammengesetztes Bild zu machen , eine stark erweiterte Schärfentiefe zeigt. Dies ist erforderlich, da die Fasern nicht flach sind.
- Herunterladen ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) und die "Stack-OAZ 'Plugin (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html).
- In ImageJ öffnen die Bilder gestapelt werden. Dann im Menü 'Bild' gehen 'Stacks' - 'Bilder zu Stack'. Im Menü 'Plugins' gehen 'Stack Focuser'. Geben Sie einen n für nxn-Kernel. Versuch und Irrtum mit 'n' kann erforderlich sein, um ein Bild mit wenig "Rauschen" zu erzeugen. Werte zwischen 11 und 77 sind in der Regel gut zu funktionieren.
- Albuminsekretion
ANMERKUNG: Dies ist ein Hepatozyten-Zellfunktionstest und keine allgemeine Test der Zellfunktion.- Samenzellen (HepG2 / C3A) auf 2D auf Gewebekulturkunststoff 10.667 / cm 2 und für 6 Tage gezüchtet. Seed HFBS, wie in Abschnitt 4 beschrieben und wachsen für 6 Tage.
- Im Anschluss an diese Proliferation Zeit der Kulturmedien ändern (EMEM + 10% FBS, 1x Glutamin & 1x Penicillin / Streptomycin) für die Gewebekultur Kunststoff und HFB einem Serum Medien kostenlos Williams E ergänzt mit 1x Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin 24 h:
- Lassen Sie den Schlauch und HFB-Modul nach den Schritten in 3.4.1. Lösen Sie die Vorratsflasche und ersetzen Sie diese mit einer Flasche, die Williams E Medium enthält. Pumpe dies durch die HFB 800 & mgr; l / h.
- Nach 24 Stunden, nehmen Medienproben. Quantifizierung sezernierten Albumins durch ELISA nach den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 1). Verdünnte Medienproben 1 in 10 bis 1 in 40 vor dem Gebrauch um Albuminkonzentrationen innerhalb des Bereichs der Standardkurve zu bringen.
Representative Results
Zellaussaat ist ein kritischer Schritt. Die Fähigkeit von Zellen an der Faser in einem 3D-Set-up anhaften ist erheblich geringer als die für die 2D-Gewebekulturkunststoff gesehen. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der reduzierten Kontaktzeit zwischen Zelle und Substrat. In der HFB fallen die Zellen durch das Modul während der statischen Phasen der Aussaat. Diese sind wesentlich kürzer in der Zeit im Vergleich zu der kontinuierlichen statischen Phase verwendet in 2D. Zellen haben Verbindungen mit dem Substrat in dieser Zeit zu machen. Zusätzlich aufgrund der gekrümmten Natur der Fasern gibt es keine flache Oberfläche für die Zellen zur Ruhe und Verbindungen herzustellen, wie es in 2D Kultur. Während dies durch die Chemie der Faser vermischt werden können eingesetzt wissen wir dies nicht der Fall für das Polymer in dieser Studie verwendet werden (Daten nicht gezeigt). Erhöhen der Aussaat Zeit und Zellansiedlungsdichte führt zur Bildung von Zellaggregaten, die während der statischen Phasen mit einer schnelleren r durch das Modul fallenaß als einzelne Zellen und verringert die Kontaktzeit zwischen den Zellen und dem Substrat. Führt eine Erhöhung der Zeit auch zu einer Vergilbung der Medien, da es eine hohe Dichte von Zellen und keine Medienaustausch während dieses Schrittes ist. Unter Verwendung der in Abschnitt 4 Zellsaat Raten beschriebenen Bedingungen von ~ 15% sind konsistent mit den HepG2 / C3A - Zellen (5A) erreicht. Während dies ein geringer Bruchteil angesehen werden kann gibt es genügend Zellen gut besiedelte Fasern in wenigen Tagen zu erzeugen (Figuren 5B und 6); im Anschluss an eine Sieben-Tage - Proliferationsperiode die Zelldichte in der HFB erreicht nähert 3x10 5 / cm 2. Dies ist eine geeignete Dichte für viele Assays Hepatozyten verwendet und können berücksichtigt werden Konfluenz zu erreichen.
Die Proliferationsraten in der HFB erreicht sind langsamer , wenn der in 2D - Zellkultur (5C) erreicht verglichen. Dies ist unwahrscheinlich durch den Verlust von Zellen in der dynamischen Strömung des Systems sein, wie Zellzahlen in den Medien gering sind (mittlere ± SEM: 20.343 Zellen ± 3.674 Zellen pro 24 Stunden bei Konfluenz, die 4% der gesamten Zellen ist), und dies nicht erhöht, wenn die Durchtrittsrate von bis zu 400 & mgr; l / h eingeschaltet wird (Daten nicht gezeigt). Es ist auch unwahrscheinlich , aufgrund einer Abnahme der Lebensfähigkeit und nachfolgenden Verlust von Zellen zu sein (siehe Figur 5D und unten). Es kann erklärt werden, zumindest teilweise durch die Tatsache diese Zellinie HepG2 klonal aus und ausgewählt auf seine Fähigkeit, abgeleitet Kontakt Hemmung der Zellproliferation zu zeigen. Die Zellen in der HFB werden bei 6x die Dichte der 2D-Zellen beimpft, die zu einer langsameren Proliferationsraten führen kann.
Viability bleibt während der HFB mit Zellen zeigen,> 90% hoch. Zwar gibt es eine leichte Abnahme der Lebensfähigkeit am Austrittsende gegenüber dem Einlass wurde dies nicht signifikant (t-Test p gefunden = 0,22).
Überwachung der Glucoseverbrauch und die Milchsäureproduktion hat die Medienvorschubgeschwindigkeit und Medienvolumen in dem System zum Abstimmen verwendet. Mit 800 & mgr; l / h und einem Gesamtmediavolumen von 50 ml der Glucose und Milchsäurespiegel oben gehalten werden, und unten (jeweils) die in Standard-Gewebekultur-Plastik Kultur.
Albumin-Sekretion ist ein Schlüsselleberfunktion durch Hepatozyten durchgeführt. Es wird in das Serum sezerniert, wo sie mehrere Rollen in den Bereichen Verkehr und Homöostase spielt. Das Albumin - Sekretion durch in der HFB gewachsenen Zellen ist 15-fach höher als die in Zellen , die auf 2D (Abbildung 7) angebaut. Dies zeigt, die Zellen sind funktionell in der HFB und zumindest im Fall von Albumin-Sekretion, wird diese Funktion in der HFB erhöht.
jpg "/>
Abbildung 1. Die in vivo -ähnlichen Umgebung eines HFB. Die Zellen werden auf die Außenseite der porösen Fasern beimpft. Das Medium wird durch das Faserlumen abgegeben, eine Blutkapillare nachahmt. (A) Längsschnitt einer Faser (nicht maßstäblich). (B) Querschnitt eines 3 Faserreaktor. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die HFB - Modul. (A) Die Abmessungen des Moduls in dieser Studie verwendet. Die Abmessungen wurden so gewählt, 3 Fasern zu passen und auf die Bedürfnisse des aktuellen Forschungsprojekt zu erfüllen. Verschiedene Größen können für einzelne Systeme und Fasern hergestellt und angepasst werden. (B) Eine Fotografie des mODUL mit angeschlossenem Endkappe und Modulanschlüsse. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Modulfertigung. (A) Die Fasern werden auf Größe geschnitten und in das Modul eingefügt. (B) Die Fasern werden in das Modul verklebt, trocknen gelassen. (C) Die Enden sind geschnitten bündig mit dem Glas. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. HFB System Set-up. Die Pfeile zeigen die Richtung der Medienfluss. Rot = Zuführungsrohr. Gelb = Pumpe tuSein. Weiß = HFB-Modul. Grün = Retentat Rohr mit Klemme. Blau = Permeatrohr. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Seeding, Proliferation, Lebensfähigkeit und biochemische Analyse. (A) Prozent der Zellen ausgesät. Schwarze Diamanten repräsentieren einzelne HFBS. Der rote Balken ist der Mittelwert. (B) Zellen Dichten bei Aussaat und nach einer 7 - tägigen Proliferationsperiode. 2D-Zellzahlen wurden durch Trypsinierung bestimmt und das Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers. HFB Zellzahlen wurden unter Verwendung des PicoGreen bestimmt Assay und eine Standardkurve erzeugt aus C3A - Zellen 26. n = 5-6. Balken = SEM. (C) Bevölkerung Verdopplungszeiten. n = 5-7. Balken = SEM. (D) Viability von tryp bestimmtein Blau-Ausschluss am Ende einer 7-tägigen Proliferation. Inlet, zentrale und Auslass repräsentieren Regionen innerhalb der HFB. n = 3-5. Balken = SEM. (E & F) Glukoseverbrauch und Milchsäureproduktion. Niveaus wurden an der Vorratsflasche (Einlass) überwacht sowie das Retentat und Permeat-Auslässe und Routinekultur auf Gewebekulturkunststoff compered (media geändert am Tag 3 und 5). n = 3-5. Balken = SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6 Bilder von auf Fasern in einer HFB gezüchteten Zellen. Die Zellen wurden ausgesät und für 48 Stunden gezüchtet , bevor Fasern herausgeschnitten wurden, in PBS gewaschen, fixiert in 4% Paraformaldehyd in PBS gewaschen und Kerne mit DAPI gefärbt. Jedes Bild ist ein Verbund aus 12 'gestapelt Focus' images, um die Tiefenschärfe des resultierenden Bildes zu erhöhen. Bereiche mit höherer und niedrigerer Zelldichte entlang der Faser zu diesem Zeitpunkt und gezeigt gefunden. Wo vorhanden Faser Grenzen sind mit einem roten Strichlinie bezeichnet. Bilder wurden auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop entnommen. Bild = 10X-Objektiv. Bar = 200 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Albumin - Sekretion. Die Zellen wurden auf Gewebekulturkunststoff ausgesät bei 10.667 / cm 2 und in der HFB , wie in Kapitel 4. Zellen für 6 Tage stark vermehrt wurden. Im Anschluss an diese Proliferation Zeit wurde die Gewebekultur Kunststoff und HFB Kulturmedien für einen Serum-freiem Williams E Medium mit Glutamin und Penicillin / streptomyci ergänzt geändertn für 24 Stunden. Medienproben wurden entnommen und ein Albumin durch ELISA quantifiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 1). n = 5-6. Balken = SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Abschnitt | Name der Ausrüstung | Unternehmen | Katze. Nein. | Notizen | Bilder |
| 2 | Glass HFB-Modul | Soham Scientific | --- | Benutzerdefinierte Artikel. | |
| 2.1 | Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | ||
| 2.3 | Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicein Kleber. | |
| 2.5 | PTFE-Band | Sigma-Aldrich | Z104388 | ||
| 3.2.1 | Vorratsflasche | Fischer | 11972619 | ||
| Q-Serie Kappe | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE die Schraubgewinde der Adapter und Überwurfmutter. Montage an der Q-Serie Kappe. Schließen Sie einen 8,5 cm langen Abschnitt des mitgelieferten PTFE-Schlauch unter dem 1-mm-Adapter und ein 4 cm Abschnitt unter der 3-mm-Adapter. |  | |
| Adapter, männlich, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, männlich, 3,0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | |||
| Fitting Nuss | Kinesis | U-350 | |||
| Neopren-Schlauch | Fischer | 10366344 | Bringen Sie den Hepa-Filter bis 6 cm aus Neopren Schlauch und befestigen Sie diese auf die "Überwurfmutter". Bringen Sie ein 2x 30 mm Abschnitte L / S14 Schlauch in den oberen zwei Widerhaken des Y-Stecker und einem 3 cm langen Abschnitt von L / S16 Schlauch auf den Boden. Bringen Sie diese an die Spitze des 3 mm ID-Adapter. (Abschnitt 3.2.1) |  | |
| HEPA-vent | Fischer | 11374634 | |||
| Y-Verbinder, Stacheldraht | Cole Parmer | OU-06295-10 | |||
| L / S16 Silikonschlauch | Cole Parmer | OU-96410-16 | |||
| L / S14 Silikonschlauch | Cole Parmer | WZ-96410-14 | |||
| L / S13 Silikonschlauch | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm, die 1,0 mm Stachel-Adapter auf der Q-Serie Kappe an der Pumpe Wanne zu verbinden ing = Innenrohr. | ||
| WM 205U / CA Pumpe | Fischer | 1248-6300 | |||
| WM Pumpenschlauch, PVC, blau-orange, 0,25 mm Bohrung | Fischer | 12416310 | PTFE das Schraubengewinde des männlichen Adapter und den weiblichen Adapter anschließen. Die Arbeit der Pumpenschlauch über einen der Widerhaken. Wiederholen Sie diesen Set-up am anderen Ende des Schlauchs. (Abschnitt 3.2.1) |  | |
| Adapter, männlich, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, weiblich, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | |||
| 3.2.2 | Female Luer Kappe | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side-Port-Endkappen. | blefig4.jpg "/>  |
| L / S13 Silikonschlauch | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm Abschnitt der Pumpenschlauch an einen Modulanschluss zu verbinden. | ||
| L / S16 Silikonschlauch | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm L / S16 ausgestattet Reduzierungen = Modulverbinder zu 3x. (Abschnitt 3.2.2) | ||
| Barbed Minderer 1/8 "x 1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | |||
| 3.2.4 | L / S13 Silikonschlauch | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm Abschnitt des Retentats mit dem L / S14 des Y-Anschluss an der Q-Serie Kappe zu verbinden. |  |
| L / S13 Silikonschlauch | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm Abschnitt des Permeats zu dem L / S14 des Y-Anschluss auf der Q-Serie Kappe zu verbinden. | ||
| Gerade Stachel-Vereinigung | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Befestigen Sie an das Ende des L / S13, die mit dem L / S14 des Y-Anschluss verbinden. | ||
| 3.4.2 | Klemme | VWR | 229-0609 | ||
| 4.3 | 4 mm Silikonschlauch | Fischer | FB68858 | Falten Sie über einen 40 mm Rohrabschnitt und befestigen Sie sie mit einem Kabelbinder = Modul Endkappe. (Abschnitt 4.3) |  |
| Kabelbinder | Fischer | 12326377 | |||
| 4.4 | MACSmix Rohr Rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | Eine Anpassung kann attac erforderlichh die Module. | |
| 4.5 | Leur Injection Port | Thistle Scientific | IB-10820 | Bringen Sie die Endkappe mit dem Injektionsanschluss. (Abschnitt 4.5) | |
| Female Luer Kappe | Cole Parmer | WZ-45508-64 | |||
| 5 | L-Milchsäure-kit | Megazyme | K-LATE | ||
| 5 | D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | ||
| 6.2 | Skalpell / micro Messer | InterFocus | 10315-12 | ||
| 7.4.3 | Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 |
Tabelle 1. Bestandteile des HFB Set-up.
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser-Bioreaktor (HFB) System für Säugetierzellkultur und ihre Nützlichkeit in wuchernden die Hepatozyten-Zelllinie HepG2 / C3A demonstriert. Das System ist auf dem Regal eines Standard-Inkubator und seine Set-up zu passen ist einfach genug, um von einer zuständigen Zellbiologe vertraut mit aseptischer Technik durchgeführt werden.
Die Fasern in der Forschungssystem verwendet hier beschriebenen in Haus durch Phaseninversions Schleuderguß (Spinnen) hergestellt, das eine nicht-bioabbaubare proprietären Polymer verwendet. Es ist möglich, Fasern zu bilden, indem aus einer Vielzahl von geeigneten Materialien für die Zellkultur Spinn sowohl biologisch abbaubare und nicht biologisch abbaubar, beispielsweise; Polycaprolacton (PCL) 27, Poly-L-lactid Säure (PLLA) 28, Poly (milch-co-glykolsäure) (PLGA) 29, Polysulfon (PSU) 12 und Polyetheretherketon (PEEK) 13. Jeder hat unterschiedliche Eigenschaften einnd sollte basierend auf den Bedürfnissen des Systems gewählt werden. Überprüfen Sie die Kompatibilität der verwendeten Faser mit dem Ethanol in der Sterilisationsschritt verwendet wird. PLGA ist bekannt , mit Ethanol erfordert eine alternative Behandlung , wie Antibiotika / Antimykotika - Lösung 25 bis plastifizieren.
Die Abmessungen der Glasmodule hier verwendet wurden, basierend auf den Anforderungen der aktuellen Forschung ausgewählt. Verschiedene Größen können von jedem seriösen Glasbläserei hergestellt werden. Eine Betrachtung in Modulgröße ist die Anzahl der Zellen, die auf die Anzahl der Fasern in dem Modul und wahrscheinlich Strömungsraten verbunden ist. Je mehr Zellen gibt es in dem Modul je höher die Strömungsraten, um sein müssen am Ausströmende des Bioreaktors günstige Kulturbedingungen zu halten. Dies wird eine Grenze, wie irgendwann erreichen und einige Versuch und Irrtum kann mit der Überwachung von Medienbedingungen im Modul Permeat erforderlich. Mathematische Modellierung kann einige Einblicke in die gewünschte Modul Dimen bietensionen und Strömungsgeschwindigkeiten 22.
Die Abmessungen der Vorrichtung hier verwendet wird, ausgelegt auf einen Inkubator Regal zu passen. Die Länge des Rohres wird durch die Länge diktiert, während auch ermöglicht genügend Bewegung von Komponenten für die Einrichtung und den Betrieb zwischen den Anschlüssen zu ermöglichen, benötigt zu erreichen. Wenn Zeitverlauf Abtastung erforderlich ist, beispielsweise bei der Überwachung von Medienbedingungen in dem Modul durchdringen kann Einblasöffnungen zum Retentat zugegeben werden und Permeatleitungen dies zu erleichtern.
Eine Voraussetzung für jede Zellkultursystem ist wachsende Zellen am Leben und in den meisten Fällen zu halten. Im Lichte der Studien eine in vivo -ähnlichen Phänotyp in Zellen gewachsen in 3D - Kultursystemen demonstrieren scheint es auch wichtig , eine Umgebung zu schaffen , die eng an die in vivo - Umgebung durch die Zellen angetroffen nachahmt. Dieser letzte Punkt wird häufig in 2D-Zellkultur zugunsten der Einfachheit halber wird dieser Kultursystem bietet vernachlässigt. Ter HFB - Mimetika in vivo Kapillarnetzwerke von Nährstoffen zu den Zellen durch das Lumen der Fasern liefert. Die Abfallprodukte werden ebenfalls von dem System durch den dynamischen Strom entfernt. Dadurch entsteht ein in vivo -ähnlichen System für die Zellkultur und einer, die in vivo - Umgebung eng nachahmt von Hepatozyten zu sehen ist , dieses System eine bessere Wahl zu machen im Vergleich zu Kulturkunststoff 2D - Gewebe für diese Zellen kultiviert werden . Dies wird durch die Tatsache untermauert, die Zellen sezer 15-fachen der Menge an Albumin, eine wichtige Leberfunktion, in der HFB Kultursystem im Vergleich zu denen auf Kulturkunststoff 2D-Gewebe gezüchtet.
Während das HFB - System die meisten , wenn nicht alle Verankerung abhängige Zelltypen geeignet ist, ist das Beispiel hier für Hepatozyten , weil es einen echten Bedarf an Kultur zu können ist funktionell, mehr in vivo -ähnlichen Hepatozyten für die Verwendung in der Arzneimittelentwicklung von der Pharmaindustrie und in bioartifiziellen Leber Geräte für die extrakorporale Unterstützungvon Leberversagen Patienten. Der Bedarf an funktioneller Zellen erstreckt sich über diese Beispiele, insbesondere auf dem Gebiet der regenerativen Medizin in eine Phase der translationalen Arbeit eintritt. Die Vorteile einer in - vivo - -ähnlichen Kulturumgebung sollte nicht übersehen werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Custom Item. (Section 2) |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
| Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
| PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
| Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 3.0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6 cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm to connect the 1.0 mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
| WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
| WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25 mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Female, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
| Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
| 4 mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
| Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
| D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
| Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
| Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |
References
- Lewis, W. H. Experimental evidence in support of the theory of outgrowth of the axis cylinder. American J Anat. 6 (1), 461-471 (1906).
- Harrison, R. G. The development of peripheral nerve fibers in altered surroundings. Wilhelm Roux Arch Entwickl Mech Org. 30 (2), 15-33 (1910).
- Ding, L., et al. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for Embryonic Stem Cell identity. Cell Stem Cell. 4 (5), 403-415 (2009).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering -In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4), 352-366 (2011).
- Sinden, J. D., Vishnubhatla, I., Muir, K. W. Prospects for stem cell-derived therapy in stroke. Prog Brain Res. 201, 119-167 (2012).
- Ouyang, A., Yang, S. -T. A two-stage perfusion fibrous bed bioreactor system for mass production of embryonic stem cells. Expert Opin Biol Ther. 8 (7), 895-909 (2008).
- Carnachan, R. J., Bokhari, M., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Taloring the morphology of emulsion-templated porous polymers. Soft Matter. 2 (7), 608-616 (2006).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34 (21), 5088-5106 (2013).
- Storm, M. P., Orchard, C. B., Bone, H. K., Chaudhuri, J. B., Welham, M. J. Three-dimensional culture systems for the expansion of pluripotent embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 107 (4), 683-695 (2010).
- Wung, N., Acott, S. M., Tosh, D., Ellis, M. J. Hollow fibre membrane bioreactors for tissue engineering applications. Biotechnol Lett. 36 (12), 2357-2366 (2014).
- Ellis, M., Jarman-Smith, M., Chaudhuri, J. B. Bioreactor systems for tissue engineering: A four-dimensional challenge. Bioreactors for tissue engineering; principles, design and operation. Chaudhuri, J., Al-Rubeai, , Springer. Chapter 1 1-18 (2005).
- Silva, A. I., Mateus, M. Development of a polysulfone hollow fibre vascular bio-artificial pancreas device for in vitro studies. J Biotechnol. 139 (3), 236-249 (2009).
- De Bartolo, L., et al. Human hepatocyte functions in a crossed hollow fiber membrane bioreactor. Biomaterials. 30 (13), 2531-2543 (2009).
- Schmelzer, E., Finoli, A., Nettleship, I., Gerlach, J. C. Long-term three-dimensional perfusion culture of human adult bone marrow mononuclear cells in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 112 (4), 801-810 (2015).
- Tapia, F., et al. Production of high-titer human influenza A virus with adherent and suspension MDKC cells cultured in a single-use hollow fiber bioreactor. Vaccine. 32 (8), 1003-1011 (2014).
- Deng, X., Zhang, G., Shen, C., Yin, J., Meng, Q. Hollow fiber culture accelerates differentiation of Caco-2 cells. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (15), 6943-6955 (2013).
- Schutte, M., et al. Rat primary hepatocytes show enhanced performance and sensitivity to acetaminophen during three-dimensional culture on a polystyrene scaffold designed for routine use. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 475-486 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge. J Anat. 211 (4), 567-576 (2007).
- Vivares, A., et al. Morphological behaviour and metabolic capacity of cryopreserved human primary hepatocytes cultivated in a perfused multiwell device. Xenobiotica. 45 (1), 29-44 (2015).
- Smith, I., et al. Human neural stem cell-derived cultures in three-dimensional substrates form spontaneously functional neuronal networks. J Tissue Eng Regen Med. , Epub ahead of print (2015).
- Davidson, A. J., Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. A theoretical approach to Zonation in a bioartificial liver. Biotechnol Bioeng. 109 (1), 234-243 (2012).
- Mulder, M. The basic principles of membrane technology. 2nd ed. , Kluwer Academic Publishers. Chapter 3 section 4 (1996).
- Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. Poly(lactic-co-glycolic acid) hollow fibre membranes for use as a tissue engineering scaffold. Biotechnol Bioeng. 96 (1), 177-187 (2007).
- Shearer, H., Ellis, M. J., Perera, S. P., Chaudhuri, J. B. Effects of common sterilization methods on the structure and properties of poly(D,L lactic-co-glycolic acid) scaffolds. Tissue Eng. 12 (10), 2717-2727 (2006).
- Forsey, R. W., Chaudhuri, J. B. Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds. Biotechnol Lett. 31 (6), 819-823 (2009).
- Williamson, M. R., Coombes, A. G. A. Gravity spinning of polycaprolactone fibres for applications in tissue engineering. Biomaterials. 25 (3), 459-465 (2004).
- El-Salmawy, A., et al. Preparation and properties of pronectin F-coated biodegradable hollow fibres. J Artif Organs. 8 (4), 245-251 (2005).
- Meneghello, G., et al. Fabrication and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid)/polyvinyl alcohol blended hollow fibre membranes for tissue engineering applications. J Memb Sci. 344 (1-2), 55-61 (2009).
