Summary
Den funksjonelle virkemåten av celler i kultur kan forbedres ved å dyrke i flere in vivo-lignende tre-dimensjonale kulturmiljøer 16-21. Dette manuskriptet beskriver oppsett og drift av en hul fiber bioreaktor system for in vivo-lignende pattedyr vev kultur.
Introduction
Vevskultur er en etablert teknikk for vekst og / eller vedlikehold av celler som har vært benyttet i over 100 år 1,2. Bekvemmeligheten av å studere celler og svar ex vivo har vidtrekkende fordeler slik eksperimenter som ellers ville være ekstremt utfordrende om ikke umulig, for eksempel generering av genmanipulerte cellelinjer og bruk av reporter celler i høy gjennomstrømning utvelgelsesassays 3. Mer nylig vev kultur har gitt opphav til feltet tissue engineering, for generering av in vitro-modeller og regenerativ medisin. Med disse programmene, har interessen for dynamiske tre-dimensjonal (3D) kultursystemer vokst betydelig.
3D-kultur metoder (definert her som en 3D-kultur substrat og / eller innføring av retnings dynamisk strømnings) bedre rekapitulere arkitektur av in vivo cellulære miljø, viktig for å oppnå enmer fysiologisk-lignende funksjon. Evnen til å trekke ut, vokse, differensiere og transplanterte cellene med sikte på å reparere sykt og skadet vev er et fagområde som har et stort potensial for pasienten nytte og kommersiell mulighet. For eksempel bruk av autologe keratinocytter for behandling av sår (se 4) og bruk av cellebaserte terapier for behandling av slag (se 5). Likeledes markedet for in vitro-modeller spenner medisiner til stratifisert medisin applikasjoner. Konvensjonen i vevskultur er fremveksten av heft eller forankringsavhengige celletyper på to-dimensjonale (2D) overflaten av en vev kultur kolbe. Mens tiden akseptert som gullstandarden i et forskningsprosjekt setting, har nyere interesse i vev tekniske applikasjoner streket det faktum at dagens 2D vevskultur miljøet er utilstrekkelig for den nødvendige opptrappingen i celleproduksjon 6.
For tilhenger celletyper en scaffold er nødvendig, noe som vil variere avhengig av sluttanvendelsen, både når det gjelder den kjemiske sammensetning og mekaniske egenskaper. Noen systemer benytter stillaser samt plate innsatser består av svært porøs matrise dannet av høy intern fase emulsjon templat (se 7) eller elektrospunnede fibre (se 8) krever minimum tilpasning fra konvensjonelle 2D kultur teknikker. Celler kan bli seedet på mikro av varierende komposisjoner og vokst i rørt tanker som leverer næringsstoffer og signalmolekyler, og bære bort avfall (massetransport) gjennom en dynamisk godt blandet miljø 9. Imidlertid er disse systemer begrenset i sin in vivo-lignende miljø og ytterligere forbedringer kan gjøres med hensyn til å skalere opp kostnader. Hule fiber bioreaktorer (HFBs) er et 3D-kultur-system som består av fibre festet til en modul med celler som vanligvis seeded på utsiden av de porøse fibre og medium som leveres gjennom fiber lumen (oversikt i ett0) (figur 1). HFBs har en in vivo-lignende miljø med fibrene som etterligner blodkapillærer og skjerming cellene fra de skjærspenninger i forbindelse med dynamisk leveringsmedium, samtidig som definert skjær å bli brukt til celler via fluidstrømning gjennom sideportene hvis ønskelig. Dette skaper et allsidig kultursystem med overlegne massetransport hvor høy celletetthet kan nås 11. HFB-systemet er godt egnet for opprettholdelse av forankringsavhengige celletyper og har blitt anvendt for å dyrke forskjellige celler, inkludert rotte pankreatiske Langerhans-øyer 12, mus β-TC-3-insulinoma cellelinje 12, primære humane hepatocytter 13, human bone marg mononukleære celler 14, Madin Darby canine nyreceller (MDCK) 15 og Caco-2 celler 16 for å nevne noen.
I tillegg til system fordelene ved masseoverføring og oppskalering, celler dyrket i 3D tissaksøke kultur systemer har en tendens til å være mer in vivo-lignende i morfologi og mer mottakelig for eksperimentelle signaler. For eksempel rotte primære hepatocytter viser et mer cuboidal morfologi, økt levedyktighet, større induksjon av cytokrom P450-enzym-aktivitet og økt følsomhet for paracetamol toksisitet når dyrket i et kommersielt tilgjengelig polystyren stillaset sammenlignet med celler dyrket i kultur 2D 17. Ved anvendelse av samme stillaset den hepatokarsinom cellelinje HepG2 har også blitt vist å øke produksjonen albumin 18 og viser et mer in vivo-lignende respons på metotreksat sammenlignet med 2D-dyrkede celler 19. Primære humane hepatocytter demonstrert forsinket dedifferentiation, høyere cytokrom-P450 aktivitet og økt clearance for 4/5 forbindelser testet i et perfusjon kultur system 20. Human neural stamceller avledet neuroner og glia dyrket i et kommersielt tilgjengelig polystyren stillas oppviste både høy (aksjonspotensial) og lav-frekvens CNCY (lokal feltpotensial) spontan aktivitet mens ingen neuronal aktivitet ble påvist i 2D-dyrkede celler 21. Caco-2 celler vist forbedret differensiering i en HFB i forhold til 2D kultur målt ved økt alkalisk fosfatase, γ-glutamyltransferase og P-glykoprotein aktivitet og høyere uttrykk av F-aktin og zona okkludens-1 protein 16. Til tross for fordelene, blir rutine dyrking av celler i annet enn et 2D vevskulturkolbe overflatesystemer likevel ikke praktisert i mange laboratorier, selv om det antall publikasjoner som siterer 3D cellekultur vokser (8-ganger økning i de siste 10 årene. Kilde : PubMed 'Resultater av året "verktøy undersøkt med" 3D kultur ").
Dette manuskriptet beskriver oppsett og driftsforhold for et HFB system for pattedyrcellekultur og demonstrerer sin nytte i dyrking av hepatokarsinom cellelinje HepG2 / C3A. Formålet med denne metoden er å kultur ble cellene ien mer in vivo-lignende kultur system som beholder nok enkelhet å gjøre det mottagelig for de som er nye til 3D-kultur-systemer. Begrunnelsen for å bruke HFBs i søknaden beskriver her, som er å forbedre forutsigbarheten av lever modeller er at det er teoretisk mulig å etterligne en lever sinusoid i HFB miljø 22. Dette er ikke tiden bart med andre kultursystemer.
Protocol
1. Fibers
- Produksjon fibrene ved fase inversjon spin casting (spinning). Detaljer om denne metoden kan bli funnet i 23,24.
MERK: For dette arbeidet fibrene er produsert i huset ved hjelp av en ikke-nedbrytbare proprietær polymer, NMP som løsemiddel og H 2 O som ikke-løsemiddel. Detaljer på andre egnede polymerer kan finnes i diskusjonen. Fibrene som brukes i systemet som er beskrevet her er 1.05mm ytre diameter med en 600-700 um lumen diameter. Fibrene er porøs med porediametre som måler 2,28 um ± 1,5 mikrometer (gjennomsnitt ± standardavvik). Dette er laget for å skille celler fra Matingen i fiber lumen, replikere leveren sinusformet eller blodkar i andre vev. Fiber kan også kjøpes fra membran leverandører som Pall.
2. Modul Fabrication
MERK: Modulene brukt i denne studien er laget av 1 mm tykt borsilikatglass med 2 sideporter(Figur 2A). Fibrene i modulen som er beskrevet her har et ytre overflateareal på 4,95 cm2 som tilsvarer omtrent halvparten av en brønn i en 6-brønns plate.
- Siliconize moduler før første gangs bruk av belegg på indre overflaten med Sigmacote (tabell 1) og la tørke i en avtrekkshette. Autoklav (121 ° C, 1 atm, 20 min) for å øke levetiden av behandlingen.
- Ved hjelp av en skalpell kutte 75 mm lange fibre og sett tre fibre i hver modul forlater ~ 7 mm overflødig lengde i hver ende (figur 3A).
- Stedet ~ 0,5 ml silikon lim (tabell 1) inn i et veie båt. Bruke et P200 pipettespiss for å plukke opp en liten mengde av silikon og arbeide limet inn i endene av modulen rundt fibrene for å danne en 3-5 mm plugg (figur 3B). La det tørke i> 3 timer.
- Ved hjelp av en skalpell kutte silikon flush med glass modul ender (Figur 3C).
- Pakk enliten mengde (~ 4 lag) av polytetrafluoretylen (PTFE) båndet rundt en sideport.
3. System Setup og Sterilisering
MERK: Pump rør og moduler med fiber er ikke autoklaveres og er sterilisert med 70% etanol. Forfatterne anbefale å kalibrere pumpeslangen med pumpen skal brukes. Prosedyren nedenfor utføres i en laminær strømningshette.
- Autoklav (som avsnitt 2.1) alle autoklaverbare komponenter før oppsett.
- Set-up
- Plasser 10 ml 70% etanol i reservoaret flasken og sette opp reservoaret flasken, Q-serie cap, tilførselsrør, pumpe og pumpeslangen (tabell 1) som i figur 4.
- Løst plassere en endehette over PTFE-tapet sideporten. Skyv endene av L / S16 modulkontakter i løpet av modulen slutter og fri sideporten. Koble en 40 mm seksjon av L / S13 slangen til modulkontakten nærmest avkortet sideporten (tabell 1) som i figur 2B
- Kople modulen til pumpen slangen, noe som sikrer å orientere modulen slik at den avkortet sideporten er nærmest pumpen.
- Koble permeatet linje og retentatet linje til de modulkontaktene, og L / S14 av den Y-kobling på reservoaret flasken (tabell 1). Kontroller at oppsettet ligner skjematisk i Figur 4.
- sterilisering
- Pump etanol gjennom modulen ved 800 pl / t (267 ul / time pr fiber) i tilstrekkelig tid til å behandle unautoclaved komponenter for> 30 min (juster ganger hvis andre steriliseringsmetoder brukes, se 25).
- vask
- Å vaske etanol ut av systemet, først slå av pumpen og tøm slangen. Først løsne pumpen slangen fra modulen adapter slangen. Hold modulen værs å tømme etanol ut av fibre og retentatet linje, tilbake til reservoaret flasken. Fjern sideporten endestykke fra modulen til å renne the etanol fra selve modulen, og permeatet linje. Fest sideporten slutten cap. Snu strømmen av media på pumpen for å tømme pumpen slangen og tilførselsledning etanol. Slå av pumpen, og sett pumpen slangen til modulen adapter.
- Skru av etanol flasken fra lokket og erstatte med en flaske som inneholder 10 ml cellevekst medium (for eksempel EMEM, GMEM, DMEM eller RPMI) uten serum. Pumpe mediet gjennom systemet ved 800 pl / time inntil retentatet linje er full av media. Klem retentatet linje for å tvinge gjennomtrengning av mediet gjennom fibrene for å vaske modulen. Vask for ~ 2 timer.
4. Seeding
MERK: Mediene og kosttilskudd som brukes i denne protokollen skal være de som er etablert for den ønskede celletype. Vennligst referer til litteraturen, den europeiske Innsamling av cellekulturer (ECACC) og American Type Culture Collection (ATCC) for ytterligere informasjon. Forut for denne metoden cellene skal være maintabestemt i henhold til etablerte protokoller for den ønskede celletype. For dette arbeidet hepatokarsinom cellelinje HepG2 / C3A kloning ble opprettholdt i henhold til distributører anbefalinger (ATCC).
MERK: seeding protokoll som presenteres nedenfor også tjener til å pre-kultur modulen med cellekulturmediet før cellevekst. Skulle en mer omfattende pre-kulturen være nødvendig da dette bør gjennomføres før såing modulen ved å tappe vaske media fra systemet, og erstatte med vekstmedier og gjennomsyrer dette gjennom modulen for noen timer. Se avsnitt 7.5.2.1 for detaljer om hvordan du bytter media i systemet.
- Fremstille en enkel cellesuspensjon ved trypsinering i henhold til etablerte protokoller for den ønskede celletype. En generell protokoll for en T75 kultur er som følger:
MERK: Antall celler til bruk i seeding skritt bør bestemmes empirisk for ønsket celletype. De bioreaktorer beskrevet her sås med en 35 ganger høyere cells tetthet (celle / cm2) enn den som benyttes i 2D vevskultur plast for en syv dagers kultur.- Vask cellene ved tilsetning av 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS), aspirere, og deretter tilsett 3 ml 0,05% trypsin etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (nok til å dekke cellene) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 min.
- Høste cellene i 7 ml vekst media supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) for å nøytralisere trypsin. Bland godt, tilsett 10 mL til kammeret av en hemocytometer og telle cellene.
- Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter for å pelletere cellene.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene ved 4x10 6 / ml i vekstmedium supplementert etter behov for den ønskede celletype.
- Slå av pumpen og tøm materøret og modul som i 3.4.1.
- Ta modulen fra modulkontaktene og feste modulen endestykker (tabell 1) pre-sterilisert i 70% etanol, og etterlater en sideport gratis. </ Li>
- Overfør ~ 500 mL av cellesuspensjonen (2x10 6 celler) (4.1.4) til modulen ved hjelp av en 18 G nål og 1 ml sprøyte, ta vare å unngå bobledannelse og for ikke å skade fibrene.
- Cap sideporten ved hjelp av en endehette. Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO2 i 2-4 timer med manuell dreining av modulen ved 180 ° hver 5 min. Alternativt modulene kan festes til et rør rotator med en intermitterende blanding innstilling (tabell 1).
- Etter såing, legg ved et endestykke på en injeksjonsåpning (tabell 1) pre-sterilisert i 70% etanol, og legge dette til PTFE-tapet sideporten. Fjern det andre sideporten endestykke og langsomt renne cellene ved å injisere luft inn i den vedlagte injeksjonsåpningen ved hjelp av en 27 G nål og 1 ml sprøyte.
- Sett på injeksjonsporten med en endehette. Sakte fylles modulen med mediet ved hjelp av fri sideporten og en 18 G nål med en 1 ml sprøyte. Remove endestykkene modul- og feste modulen til slangen ved hjelp av modulkontaktene.
- Bytt vaske media flasken med en som inneholder 50 ml vekstmedier og kosttilskudd følgende fremgangsmåten beskrevet i 7.5.2.1. Pumpe vekstmediet gjennom systemet ved 800 pl / time.
5. Proliferation
MERK: Fibrene brukt i forskningssystemet som beskrives her er satt til å gjennomsyre på ~ 80 mL / t, med en 800 mL / time matehastighet.
- Bruk av fibrene for å dyrke cellene i perioder på opptil syv dager i en fuktig inkubator innstilt på 37 ° C, 5% CO2.
MERK: Overvåking av næringsstoffer og metabolitter i vekstfasen kan gi nyttig informasjon om spredning, metabolsk opptak og produksjon av celler og næringsstoffer og metabolitter i media. For eksempel glukose bruk og laktat produksjon. Pakkene er tilgjengelig fra ulike leverandører som kan kvanitfisere disse faktorene fra media (se
6. Eksisjon
MERK: Fibrene kan være skåret ut fra modulen ved slutten av et eksperiment for analyse.
- Trekk ut og tøm HFB.
- Sett inn en skalpell / micro kniv (tabell 1) blad mellom glasset og silikon. Snu modulen for derved å skjære vekk silikon fra glasset. Gjenta denne fremgangsmåten ved begge ender av modulen.
- Ved hjelp av bladet koble ut silikonpluggen fra den ene enden og dra forsiktig. Sørg for at fibrene kommer med det. 7. Cell Analysis
- celle tall
NB: For C3a cellene som ble brukt i denne studien noen tidspunkter i løpet av 7 dagers vekstperiode er egnet for anvendelse i denne beregningen som vekstrater ikke vesentlig endrer seg over celletettheter oppnådd i dette tidsrommet.- Etter eksisjon (§ 6) dyppe fibrene i PBS for å vaske og skjær dem i en 1,5 ml tube inneholder 0,5 ml Tris EDTA (TE) buffer. Underkaste denne til to fryse-tine-sykluser i en -80 ° C fryser. Måle DNA-innhold ved hjelp av PicoGreen og bestemme celletall ved å sammenligne denne verdi med en standardkurve tatt opp med den ønskede celletype 26.
- Celleproliferasjon priser
- Ved hjelp av celletallene beregnet ved to forskjellige tidspunkter beregne den spesifikke veksthastigheten μ (ligning 1) hvor Ln (X1) er den naturlige logaritme av celletallet ved det første tidspunkt og Ln (X2) er den naturlige logaritme av cellen nummer på andre tidspunkt.
μ = (Ln (X2) -lN (X1)) / tid (t) (1)
Fra denne beregne befolknings dobling ganger (DT) (ligning 2) der μ er den spesifikke vekstraten.
dT = ln2 / μ (2)
- Ved hjelp av celletallene beregnet ved to forskjellige tidspunkter beregne den spesifikke veksthastigheten μ (ligning 1) hvor Ln (X1) er den naturlige logaritme av celletallet ved det første tidspunkt og Ln (X2) er den naturlige logaritme av cellen nummer på andre tidspunkt.
- celleviabilitet
- Etter utskjæring (Section 6) dyppe fibrene i PBS for å vaske og skjære dem inn i et 1,5 ml rør inneholdende 500 ul 0,05% trypsin etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Inkuber ved 37 ° C i 10 min.
- Bland og tilsett 10 mL av cellesuspensjon til 10 mL trypan blå. Load 10 mL mot en hemocytometer og telle antall døde (blå) og levende celler.
- Imaging
- Etter excision dyppe fibrene i PBS for å vaske og bruke saks til å klippe dem opp i mindre lengder inn i en 24-brønns plate. Tilsett 400 ul 4% para-formaldehyd (i PBS) og inkuber ved romtemperatur i 20 min.
- Vask med PBS ved pipettering 400 ul av og på. Gjenta this takt med frisk PBS.
- Tilsett 400 ul 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fortynnet i PBS til ca. 100 ng / ml og inkuberes ved RT i 20 min. Beskytt mot lys.
- Vask to ganger med PBS (som 7.3.2) og en gang med H2O Legg en fluorescens monteringsmedium for å dekke fiber og bilde umiddelbart å samle inn data før prøvene tørre (DAPI ex / em; 359/461 nm).
- Ta bilder med forskjellige fokusplan og bruke "fokusere stabling 'programvare (f.eks stabel focuser plugin for ImageJ, nedenfor) for å lage et sammensatt bilde som viser en sterkt utvidet dybdeskarphet. Dette er nødvendig fordi fibrene ikke er helt flate.
- Last ned ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) og "stable-focuser 'plugin (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html).
- I ImageJ åpne bildene som skal stables. Så i "Image" menyen gå til 'Stacks' - 'bilder til Stack'. I "Plugins" -menyen gå til "Stack focuser'. Angi en n for nxn kjernen. Prøving og feiling med 'n' kan være nødvendig for å generere et bilde med lite "støy". Verdier mellom 11 og 77 har en tendens til å fungere godt.
- albumin sekresjon
MERK: Dette er en hepatocytter celle funksjonstest og ikke en generell test av cellefunksjon.- Seed celler (HepG2 / C3A) på 2D vevskultur plast på 10667 / cm 2 og dyrket i 6 dager. Seed HFBs som beskrevet i kapittel 4 og vokse i 6 dager.
- Etter denne spredningen perioden endre kulturen media (EMEM + 10% FBS, 1x glutamin og 1x penicillin / streptomycin) for vevet kultur plast og HFB til et serum gratis Williams E media supplert med 1x glutamin og 1x penicillin / streptomycin for 24 timer:
- Tapp av slangen og HFB modul følge trinnene fastsatt i 3.4.1. Skru av reservoaret flasken og erstatte denne med en flaske som inneholder Williams E media. Pump dette gjennom HFB 800 ul / time.
- Etter 24 timers, ta medieprøver. Kvantifisere utskilt albumin ved ELISA i henhold til produsentens instruksjoner (tabell 1). Fortynn medie-prøver 1 på 10 til 1 i 40 før bruk for å bringe albuminkonsentrasjoner innenfor området av standardkurven.
Representative Results
Cell seeding er et kritisk punkt. Evnen til cellene til å forholde seg til fiber i et 3D oppsett er betydelig mindre enn det som ble sett for 2D vev kultur plast. Dette er sannsynligvis på grunn av det reduserte kontakttiden mellom celle og substrat. I HFB cellene falle gjennom modulen i løpet av de statiske faser av poding. Disse er vesentlig kortere i tid i forhold til den kontinuerlige en statisk fase brukt i 2D. Celler må gjøre forbindelser til underlaget i denne tiden. I tillegg, på grunn av den buede arten av fibrene er det ingen flat overflate for cellene til å hvile og lage forbindelser som det er i 2D kultur. Selv om dette kan bli forsterket av kjemien av fiberen anvendte vi vet dette ikke å være tilfelle for de som anvendes i denne studien polymer (data ikke vist). Økning av fordelingstid og celle såing tetthet fører til dannelsen av celleaggregater som faller gjennom modulen i løpet av de statiske fasene i et raskere rspiste enn enkeltceller og ytterligere reduserer kontakttiden mellom celler og substratet. Øke tiden også fører til gulning av de medier som det er en høy tetthet av celler, og ingen utveksling media under dette trinnet. Bruke vilkårene som er beskrevet i kapittel 4 celle seeding priser på ~ 15% er konsekvent oppnådd med HepG2 / C3a- celler (figur 5A). Mens dette kan betraktes som en lav fraksjon er det nok celler til å generere godt befolkede fibre i løpet av noen dager (figur 5B og 6); etter en syv dagers periode proliferasjon celletettheten nådde i HFB nærmer 3x10 5 / cm2. Dette er en passende tetthet for mange analyser anvendelse av hepatocytter og kan anses å være nådd konfluens.
De spredning priser oppnådd i HFB er tregere i forhold til det som oppnås i 2D cellekultur (figur 5C). Dette er unsannsynlighet for å være på grunn av tap av celler i det dynamiske strømmen i systemet som celletellinger i media er lav (gjennomsnitt ± SEM: 20,343 celler ± 3,674 celler pr 24 timer ved sammenløpet, noe som er 4% av de totale celler) og denne ikke øker når gjennomtrengningshastigheten er skrudd opp til 400 pl / t (data ikke vist). Det er også usannsynlig å skyldes en reduksjon i levedyktighet og påfølgende tap av celler (se figur 5D og under). Det kan bli forklart, i det minste delvis av det faktum denne cellelinjen ble klonalt avledet fra HepG2 og utvalgt på sin evne til å vise kontakt inhibering av celleproliferasjon. Cellene i den HFB utsåes med 6x tettheten av 2D-celler som kan føre til lavere priser spredning.
Levedyktighet er fortsatt høy i hele HFB med celler som utviser> 90%. Mens det er en liten reduksjon i levedyktighet ved utløpsenden i forhold til innløpet dette ble ikke funnet å være signifikant (t-test p = 0,22).
Overvåking av glukoseforbruk og melkesyreproduksjon har vært brukt til å justere matehastigheten media og medievolumet i systemet. Ved å bruke 800 pl / time og et totalmedievolum på 50 ml glukose og melkesyre nivå opprettholdes over og under (henholdsvis) som ble sett i standard vevskultur plastkultur.
Albumin sekresjon er en viktig leverfunksjon utføres av hepatocytter. Det utskilles i serum hvor den spiller flere roller i transport og homeostase. Albumin sekresjon av celler dyrket i HFB er 15 ganger høyere enn det i celler dyrket på 2D (figur 7). Dette viser at cellene er funksjonell i HFB og i det minste i tilfelle av albumin sekresjon, er denne funksjonen forhøyet i HFB.
jpg "/>
Figur 1. Den in vivo-som omgivelser av en HFB. Cellene blir sådd ut på utsiden av de porøse fibre. Media er levert gjennom fiber lumen, etterligne en blodkapillært. (A) lengdesnitt av en fiber (ikke i målestokk). (B) Tverrsnitt av en tre fiber reaktoren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. HFB-modulen. (A) Dimensjonene av modulen brukt i denne studien. Dimensjonene ble valgt til å passe 3 fibre og oppfylle behovene til den aktuelle forskningsprosjektet. Ulike størrelser kan produseres og skreddersydd for individuelle systemer og fiber. (B) Et fotografi av module med vedlagte slutten cap og modulkontakter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Modul fabrikasjon. (A) Fibrene kuttes til riktig størrelse og settes inn i modulen. (B) fibre er limt inn i modulen, fikk tørke. (C) Endene er kuttet i flukt med glass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. HFB systemoppsett. Pilene viser retningen av media flyt. Rød = materøret. Gul = pumpe tuvære. Hvit = HFB modul. Grønn = retentat tube med klemme. Blå = gjennomsyre tube. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Seeding, spredning, levedyktighet og biokjemisk analyse. (A) Prosent av celler seeded. Svarte diamanter representerer individuelle HFBs. Den røde linjen er gjennomsnittet. (B) Celler tettheter ved såing og etter en 7 dagers periode spredning. 2D celleantall ble bestemt ved trypsinisering og telling ved anvendelse av et hemocytometer. HFB celle tall ble bestemt ved hjelp av PicoGreen analysen og en standard kurve produsert fra C3a- celler 26. n = 5-6. Bars = SEM. (C) Befolkning dobling ganger. n = 5-7. Bars = SEM. (D) Livskraftig bestemmes av Trypen blå eksklusjon ved slutten av en 7 dagers proliferasjon. Inlet, sentral og uttak representerer regioner i HFB. n = 3-5. Bars = SEM. (E og F) glukoseforbruk og melkesyreproduksjon. Nivåer ble overvåket ved reservoaret flasken (innløp) samt retentatet og permeatet uttak og compered til rutine kultur på vevskultur plast (medier endres på dag 3 og 5). n = 3-5. Bars = SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Bilder fra celler dyrket på fibrene i en HFB. Celler ble sådd og dyrket i 48 timer før fibrene ble skåret ut, vasket i PBS, fiksert i 4% paraformaldehyd, vasket i PBS og kjerner farget med DAPI. Hvert bilde er en sammensetning av 12 fokus stablet 'imaGES for å øke dybdeskarpheten av det resulterende bildet. Områder med høyere og lavere celletetthet er funnet langs fiberen ved dette tidspunkt og er vist. Hvor nåværende fiber grenser er markert med en rød stiplet linje. Bilder ble tatt på en omvendt fluorescens mikroskop. Image = 10X objektiv. Bar = 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Albumin sekresjon. Cellene ble sådd ut på vevkultur-plast ved 10 667 / cm 2 og i den HFB som beskrevet i del 4. Celler ble proliferert i 6 dager. Etter denne spredningen perioden vevet kultur plast og HFB kultur media ble endret for et serum gratis Williams E media supplert med glutamin og penicillin / streptomycin i 24 timer. Medieprøver ble tatt og et albumin kvantifisert ved hjelp av ELISA i henhold til produsentens anvisninger (Tabell 1). n = 5-6. Bars = SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Seksjon | Navn på utstyr | Selskap | Katt. Nei. | Merknader | Bilder |
| 2 | Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Tilpasset element. | |
| 2.1 | Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | ||
| 2.3 | Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicen Lim. | |
| 2,5 | PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | ||
| 3.2.1 | Reservoir flaske | Fisher | 11972619 | ||
| Q-serien cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE gjengene av adaptere og montering mutter. Fest i Q-serien cap. Fest en 8,5 cm seksjon av den medfølgende PTFE slange under 1 mm adapter og en 4 cm seksjon under 3 mm adapter. |  | |
| Adapter, Male, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, Male, 3,0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | |||
| montering Nut | Kinesis | U-350 | |||
| neopren tubing | Fisher | 10366344 | Fest Hepa filter til 6 cm av neopren tubing og legge dette til "montering mutter '. Fest en 2x 30 mm deler av L / S14 rør til de to øverste mothaker av Y-kobling og en 3 cm delen av L / S16 rør til bunnen. Fest denne til brodd av 3 mm ID adapter. (Avsnitt 3.2.1) |  | |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | |||
| Y-kobling, piggtråd | Cole Parmer | OU-06295-10 | |||
| L / S16 Silikon rør | Cole Parmer | OU-96410-16 | |||
| L / S14 Silikon rør | Cole Parmer | WZ-96410-14 | |||
| L / S13 Silikon rør | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm for å koble 1,0 mm pigg adapter på Q-serien cap til pumpen karet ing = materøret. | ||
| WM 205U / CA pumpe | Fisher | 1248-6300 | |||
| WM pumpe rør, PVC, blå-orange, 0,25 mm boring | Fisher | 12416310 | PTFE gjengene av den mannlige adapter og koble den kvinnelige adapter. Arbeider pumpen slangen over en av mothakene. Gjenta dette oppsett i den andre enden av slangen. (Avsnitt 3.2.1) |  | |
| Adapter, Male, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, Kvinne, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | |||
| 3.2.2 | Kvinne Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port endestykker. | blefig4.jpg "/>  |
| L / S13 Silikon rør | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm delen for å montere pumpen slangen til en modulkontakten. | ||
| L / S16 Silikon rør | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm L / S16 montert 3x reduksjonsgir = modulkontakter. (Avsnitt 3.2.2) | ||
| Barbed redusering 1/8 "x 1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | |||
| 3.2.4 | L / S13 Silikon rør | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm delen for å koble retentat til L / S14 av Y-kontakten på Q-serien cap. |  |
| L / S13 Silikon rør | Cole Parmer | OU-96410-1. 3 | 45 cm avsnitt for å koble den gjennomtrengende til L / S14 av Y-kontakten på Q-serien cap. | ||
| Rett piggtråd union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Festes til enden av L / S13 som vil få kontakt med L / S14 i Y-kobling. | ||
| 3.4.2 | Klemme | VWR | 229-0609 | ||
| 4.3 | 4 mm Silikon rør | Fisher | FB68858 | Brett over en 40 mm seksjon av rør og fest med en strips = Modul endestykke. (§ 4.3) |  |
| Buntebånd | Fisher | 12326377 | |||
| 4.4 | MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | En tilpasning kan bli pålagt å Attach modulene. | |
| 4.5 | Leur Injeksjon port | Thistle Scientific | IB-10820 | Feste endehetten til injeksjonsåpningen. (§ 4.5) | |
| Kvinne Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | |||
| 5 | L-melkesyre kit | Megazyme | K-LATE | ||
| 5 | D-glukose kit | Megazyme | K-Gluc | ||
| 6.2 | Skalpell / micro kniv | InterFocus | 10315-12 | ||
| 7.4.3 | albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 |
Tabell 1. Komponenter i HFB-oppsett.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver oppsett og drift av en hul fiber bioreaktor (HFB) system for pattedyrcellekultur og dens nytte er demonstrert i proliferating hepatocytter cellelinje HepG2 / C3A. Systemet er designet for å passe på sokkelen av en standard inkubator og sin set-up er enkel nok til å bli utført av en kompetent celle biolog kjent med aseptisk teknikk.
Fibrene brukes i forskningssystemet som er beskrevet her er produsert i huset av fase inversjon spin casting (spinning) ved bruk av en ikke-nedbrytbare proprietær polymer. Det er mulig å gjøre fibrene ved spinning fra en rekke materialer som er egnet for cellekulturer, både biologisk nedbrytbare og ikke-nedbrytbare, for eksempel; polykaprolakton (PCL) 27, poly-L-laktid syre (PLLA) 28, poly (melke-ko-glykolsyre) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 og polyetereterketon (PEEK) 13. Hver har ulike egenskaper ennd bør velges basert på behovene i systemet. Kontroller kompatibiliteten av den anvendte fiber med etanolen anvendes i steriliseringstrinn. PLGA er kjent for å mykne med etanol som nødvendiggjør en alternativ behandling, for eksempel antibiotisk / antimykotisk oppløsning 25.
Dimensjonene av glassmoduler som brukes her ble valgt basert på behovene til dagens forskning. Ulike størrelser kan gjøres av noen anerkjente glassblåsing selskap. En vurdering i modulen størrelse er antall celler, som er knyttet til det antall fibre i modulen og sannsynlige strømningshastigheter. Jo flere celler det er i modulen jo høyere strømningshastighetene må være for å opprettholde gode dyrkningsforhold ved utløpsenden av bioreaktoren. Dette vil nå en grense som bestemt tidspunkt, og noen prøving og feiling kan være nødvendig med overvåking av mediaforhold i modulen permeatet. Matematisk modellering kan gi noen innsikt i de nødvendige modul dimensjoner og strømningshastigheter 22.
Dimensjonene på apparatet som anvendes her er utformet for å passe inn i en inkubator hylle. Lengden av røret er diktert av lengden nødvendig for å nå mellom kontaktene samtidig som det tillater tilstrekkelig bevegelse av komponenter for å gi rom for oppsett og operasjon. Hvis tidsforløpet prøvetaking er nødvendig, for eksempel ved overvåkning av medie forhold i modulen permeat deretter injeksjonsporter kan tilsettes til retentatet og permeatet linjer for å lette dette.
En forutsetning for en hvilken som helst cellekultursystem er å holde cellene i live og i de fleste tilfeller vokser. I lys av studier som viser en mer in vivo-lignende fenotype i celler dyrket i 3D kultursystemer virker det også viktig å gi et miljø som etterligner in vivo miljøet støtt av cellene. Dette siste punktet er ofte neglisjert i 2D cellekultur i favør av bekvemmelig denne kulturen systemet tilbyr. Than HFB etterligner in vivo-kapillære nettverk ved å levere næringsstoffer til cellene gjennom hulrommet av fibrene. Avfallsprodukter blir også fjernet fra systemet av den dynamiske strømnings. Dette skaper en in vivo-lignende system for celledyrking og en som etterligner in vivo miljø sett av hepatocytter, noe som gjør dette system et bedre valg i forhold til 2D vevskultur plast for dyrking av disse cellene. Dette bekreftes av det faktum at cellene utskiller 15-ganger mengden av albumin, en viktig leverfunksjon, i det HFB kultursystemet sammenlignet med de som var dyrket på 2D-vevskultur plast.
Mens HFB-systemet er egnet til de fleste om ikke alle forankringsavhengige celletyper, i eksemplet her er for hepatocytter, fordi det er et reelt behov for å være i stand til kultur funksjonell, mer in vivo -lignende hepatocytter for anvendelse i legemiddelutvikling av den farmasøytiske industrien og i kunstige biologiske lever enheter for ekstrastøtteleverpasienter. Behovet for flere funksjonelle celler som strekker seg forbi disse eksemplene, særlig som feltet av regenerativ medisin går inn i en fase av translatorisk arbeid. Fordelene med en mer in vivo-lignende kultur miljø bør ikke bli oversett.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Custom Item. (Section 2) |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
| Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
| PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
| Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 3.0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6 cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm to connect the 1.0 mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
| WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
| WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25 mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Female, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
| Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
| 4 mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
| Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
| D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
| Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
| Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |
References
- Lewis, W. H. Experimental evidence in support of the theory of outgrowth of the axis cylinder. American J Anat. 6 (1), 461-471 (1906).
- Harrison, R. G. The development of peripheral nerve fibers in altered surroundings. Wilhelm Roux Arch Entwickl Mech Org. 30 (2), 15-33 (1910).
- Ding, L., et al. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for Embryonic Stem Cell identity. Cell Stem Cell. 4 (5), 403-415 (2009).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering -In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4), 352-366 (2011).
- Sinden, J. D., Vishnubhatla, I., Muir, K. W. Prospects for stem cell-derived therapy in stroke. Prog Brain Res. 201, 119-167 (2012).
- Ouyang, A., Yang, S. -T. A two-stage perfusion fibrous bed bioreactor system for mass production of embryonic stem cells. Expert Opin Biol Ther. 8 (7), 895-909 (2008).
- Carnachan, R. J., Bokhari, M., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Taloring the morphology of emulsion-templated porous polymers. Soft Matter. 2 (7), 608-616 (2006).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34 (21), 5088-5106 (2013).
- Storm, M. P., Orchard, C. B., Bone, H. K., Chaudhuri, J. B., Welham, M. J. Three-dimensional culture systems for the expansion of pluripotent embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 107 (4), 683-695 (2010).
- Wung, N., Acott, S. M., Tosh, D., Ellis, M. J. Hollow fibre membrane bioreactors for tissue engineering applications. Biotechnol Lett. 36 (12), 2357-2366 (2014).
- Ellis, M., Jarman-Smith, M., Chaudhuri, J. B. Bioreactor systems for tissue engineering: A four-dimensional challenge. Bioreactors for tissue engineering; principles, design and operation. Chaudhuri, J., Al-Rubeai, , Springer. Chapter 1 1-18 (2005).
- Silva, A. I., Mateus, M. Development of a polysulfone hollow fibre vascular bio-artificial pancreas device for in vitro studies. J Biotechnol. 139 (3), 236-249 (2009).
- De Bartolo, L., et al. Human hepatocyte functions in a crossed hollow fiber membrane bioreactor. Biomaterials. 30 (13), 2531-2543 (2009).
- Schmelzer, E., Finoli, A., Nettleship, I., Gerlach, J. C. Long-term three-dimensional perfusion culture of human adult bone marrow mononuclear cells in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 112 (4), 801-810 (2015).
- Tapia, F., et al. Production of high-titer human influenza A virus with adherent and suspension MDKC cells cultured in a single-use hollow fiber bioreactor. Vaccine. 32 (8), 1003-1011 (2014).
- Deng, X., Zhang, G., Shen, C., Yin, J., Meng, Q. Hollow fiber culture accelerates differentiation of Caco-2 cells. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (15), 6943-6955 (2013).
- Schutte, M., et al. Rat primary hepatocytes show enhanced performance and sensitivity to acetaminophen during three-dimensional culture on a polystyrene scaffold designed for routine use. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 475-486 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge. J Anat. 211 (4), 567-576 (2007).
- Vivares, A., et al. Morphological behaviour and metabolic capacity of cryopreserved human primary hepatocytes cultivated in a perfused multiwell device. Xenobiotica. 45 (1), 29-44 (2015).
- Smith, I., et al. Human neural stem cell-derived cultures in three-dimensional substrates form spontaneously functional neuronal networks. J Tissue Eng Regen Med. , Epub ahead of print (2015).
- Davidson, A. J., Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. A theoretical approach to Zonation in a bioartificial liver. Biotechnol Bioeng. 109 (1), 234-243 (2012).
- Mulder, M. The basic principles of membrane technology. 2nd ed. , Kluwer Academic Publishers. Chapter 3 section 4 (1996).
- Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. Poly(lactic-co-glycolic acid) hollow fibre membranes for use as a tissue engineering scaffold. Biotechnol Bioeng. 96 (1), 177-187 (2007).
- Shearer, H., Ellis, M. J., Perera, S. P., Chaudhuri, J. B. Effects of common sterilization methods on the structure and properties of poly(D,L lactic-co-glycolic acid) scaffolds. Tissue Eng. 12 (10), 2717-2727 (2006).
- Forsey, R. W., Chaudhuri, J. B. Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds. Biotechnol Lett. 31 (6), 819-823 (2009).
- Williamson, M. R., Coombes, A. G. A. Gravity spinning of polycaprolactone fibres for applications in tissue engineering. Biomaterials. 25 (3), 459-465 (2004).
- El-Salmawy, A., et al. Preparation and properties of pronectin F-coated biodegradable hollow fibres. J Artif Organs. 8 (4), 245-251 (2005).
- Meneghello, G., et al. Fabrication and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid)/polyvinyl alcohol blended hollow fibre membranes for tissue engineering applications. J Memb Sci. 344 (1-2), 55-61 (2009).
