Summary
Funktionelle respons af celler i kultur kan forbedres ved dyrkning i mere in vivo-lignende 3-dimensionelle kultur miljøer 16-21. Dette håndskrift beskriver opsætning og drift af en hul fiber bioreaktor-system til in vivo-lignende pattedyr vævskultur.
Introduction
Vævskultur er en etableret teknik til vækst og / eller opretholdelse af celler, der er blevet anvendt i over 100 år 1,2. Bekvemmeligheden ved studerer celler og reaktioner ex vivo har vidtrækkende fordele tillader eksperimenter, der ellers ville være yderst udfordrende, hvis ikke umuligt, for eksempel dannelsen af genetisk konstruerede cellelinier, og anvendelsen af reporter-celler i højt gennemløb screeningsassays 3. For nylig vævskultur har givet anledning til området for tissue engineering, til frembringelse af in vitro-modeller og til regenerativ medicin. Med disse programmer, har interesse i dynamiske 3-dimensional (3D) dyrkningssystemer vokset betydeligt.
3D dyrkningsmetoder (defineret her som en 3D-kultur substrat og / eller indførelse af retningsbestemt dynamisk flow) bedre rekapitulere arkitektur in vivo cellulære miljø, vigtigt for at opnå enmere fysiologisk-lignende funktion. Evnen til at udtrække, vokse, differentiere og transplantation celler med det formål at reparere sygt og beskadiget væv er et fagområde, der har et stort potentiale for patient gavn og kommercielle muligheder. For eksempel brugen af autologe keratinocytter til behandling forbrændinger (se 4) og anvendelse af cellebaserede behandlingsformer til behandlingen af slagtilfælde (se 5). Ligeledes markedet for in vitro-modeller spænder lægemiddelforskning til stratificeret medicin applikationer. Konventionen i vævskultur er væksten af adhærente eller forankringsafhængige celletyper på 2-dimensional (2D) overflade af en vævsdyrkningskolbe. Mens øjeblikket accepteret som den gyldne standard i et forskningsmiljø, har nylige interesse i væv ingeniørmæssige anvendelser understregede, at nuværende 2D vævskultur miljø er utilstrækkelig til den nødvendige opskalering i celle produktion 6.
For vedhængende celletyper en scaffold er påkrævet, som vil variere afhængigt af slutanvendelsen, både med hensyn til den kemiske sammensætning og de mekaniske egenskaber. Nogle systemer anvender stilladser samt-plade indsatser, der består af meget porøs matrix dannet af stor indre fase emulsion templating (se 7) eller elektrospundne fibre (se 8) kræver minimum tilpasning fra konventionelle 2D kultur teknikker. Celler kan podes på mikrobærere af varierende kompositioner og dyrkes i omrørte tanke, der leverer næringsstoffer og signalmolekyler, og bære væk affaldsprodukter (masse transport) gennem en dynamisk godt blandet miljø 9. Men disse systemer begrænset i deres in vivo-lignende miljø, og kan foretages yderligere forbedringer med hensyn til at skalere op omkostninger. Hul fiber bioreaktorer (HFBs) er et 3D kultur, der består af fibre, der er fastsat i et modul med celler typisk podet på ydersiden af de porøse fibre og medier, der leveres gennem fiberen lumen (gennemgået i 10) (figur 1). HFBs tilbyde en in vivo-lignende miljø med fibrene efterligner blodkapillærer og afskærmning af cellerne fra de forskydningsspændinger, der er forbundet med dynamisk medier levering, samtidig med at defineret forskydning, der skal anvendes til celler de via fluidstrømning gennem sideporte hvis det ønskes. Dette skaber en alsidig dyrkningssystem med overlegen stoftransport i hvor høj celledensiteter kan nås 11. Den HFB system er velegnet til opretholdelse af forankringsafhængige celletyper og er blevet anvendt til at dyrke en række celler, herunder rotte pancreas-øer af Langerhans 12, muse β-TC-3 insulinoma cellelinie 12, primære humane hepatocytter 13, human knogle marv mononukleære celler 14, Madin Darby nyreceller fra hund (MDCK) 15 og Caco-2 celler 16 at nævne nogle få.
Ud over systemet fordele ved massetransport og opskalering, celler dyrket i 3D tissagsøge kultur systemer tendens til at være mere in vivo-lignende i morfologi og mere lydhøre over for eksperimentelle signaler. For eksempel rotte primære hepatocytter viser en mere terningformet morfologi, øget levedygtighed, større induktion af cytochrom-P450-enzymaktivitet og forøget følsomhed over for paracetamol toksicitet ved dyrkning i et kommercielt tilgængeligt polystyren stillads sammenlignet med celler dyrket i 2D kultur 17. Under anvendelse af samme stillads den leverkarcinom HepG2 har også vist sig at øge albumin produktionen 18 og viser en mere in vivo-lignende respons på methotrexat sammenlignet med 2D dyrkede celler 19. Primære humane hepatocytter viste forsinket dedifferentiering, højere cytochrom-P450-aktivitet og øget clearance til 4/5 testede forbindelser i et perfusion kultur 20. Humane neurale stamceller afledte neuroner og glia dyrket i en kommercielt tilgængelig polystyren stillads udstillet både høj (aktionspotentiale) og lav-frequeNCY (lokal felt potentielle) spontan aktivitet mens ingen neuronal aktivitet blev påvist i 2D dyrkede celler 21. Caco-2-celler vist bedre differentiering i en HFB forhold til 2D kultur målt ved forhøjet alkalisk phosphatase, γ-glutamyltransferase og P-glycoprotein aktivitet og højere ekspression af F-actin og zona occludens-1 protein 16. Til trods for fordelene, rutinen dyrkning af celler i andre end en 2D vævskulturkolbe overflade systemer stadig ikke praktiseres i mange laboratorier, selv om antallet af publikationer, der citerer 3D cellekultur vokser (8 gange stigning i de sidste 10 år. Kilde : PubMed 'resultater efter Year' værktøj sonderet med '3D kultur «).
Dette håndskrift beskriver opsætning og driftsbetingelser af et HFB system til pattedyr celle kultur og viser sin nytte i at dyrke hepatocarcinoma HepG2 / C3A. Formålet med denne metode er at dyrke cellerne ien mere in vivo-lignende kultur, der bevarer nok enkelthed til at gøre det modtagelig for dem, der er nye til 3D dyrkningssystemer. Rationalet bag ved hjælp HFBs i ansøgningen beskrive her, som er at forbedre forudsigeligheden af leveren modeller er, at det er teoretisk muligt at efterligne en hepatisk sinusoid i HFB miljø 22. Dette er ikke i øjeblikket er muligt med andre dyrkningssystemer.
Protocol
1. Fibre
- Fremstilling fibrene ved fase inversion spin-støbning (spinning). Nærmere oplysninger om denne metode kan findes i 23,24.
BEMÆRK: For dette arbejde fibrene er fremstillet in-house under anvendelse af en ikke-bionedbrydelig proprietære polymer, NMP som opløsningsmiddel og H2O som ikke-opløsningsmidlet. Nærmere oplysninger om andre egnede polymerer kan findes i diskussionen. De anvendes i systemet beskrevet her fibre er 1.05mm ydre diameter med en 600-700 um lumen diameter. Fibrene er porøse med porediametre måler 2,28 um ± 1,5 um (middelværdi ± standardafvigelse). Dette er designet til at separere cellerne fra mediet foder i fiber lumen, replikerende leveren sinusoid eller vaskulaturen af andre væv. Fibre kan også købes fra membran leverandører som Pall.
2. Modul Fabrication
BEMÆRK: Modulerne anvendt i denne undersøgelse, er fremstillet af 1 mm tyk borosilikatglas med 2 sideporte(Figur 2A). Fibrene i modulet beskrives her have en ydre overfladeareal på 4,95 cm2, som svarer til omkring halvdelen af en brønd i en 6-brønds plade.
- Siliconize moduler før første anvendelse ved at overtrække den indre overflade med Sigmacote (tabel 1) og gør det muligt at tørre i et stinkskab. Autoklave (121 ° C, 1 atm, 20 min) for at øge levetiden for behandlingen.
- Ved hjælp af en skalpel skåret 75 mm lange fibre og indsætte tre fibre i hvert modul forlader ~ 7 mm overskydende længde ved hver ende (figur 3A).
- Sted ~ 0,5 ml silikone lim (tabel 1) i en vejebåd. Brug en P200 pipette tip at afhente en lille mængde silikone og arbejde limen ind i enderne af modulet omkring fibrene for at danne en 3-5 mm stik (figur 3B). Lad det tørre i> 3 timer.
- Ved hjælp af en skalpel skæres silicone flugter med glas modul ender (figur 3C).
- Wrap enlille mængde (~ 4 lag) af polytetrafluorethylen (PTFE) bånd omkring en sideåbning.
3. Systemopsætning og Sterilisation
BEMÆRK: Pump slanger og moduler med fibre ikke autoklaveres og er steriliseret ved hjælp af 70% ethanol. Forfatterne anbefaler kalibrering af pumpens rør, med pumpen skal anvendes. Proceduren nedenfor udføres i et stinkskab med sideværts luftstrømning.
- Autoklave (som afsnit 2.1) alle autoklaverbare komponenter før opsætning.
- Opsætning
- Placer 10 ml 70% ethanol i reservoiret flasken og opsætning reservoiret flasken, Q-serien cap, føderør, pumpe og pumpe rør (tabel 1) som i figur 4.
- Løst placere et endedæksel over PTFE-tapede sideåbning. Skub enderne af L / S16 modul stik over modulets ender og fri sideåbning. Tilslut en sektion af L / S13 slange til modulet stikket nærmest udjævnede sideporten (tabel 1) 40 mm som i figur 2B
- Tilslut modulet til pumpen slanger, sikrer at orientere modulet så den udjævnede sideporten er nærmest pumpen.
- Tilslut permeatledningen og retentat linje til modulet stik og L / S14 af Y-konnektoren på reservoiret flaske (tabel 1). Sørg for, at set-up ligner skemaer i figur 4.
- sterilisation
- Pump ethanol gennem modulet ved 800 ul / time (267 pi / time pr fiber) for tilstrækkelig tid til at behandle unautoclaved komponenter til> 30 minutter (justere gange, hvis der anvendes andre steriliserende metoder, se 25).
- Vask
- At vaske ethanol ud af systemet, først slukke for pumpen og dræne slangen. Først afmontere pumpen slange fra modulet adapter slange. Hold modulet aloft at dræne ethanol ud af fibre og retentat linje, tilbage til reservoiret flasken. Fjern sideporten endedækslet fra modulet til at dræne the ethanol fra selve modulet, og permeatledningen. Sæt den side porten endedæksel. Vende strømmen af medier på pumpen at dræne pumpens rør og tilførselsledningen ethanol. Sluk for pumpen, og sæt pumpen slange til modulet adapter.
- Skru ethanol flaske fra låget og erstatte med en flaske indeholdende 10 ml cellevækst medium (såsom EMEM, GMEM, DMEM eller RPMI) uden serum. Pump mediet gennem systemet ved 800 pl / time, indtil retentatet linje er fuld af medier. Klemme retentatet linje for at tvinge gennemtrængning af mediet gennem fibrene for at vaske modulet. Vask i ~ 2 timer.
4. Seeding
BEMÆRK: Medierne og kosttilskud, der anvendes i denne protokol bør være dem, der er fastlagt for den ønskede celletype. Der henvises til litteraturen, den europæiske Collection of Cell Cultures (ECACC) og American Type Culture Collection (ATCC) for yderligere oplysninger. Forud for denne metode celler bør være maintained ifølge etablerede protokoller for den ønskede celletype. Til dette arbejde hepatocarcinoma HepG2 / C3A subklonen blev fastholdt efter den distributører henstillinger (ATCC).
BEMÆRK: seeding protokol nedenfor også tjener til at pre-kultur modulet med celledyrkningsmediet før cellevækst. Skulle en mere omfattende pre-kultur kræves så dette bør udføres før såning modulet ved at dræne vask medier fra systemet, der erstatter med vækstmedier og gennemtrænger dette gennem modulet for få timer. Se afsnit 7.5.2.1 for detaljer om at erstatte medier i systemet.
- Der fremstilles en enkelt cellesuspension ved trypsinisering ifølge etablerede protokoller for den ønskede celletype. En generel protokol for en T75 kultur er som følger:
BEMÆRK: Antallet af celler til brug i seeding skridt bør bestemmes empirisk for den ønskede celletype. De her beskrevne bioreaktorer podes på en 35-fold højere cells densitet (celle / cm2) end anvendt i 2D vævskulturplast for en 7 dages kultur.- Vask cellerne ved tilsætning af 10 ml phosphatbufret saltvand (PBS), aspirat, hvorefter der tilsættes 3 ml 0,05% trypsin ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (nok til at dække cellerne) og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 5 minutter.
- Harvest celler i 7 ml vækstmedier suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) for at neutralisere trypsin. Bland godt, tilsæt 10 pi til kammeret af et hæmocytometer og tælle cellerne.
- Centrifuger ved 200 xg i 5 min for at pelletere cellerne.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellerne ved 4x10 6 / ml i vækstmedier suppleres efter behov for den ønskede celletype.
- Sluk for pumpen og dræne foderrøret og modul som i 3.4.1.
- Tag modulet fra modulet stik og vedhæfte modul endedæksler (tabel 1) præ-steriliserede i 70% ethanol, der forlader en side port fri. </ Li>
- Overfør ~ 500 pi af cellesuspensionen (2x10 6 celler) (4.1.4) til modulet ved hjælp af en 18 G nål og 1 ml sprøjte, skal undgås bobledannelse og for ikke at beskadige fibrene.
- Cap sideåbningen ved anvendelse af en endehætte. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 i 2-4 timer med manuel drejning af modulet ved 180 ° hver 5 min. Alternativt modulerne kan fastgøres til et rør rotator med en intermitterende blanding indstilling (tabel 1).
- Efter podning, vedhæfte et endedæksel på en injektionsport (tabel 1) præ-steriliseret i 70% ethanol, og vedhæfte denne til PTFE-tapede sideåbning. Fjern den anden side port endedæksel og langsomt dræne cellerne ved at injicere luft ind i vedlagte injektionsporten under anvendelse af en 27 G nål og 1 ml sprøjte.
- Erstat injektionsporten med en endehætte. Fyld langsomt modul med medier, der bruger den frie sideporten og en 18 G nål med en 1 ml sprøjte. remove modulet endestykker og fastgør modulet til slangen ved hjælp af modulet stik.
- Udskift vask medier flaske med en, der indeholder 50 ml vækstmedier og kosttilskud efter proceduren i 7.5.2.1. Pump vækstmediet gennem systemet ved 800 pl / time.
5. Proliferation
BEMÆRK: De anvendte i forskningssystemet her beskrevne fibre er indstillet til at trænge på ~ 80 pi / t, med en 800 gl / time tilspænding.
- Brug fibrene at dyrke cellerne i perioder på op til 7 dage i en befugtet inkubator indstillet til 37 ° C, 5% CO2.
BEMÆRK: Overvågning af næringsstoffer og metabolitter i vækstfasen kan give nyttige oplysninger om spredning, metabolisk optagelse og output af cellerne og næringsstoffer og metabolitter i medierne. For eksempel glucose brug og lactat produktion. Kits er tilgængelige fra forskellige leverandører, der kan kvantificere disse faktorer fra medier (se
6. Excision
BEMÆRK: Fibre kan udskæres fra modulet ved slutningen af et eksperiment til analyse.
- Træk stikket og dræne HFB.
- Indsæt en skalpel / micro kniv (tabel 1) klinge mellem glasset og silikone. Vend modulet således at der skæres væk siliconen fra glasset. Gentag denne procedure i begge ender af modulet.
- Brug af bladet krog ud silikone stik fra den ene ende og træk forsigtigt. Sørg for, at fibrene kommer med det. 7. Cell Analyse
- celleantal
BEMÆRK: C3a celler, der anvendes i denne undersøgelse nogen tidspunkter i vækstperioden 7 dage er egnet til brug i denne beregning som vækstrater ikke væsentligt ændre sig over de celledensiteter opnået i denne tidsramme.- Efter udskæring (afsnit 6) dyppe fibrene i PBS for at vaske og skære dem i et 1,5 ml rør indeholdende 0,5 ml Tris EDTA (TE) buffer. Underkaste dette til to fryse-tø-cykler i en -80 ° C fryser. Mål DNA-indholdet ved hjælp PicoGreen og bestemme celletal ved at sammenligne denne værdi med en standardkurve fremstillet med den ønskede celletype 26.
- Celleproliferation satser
- Brug af celle tal opgjort på to forskellige tidspunkter beregne den specifikke væksthastighed μ (ligning 1), hvor Ln (X1) er den naturlige logaritme af cellen nummer på det første tidspunkt og Ln (X2) er den naturlige logaritme af cellen nummer på det andet tidspunkt.
μ = (Ln (X2) -ln (X1)) / tid (hr) (1)
Fra denne beregne befolkningen fordobling gange (DT) (ligning 2), hvor μ er den specifikke vækstrate.
dT = LN2 / μ (2)
- Brug af celle tal opgjort på to forskellige tidspunkter beregne den specifikke væksthastighed μ (ligning 1), hvor Ln (X1) er den naturlige logaritme af cellen nummer på det første tidspunkt og Ln (X2) er den naturlige logaritme af cellen nummer på det andet tidspunkt.
- cellelevedygtighed
- Efter udskæring (afsnit 6) dyppe fibrene i PBS for at vaske og skære dem i et 1,5 ml rør indeholdende 500 pi 0,05% trypsin ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Der inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
- Blandes og tilsættes 10 pi cellesuspension til 10 pi trypanblåt. Load 10 pi onto et hæmocytometer og tælle antallet af døde (blå) og levende celler.
- Imaging
- Efter udskæring dyppe fibrene i PBS for at vaske og bruge en saks til at skære dem i mindre længder i en plade med 24 brønde. Tilsæt 400 pi 4% paraformaldehyd (i PBS) og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Vask med PBS ved pipettering 400 pi til og fra. Gentag this trin med frisk PBS.
- Tilsæt 400 pi 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndet i PBS til ca. 100 ng / ml og inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. Beskyttes mod lys.
- Vask med PBS to gange (som 7.3.2) og en gang med H 2 O. Tilføj en Fluorescensmonteringsmedium at dække fiber og billedet straks at indsamle data, før prøverne tørre (DAPI ex / em, 359/461 nm).
- Tag billeder ved forskellige fokale planer og bruge 'fokus stabling' software (f.eks stack focuser plugin til ImageJ, nedenfor) for at gøre et sammensat billede, der viser en stærkt udvidet dybdeskarphed. Dette er nødvendigt som fibrene ikke er flade.
- Hent ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) og »stack-focuser 'plugin (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html).
- I ImageJ åbne billeder, der skal stables. Så i menuen 'Billede' gå til 'Stakke' - 'billeder til Stack'. I "plugins 'i menuen gå til' Stak Focuser'. Angiv en n for nxn kerne. Trial and error med "n" kan være påkrævet for at generere et billede med lidt "støj". Værdier mellem 11 & 77 tendens til at arbejde godt.
- albuminsekretion
BEMÆRK: Dette er en hepatocyt celle funktionstest og ikke en generel test af celle funktion.- Seed celler (HepG2 / C3A) på 2D vævskulturplast på 10,667 / cm2 og dyrket i 6 dage. Seed HFBs som beskrevet i afsnit 4 og vokse i 6 dage.
- Efter denne spredning periode ændre dyrkningsmedierne (EMEM + 10% FBS, 1x glutamin & 1x penicillin / streptomycin) til vævskulturplast og HFB til en serumfrit Williams E medium suppleret med 1x glutamin og 1 x penicillin / streptomycin i 24 timer:
- Tøm slanger og HFB modul følge trinene, der er fastsat i 3.4.1. Skru reservoir flasken og erstatte dette med en flaske, der indeholder Williams E medier. Pump dette gennem HFB 800 pl / time.
- Efter 24 timer, tage medieprøver. Kvantificere udskilt albumin ved ELISA i overensstemmelse med producentens instruktioner (tabel 1). Fortynd medieprøver 1 i 10 til 1 i 40 før anvendelse for at bringe albuminkoncentrationer inden for området af standardkurven.
Representative Results
Cellepodning er et kritisk trin. Cellers evne til at adhærere til fiberen i en 3D opsætning er betydeligt mindre end den, der ses for 2D vævsdyrkningsplastic. Dette skyldes sandsynligvis den reducerede kontakttid mellem celle og substrat. I HFB cellerne falder gennem modulet i de statiske faser af podning. Disse er betydelig kortere i tid i forhold til den ene kontinuerlige statiske fase, der anvendes i 2D. Celler er nødt til at gøre forbindelser til substratet i denne tid. Derudover, på grund af den buede natur af fibrene er der ingen plan overflade for cellerne at hvile og skabe forbindelser, som der er i 2D kultur. Mens dette kan forværres af kemien af fiberen anvendte vi ved dette ikke at være tilfældet for polymeren anvendt i denne undersøgelse (data ikke vist). Forøgelse af seeding tid og cellepodning densitet fører til dannelsen af celleaggregater, der falder gennem modulet i de statiske faser i et hurtigere rspiste end enkeltceller og reducerer yderligere kontakttiden mellem celler og substrat. Øge tiden også fører til gulfarvning af medierne, da der er en høj tæthed af celler og ingen udveksling medier under dette trin. Brug de betingelser, der er beskrevet i afsnit 4 celle seeding satser på ~ 15% er konsekvent opnået med HepG2 / C3A celler (figur 5A). Mens dette kan betragtes som en lav fraktion der er nok celler til at generere godt befolkede fibre i løbet af få dage (figur 5B og 6); efter en syv-dages proliferation periode celledensiteten nåede i HFB nærmer 3x10 5 / cm2. Dette er en passende densitet for mange assays udnytter hepatocytter og kan anses at have nået konfluens.
De opformeringsrater opnået i HFB er langsommere i forhold til hvad der opnås i 2D cellekultur (figur 5C). Dette er unsandsynligvis på grund af tab af celler i den dynamiske strømning af systemet som celletal i medierne er lav (gennemsnit ± SEM: 20,343 celler ± 3.674 celler pr 24 timer ved konfluens, hvilket er 4% af de totale celler), og denne øges ikke, når permeationshastigheden er skruet op til 400 gl / time (data ikke vist). Det er også usandsynligt at skyldes et fald i levedygtighed og efterfølgende tab af celler (se figur 5D og nedenfor). Det kan forklares, i det mindste delvist af, denne cellelinie blev afledt ved kloning fra HepG2 og udvælges på dets evne til at vise kontaktinhibering af celleproliferation. Cellerne i HFB podes med 6x densiteten af 2D celler, som kan føre til en langsommere opformeringsrater.
Levedygtighed fortsat høj i hele HFB med celler udviser> 90%. Mens der er et lille fald i levedygtighed ved udløbsenden forhold til indløbet dette ikke fandtes at være signifikant (t-test p = 0,22).
Overvågning af glucose forbrug og mælkesyre produktion er blevet anvendt til at tune medierne tilspænding og medier volumen i systemet. Brug af 800 pl / time og et totalt volumen på 50 ml medie glucosen og mælkesyre niveauer opretholdes over og under (henholdsvis) dem, der ses i standard vævsdyrkningsplastic kultur.
Albuminsekretion er en vigtig leverfunktion udført af hepatocytter. Det udskilles i serum, hvor det spiller flere roller i transport og homeostase. Albumin-sekretion fra celler dyrket i HFB er 15 gange højere end den, celler dyrket på 2D (figur 7). Dette viser cellerne er funktionel i den HFB og mindst i tilfældet med albumin sekretion er denne funktion forhøjet i HFB.
jpg "/>
Figur 1. In vivo-lignende miljø i en HFB. Celler podes på ydersiden af de porøse fibre. Media er leveret gennem fiber lumen, efterligne en blod kapillær. (A) længdesnit af en fiber (ikke målfast). (B) Tværsnit af en 3 fiber reaktor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. HFB-modulet. (A) Dimensionerne af modulet anvendt i denne undersøgelse. Dimensionerne blev valgt til at passe 3 fibre og opfylder behovene i den aktuelle forskningsprojekt. Forskellige størrelser kan fremstilles og skræddersyet til de enkelte systemer og fibre. (B) Et fotografi af modul med vedhæftede ende cap og modul-stik. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Modul fabrikation. (A) Fibre tilskæres og indsættes i modulet. (B) fibre er limet ind i modulet, lov til at tørre. (C) Enderne skæres flugter med glasset. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. HFB-system set-up. Pile angiver retningen af mediernes flow. Rød = føderøret. Gul = pumpe tuvære. Hvid = HFB modul. Grøn = retentat rør med klemme. Blå = gennemsyrer rør. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Seeding, proliferation, levedygtighed og biokemiske analyser. (A) Procent af celler podet. Sorte diamanter repræsenterer individuelle HFBs. Den røde bar er middelværdien. (B) Celler massefylder ved podning, og efter en 7 dages proliferation periode. 2D celleantal blev bestemt ved trypsinisering og tælling under anvendelse af et hæmocytometer. HFB celleantal bestemtes under anvendelse af PicoGreen assay og en standardkurve fremstillet af C3a celler 26. n = 5-6. Bars = SEM. (C) Population fordoblingstider. n = 5-7. Bars = SEM. (D) Levedygtighed bestemt ved Trypen blå-udelukkelse i slutningen af en 7 dages proliferation. Inlet, centrale og udløb repræsenterer regioner i HFB. n = 3-5. Bars = SEM. (E & F) Glucose forbrug og mælkesyre-produktion. Niveauer blev overvåget ved reservoiret flaske (indgang) samt retentatet og permeat forretninger og compered til rutinemæssig dyrkning på vævsdyrkningsplast (media ændret på dag 3 og 5). n = 3-5. Bars = SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Billeder af celler dyrket på fibre i et HFB. Celler blev podet og dyrket i 48 timer, før fibrene blev udskåret, vasket i PBS, fikseret i 4% paraformaldehyd, vasket i PBS og kerner farvet med DAPI. Hvert billede er en komposit af 12 fokus stablet 'imaGES for at øge dybden af området for det resulterende billede. Områder med højere og lavere celledensitet findes langs fiberen på dette tidspunkt og er vist. Hvor nuværende fiber grænser er angivet med en rød stiplet linje. Billeder blev taget på en inverteret fluorescens mikroskop. Image = 10X objektiv. Bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Albumin sekretion. Celler blev podet på vævskulturplast på 10,667 / cm2 og i HFB som beskrevet i afsnit 4. Celler blev spredt i 6 dage. Efter denne proliferation periode vævskulturplast og HFB dyrkningsmedier blev ændret for et serumfrit Williams E medium suppleret med glutamin og penicillin / streptomycin i 24 timer. Medier blev udtaget og en albumin kvantificeret ved ELISA ifølge producentens instruktioner (tabel 1). n = 5-6. Bars = SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Sektion | Navn på udstyr | Selskab | Kat. Ingen. | Noter | Billeder |
| 2 | Glas HFB Module | Soham Scientific | --- | Tilpasset Item. | |
| 2.1 | Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | ||
| 2.3 | Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicen lim. | |
| 2.5 | PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | ||
| 3.2.1 | Reservoir flaske | Fisher | 11972619 | ||
| Q-serien cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE skruegevind adapterne og montering møtrik. Fastgør til Q-serien cap. Vedhæfte en 8,5 cm sektion af den tilførte PTFE-slange under 1 mm adapter og en 4 cm sektion under 3 mm adapter. |  | |
| Adapter, Mand, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, Mand, 3,0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | |||
| montering Nut | Kinesis | U-350 | |||
| Neopren slange | Fisher | 10366344 | Fastgør Hepa filter til 6 cm neopren slange og vedhæfte denne til 'montering møtrik'. Vedhæft en 2x 30 afsnit af L / S14 slanger mm til de to øverste modhager af Y-stik og en 3 cm afsnit af L / S16 slange til bunden. Vedhæfte denne til modhagen af 3 mm ID adapter. (Afsnit 3.2.1) |  | |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | |||
| Y-stik, pigtråd | Cole Parmer | OU-06.295-10 | |||
| L / S16 Silicone slange | Cole Parmer | OU-96.410-16 | |||
| L / S14 Silicone slange | Cole Parmer | WZ-96.410-14 | |||
| L / S13 Silicone slange | Cole Parmer | OU-96.410-13 | 80 cm til at forbinde 1,0 mm pigtråd adapter på Q-serien hætte til pumpen karbad ing = føderøret. | ||
| WM 205u / CA pumpe | Fisher | 1248-6300 | |||
| WM pumpe slanger, PVC, blå-orange, 0,25 mm boring | Fisher | 12416310 | PTFE gevindet af den mandlige adapter og tilslut den kvindelige adapter. Arbejde pumpen slange over en af modhagerne. Gentag denne opsætning i den anden ende af røret. (Afsnit 3.2.1) |  | |
| Adapter, Mand, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, kvinde, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | |||
| 3.2.2 | Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45.508-64 | Side port endestykker. | blefig4.jpg "/>  |
| L / S13 Silicone slange | Cole Parmer | OU-96.410-13 | 40 mm sektion til at forbinde pumpen slangen til et modul stik. | ||
| L / S16 Silicone slange | Cole Parmer | OU-96.410-16 | 3x 30 mm L / S16 monteret til 3x reduktionsgear = modul stik. (Afsnit 3.2.2) | ||
| Barbed reducer 1/8 "x 1/16" | Cole Parmer | 30.616-43 | |||
| 3.2.4 | L / S13 Silicone slange | Cole Parmer | OU-96.410-13 | 55 cm afsnit til at tilslutte retentatet til L / S14 af Y-konnektoren på Q-serien cap. |  |
| L / S13 Silicone slange | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm afsnit til at tilslutte permeatet til L / S14 af Y-konnektoren på Q-serien cap. | ||
| Lige pigtråd union | Cole Parmer | WZ-30.612-43 | Fastgør til slutningen af L / S13, der vil forbinde med L / S14 af Y-stik. | ||
| 3.4.2 | Klemme | VWR | 229-0609 | ||
| 4.3 | 4 mm Silicone slange | Fisher | FB68858 | Fold over en sektion af slange 40 mm og sikres med en kabelbinder = Modul endekappe. (Afsnit 4.3) |  |
| kabelbinder | Fisher | 12326377 | |||
| 4.4 | MACSmix rør rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | En tilpasning kan være nødvendigt at Attach modulerne. | |
| 4,5 | Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Fastgør endehætten til injektionsporten. (Afsnit 4.5) | |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45.508-64 | |||
| 5 | L-mælkesyre kit | Megazyme | K-SENT | ||
| 5 | D-glucose kit | Megazyme | K-gluc | ||
| 6.2 | Skalpel / micro kniv | Interfocus | 10.315-12 | ||
| 7.4.3 | Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 |
Tabel 1. Komponenter i HFB set-up.
Discussion
Dette håndskrift beskriver opsætning og drift af en hul fiber bioreaktor (HFB) system til pattedyr celle kultur og dens anvendelighed demonstreres i prolifererende hepatocytsuspensionen HepG2 / C3A. Systemet er designet til at passe ind på hylden for en standard inkubator og dens opbygning er enkel nok til at udføres af en kompetent celle biolog fortrolig med aseptisk teknik.
De anvendes i forskningssystemet her beskrevne fibre fremstilles i huset ved faseinversion spin-støbning (spinning) ved hjælp af en ikke-biologisk nedbrydelig proprietære polymer. Det er muligt at lave fibre ved spinding fra en række materialer, der er egnede til celledyrkning, både bionedbrydelige og ikke-bionedbrydelige, f.eks; polycaprolacton (PCL) 27, poly-L-lactid acid (PLLA) 28, poly (mælke-co-glycolsyre) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 og polyetheretherketon (PEEK) 13. Hver har forskellige egenskaber ennd bør vælges baseret på de behov af systemet. Tjek kompatibiliteten af de beskæftigede fiber med ethanol anvendes i sterilisering trin. PLGA er kendt for at blødgøre med ethanol nødvendiggør en alternativ behandling såsom antibiotika / antimykotisk løsning 25.
Dimensionerne af glasset moduler, der bruges her blev valgt baseret på behovene for den aktuelle forskning. Forskellige størrelser kan foretages af enhver velansete glasblæsning selskab. En overvejelse i modul størrelse er antallet af celler, som er forbundet med antallet af fibre i modulet og sandsynlige strømningshastigheder. Jo flere celler, der er i modulet den højere strømningshastighederne skal være for at fastholde gunstige dyrkningsbetingelser ved udstrømningsenden af bioreaktoren. Dette vil nå en grænse et tidspunkt, og nogle trial and error kan være påkrævet med overvågning af medieforhold i modulet permeat. Matematisk modellering kan give nogle indsigt i de nødvendige modul dimemelser og flowhastigheder 22.
Dimensionerne af apparatet bruges her er udformet til at passe på en inkubator hylde. Længden af slangen er dikteret af længden er nødvendig for at nå op på mellem stikkene samtidig tillader nok bevægelse af komponenter for at give mulighed for opsætning og drift. Hvis tidsforløbet prøveudtagning er påkrævet, for eksempel ved overvågning af medieforhold i modulet permeat derefter injektionsporte kan tilsættes til retentatet og permeat linjer for at lette dette.
En forudsætning for et cellekultursystem er at holde cellerne i live og i de fleste tilfælde vokser. I lyset af undersøgelser, der viser en mere in vivo-lignende fænotype i celler dyrket i 3D dyrkningssystemer synes det også vigtigt at skabe et miljø, der nøje efterligner in vivo miljø støder cellerne. Dette sidste punkt er ofte overset i 2D cellekultur til fordel for bekvemmelighed denne kultur system tilbyder. Than HFB efterligner in vivo kapillære netværk ved at levere næringsstoffer til cellerne gennem lumenet af fibre. Spildprodukterne også fjernes fra systemet med den dynamiske flow. Dette skaber en in vivo-lignende system til celledyrkning og en, der nøje efterligner in vivo-miljø set af hepatocytter, hvilket gør dette system et bedre valg i forhold til 2D vævskulturplast til dyrkning af disse celler. Dette bekræftes af det faktum, at cellerne udskiller 15 gange mængden af albumin, en vigtig leverfunktion, i HFB kultur-systemet i forhold til dem, der dyrkes på 2D vævskultur plast.
Mens HFB systemet er velegnet til de fleste, hvis ikke alle forankringsafhængige celletyper, eksemplet her er for hepatocytter, fordi der er et reelt behov for at kunne kultur funktionel, mere in vivo-lignende hepatocytter til brug i lægemiddeludvikling fra medicinalindustrien og i biosyntetiske lever indretninger til ekstrakorporal støtteaf leversvigt patienter. Behovet for flere funktionelle celler strækker sig ud over disse eksempler, især da området regenerativ medicin går ind i en fase af translationel arbejde. Fordelene ved en mere in vivo-lignende kultur miljø ikke bør overses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Custom Item. (Section 2) |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
| Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
| PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
| Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 3.0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6 cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm to connect the 1.0 mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
| WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
| WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25 mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Female, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
| Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
| 4 mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
| Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
| D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
| Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
| Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |
References
- Lewis, W. H. Experimental evidence in support of the theory of outgrowth of the axis cylinder. American J Anat. 6 (1), 461-471 (1906).
- Harrison, R. G. The development of peripheral nerve fibers in altered surroundings. Wilhelm Roux Arch Entwickl Mech Org. 30 (2), 15-33 (1910).
- Ding, L., et al. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for Embryonic Stem Cell identity. Cell Stem Cell. 4 (5), 403-415 (2009).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering -In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4), 352-366 (2011).
- Sinden, J. D., Vishnubhatla, I., Muir, K. W. Prospects for stem cell-derived therapy in stroke. Prog Brain Res. 201, 119-167 (2012).
- Ouyang, A., Yang, S. -T. A two-stage perfusion fibrous bed bioreactor system for mass production of embryonic stem cells. Expert Opin Biol Ther. 8 (7), 895-909 (2008).
- Carnachan, R. J., Bokhari, M., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Taloring the morphology of emulsion-templated porous polymers. Soft Matter. 2 (7), 608-616 (2006).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34 (21), 5088-5106 (2013).
- Storm, M. P., Orchard, C. B., Bone, H. K., Chaudhuri, J. B., Welham, M. J. Three-dimensional culture systems for the expansion of pluripotent embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 107 (4), 683-695 (2010).
- Wung, N., Acott, S. M., Tosh, D., Ellis, M. J. Hollow fibre membrane bioreactors for tissue engineering applications. Biotechnol Lett. 36 (12), 2357-2366 (2014).
- Ellis, M., Jarman-Smith, M., Chaudhuri, J. B. Bioreactor systems for tissue engineering: A four-dimensional challenge. Bioreactors for tissue engineering; principles, design and operation. Chaudhuri, J., Al-Rubeai, , Springer. Chapter 1 1-18 (2005).
- Silva, A. I., Mateus, M. Development of a polysulfone hollow fibre vascular bio-artificial pancreas device for in vitro studies. J Biotechnol. 139 (3), 236-249 (2009).
- De Bartolo, L., et al. Human hepatocyte functions in a crossed hollow fiber membrane bioreactor. Biomaterials. 30 (13), 2531-2543 (2009).
- Schmelzer, E., Finoli, A., Nettleship, I., Gerlach, J. C. Long-term three-dimensional perfusion culture of human adult bone marrow mononuclear cells in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 112 (4), 801-810 (2015).
- Tapia, F., et al. Production of high-titer human influenza A virus with adherent and suspension MDKC cells cultured in a single-use hollow fiber bioreactor. Vaccine. 32 (8), 1003-1011 (2014).
- Deng, X., Zhang, G., Shen, C., Yin, J., Meng, Q. Hollow fiber culture accelerates differentiation of Caco-2 cells. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (15), 6943-6955 (2013).
- Schutte, M., et al. Rat primary hepatocytes show enhanced performance and sensitivity to acetaminophen during three-dimensional culture on a polystyrene scaffold designed for routine use. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 475-486 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge. J Anat. 211 (4), 567-576 (2007).
- Vivares, A., et al. Morphological behaviour and metabolic capacity of cryopreserved human primary hepatocytes cultivated in a perfused multiwell device. Xenobiotica. 45 (1), 29-44 (2015).
- Smith, I., et al. Human neural stem cell-derived cultures in three-dimensional substrates form spontaneously functional neuronal networks. J Tissue Eng Regen Med. , Epub ahead of print (2015).
- Davidson, A. J., Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. A theoretical approach to Zonation in a bioartificial liver. Biotechnol Bioeng. 109 (1), 234-243 (2012).
- Mulder, M. The basic principles of membrane technology. 2nd ed. , Kluwer Academic Publishers. Chapter 3 section 4 (1996).
- Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. Poly(lactic-co-glycolic acid) hollow fibre membranes for use as a tissue engineering scaffold. Biotechnol Bioeng. 96 (1), 177-187 (2007).
- Shearer, H., Ellis, M. J., Perera, S. P., Chaudhuri, J. B. Effects of common sterilization methods on the structure and properties of poly(D,L lactic-co-glycolic acid) scaffolds. Tissue Eng. 12 (10), 2717-2727 (2006).
- Forsey, R. W., Chaudhuri, J. B. Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds. Biotechnol Lett. 31 (6), 819-823 (2009).
- Williamson, M. R., Coombes, A. G. A. Gravity spinning of polycaprolactone fibres for applications in tissue engineering. Biomaterials. 25 (3), 459-465 (2004).
- El-Salmawy, A., et al. Preparation and properties of pronectin F-coated biodegradable hollow fibres. J Artif Organs. 8 (4), 245-251 (2005).
- Meneghello, G., et al. Fabrication and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid)/polyvinyl alcohol blended hollow fibre membranes for tissue engineering applications. J Memb Sci. 344 (1-2), 55-61 (2009).
