Protocol
أخلاقيات الإعلان: تم إجراء هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) من الجامعة الوطنية تشيايي، ID موافقة: 99022. ويسمح باستخدام عينة الحوتيات بواسطة مجلس الزراعة في تايوان (تصريح بحوث 100M-02.1-C-99).
إعداد نموذج 1. العضلات وSDS-PAGE
ملاحظة: عينات العضلات من 23 نوعا منها 16 نوعا من الثدييات البحرية، 5 أنواع من الثدييات الأرضية، واستخدمت التونة والدجاج في هذه الدراسة (الجدول 1). تم الحصول على عينات من العضلات الحيتان من الأفراد الذين تقطعت بهم السبل، الصيد العرضي السمكية، والمصادرة. تم الحصول على الأرانب، والفئران، والكلب، والأنسجة العضلية الدجاج من مركز التشخيص الأمراض الحيوانية من الجامعة الوطنية جايبور. تم شراء عينات من لحم البقر والخنزير والضأن، وسمك التونة من المتاجر المحلية. عينة العضلات لميناء ختم (PHOCA vitulina
- تخزين جميع العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- هاون قبل بارد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ثم وضع 3 غرام من عينة العضلات المجمدة في ذلك.
- تجانس العينة مع 10 مل من بارد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام الخالط الأنسجة.
- أجهزة الطرد المركزي لعينة متجانسة في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع supernatants وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد 5 مل من 5٪ التراص هلام (3.07 مل من الماء المقطر، 1.25 مل من العازلة هلام العلوي 4x والرقم الهيدروجيني 6.8، 625 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 50 ميكرولتر من 10٪ فوق كبريتات الأمونيوم (APS)، و 5 ميكرولتر من tetramethylethylenediamine ( TEMED)) و 10 مل من 15٪ يفصل هلام (3.65 مل من الماء المقطر، 2.5 مل من 4X أقل عازلة هلام الرقم الهيدروجيني 8.8، 3.75 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، 100 ميكرولتر من 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية،و4 ميكرولتر من TEMED).
- في الخلية الكهربائي، صب جل التراص (5٪ الأكريلاميد) على أعلى من هلام فصل (15٪ الأكريلاميد) بعد أن وطدت هذه الأخيرة. إدراج مشط هلام في هلام التراص.
- أداء PAGE وفقا للشروط التالية: حالة المدى الأولية: 100 فولت، 20 دقيقة، وحالة النهائية: 120 فولت و 40 دقيقة.
- وصمة عار الجل مع Coomassie الأزرق اللامع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى الجل الأزرق بشكل موحد في اللون.
ملاحظة: تلطيخ اكتمال عندما هلام لم يعد مرئيا في محلول الصبغة. - يزيل اللون مع حل حامض الخليك (10٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. وسوف يبدأ البولنجر على ما يبدو. تواصل destaining في 4 درجات مئوية خلال الليل حتى خلفية واضحة.
2. الببتيد التجميعي وحيدة النسيلة جسم إنتاج
- استرداد تسلسل الأحماض الأمينية ميغابايت من بنك الجينات بما في ذلك سمك التونة والدجاج والنعام والثدييات المحلية، وختم 18 نوعاالثدييات البحرية (الجدول 2).
- محاذاة تسلسل باستخدام البرامج المناسبة 16:
- إطلاق مستكشف محاذاة طريق تحديد محاذاة: تعديل / بناء التوافق على شريط الإطلاق؛ حدد إنشاء محاذاة جديد ثم انقر فوق موافق. سيظهر مربع حوار يسأل "هل بناء الحمض النووي أو البروتين تسلسل المحاذاة؟"
- انقر فوق الزر المسمى "البروتين". تحديد البيانات: فتح: استرداد سلاسل من الملفات وحدد ملف تسلسل. حدد تعديل: حدد جميع الأوامر القائمة لتحديد جميع المواقع لكل تسلسل في مجموعة البيانات لإنشاء محاذاة تسلسل متعددة.
- اختر محاذاة: محاذاة بواسطة ClustalW من القائمة الرئيسية لمحاذاة البيانات تسلسل المحدد باستخدام خوارزمية ClustalW. حدد "BLOSUM"، كما البروتين الوزن مصفوفة ثم انقر فوق الزر موافق.
- تحليل تسلسل المحاذاة:
- التركيز على 5 سي التفاعلي الأنتيجينقسم التدريب والامتحانات 17: الموقع 1 (AKVEADVA، 15-22)، موقع 2 (KASEDLK، 56-62)، الموقع 3 (ATKHKI، 94-99)، الموقع 4 (HVLHSRH، 113-119)، والموقع (5 KYKELGY، 145- 151) والعثور على جزء المحفوظة بين الثدييات البحرية. * (علامة النجمة، رمز إجماع في محاذاة (بروتوكول 2.2.3)) إلى المواقف التي لديها واحدة، وبقايا الحفظ تماما. تم العثور على شظايا الحفظ التالية في الحيتان: تسلسل KASEDLKKHG (والذي يتضمن الموقع 2)، وتسلسل HVLHSRHP (والذي يتضمن الموقع 4).
- توليف مرشح تسلسل شظايا وفقا لتحليل تسلسل، والمترافقة مع بروتين ألبومين البيض (OVA) كما البروتين الناقل باستخدام الخدمات التجارية.
- إضافة الأحماض الأمينية مسعور (على سبيل المثال، ميثيونين) إلى N-محطة من موقع رد الفعل الأنتيجين لمنع الببتيد من التحلل (على سبيل المثال، M-KASEDLKKHG).
- إطالة C-محطة من موقع رد الفعل الأنتيجين لفضح الموقع الأنتيجين الأساسية لخلية مناعية. وعلاوة على ذلك، conjuبوابة الببتيد مع OVA بإضافة السيستين (السيستئين، C) إلى C-محطة (على سبيل المثال، M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- يستحلب مساعد الكامل فرويند لمستمنع 1 أو مساعد ناقصة فرويند لمستمنع 2 مع حجم مساو من كل الببتيد الاصطناعية في برنامج تلفزيوني (3 مل، نهائي تركيز 30-50 ميكروغرام / 100 ميكرولتر).
- تطعيم مستمنع 1 (0.1 ملغ) تحت الجلد في كل من 5 إناث الفئران BALB / ج.
- أداء حقن منشطة تحت الجلد خمس مرات باستخدام مستمنع 2 على فترات لمدة أسبوعين، وجمع الأمصال الاختبار عن طريق أخذ العينات ذيل مقطع من الفئران قبل كل معززة.
- تحديد عيار الأمصال للفحص الأول.
- حل 100 ميكروغرام من الببتيد مجانا في 25 مل من رد فعل العازلة وقسامة 50 ميكرولتر من الحل في كل بئر من لوحة 96-جيدا. إضافة 10 ميكرولتر حل اقتران الكاشف في كل بئر وتخلط لوحة. احتضان لوحة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة محتويات البئر،غسل كل بئر 3 مرات بالماء المقطر، ومنع لوحة بإضافة 200 ميكرولتر من عرقلة الحل. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة محتويات وغسل كل بئر 3 مرات بالماء المقطر.
- أداء إليسا غير المباشر (بروتوكول 5،1-5،7) لتحديد الأمصال عيار لفحص الأول. اختيار الماوس وفقا لأعلى عيار (أعلى كثافة ضوئية) لجمع الطحال.
- قبل ثلاثة أيام لجمع الطحال، تطعيم 0.1 ملغ من مستمنع 1 تحت الجلد في الماوس تقديم أعلى عيار.
- جمع خلايا الطحال من الفئران تحصين المختارة والصمامات مع خلايا المايلوما الفئران F0 (SP2 / 0-Ag14) للحصول على خلايا هجين لتوليد ماب 18.
- بعد 14 يوما الانصهار، حدد استنساخ إيجابية عن طريق فحص والتفاعل من supernatants هجين نحو الببتيد الاصطناعية مجانا باستخدام الاليزا غير المباشر (بروتوكول 5،1-5،7).
- تمييع الخلايا لعدد مناسب لكل بئر لmaximizجي نسبة الآبار التي تحتوي على نسخة واحدة واحدة فقط (تخفيف الاستنساخ).
- إضافة 100 ميكرولتر من مستنبت الخلية لجميع الآبار في لوحة 96-جيدا إلا A1 الآبار التي تبقى فارغة.
- إضافة 200 ميكرولتر من خلية إلى تعليق A1 جيدا. ثم سرعان ما نقل 100 ميكرولتر من A1 إلى B1 ومزيج من قبل pipetting بلطف. كرر هذه 1: 2 التخفيفات أسفل العمود بأكمله، ثم تنقلب 100 ميكرولتر من H1 بحيث ينتهي مع نفس الحجم مثل الآبار فوقه.
- إضافة 100 ميكرولتر إضافية من المتوسطة إلى العمود 1 مع micropipette 8 قنوات. ثم سرعان ما نقل 100 ميكرولتر من كل من الآبار في العمود 1 لتلك الموجودة في العمود 2 باستخدام نفس ماصة، ومزيج من قبل pipetting بلطف.
- باستخدام نفس النصائح، كرر هذه 1: 2 التخفيفات عبر لوحة كاملة. تجاهل 100 ميكرولتر من كل من الآبار في العمود الأخير.
- جلب الحجم النهائي من جميع الآبار إلى 200 ميكرولتر بإضافة 100 ميكرولتر المتوسطة إلى كل بئر. احتضان جيش التحرير الشعبى الصينىدون عائق الشركة المصرية للاتصالات عند 37 درجة مئوية في ترطيب CO 2 الحاضنة.
- التحقق من كل جانب وعلامة جميع الآبار التي تحتوي على مجرد مستعمرة واحدة. تنفيذ اثنين أو أكثر من clonings حتى> 90٪ من الآبار التي تحتوي على الحيوانات المستنسخة واحدة إيجابية لإنتاج الأجسام المضادة.
- فحص الحيوانات المستنسخة لطخة الغربية وصمة عار نقطة (بروتوكول 3،1-4،6). ثم المستعمرات ثقافة فرعية من الآبار إلى السفن الكبيرة إلى توسيع الخلايا للحصول على ماب. وعادة ما يتم نقل كل استنساخ في بئر واحدة في لوحة 12- أو 24-جيدا.
- قياس تقارب بين MABS ومقتطفات العضلات من البقر والماعز والخنازير والكلاب والأرانب والتونة والدجاج، وختم، وأربعة أنواع الحيتان تمثيلية لطخة الغربية وصمة عار نقطة (بروتوكول 3،1-4،6).
- تطعيم الخلايا هجين مختارة (ما يصل الى 3 × 10 6) البريتونى في الفئران للحث على استسقاء. انتفاخ البطن عادة ما يبدو في غضون 7-10 آخر أيام حقن هجين. جمع السائل باستخدام إبرة تحت الجلد(أقل من قياس 20).
- أجهزة الطرد المركزي سائل الاستسقاء (10000 x ج لمدة 10 دقيقة) لإزالة الخلايا والحطام. تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون. إضافة 1-20 مل من العينة، 15 مل العازلة ملزمة، و3-5 مل من شطف العازلة في البروتين العمود G سيفاروز. جمع الكسر شطف تحتوي على الأجسام المضادة تنقيته من السوائل استسقاء الفئران.
- تحديد نمط إسوي الأجسام المضادة من قبل الأجسام المضادة عدة isotyping باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
3. ويسترن وصمة عار
- إعداد العازلة تحميل 2X تحتوي على بيتا المركابتويثانول (BME) عن طريق خلط 950 ميكرولتر من عينة العازلة 2X Laemmli مع 50 ميكرولتر من أساسيات إدارة الأعمال. تمييع supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في العازلة تحميل مع نسبة ملائمة من أجل الحصول على إشارات جيدة: 01:50 (الحيتان والفقمة) و 1: 5 (الحيوانات الأليفة وأسماك التونة) عند استخدام الأجسام المضادة ميغابايت الأرنب بولكلونل مكافحة الإنسان، و 1: 1 (الخنازير والأرانب والدجاج والتونة)، 1: 5 (البقر والماعز والكلاب)، و01:25 (الحيتان والفقمة) عندماntibody هو من طاف هجين.
- عينة الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نماذج تحميل في الآبار من هلام SDS-PAGE (4٪ الأكريلاميد التراص و 12٪ الأكريلاميد فصل) جنبا إلى جنب مع علامات الوزن الجزيئي. تشغيل هلام لمدة 5 دقائق في 50 V ثم زيادة الجهد إلى 150 فولت لإنهاء التشغيل في حوالي 1 ساعة.
- وضع الجل في المخزن نقل 1X لمدة 15 دقيقة. نقل البروتين فصلها لالنيتروسليلوز (NC) الأغشية بعد أن يتم فصل في الصفحة. ويمكن أن يتم نقل 100 V ل60-90 دقيقة.
- يعد حل حجب ما يلي: 1X PBS تحتوي على 0.1٪ توين 20 مع 5٪ الحليب الجاف الخالي. منع غشاء NC في 25 مل من عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما مع 15 مل الفوسفات مخزنة المالحة مع توين 20 (PBST).
- احتضان الغشاء والأجسام المضادة الأولية (استسقاء السائل أو طاف هجين) في 10 مل العازلة تخفيف الأجسام المضادة المخفف مع 5٪ عرقلة الحل في 4 درجات مئوية خلال الليل.
- غسل MEMBRANالبريد ثلاث مرات مرة أخرى مع PBST لتنظيف قبالة الأجسام المضادة المفرط.
- احتضان الغشاء مع القلوية الفوسفاتيز مترافق الماعز المضادة للماوس مفتش في 1: 1250 في محلول مانع مع الإثارة لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل الغشاء مرة أخرى واحتضان ذلك في 5 برومو-4-كلورو-3-indolyl كلوريد الفوسفات / ف تترازوليوم نتروبلو (BCIP / NBT) الفوسفاتيز الركيزة الخليط لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى وضع اللون.
- وقف رد فعل عن طريق غسل الغشاء في العديد من التغييرات من الماء المقطر.
4. نقطة وصمة عار
- تمييع supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في 5٪ الزلال المصل البقري (BSA) في PBST مع نسبة ملائمة من أجل الحصول على إشارات جيدة: 1: 5 للحيوانات المحلية والتونة، و01:25 لالحيتان والفقمة. بقعة 5 ميكرولتر من العينات على الغشاء. تقليل المنطقة أن الحل تخترق (عادة قطرها ملم 3-4) عن طريق تطبيق ببطء.
- يجف الغشاء في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال، </ م> في تدفق الصفحي لمدة 30-60 دقيقة)، منعه مع عرقلة الحل في طبق بتري لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مع PBST.
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (ماب من طاف هجين في 1: 10000 أو السائل الاستسقاء في 1: 100،000 المخفف في 5٪ عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام PBST لغسل غشاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل لإزالة الأجسام المضادة الزائد، ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (القلوية الماعز الفوسفاتيز مترافق المضادة للماوس مفتش في 1: 1250 في 5٪ عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة .
- يغسل الغشاء مرة أخرى واحتضان ذلك في BCIP / NBT خليط الفوسفاتيز الركيزة في غضون 10 إلى 20 دقيقة حتى وضع اللون.
- وقف رد فعل عن طريق غسل الغشاء في العديد من التغييرات من الماء المقطر.
5. غير المباشر ELISA
- إعداد غسل العازلة (0.002 M ايميدازول مخزنة المالحة مع 0.02٪ توين 20). غسل لوحة 3 مرات مع الغسيلالعازلة بين كل خطوة التالية (بروتوكول 5،2-5،5).
- إعداد 1:25 التخفيف من supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في المخزن الطلاء. معطف 96-جيدا لوحة ELISA مع 100 ميكرولتر supernatants المخففة عند 4 درجات مئوية خلال الليل ومنعه مع عازلة تمنع (1٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 1: 2000 تخفيف من ماب النقي مع عازلة المخفف وإضافة 100 ميكرولتر من ماب المخفف إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة الماعز المضادة للمفتش الماوس مترافق مع البيروكسيديز الفجل (1: 200 التخفيف في المخزن المخفف) لمزيد من الحضانة.
- إضافة البيروكسيديز الركيزة على كل جانب (100 ميكرولتر / جيد)، واحتضان لمدة 10-15 دقيقة.
- وقف رد فعل الانزيم من قبل وقف الحل البيروكسيداز (100 ميكرولتر / جيد) عندما لوحظ اللون التنمية.
- قراءة الكثافة البصرية في 450 نانومتر باستخدام مطياف صفيحة.
6. إعداد ماب المسمى الذهب الغروية ملاحظة: لون حل الذهب الغروية والخليط يجب أن تكون دائما حمراء. ضبط درجة الحموضة، وتركيز ماب، سرعة أجهزة الطرد المركزي عندما يلاحظ راسب أسود. الخطوات 6.1 و 6.2 خطوات الأمثل.
- إضافة تنقيته كشف ماب (50 ميكروغرام / مل، و 3 ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروية مع قيم الرقم الهيدروجيني متفاوتة 5-9. ويعتبر الحد الأدنى من درجة الحموضة التي تحافظ على اللون الأحمر لمدة ساعتين كما أن درجة الحموضة المثلى. ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام 0.1 M كربونات البوتاسيوم لضبط الذهب الغروي (40 نانومتر) حل لدرجة الحموضة 8.0 (درجة الحموضة المثلى).
- إضافة كمية مختلفة من تنقية كشف ماب (500 ميكروغرام / مل، 1-20 ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروية في درجة الحموضة 8.0. ملاحظة: إن تركيز الأمثل في هذه الدراسة هو 6 ميكروغرام / مل (أي راسب أسود).
- وفقا لنتائج المذكورة أعلاه، إضافة 60 ميكروغرام من تنقية كشف ماب قطرة من الحكمة إلى 10 مل من محلول الذهب الغروي. استحلب الخليط بلطف على درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ميلاديد 2 مل من محلول 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى الخليط ويستحلب بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للحد من التدخل في الخلفية.
- أجهزة الطرد المركزي الخليط في 10000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف مع الأجسام المضادة اللامقترن بعناية وتعليق الكريات الناتجة في 4 مل PBST تحتوي على 1٪ BSA و 0.1٪ توين 20، وكرر الطرد المركزي وتعليق عدة مرات.
- تعليق رواسب النهائية في 1 مل PBST وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.
7. بناء قطاع المناعي
ملاحظة: يبين الشكل 1 تصميم الشريط المناعي. إعداد وتجميع الشرائط في الرطوبة منخفضة الظروف البيئية مختبر (<20٪ الرطوبة النسبية) للحياة تخزين لفترات طويلة (> 1 سنة). أبعاد منصات وغشاء هي: المكورات وحة 300 مم × 10 مم، وسادة ماصة 300 مم × 24 مم، وسادة العينة 300 مم × 24 مم، NC غشاء 300 مم × 25 مم، كرتون 300مم × 80 مم.
- إضافة الغروي حل المسمى الذهب ماب من الخطوة 6.6 مع micropipette لتشبع لوحة المترافقة ثم جففه في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل تجميع.
- توزيع محددة ماب (500 ميكروغرام / مل) على منطقة الاختبار التقاط مستضد، وأرنب لمكافحة فأر مفتش (500 ميكروغرام / مل) على المنطقة المراقبة للكشف عن ماب على الغشاء NC باستخدام طابعة ماصة أو immunostrip. الحفاظ على مسافة (> 5 ملم) بين المنطقتين لتفادي أي تشويش.
- لصق لوحة مترافق، وسادة ماصة والأغشية NC على الكرتون مع الشريط على الوجهين.
ملاحظة: تداخل منصات على كل جانب من الغشاء NC بنحو 2 مم. وبناء قطاع غير لائق يؤدي إلى اختبار غير مكتملة. - وضع لوحة العينة على لوحة المترافقة (2 ملم) ولصقها على ورق مقوى.
- إنشاء شرائح واسعة 6 ملم مع ورقة القاطع. حزمة شرائح في كيس رقائق الألومنيوم مع المجففة، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.
8. عبر التفاعل الاختبار
- التجانس 0.03 غرام من عينة العضلات الخام مع 1 مل PBS (التي تحتوي على 0.1٪ BSA) في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل باستخدام عصا الخيزران أو طحن قضيب.
- عقد قطاع كتبها العكس حد للمناطق اختبار وتراجع الجزء وحة العينة إلى العينة لمدة 5-10 دقيقة ومراقبة نتيجة مباشرة.
- اختياري: جمع 500 ميكرولتر طاف وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة.
ملاحظة: اقترح هذه الخطوة إذا كانت إشارة ليست واضحة عندما يتم استيعابه الشريط مباشرة في طاف.
- اختياري: جمع 500 ميكرولتر طاف وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة.
- اختبار عينات العضلات المختلفة في ثلاث نسخ.
ملاحظة: نحن هنا اختبار التونة، الدجاج، ختم، 15 نوعا من الثدييات و 5 أنواع من الثدييات الأرضية. - لدينا خمسة مفتشين مستقلين يكرر 8.3 لخمس مرات، أي استخدام 575 شرائط في المجموع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خصائص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة
وضعنا اثنين مفتش 1 MABS (CGF5H9 وCSF1H13) الاعتراف اثنين من الببتيدات الاصطناعية (MKASEDLKKHGNTVLC وAIIHVLHSRHPAEFGC)، على التوالي، من الحوتيات ميغابايت، وكانت تستخدم هذه لبناء شطيرة من نوع الذهب الغروية شريط الاختبار المناعي للكشف السريع ميغابايت الحيتان. ويبين الشكل 2 أن CGF5H9 بالكشف عن الحيتان والثدييات الأخرى والفرقة الملون واحدة في الوزن الجزيئي وتوقع من تقريبي 17 كيلو دالتون. وحوت المنك المشترك (هركول acutorostrata) يظهر الفرقة خفوتا نسبيا من العصابات الثدييات البحرية الأخرى. العصابات غائبة عن سمك التونة والدجاج والأختام، في حين لوحظ الفرقة في حوالي 50 كيلو دالتون للخنازير. بالرغم من وجود عصابات غير محددة متعددة للخنازير والتونة، CSF1H13 غير محددة للغاية لأنه يتفاعل فقط مع الحيتان والفقمة والفرقة في الوزن الجزيئي وتوقع من تقريبي 17 كدا. حوت المنك يظهر سوى إشارة قوية في 01:10 (لا تظهر البيانات) مع عدم وجود إشارة لوحظ في 01:25. ويبين الشكل 2 نتائج متطابقة في وصمة عار نقطة.
ويبين الشكل 3A أن CGF5H9 يدل إشارة إيجابية عن الحيتان والأرانب والكلاب والماعز، والأبقار (قيمة OD> 3.0)؛ ضعف إشارة إيجابية للخنازير (قيمة OD = 1.5)؛ إشارة سلبية لأختام والدجاج والتونة. ويبين الشكل 3B أن CSF1H13 عن قابلية عالية تجاه الحيتان والفقمة (قيمة OD> 3.0). كلا CSF1H13 وCGF5H9 يمكن أن تتفاعل بقوة مع كل أنواع الحيتان الأربعة. هذه الأنواع الأربعة هي من عائلات مختلفة (حوت المنك: Balaenopteridae، الدلفين: Delphinidae، قزم حوت العنبر: Kogiidae، finless خنزير البحر: Phocoenidae)، مما يدل على التفاعل واسع لأنواع الحيتان متنوعة.
لبناء قطاع، CGF5H9، الذي يعترف رانه MBS الثدييات البحرية والثدييات الأخرى، غير الغروي وتستخدم الأجسام المضادة الكشف لربط الميوجلوبين، والمغلفة CSF1H13 على خط الاختبار فقط لالتقاط MBS من الحيتان والفقمة وصفت الذهب. لذلك تم تصميم خط اختبار لإظهار إشارة إيجابية عندما كشف كل من MABS ميغابايت الحيتان. لأن ميغابايت من الحيوانات غير الحيتان يمكن الكشف عنها إلا من خلال واحدة من هذه MABS، وهما خط اختبار يظهر نتيجة سلبية عندما يتم اختبار عينات العضلات من الحيوانات الأخرى. خط السيطرة يظهر دائما نتيجة ايجابية لأرنب لمكافحة فأر مفتش يربط الغروانية المسمى الذهب CGF5H9. ونتيجة فشل في خط السيطرة تشير إلى أن نوعية المواد على الشريط رديئة.
اختبار الشريط
ويبين الشكل 4 العصابات إشارة في كل خط الاختبار وخط السيطرة عند استخدام عينات العضلات الحيتان. عندما العينة ليست من الثدييات البحرية، لا يوجد سوى فرقة واحدة في واي خط السيطرةث غياب الفرقة عند خط الاختبار. نتيجة ناجحة يمكن ملاحظتها مباشرة في 5-10 دقيقة بعد المجانسة 0.03 غرام من العضلات مع 10 مل PBS تحتوي على 0.1٪ BSA باستخدام البلاستيك أو عصا الخيزران وتمرغ الشريط في الخليط. بعد اختبار 15 نوعا الحيتان وثمانية أنواع غير الثدييات البحرية في ثلاث نسخ، والنوعية (نسبة العينات غير الحيتان التعرف بشكل صحيح) والحساسية (النسبة المئوية للعينات الحيتان التي تم تحديدها بشكل صحيح) على حد سواء بنسبة 100٪.
والطبقات الشكل 1. تصميم الشريط المناعي. جميع المكونات بعناية إلى بطاقة بدعم من البلاستيك بحيث تتداخل. وهذا يسمح للالكواشف وعينة تدفق حتى من خلال الغشاء ولوحة ماصة. T: منطقة الاختبار. C: المنطقة السيطرة. وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة قطاع الذهب الغرويةلالحوتيات اللحوم تقييد التجارة غير المشروعة والاستهلاك: الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى:. 10،1371 / journal.pone.0060704 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. وصمة عار الغربية وتحليل لطخة دوت باستخدام supernatants هجين. (A) CGF5H9، (ب) CSF1H13. ويمكن لكل من supernatants هجين كشف الحيتان والفرقة الملون واحدة في الوزن الجزيئي وتوقع من تقريبي 17 كيلو دالتون. ميغاواط: حوت المنك، BND: الدلفين، إدارة الرعاية الاجتماعية: حوت العنبر القزم، FP: خنزير البحر finless، PKW: الأقزام حوت قاتل، N: برنامج تلفزيوني (مراقبة سلبية). وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة قطاع الذهب الغروية لجetacean اللحوم تقييد التجارة غير المشروعة والاستهلاك: الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى:. 10،1371 / journal.pone.0060704 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ELISA غير المباشرة مقتطفات العضلات من الأنواع المختلفة باستخدام MABS النقاء. (A) CGF5H9، (ب) CSF1H13. يمكن الثدييات البحرية الوحيدة تنتج إشارات إيجابية قوية في كل من MABS. وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة الغروية قطاع الذهب لحوم الحوتيات تقييد التجارة والاستهلاك غير المشروع:.. الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى: 10.1371 / journal.pone.0060704. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. خصوصية قطاع الذهب الغروية المناعة T: خط الاختبار. C: خط السيطرة. فقط عند استخدام عينات العضلات الحيتان، نتائج ناجحة (العصابات إشارة في كل خط الاختبار وخط السيطرة) يمكن ملاحظتها. (A) عينات غير الحيتان: 1: البقرة. 2: الماعز. 3: الخنزير. 4: الكلب. 5: الأرنب. 6: سمك التونة. 7: الدجاج. 8: هاربور ختم (PHOCA vitulina). (ب) عينات الحيتان: 1: المنك المشترك الحوت (هركول acutorostrata). 2: أومورا والحوت (هركول omurai). 3: الدلفين الأنف (Tursiops aduncus). 4: الدلفين (T. ترنكيتس). 5: الدلفين فريزر (Lagenodelphis hosei </ م>). 6: المحيطين الهندي والهادئ الدولفين الأحدب (سوزا تشينينسيس). 7: دلفين ريسو في (غرامبوس سنجابي). 8: Pantropical رصدت شركة دولفين للطاقة (Stenella attenuata). 9: الدلفين ذو أسنان خشنة (bredanensis ستينو). 10: الأقزام حوت قاتل (Feresa attenuata). 11: قصير الزعانف الحوت الرائد (Globicephala macrorhynchus). 12: يرأس البطيخ الحوت (Peponocephala إليكترا). 13: القزم حوت العنبر (Kogia سيما). 14: حوت العنبر القزمي (breviceps ك). 15: خنزير البحر Finless (phocaenoides Neophocaena). وقد تم استنساخ هذا الرقم من لو، C. وآخرون السريع المناعة الغروية قطاع الذهب لحوم الحوتيات تقييد التجارة والاستهلاك غير المشروع:.. الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى:. 10،1371 / journal.pone.0060704 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أنواع الحيتان | الأنواع غير الحيتان |
| حوت العنبر القزمي (breviceps Kogia) | ميناء ختم (PHOCA vitulina) |
| قزم حوت العنبر (Kogia سيما) | كلب (كلب familiaris الذئبة) |
| قصير الزعانف التجريبية الحوت (Globicephala macrorhynchus) | أرنب (النقبة Oryctolagus) |
| التي ترأسها البطيخ الحوت (Peponocephala إليكترا) | خنزير (scrofa سوس) |
| حوت قاتل قزم (Feresa attenuata) | الماعز (شعر الإبط كابرا) |
| رصدت Pantropical شركة دولفين للطاقة (Stenella attenuata) | الماشية (بوس الثور) |
| الدلفين (توrsiops ترنكيتس) | الدجاج (جالوس جالوس) |
| الدلفين (aduncus Tursiops) | التونة صفراء الزعانف (Thunnus albacares) |
| الدلفين فريزر (Lagenodelphis hosei) | |
| المحيطين الهندي والهادئ الدولفين الأحدب (سوزا تشينينسيس) | |
| شركة دولفين للطاقة الخام ذو أسنان (bredanensis ستينو) | |
| دولفين ريسو في (غرامبوس سنجابي) | |
| خنزير البحر Finless (phocaenoides Neophocaena) | |
| المشترك حوت المنك (acutorostrata هركول) | |
| الحوت أومورا في (هركول أومورا ط) |
الجدول 1. الأنواع التي كانت العضلات كوليالإدارة التنفيذية واختبارها في هذه الدراسة، وتشمل الأنواع التونة، الدجاج، ختم، 5 أنواع من الثدييات الأرضية، و 15 نوعا من الثدييات البحرية (4 أسرة).
| نوع | الانضمام لا. |
| المشترك حوت المنك (acutorostrata هركول) | P02179 |
| الأقزام برايد وحوت (هركول edeni) | Q0KIY2 |
| الحوت الأحدب (novaeangliae Megaptera) | P02178 |
| الحوت الرمادي (Eschrichtius المتين) | P02177 |
| حوت العنبر (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| حوت العنبر القزمي (breviceps Kogia) | Q0KIY5 |
| قزم حوت العنبر (Kogia سيما) | P02184 |
| قصيرة beakeد الدلفين الشائع (DELPHIS دلفين) | P68276 |
| منذ فترة طويلة الزعانف التجريبية الحوت (ميلاس Globicephala) | P02174 |
| الحوت القاتل (Orcinus أرك) | P02173 |
| التي ترأسها البطيخ الحوت (Peponocephala إليكترا) | Q0KIY3 |
| رصدت Pantropical شركة دولفين للطاقة (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| الدلفين الأنف (Tursiops ترنكيتس) | P68279 |
| ميناء خنزير البحر (Phocoena phocoena) | P68278 |
| الأمازون دولفين نهر (أينيا geoffrensis) | P02181 |
| الحوت ذو المنقار لونجمان ل(pacificus Indopacetus) | Q0KIY9 |
| هوبز "الحوت ذو المنقار (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| حوت كوفييه ذو المنقار (زيphius cavirostris) | P02182 |
| ميناء ختم (PHOCA vitulina) | P68080 |
| الماشية (بوس الثور) | P02192 |
| الماعز (شعر الإبط كابرا) | B7U9B5.3 |
| الحصان (ايكوس الحصانية) | P68082 |
| خنزير (scrofa سوس) | P02189 |
| كلب (كلب familiaris الذئبة) | P63113 |
| الدجاج (جالوس جالوس) | P02197 |
| النعام (camelus Struthio) | P85077 |
| التونة صفراء الزعانف (Thunnus albacares) | P02205 |
الجدول 2. تسلسل الميوجلوبين المستخدمة في هذه الدراسة مع الأرقام انضمام بنك الجينات المعنية. وتشمل الأنواع التونة،الدجاج والنعام والثدييات المحلية، وختم و 18 نوعا من الثدييات البحرية (7 أسر). وقد تم استنساخ هذا الجدول من لو، C. وآخرون السريع المناعة الغروية قطاع الذهب لحوم الحوتيات تقييد التجارة والاستهلاك غير الشرعية: الآثار المترتبة على حفظ والصحة العامة بلوس وان 8، e60704 (2013). دوى: 10.1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام الببتيد الاصطناعية مترافق إلى البروتين الناقل هو ملحوظ أكثر فعالية مقارنة مع البروتين وما شابه ذلك. لمعدات القائم على شطيرة، لأنه يتم تطوير ماب باستخدام الحواتم مع المواقع النسبية المعروفة، وMABS اثنين في هذه الدراسة من غير المحتمل أن تتداخل مع تفاعل كل منهما مع حاتمة المستضد الهدف. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعل بين البروتين الأصلي والأجسام المضادة من الفئران تحصين مع الاصطناعية الببتيد المترافقة قد تكون أقوى من التفاعل بين البروتين الأصلي والأجسام المضادة التي تنتج من البروتين الأصلي 19. لذا ينصح استخدام تقارن الببتيد الاصطناعية لإجراءات التحصين فعالة وجيل من المناسب ماب مكافحة الببتيد.
بنية البروتين ينطوي أساسا تسلسل الأحماض الأمينية في سلسلة ببتيد. كل الأحماض الأمينية يحتوي على جانب سلسلة مما يؤدي إلى خصائص معينة، وتغيير طفيف في المجلس الدولي للمطارات الأمينيةالنتائج د تسلسل في التغييرات هيكل. لأن الببتيدات بطول 10-20 الأحماض الأمينية هي مثالية لإعداد الأجسام المضادة، تم زيادة طول الببتيدات الاصطناعية (مستمنع) في المنطقة C-الطرفية لضمان أن يتم الاعتراف المنطقة مولدة الأساسية. ولذلك، فإن بقايا الأحماض الأمينية بين MBS من الحيوانات المختلفة مما أدى إلى هياكل حاتمة مختلفة يمكن تمييزها بكفاءة. على سبيل المثال، 3A الشكل يدل على تصميم الببتيد المذكورة يساهم في CGF5H9 التفاعل بقوة مع الحيتان ولكن سلبا مع الأختام. مثال آخر هو الانتماءات متميزة نحو الدجاج والكلاب من CGF5H9 على الرغم من أن الدجاج يحتوي على تسلسل متطابقة إلى أن من الكلب في الموقع المستضدية الأساسية 2. وهذا يدل على أن الفرق تسلسل في المنطقة الخارجية يمكن أن يؤدي إلى تغيير بنية وبالتالي متغير تقارب بين المستضد والأجسام المضادة ملزمة.
استخدمت طخة غربية، نقطة وصمة عار، وإليسا غير مباشر فيلدينا وسيلة لفحص MABS مناسبة. يستخدم على نطاق واسع لطخة غربية للكشف عن بروتينات معينة في انتزاع الأنسجة أو جناسة. في هذه التقنية، ويستخدم الكهربائي للهلام لفصل البروتينات التشويه والتحريف من قبل طول ببتيد. لذلك، فمن الممكن للتأكد مما اذا تشير إشارة البروتين وتوقع الوزن الجزيئي. ومع ذلك، فإن نتيجة الكشف (إشارة إيجابية أو سلبية، قوية أو ضعيفة) قد لا يمثل الوضع الحقيقي للمستضد الضد ملزمة لأنه يتم استخدام البروتينات التشويه والتحريف. ونتيجة لذلك، نقطة لطخة يمكن استخدامها للكشف عن المرحلة الثانية. نقطة لطخة هو أسلوب للكشف عن البروتينات. وهو يمثل تبسيط طريقة لطخة الغربي. في لطخة نقطة، يتم تطبيق مزيج يحتوي على جزيء يتم الكشف مباشرة على غشاء بمثابة نقطة. وهذا يختلف من وصمة عار الغربية لأنه لم يتم التشويه والتحريف عينات البروتين. لاحظ أن هذا الأسلوب لا يقدم أي معلومات عن حجم جزيء حيوي الهدف، وسوف تظهر نقطة واحدة إذا كان اثنان موتم الكشف عن lecules من مختلف الأحجام. وأخيرا، يتم استخدام ELISA غير المباشرة لفحص ملزم يجند من أجل توليد إشارة التي يمكن قياسها بشكل صحيح. فإنه يوفر المزيد من المعلومات عن خصائص الإنسان والمحيط الحيوي، وبالتالي يسهل بناء القطاع.
تركيزات ميغابايت في العضلات هي متغيرة تبعا لموقع المجموعة. على سبيل المثال، العضلات السباحة (العضلات محوري) في الثدييات البحرية لديها نسبة أعلى بكثير من ميغابايت مقارنة مع عضلات غير السباحة، وسوف عينات من الثدييات البحرية شابة لديها تركيز ميجا بايت أقل بسبب زيادة تركيز ميغابايت طوال حياة الحيوان 20. في البداية، CSF1H13، الذي يجسد فقط ميغابايت من الحيتان والفقمة، كان القصد منه أن يكون الغروي المسمى الذهب ويكون الكشف عن الأجسام المضادة، وCGF5H9، الذي يعترف ميغابايت من كثير من الأنواع، سيكون التقاط الأجسام المضادة على خط الاختبار. ونحن افترضنا أن الأجسام المضادة كشف ينبغي أن تكون أكثر تحديدا ويجب أن الأجسام المضادة القبضتكون أكثر عمومية. ومع ذلك، تم العثور على إشارة إيجابية ضعيفة على الخط اختبار عندما استخدمت عينات الحيتان مع تركيزات منخفضة ميجا بايت (لا تظهر البيانات). تم حل المشكلة عندما تم عكس مواقف MABS اثنين كما هو موضح في نتائج تمثيلية. وقد تبين حتى إشارة جيدة لالحيتانيات حديثي الولادة (أ تقطعت بهم السبل الحوت أومورا ل) (الشكل 4). ومن غير الواضح ما إذا كانت الخصائص وتركيز MABS تساهم في هذه الظاهرة.
في هذه الدراسة، تم استخدام عينات العضلات المجمدة إذابة المتجانس مع برنامج تلفزيوني على اختبار الشريط. شروط عينة أخرى وأساليب إعداد قد تؤثر على النتيجة. على سبيل المثال، يجب أن يتم استخراج البروتين والملح للذوبان مثل ميغابايت باستخدام برنامج تلفزيوني بدلا من الماء النقي. خلاف ذلك، قد يكون استخراج كافية، الأمر الذي قد يؤدي إلى نتيجة شاذة. المناسبة استخراج العازلة: نسبة عينة اللحوم مسؤولة جزئيا عن تفسير الناجح لنتيجة القطاع. عمو كبيرالإقليم الشمالي (0.3 غرام في 1 مل العازلة) للعينات السيطرة (على سبيل المثال، الحيوانات الأليفة) يمكن أن تسبب نتيجة إيجابية وخلفية واضحة. ومع ذلك، فإن نسبة المستخدمة في هذه الدراسة (1: 0.03) تنتج النتائج الصحيحة. فقط عينات العضلات جديدة يمكن استخدامها لهذا الاختبار الشريط. البروتين يمكن أن تحلل أو التشويه والتحريف بعد العلاج معينة (مثل علاج من صلصة الصويا والغليان)، والتي يمكن أن تسبب نتائج إيجابية ليس فقط بالنسبة للعينات العضلات الحيتان ولكن أيضا عينات من الحيوانات الأخرى (لا تظهر البيانات). لذلك، يقترح أن مصادر عينة متغيرة ومختلفة خطط تصميم البناء ينبغي أن تستخدم خلال تطوير القطاع.
في الختام، يصف هذا البروتوكول تطوير اثنين من MABS رد الفعل بقوة ميغابايت من الثدييات البحرية، وتطبق هذه MABS على شريط اختبار سريع للتمييز بين ميغابايت من الثدييات البحرية من ختم وغيرها من الحيوانات. على الرغم من موثوق تحليل الحمض النووي القائم على PCR لتحديد اللحوم الحوتيات متاح 12، هو أناالصورة كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. شريط الاختبار السريع هو تقنية يمكن الاعتماد عليها والسريعة التي يمكن استخدامها في هذا المجال لتحديد اللحوم الحيتان، وهو مرغوب فيه للغاية بالنسبة للوكالات التنظيمية 21. ومن المرجح أن الشريط يمكن تطويرها للكشف عن MBS محددة من الحيوانات مثل الخيول أو الخنازير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
