Protocol
Заявление по этике: Исследование было проведено в соответствии с международными стандартами и утверждены по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) Национального университета Цзяи, утверждение ID по: 99022. китообразных использование образца разрешено Совета по сельскому хозяйству Тайваня (исследований разрешения 100M-02.1-C-99).
1. Мышцы Подготовка проб и SDS-PAGE
Примечание: Образцы мышцы от 23 видов , включая 16 видов морских млекопитающих, 5 видов наземных млекопитающих, тунец и курица были использованы в этом исследовании (таблица 1). Китообразных образцы мышц были получены из скрученных лиц, рыбное прилов и конфискации. Кролик, крысы, собаки, и ткани куриные мышцы были получены от болезней животных диагностического центра Национального университета Цзяи. Образцы говядины, свинины, баранины, и тунец были приобретены у местного супермаркета. Мышцы образец тюлень (Phoca vitulina
- Хранить все образцы при -20 ° С до использования.
- Предварительно прохладное известковый раствор при -20 ° С. Затем положить 3 г замороженного образца мышцы в него.
- Однородный образца с 10 мл холодного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) с использованием гомогенизатора тканей.
- Центрифуга гомогенизированный образец при 10000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Собирают супернатанты и хранить при -20 ° С до использования.
- Подготовка 5 мл 5% концентрирующий гель (3,07 мл дистиллированной воды, 1,25 мл 4-кратным верхнего буфера геля рН 6,8, 625 мкл 40% -ного акриламида, 50 мкл 10% персульфата аммония (APS), и 5 мкл тетраметилэтилендиамина ( TEMED)) и 10 мл 15% разделяющий гель (3,65 мл дистиллированной воды, 2,5 мл 4 раза ниже, гель буфер рН 8,8, 3,75 мл 40% акриламид, 100 мкл 10% APS,и 4 мкл TEMED).
- В электрофорез клетке, налить концентрирующий гель (5% акриламид) на верхней части разделительного геля (15% акриламид), после того, как последний затвердеет. Вставьте гель гребень в геле штабелирования.
- Выполните СТР в соответствии со следующими условиями: начальное условие запуска: 100 вольт, 20 мин и окончательное условие: 120 вольт, 40 мин.
- Пятно гель Кумасси бриллиантовым синим при комнатной температуре в течение 30 мин до тех пор, пока гель не является равномерно синего цвета.
Примечание: Окрашивание завершена, когда гель уже не видно в растворе красителя. - Destain его с раствором уксусной кислоты (10%) при комнатной температуре в течение 1 часа. Полосы начнут появляться. Продолжить Обесцвечивание при 4 ° С в течение ночи, пока фон не станет прозрачным.
2. Синтез пептидов и моноклональных антител Производство
- Получение последовательности аминокислот Mb из GenBank включая тунца, курицы, страуса, домашних млекопитающих, тюленей и 18 видовкитообразных (таблица 2).
- Выравнивание последовательностей с помощью соответствующего программного обеспечения 16:
- Запустите Alignment Explorer , выбрав Align: Редактировать / Построить выравнивания на панели запуска; выберите Создать новый Выравнивание и нажмите кнопку OK. Появится диалоговое окно с вопросом: "Вы создаете ДНК или белка выравнивания последовательностей?"
- Нажмите на кнопку с надписью "Протеин"; выберите Данные: Часы работы: Получение последовательности из файла и выбрать файл последовательности; выберите Правка: Выделить все команды меню , чтобы выбрать все сайты для каждой последовательности в наборе данных для создания множественного выравнивания последовательностей.
- Выберите Выравнивание: Выравнивание по ClustalW из главного меню для выравнивания выбранных данных последовательностей с использованием алгоритма ClustalW; выберите "BLOSUM" в качестве белка весовой матрицы затем нажмите кнопку OK.
- Анализ выравнивание последовательности:
- Фокус на 5 антигенной реактивной сиTES 17: участок 1 (AKVEADVA, 15-22), сайт 2 (KASEDLK, 56-62), участок 3 (ATKHKI, 94-99), сайт 4 (HVLHSRH, 113-119) и 5 - сайт (KYKELGY, 145- 151) и найти фрагмент консервативна среди китообразных. * (Звездочка, символ консенсуса в створе (протокол 2.2.3)) указывает на позиции, которые имеют одну, полностью сохраняющийся остаток. Были обнаружены следующие фрагменты сохраняющиеся в китообразных: последовательность KASEDLKKHG (которая включает в себя участок 2) и последовательность HVLHSRHP (которая включает в себя участок 4).
- Обобщить фрагменты последовательностей-кандидатов в соответствии с анализом последовательности и конъюгата с белком овальбумином (OVA) в качестве белка-носителя с использованием коммерческих услуг.
- Добавить гидрофобные аминокислоты (например, метионин) к N-концу антигенной реактивного сайта для предотвращения пептида из разложения (например, М-KASEDLKKHG).
- Удлините С-конец антигенной реактивного сайта для раскрытия основной антигенного сайта на иммуноцита. Кроме того, conjuВорота пептид с OVA путем добавления цистеина (Cys, С) к С-концевой (например, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Эмульсию адъювант Фрейнда для иммуногена 1 или неполный адъювант Фрейнда для иммуногена 2 с равным объемом каждого синтетического пептида в PBS (3 мл, конечная концентрация 30-50 мкг / 100 мкл).
- Инокулируйте иммуноген 1 (0,1 мг) подкожно в каждую из 5 самок мышей линии BALB / C.
- Выполните подкожного бустерные инъекции пять раз с использованием иммуногена 2 с двухнедельными интервалами и собирать тест-сывороток путем отбора проб хвост клип из мышей перед каждым усилителем.
- Определение титра сывороток для первого скрининга.
- Растворить 100 мкг свободного пептида в 25 мл реакционного буфера и аликвоты по 50 мкл раствора в каждую лунку 96-луночного планшета. Добавить раствор реагента сочетания 10 мкл в каждую лунку и смешайте пластину. Инкубируйте планшет в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Удалить содержимое скважины,мыть каждую лунку 3 раза дистиллированной водой, и блокировать пластины путем добавления 200 мкл блокирующего раствора. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Удалить содержимое и промыть каждую лунку 3 раза дистиллированной водой.
- Выполните непрямой ELISA (протокол 5,1-5,7) для определения титра сывороток для первого скрининга. Выберите мышь с самым высоким титром (самая высокая оптическая плотность) для сбора селезенке.
- За три дня до сбора селезенке, прививают 0,1 мг иммуногена 1 подкожно в мышь, представляя самый высокий титр.
- Сбор клеток селезенки от иммунизированных мышей , отобранных и плавким предохранителем с мышиной миеломы F0 (sp2 / 0-AG14) для получения гибридомных клеток для генерации мАт 18.
- Через 14 дней после слияния, выбора положительных клонов путем скрининга реакционной способности супернатантов гибридомы в направлении свободного синтетического пептида с использованием непрямой ELISA (Протокол 5,1-5,7).
- Развести клетки соответствующего числа на лунку для maximizИНГ доля скважин, которые содержат только один единственный клон (разведение клонирования).
- Добавьте 100 мкл культуральной среды клеток во все лунки в 96-луночного планшета, кроме скважины A1, который остается пустым.
- Добавьте 200 мкл суспензии клеток в лунке A1. Затем быстро передать 100 мкл от А1 до В1 и перемешать, осторожно пипеткой. Повторите эти 1: 2 разведений вниз по всей колонне, а затем выбросить 100 мкл из H1 так, что она заканчивается тем же объемом, что и над ним скважин.
- Добавьте еще 100 мкл среды в колонну 1 с 8-канальный микропипетки. Затем быстро передавать по 100 мкл из каждой из лунок в колонке 1 для тех, кто в колонке 2, используя тот же пипетку, и перемешать, осторожно пипеткой.
- Используя те же советы, повторите описанные выше 1: 2 разведений по всей пластине. Откажитесь 100 мкл из каждой из лунок в последней колонке.
- Довести конечный объем всех лунок к 200 мкл путем добавления 100 мкл среды в каждую лунку. Выдержите плаТ.Е. ненарушенных при 37 ° C в увлажненной CO 2 инкубаторе.
- Проверьте каждую лунку и отметьте все лунки, которые содержат только одну колонию. Проводят два или более клонирований до> 90% из лунок, содержащих отдельные клоны не имеют положительный результат на получение антитела.
- Экран клонов с помощью Вестерн-блоттинга и дот-блоттинга (протокол 3.1-4.6). Затем субкультура колонии из колодцев в более крупные сосуды, чтобы расширить клетки для получения мАт. Обычно каждый клон переносят в отдельную лунку в 12-ти или 24-луночный планшет.
- Измерьте сродство между моноклональными и мышечных экстрактов из коровы, козы, свиньи, собаки, кролика, тунец, курица, печать и четырех представительных видов китообразных с помощью Вестерн-блоттинга и дот-блоттинга (протокол 3.1-4.6).
- Привить выбранных гибридомных клеток (до 3 - х 10 6) внутрибрюшинно мышам , чтобы вызвать асцит. Вздутие живота, как правило, проявляется в течение 7-10 дней после инъекции гибридом. Сбор жидкости с помощью иглы для подкожных инъекций(Менее 20 калибра).
- Центрифуга асцитной жидкости (10000 мкг в течение 10 мин) для удаления клеток и мусора. Смесь фильтруют через фильтр 0,45 мкм. Добавить от 1 до 20 мл пробы, 15 мл буфера для связывания, и от 3 до 5 мл буфера для элюции в белковую колонке G-сефарозе. Собирают элюции фракции, содержащей очищенного антитела из асцитической жидкости мышей.
- Определение изотипа антитела комплект Изотипирование антител с использованием инструкции производителя.
3. Вестерн-блот
- Готовят 2x буфера загрузки, содержащий бета-меркаптоэтанола (BME) путем смешивания 950 мкл 2х Laemmli буфера для образца с 50 мкл BME. Развести мышечных супернатантов (протокол 1,1-1,4) в загрузочном буфере с соответствующим соотношением для получения хороших сигналов: 1:50 (китообразные и печать) и 1: 5 (домашних животных и тунца) при использовании поликлональной кроличьей антитела против человеческого Mb, и 1: 1 (свинья, кролик, курица и тунец), 1: 5 (коровы, козы и собаки) и 1:25 (китообразные и печать), когдаntibody от супернатанта гибридомы.
- Образец тепла при температуре 95 ° С в течение 5 мин. Загружают образцы в лунки SDS-PAGE гель (4% акриламид укладку и 12% акриламид разделяющего) вместе с маркерами молекулярной массой. Выполнить геля в течение 5 мин при 50 В, то увеличить напряжение до 150 В, чтобы закончить бег в течение приблизительно 1 ч.
- Поместите гель в буфере передачи 1х в течение 15 мин. Передача выделенного белка на нитроцеллюлозу (NC) мембраны после того, как они отделены друг от друга СТР. Передача может быть сделано при 100 V в течение 60-90 мин.
- Готовят блокирующий раствор: 1X PBS, содержащим 0,1% Tween 20 с 5% обезжиренного сухого молока. Блок мембраны NC в 25 мл блокирующего раствора при комнатной температуре в течение 1 часа. Промыть три раза в течение 5 мин каждый с 15 мл фосфатно-буферным солевым раствором с Tween 20 (PBST).
- Инкубируйте мембраны и первичное антитело (асцитической жидкости или супернатанта гибридомы) в 10 мл буфера для разведения антитела разбавили 5% блокирующего раствора при 4 ° С в течение ночи.
- Промыть MEMBRANе три раза снова с PBST для очистки от чрезмерного антитела.
- Инкубируйте мембрану с щелочной фосфатазы-конъюгированные антитела из козы против мышиного IgG в соотношении 1: 1250 в блокатора растворе при осторожном перемешивании в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промыть мембрану снова и инкубировать ее в 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат хлорид / п-тетразола (BCIP / NBT) фосфатазы смесь субстрата в течение 10 до 20 мин до развития окраски.
- Остановить реакцию путем промывки мембраны в нескольких сменах дистиллированной воды.
4. Дот-блот
- Развести мышечных супернатантов (протокол 1,1-1,4) в 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBST с соответствующим соотношением для получения хороших сигналов: 1: 5 для домашних животных и тунца, и 1:25 для китообразных и печатью. Пятно 5 мкл проб на мембрану. Минимизация область, которую раствор проникает (обычно диаметром 3-4 мм), применяя его медленно.
- Высушите мембрану при комнатной температуре (например, </ EM> в ламинарном потоке в течение 30-60 мин), блокируют его с блокирующим раствором в чашке Петри в течение 1 ч при комнатной температуре, и промыть его с помощью PBST.
- Инкубируйте мембрану с первичным антителом (МАт из супернатанта гибридомы в соотношении 1: 10000 или асцитной жидкости при 1: 100 000 разведенного в 5% блокирующего раствора) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Использование PBST, чтобы промыть мембрану три раза в течение 5 мин каждый, чтобы удалить избыток антитела, а затем инкубируют его с вторичным антителом (щелочная фосфатаза-конъюгированным козьим антимышиным IgG в соотношении 1: 1,250 в 5% блокирующем растворе) в течение 1 ч при комнатной температуре ,
- Промойте мембрану снова и инкубировать ее в смеси фосфатазы субстрата BCIP / NBT в пределах от 10 до 20 мин до развития окраски.
- Остановить реакцию путем промывки мембраны в нескольких сменах дистиллированной воды.
5. Непрямой ИФА
- Приготовьте промывочный буфер (0,002 М имидазола-солевом буферном растворе с 0,02% твина 20). Промыть пластины 3 раза с промывкойбуфер между каждым следующим шагом (протокол 5,2-5,5).
- Приготовьте 1:25 разбавление мышечных супернатантов (протокол 1,1-1,4) в буфере для нанесения покрытия. Coat 96-луночный ELISA-пластину с 100 мкл разведенного супернатантов при температуре 4 ° С в течение ночи и блокируют его с блокирующим буфером (1% BSA в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Приготовьте 1: 2000 разведение очищенного мАт с разбавленным буфером и добавляют 100 мкл разведенного мАт в каждую лунку. Инкубируйте планшет в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Добавить козий против мышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (1: 200 разбавлении в разбавленном буфере) для дальнейшей инкубации.
- Добавить субстрата пероксидазы в каждую лунку (100 мкл / лунку) и инкубируют в течение 10-15 мин.
- Остановить реакцию фермента пероксидазы стоп-раствора (100 мкл / лунку), когда наблюдается развитие окраски.
- Считать оптическую плотность при 450 нм с использованием микропланшет-спектрофотометра.
6. Получение коллоидного золота-меченого мАт Примечание: Цвет раствора коллоидного золота и смесь всегда должна быть красной. Отрегулируйте рН, концентрацию биосфера, скорость центрифуги, когда черный осадок заметили. Шаги 6.1 и 6.2 являются шаги по оптимизации.
- Добавить очищенный обнаружение мАт (50 мкг / мл, 3 мкл) в 100 мкл коллоидного раствора золота с значениями рН колеблется от 5-9. Минимальный рН, который сохраняет красный цвет в течение двух часов, считается оптимальным рН. Примечание: В данном исследовании, 0,1 М карбоната калия используется для регулировки коллоидный золота (40 нм), рН раствора до 8,0 (оптимальное значение рН).
- Добавляют различные количества очищенного обнаружения мАт (500 мкг / мл, 1-20 мкл) в 100 мкл коллоидного раствора золота при рН 8,0. Примечание: Оптимальная концентрация в данном исследовании, составляет 6 мкг / мл (отсутствие черного осадка).
- В соответствии с приведенными выше результатами, добавьте 60 мкг очищенного обнаружения мАт по каплям к 10 мл коллоидного раствора золота. Эмульгировать смесь осторожно при комнатной температуре в течение 10 мин. Объявлениег 2 мл 5% раствора БСА в PBS (рН 7,4) к смеси и осторожно эмульгировать при комнатной температуре в течение 15 мин, чтобы уменьшить фоновых помех.
- Центрифуга смесь при 10000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С.
- Удалить супернатант с неконъюгированного антитела тщательно и подвесить Полученные гранулы в 4 мл PBST, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20, и повторяют центрифугирование и подвески несколько раз.
- Приостановка финальные преципитаты в 1 мл PBST и хранить его при температуре 4 ° C до использования.
7. Строительство Иммунная Газа
Примечание: На рисунке 1 показана конструкция иммунной полосы. Подготовить и собрать полоски в низкой влажностью лабораторных условиях окружающей среды (<20% относительной влажности) в течение длительного срока хранения (> 1 год). Размеры прокладок и мембраны: площадка парного 300 мм х 10 мм, впитывающей подушечки 300 мм х 24 мм, образец накладка 300 мм х 24 мм, NC мембрана 300 мм х 25 мм, картонная 300х 80 мм.
- Добавить коллоидное золото-меченых решение MAB со стадии 6.6 с микропипетки насытить сопряженную площадку, а затем высушить его при температуре 37 ° С в течение 1 часа перед сборкой.
- Распределить специфического антигена захвата мАт (500 мкг / мл) на испытательной зоне, и кроличьи антитела мыши IgG (500 мкг / мл) на контрольной зоне для обнаружения мАт на мембране НК с использованием пипетки или immunostrip принтера. Поддерживать расстояние (> 5 мм) между двумя зонами, чтобы избежать помех.
- Вставить сопряженную панель, абсорбирующей прокладки и мембраны NC на монтажном столе с двухсторонней ленты.
Примечание: перекрывающийся колодки с каждой стороны мембраны NC примерно 2 мм. Недопустимом строительство полосы приведет к неполному теста. - Поместите образец площадку над сопряженного площадки (2 мм) и вставить его на монтажном столе.
- Создание 6 мм шириной полосы с помощью резака бумаги. Упаковать полоски в мешок алюминиевой фольги с осушителем, и хранить их при температуре 4 ° С до использования.
8. Перекрестная реактивность Тест
- Однородный 0,03 г сырого образца мышечной с 1 мл PBS (содержащей 0,1% BSA) в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл с использованием бамбуковой палкой или размола стержень.
- Держа полоску на конце, противоположном тестовых областей и окунуть образцовой прокладки часть в образец в течение 5-10 мин и наблюдать результат непосредственно.
- Дополнительно: Соберите 500 мкл супернатанта и перенести его в новую центрифужную пробирку.
Примечание: Этот шаг предлагается, если сигнал не является очевидным, когда полоса непосредственно замачивают в супернатант.
- Дополнительно: Соберите 500 мкл супернатанта и перенести его в новую центрифужную пробирку.
- Проверьте различные образцы мышц в трех экземплярах.
Примечание: Здесь мы протестировали тунец, курица, печать, 15 видов китообразных и 5 видов наземных млекопитающих. - Есть пять независимых инспекторов повторить 8.3 пять раз, то есть, использовать 575 полос в общей сложности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Моноклональные характеристики антител
Мы разработали два IgG 1 мАт (CGF5H9 и CSF1H13) , распознающие два синтетических пептидов (MKASEDLKKHGNTVLC и AIIHVLHSRHPAEFGC), соответственно, китообразных Mb, и они были использованы для создания сэндвич-типа коллоидного золота иммунохроматографический тест - полоски для быстрого обнаружения китообразных Mb. на рисунке 2 показано , что CGF5H9 обнаруживает китообразных и других млекопитающих как единый окрашенная полоса в предсказанной молекулярной массой приблизительной 17 кДа. Малый полосатик (Balaenoptera acutorostrata) показывает сравнительно более слабую полосу , чем полосы других китообразных. Группы отсутствуют для тунца, кур и тюленей, в то время как полоса примерно 50 кДа наблюдается у свиней. Хотя существует множество неспецифических полос для свиней и тунца, CSF1H13 весьма специфичен, так как он реагирует только с китообразных и тюленей, как полоса при предсказанной молекулярной массой приближенной к 17Да. Полосатиков только показывает сильный сигнал в 1:10 (данные не показаны) при отсутствии сигнала , наблюдаемой на 1:25. Рисунок 2 показывает одинаковые результаты в дот - блоттинга.
Рисунок 3A показывает , что CGF5H9 демонстрирует позитивный сигнал для китообразных, кроликов, собак, коз и коров (значение OD> 3,0); слабый положительный сигнал для свиней (значение OD = 1,5); негативный сигнал для тюленей, цыплят и тунца. Рисунок 3B показывает , что CSF1H13 выражает высокое сродство по отношению к китообразных и тюленей (значение OD> 3.0). Оба CSF1H13 и CGF5H9 могут сильно реагируют со всеми четырьмя китообразных. Эти четыре вида из разных семей (полосатиков: Balaenopteridae; афалина: Delphinidae; карликовый кашалот: Kogiidae; finless морская свинка: Phocoenidae), что указывает на широкую реакционную способность различных видов китообразных.
Для построения полосы, CGF5H9, которая признает тон Mbs китообразных и других млекопитающих, является коллоидный золото-меченых и использовали в качестве детектирующего антитела для связывания миоглобина, и CSF1H13 наносят на испытательной линии только, чтобы захватить MBS китообразных и тюленей. Поэтому тестовая линия предназначена, чтобы показать позитивный сигнал, когда оба мАт обнаружения китообразных Мб. Поскольку Мб из не китообразными животных могут быть обнаружены только в одной из этих двух моноклональных антител, тестовая линия показывает отрицательный результат, когда образцы мышц от других животных тестируются. Линия управления всегда показывает положительный результат, потому что кролик анти-мышиного IgG связывает коллоидное золото-меченых CGF5H9. Неудачный результат в контрольной линии указывает на то, что качество материалов на полосе оставляет желать лучшего.
тест - полоска
На рисунке 4 показаны полосы сигнала на обоих тестовой линии и линии управления , когда используются китообразных образцы мышц. Когда проба не из китообразных, есть только одна полоса в контрольной линии Wiго отсутствие полосы на тестовой линии. Успешный результат можно наблюдать непосредственно через 5-10 мин после того, как гомогенизацию 0,03 г мышце с 10 мл PBS, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина с помощью пластиковой или бамбуковую палку и вымачивание полосу в смесь. После тестирования 15 видов китообразных и восемь без видов китообразных в трех экземплярах, специфичность (процент не-китообразных образцов правильно определили) и чувствительность (процент китообразных образцов правильно идентифицированы) и 100%.
Рисунок 1. Конструкция иммунной полосы. Все компоненты тщательно наслаивали на пластиковой подложке карты таким образом , чтобы они перекрывались. Это позволяет реагенты и поток пробы через мембрану и к абсорбирующей прокладки. Т: зона тестирования. C: зона управления. Эта цифра была воспроизведена с Lo, С. и др. Быстрое иммунный коллоидное золото полосадля китообразных мяса сдерживающей незаконной торговли и потребления:. последствия для сохранения и общественного здравоохранения PLoS ONE 8, e60704 (2013). DOI:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Вестерн - блот и дот - блот анализа с использованием гибридомных супернатантов. (А) CGF5H9, (Б) CSF1H13. Оба гибридомные супернатанты могут обнаружить китообразных как один окрашенная полоса в предсказанной молекулярной массой приблизительной 17 кДа. MW: малый полосатик, БНД: афалина, ДСВ: карликовый кашалот, FP: finless морская свинка, PKW: карликовая косатка, N: PBS (отрицательный контроль). Эта цифра была воспроизведена с Lo, С. и др. Быстрое иммунный коллоидное золото полосы для сetacean мясо сдерживающим незаконную торговлю и потребление:. последствия для сохранения и общественного здравоохранения PLoS ONE 8, e60704 (2013). DOI:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Косвенное ИФА мышечных экстрактов различных видов с использованием очищенного мАт. (А) CGF5H9, (Б) CSF1H13. Только китообразные могут производить сильные позитивные сигналы в обоих мАт. Эта цифра была воспроизведена с Lo, С. и др Rapid Иммунная коллоидное золото полосы для китообразных мяса сдерживающей незаконной торговли и потребления:.. Последствия для сохранения и общественного здравоохранения PLoS ONE 8, e60704 (2013). DOI: 10.1371 / journal.pone.0060704. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Специфичность иммунной коллоидного золота полосы Т:. Тестовой линии. C: контрольная линия. Только при использовании китообразных образцы мышц, можно наблюдать успешные результаты (сигнальные полосы в обоих тестовой линии и контрольной линии). (A) Non-китообразных образцы: 1: Корова. 2: Коза. 3: Свинья. 4: Собака. 5: Кролик. 6: Тунец. 7: Chicken. 8: тюлень (Phoca vitulina). (B) китообразным образцы: 1: малый полосатик (Balaenoptera acutorostrata). 2: кит (Balaenoptera omurai) Омуры. 3: афалина (Tursiops aduncus). 4: афалина (Т. truncatus). 5: дельфин Фрейзера (Lagenodelphis Hosei </ EM>). 6: Индо-Пацифика Горбатый дельфин (Sousa лесбийский). 7: дельфин (Grampus пзеиз) Риссо. 8: пантропические пятнистый дельфин (Stenella attenuata). 9: крупнозубый дельфин (Steno bredanensis). 10: карликовая косатка (Feresa attenuata). 11: Короткие плавниками гринды (Globicephala macrorhynchus). 12: дыня , возглавляемые кит (Peponocephala Electra). 13: Карлик кашалот (Kogia сима). 14: Карликовый кашалот (К.) африканские узкороты. 15: Finless (морская свинка Neophocaena phocaenoides). Эта цифра была воспроизведена с Lo, С. и др Rapid Иммунная коллоидное золото полосы для китообразных мяса сдерживающей незаконной торговли и потребления:.. Последствия для сохранения и общественного здравоохранения PLoS ONE 8, e60704 (2013). DOI:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры,
| китообразных | Non-китообразных |
| Карликовый кашалот (Kogia африканские узкороты) | Тюлень (Phoca vitulina) |
| Карликовый кашалот (Kogia сима) | Собака (Canis волчанка Familiaris) |
| Короткие плавниками гринды (Globicephala macrorhynchus) | Кролик (Oryctolagus cuniculus) |
| Дыня головой кита (Peponocephala Electra) | Свиньи (Sus SCROFA) |
| Карликовая косатка (Feresa attenuata) | Коза (Capra ушной раковине) |
| Пантропические пятнистый дельфин (Stenella attenuata) | Крупный рогатый скот (Bos Taurus) |
| Афалина (Туrsiops truncatus) | Цыпленок (Gallus Gallus) |
| Афалина (Tursiops aduncus) | Желтоперый (Thunnus albacares) |
| Дельфин Фрейзер (Lagenodelphis Hosei) | |
| Индо-тихоокеанского горбатых дельфинов (Sousa лесбийский) | |
| Крупнозубый дельфин (Steno bredanensis) | |
| Серый дельфин (Grampus пзеиз) | |
| Finless морская свинка (Neophocaena phocaenoides) | |
| Малый полосатик (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Полосатик омуры (Balaenoptera Омура я) |
Таблица 1. Виды , из которого мышцы был КоллеИДКТК и испытаны в этом исследовании. Виды включают тунец, курица, печать, 5 видов наземных млекопитающих и 15 видов китообразных (4 семьи).
| вид | Присоединение нет. |
| Малый полосатик (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Карликовый кит Брайда (Balaenoptera edeni) | Q0KIY2 |
| Горбатый кит (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Серый кит (Eschrichtius массивные) | P02177 |
| Кашалот (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Карликовый кашалот (Kogia африканские узкороты) | Q0KIY5 |
| Карликовый кашалот (Kogia сима) | P02184 |
| Short-beaked обыкновенный дельфин (Delphinus Delphis) | P68276 |
| Обыкновенная гринда (Globicephala Мелас) | P02174 |
| Касатка (Orcinus косатка) | P02173 |
| Дыня головой кита (Peponocephala Electra) | Q0KIY3 |
| Пантропические пятнистый дельфин (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Афалины (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Морских свиньях (Phocoena Phocoena) | P68278 |
| Амазонский дельфин (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Клюворыловые Лонгмана (Indopacetus расШсиз) | Q0KIY9 |
| Ремнезуб хаббса (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Клюворыл (ZiPHIUS cavirostris) | P02182 |
| Тюлень (Phoca vitulina) | P68080 |
| Крупный рогатый скот (Bos Taurus) | P02192 |
| Коза (Capra ушной раковине) | B7U9B5.3 |
| Лошадь (Equus Caballus) | P68082 |
| Свиньи (Sus SCROFA) | P02189 |
| Собака (Canis волчанка Familiaris) | P63113 |
| Цыпленок (Gallus Gallus) | P02197 |
| Страус (Struthio Camelus) | P85077 |
| Желтоперый (Thunnus albacares) | P02205 |
Таблица 2. миоглобина последовательности , используемые в данном исследовании , с соответствующими номерами доступа GenBank. Виды включают тунец,курица, страусы, домашние млекопитающие, печать и 18 видов китообразных (7 семей). Эта таблица была воспроизведена с Lo, С. и др Rapid Иммунная коллоидное золото полосы для китообразных мяса сдерживающей незаконной торговли и потребления:. Последствия для сохранения и общественного здравоохранения PLoS ONE 8, e60704 (2013).. DOI: 10.1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование синтетического пептида, конъюгированного с белком-носителем является удивительно более эффективным по сравнению с родственным белком. Для техники сэндвич на основе, поскольку моноклональное антитело разработано с использованием эпитопов с известными относительные пути, два мАт в данном исследовании, вероятно, мешать взаимодействию друг с другом с антигеном-мишенью, эпитоп не. Кроме того, реакционная способность между нативного белка и антитела у мышей , иммунизированных с синтетическим пептидом-конъюгат может быть сильнее , чем реакционная способность между нативного белка и антитела , полученного из нативного белка 19. Использование синтетических пептидных конъюгатов поэтому рекомендуется для эффективных процедур иммунизации и выработки соответствующего антипептидную мАт.
Структура белка, главным образом, включает в себя последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Каждая аминокислота имеет боковую цепь, ведущую к конкретным свойствам, и небольшое изменение амино- ACId последовательности приводит к изменению структуры. Поскольку пептиды с длиной 10-20 аминокислот, идеально подходят для приготовления антител, длина синтетических пептидов (иммуногена) на С-концевой области был увеличен, чтобы гарантировать, что основной антигенную область будет признана. Таким образом, аминокислотные остатки среди Mbs различных животных, в результате различных эпитопов структур могут быть эффективно дифференцированы. Например, на рисунке 3A показывает упомянутый пептид конструкция способствует CGF5H9 сильно реагировать с китообразных , но отрицательно с уплотнениями. Другим примером могут служить различные аффинности в сторону кур и собак CGF5H9 хотя курица имеет идентичную последовательность в том, что собаки в антигенном сайте сердечника 2. Это указывает на то, что разница в последовательности во внешней области может привести к изменению структуры и, таким образом, переменная аффинности связывания между антигеном и антителом.
Вестерн-блот, дот-блот, и непрямой ELISA были использованы внаш метод скрининга подходящих мАт. Вестерн-блот широко используется для выявления специфических белков в экстракте ткани или гомогената. В этой технике, гель-электрофореза используется для разделения денатурированные белки длиной полипептида. Таким образом, можно подтвердить, если сигнал указывает на молекулярную массу предсказанного белка. Тем не менее, результат обнаружения (положительный или отрицательный, сильный или слабый сигнал), возможно, не представлял реальную ситуацию антиген-антитело связывания, поскольку используются денатурированные белки. Следовательно, дот-блоттинга может быть использован для второй стадии скрининга. Дот-блот представляет собой метод обнаружения белков. Она представляет собой упрощение западного метода блот. В дот-блот, смесь, содержащая молекулу для обнаружения наносят непосредственно на мембране в виде точки. Это отличается от западного блоттинга, потому что образцы белка не денатурированный. Обратите внимание, что этот метод не дает никакой информации о размере целевого биомолекулы, и одна точка, если два мес появитсяобнаруживаются lecules разных размеров. И, наконец, непрямой ИФА используется для связывания лиганда анализа, с тем, чтобы генерировать сигнал, который может быть соответствующим образом определена. Она обеспечивает более подробную информацию о характеристиках MAB и тем самым облегчает построение полосы.
Концентрации Mb в мышцах варьируются в зависимости от места сбора. Например, плавательные мышцы (аксиальные мышцы) китообразных имеют значительно более высокое содержание Mb по сравнению с не-плавательных мышц, а также образцы из молодых китообразными будет иметь более низкую концентрацию Мбайтам , поскольку концентрация увеличивается Mb на протяжении всей жизни животного 20. Первоначально CSF1H13, который только захватывает Мб китообразных и тюленей, был задуман как коллоидное золото-меченых и быть обнаружение антител, и CGF5H9, который признает Mb многих видов, было бы захвата антитела на тестовой линии. Мы предположили, что обнаружение антител должно быть более точным и антитело захват долженбыть более общим. Тем не менее, слабый положительный сигнал был обнаружен на тестовой линии, когда использовались китообразным образцы с низкой концентрацией МБ (данные не показаны). Проблема была решена, когда были отменены положения двух моноклональных антител, как описано в представительных результатов. Хороший сигнал был даже показан для новорожденных китообразных (многожильных кита Омуры) (рисунок 4). Остается неясным, являются ли характеристики и концентрация мАт способствуют этому явлению.
В этом исследовании, замороженном размораживают образцы мышц гомогенизируют с PBS были использованы на тест-полосок. Другие условия выборки и методы получения, могут влиять на результат. Например, соль-растворимый белок, такой как Mb должны быть извлечены с помощью PBS, а не чистой воды. В противном случае, экстракция может быть недостаточным, что может привести к аномальным результату. Соответствующий экстракционный буфер: коэффициент отбора проб мяса частично отвечает за успешную интерпретацию результата полосы. Большой Amouнт (0,3 г в 1 мл буфера) контрольных образцов (например, домашних животных) может привести к положительному результату и размытого фона. Тем не менее, соотношение, используемое в данном исследовании (1: 0,03), полученного правильные результаты. Только образцы свежей мышцы могут быть использованы для этой тест-полоски. Белок может быть гидролизованы или денатурированный после определенных процедур (например, отверждение с помощью соевого соуса и кипячения), что может привести к положительным результатам не только для китообразных образцов мышц, но также образцы от других животных (данные не показаны). Таким образом, предполагается, что переменные источники выборки и различные проектные планы строительства должны быть использованы в процессе разработки полосы.
В заключение, этот протокол описывает развитие двух мАт сильно реактивных к Mb китообразных, и эти моноклональные антитела наносят на быстрый тест-полоски, чтобы дифференцировать Мб китообразных от печати и других животных. Хотя надежный анализ ДНК на основе ПЦР для идентификации китообразных мяса доступен 12, он яs трудоемкий и занимает много времени. Быстрый тест - полоска представляет собой надежный и быстрый метод , который может быть использован в поле для идентификации китообразных мяса, что является весьма желательным для регулирующих органов 21. Вполне вероятно, что полоса может быть разработана для выявления специфических MBS от животных, таких как лошади или свиньи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
