Protocol
Declaração de Ética: O estudo foi realizado de acordo com as directrizes internacionais e aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Chiayi, aprovação ID: 99022. O uso da amostra de cetáceos foi permitido pelo Conselho da Agricultura de Taiwan (Research Permissão 100M-02.1-C-99).
1. Preparação de amostras do músculo e de SDS-PAGE
Nota: As amostras de músculo de 23 espécies, incluindo 16 espécies de mamíferos marinhos, 5 espécies de mamíferos terrestres, atum e frango foram utilizados neste estudo (Tabela 1). As amostras de músculo de cetáceos foram obtidas de indivíduos presos, as capturas acessórias da pesca e confisco. Coelho, rato, cão, e tecidos musculares de frango foram obtidos a partir do Centro de Diagnóstico de Doenças dos Animais da Universidade Nacional de Chiayi. As amostras de carne de vaca, porco, cordeiro e atum foram comprados de um supermercado local. A amostra do músculo do selo de porto (Phoca vitulina
- Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à sua utilização.
- Pré-cool argamassa a -20 ° C. Em seguida, coloque 3 g de amostra muscular congelado nele.
- Homogeneizar a amostra com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS), utilizando um homogeneizador de tecidos.
- Centrifugar a amostra homogeneizada a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recolhe-se os sobrenadantes e armazená-lo a -20 ° C até à sua utilização.
- Prepare 5 ml de 5% de gel de empilhamento (3,07 ml de água destilada, 1,25 ml de gel tampão superior 4x de pH 6,8, 625 ul de 40% de acrilamida, 50 ul de 10% de persulfato de amónio (APS), e 5 ul de tetrametiletilenodiamina ( TEMED)) e 10 ml de 15% de gel de separação (3,65 ml de água destilada, 2,5 ml de tampão de gel de 4x mais baixo de pH 8,8, 3,75 ml de 40% de acrilamida, a 100 ul de APS a 10%,e 4 ul de TEMED).
- Na célula de electroforese, derramar empilhamento gel (5% de acrilamida) no topo do gel de separação (acrilamida a 15%) depois de este ter solidificado. Insira um pente de gel no gel de empilhamento.
- Execute página de acordo com as seguintes condições: condição inicial de execução: 100 volts, 20 min e condição final: 120 volts, 40 min.
- Corar o gel com azul brilhante de Coomassie à temperatura ambiente durante 30 min, até que o gel é uniformemente azul em cor.
Nota: A coloração é completa quando o gel não é mais visível na solução corante. - Destain-o com solução de ácido acético (10%) à temperatura ambiente durante 1 h. Bandas vão começar a aparecer. Continuar descoloração a 4 ° C durante a noite até que o fundo é clara.
2. Peptide Synthesis e Produção de Anticorpo Monoclonal
- Recuperar as sequências de aminoácidos de MB a partir do GenBank incluindo atum, frango, avestruz, mamíferos domésticos, vedação e 18 espéciesde cetáceos (Tabela 2).
- Alinhar as sequências utilizando software adequado 16:
- Inicie o Alignment Explorer selecionando Alinhar: Editar / Criar Alinhamento na barra de inicialização; selecione Criar Nova Alinhamento e clique em OK. Uma caixa de diálogo aparecerá perguntando "Você está construindo um alinhamento de sequências de DNA ou proteína?"
- Clique no botão "Protein"; selecione Dados: Open: recuperar seqüências de arquivo e selecione o arquivo de sequência; selecione Editar: Selecionar tudo comando de menu para selecionar todos os sites para cada sequência no conjunto de dados para a criação de um alinhamento múltiplo de sequências.
- Seleccione Alinhamento: Alinhar por ClustalW a partir do menu principal para alinhar os dados sequências selecionadas usando o algoritmo ClustalW; selecione "BLOSUM" como a proteína da matriz de peso, em seguida, clique no botão OK.
- Analisar o alinhamento da sequência:
- Concentre-se em 5 de si reativa antigênicates 17: Local 1 (AKVEADVA, 15-22), local 2 (KASEDLK, 56-62), local 3 (ATKHKI, 94-99), local 4 (HVLHSRH, 113-119) e sítio 5 (KYKELGY, 145- 151) e encontrar o fragmento conservado entre os cetáceos. Uma * (asterisco; símbolo consenso no alinhamento (protocolo 2.2.3)) indica as posições que têm um único resíduo, totalmente conservada. Os seguintes fragmentos conservados em cetáceos foram encontrados: sequência KASEDLKKHG (que inclui local 2) e sequência HVLHSRHP (que inclui local 4).
- Sintetizar fragmentos de sequência candidata de acordo com a análise de sequência, e conjugado com uma proteína de ovalbumina (OVA) como proteína veículo usando serviços comerciais.
- Adicionar aminoácidos hidrofóbicos (por exemplo, metionina) ao N-terminal do local reactivo antigénico para prevenir o péptido a partir da decomposição (por exemplo, M-KASEDLKKHG).
- Alongar a C-terminal do local reactivo antigénico para expor o local antigénico do núcleo para o imunócito. Além disso, conjuporta o péptido com OVA através da adição de uma cisteína (Cys, C) para o C-terminal (por exemplo, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulsionar o adjuvante completo de Freund para um imunogénio ou adjuvante incompleto de Freund para o imunogénio 2 com um volume igual de cada péptido sintético em PBS (3 mL, concentração final de 30-50 ug / 100 uL).
- Inocular imunogénio 1 (0,1 mg) subcutaneamente em cada um de cinco fêmeas BALB / c.
- Execute injecções de reforço subcutâneos cinco vezes usando imunógeno 2 em intervalos de duas semanas e recolher soros de teste por amostragem cauda clipe dos camundongos antes de cada reforço.
- Determinar título soros pela primeira triagem.
- Dissolve-se 100 ug de péptido livre em 25 ml de tampão de reacção e alíquota de 50 ul da solução em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicionar solução de reagente de acoplamento de 10 ul a cada poço e a placa misturar. Incubar a placa durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Remover os conteúdos do poço,lavar cada poço 3 vezes com água destilada, e bloquear a placa adicionando 200 ul de solução de bloqueio. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Remover o conteúdo e lavar cada cavidade 3 vezes com água destilada.
- Execute ELISA indireto (Protocolo 5,1-5,7) para determinar soros título pela primeira triagem. Escolha o mouse com o título mais elevado (maior densidade óptica) para a coleta de baço.
- Três dias antes da colheita do baço, inocular 0,1 mg de imunógeno 1 por via subcutânea no rato apresentando o maior título.
- Recolher as células do baço dos ratinhos imunizados seleccionados e fundir com células de mieloma de murino F0 (SP2 / 0-Ag14) para se obter células de hibridoma para produção de mAb 18.
- 14 dias após a fusão, selecione os clones positivos por rastreio a reactividade dos sobrenadantes de hibridoma em direção péptido sintético livre usando ELISA indireto (Protocolo de 5,1-5,7).
- Dilui-se as células para um número apropriado por poço para maximizing a proporção de poços que contêm apenas um clone único (diluição clonagem).
- Adicionar 100 ul de meio de cultura celular para todos os poços da placa de 96 poços excepto A1 bem que é deixado vazio.
- Adicionar 200 ul da suspensão de células para o poço A1. Em seguida, transferir rapidamente 100 mL de A1 a B1 e misture com cuidado pipetando. Repita essas 1: 2 diluições para baixo toda a coluna, e depois descartá 100 ul de H1 de modo que termina com o mesmo volume que os poços acima dela.
- Adicionar mais 100 ul de meio para a coluna 1 com uma micropipeta de 8 canais. Em seguida, transferir rapidamente 100 pi de cada um dos poços na coluna 1 para aqueles na coluna 2, utilizando a mesma pipeta, e misturar por pipetagem suave.
- Utilizando as mesmas pontas, repetir estes 1: 2 diluições em toda a placa. Rejeitar 100 ul de cada um dos poços na última coluna.
- Levar o volume final de todas as cavidades a 200 ul pela adição de 100 ul de meio para cada poço. incubar plate não perturbadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora.
- Verifique cada poço e marcar todos os poços que contêm apenas uma única colônia. Efectuam-se duas ou mais clonagens até> 90% dos poços contendo clones individuais são positivas para a produção de anticorpos.
- Peneirar os clones por western blot e dot blot (protocolo 3,1-4,6). Então colônias subcultura dos poços em navios de maior porte para expandir as células para a obtenção de mAb. Normalmente, cada clone é transferida para um único poço de uma placa de 12 ou 24 poços.
- Medir a afinidade entre os mAbs e os extratos de músculo de vaca, cabra, porco, cão, coelho, atum, frango, selo, e quatro espécies de cetáceos representativos por western blot e dot blot (protocolo 3,1-4,6).
- Inocular células de hibridoma seleccionadas (até 3 x 10 6) intraperitoneal em ratinhos para induzir ascite. inchaço abdominal é tipicamente evidente dentro de 7-10 dias após a injecção de hibridoma. Recolha de fluido utilizando uma agulha hipodérmica(Menos do que um calibre 20).
- fluido de ascites de centrifugação (10.000 xg durante 10 min) para remover as células e detritos. Filtrar através de um filtro de 0,45 um. Adicionar 1 a 20 ml da amostra, 15 ml de tampão de ligação, e de 3 a 5 ml de tampão de eluição à coluna de proteína G-Sepharose. Recolher a fracção de eluição contendo o anticorpo purificado a partir do fluido de ascites ratos.
- Determinar o isotipo de anticorpos pelo kit de isotipagem de anticorpos utilizando as instruções do fabricante.
3. Western Blot
- Preparar tampão de carga 2x contendo β-mercaptoetanol (BME) por mistura de 950 ul de tampão de amostra Laemmli 2x com 50 ul de BME. Diluir o sobrenadante musculares (protocolo 1,1-1,4) em tampão de carregamento com proporção adequada para a obtenção de bons sinais: 1:50 (cetáceos e focas) e 1: 5 (animais domésticos e atum) quando se utiliza anticorpo Mb policlonal de coelho anti-humano e 1: 1 (porco, coelho, frango e atum), 1: 5 (vaca, cabra e cão) e 1:25 (cetáceos e selo) quando umntibody é a partir do sobrenadante de hibridoma.
- amostra de calor a 95 ° C durante 5 min. Carregar as amostras nas cavidades do gel de SDS-PAGE (acrilamida a 4% de empilhamento e 12% de separação de acrilamida), juntamente com marcadores de peso molecular. Submeter o gel durante 5 min a 50 V, então, aumentar a tensão para 150 V para terminar o prazo em cerca de 1 h.
- Colocar o gel em tampão de transferência 1x durante 15 min. Transferir a proteína separadas para nitrocelulose (NC) membranas depois de serem separados por PAGE. A transferência pode ser realizada a 100 V durante 60-90 min.
- Preparar solução de bloqueio: 1x PBS contendo 0,1% de Tween 20 com 5% de leite em pó magro. Bloquear a membrana de NC em 25 ml de solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. Lavar três vezes durante 5 min cada com 15 ml de solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 (PBST).
- Incubar a membrana e o anticorpo primário (fluido de ascites ou sobrenadante de hibridoma) em 10 ml de tampão de diluição do anticorpo diluído com solução de bloqueio 5% a 4 ° C durante a noite.
- Lava-se a Membrane três vezes novamente com PBST para limpar anticorpo excessiva.
- Incubar a membrana com IgG conjugado com fosfatase alcalina de cabra anti-rato a 1: 1250 em solução de bloqueador com agitação suave durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Lava-se a membrana de novo e incubar-lo no cloreto de fosfato de / p-nitroazul de tetrazólio 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP / NBT) mistura de substrato de fosfatase de 10 a 20 min, até o desenvolvimento da cor.
- Parar a reacção por lavagem da membrana em várias mudas de água destilada.
4. Dot Blot
- Diluir o sobrenadante musculares (protocolo 1,1-1,4) em albumina de soro bovino a 5% (BSA) em PBST com proporção adequada para a obtenção de bons sinais: 1: 5 para animais domésticos e atum, e 01:25 para os cetáceos e focas. Ponto 5 ul de amostras para uma membrana. Minimizar a área que a solução penetra (normalmente 3-4 mm de diâmetro), aplicando-o lentamente.
- Seca-se a membrana à temperatura ambiente (por exemplo, </ Em> em fluxo laminar durante 30-60 min), bloqueá-lo com a solução em uma placa de Petri de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente, e lavá-lo com PBST.
- Incubar a membrana com anticorpo primário (mAb a partir do sobrenadante de hibridoma em 1: 10.000 ou fluido de ascites a 1: 100000 diluído em solução de bloqueio 5%) durante 1 h à temperatura ambiente.
- Uso PBST para se lavar a membrana três vezes durante 5 minutos cada para remover o excesso de anticorpo, e depois incubar com o anticorpo secundário (anti-IgG de rato alcalina de cabra conjugado com fosfatase a 1: 1250 em 5% de solução de bloqueio) durante 1 hora à temperatura ambiente .
- Lava-se a membrana de novo e incubar-lo na mistura de substrato da fosfatase BCIP / NBT dentro de 10 a 20 min, até o desenvolvimento da cor.
- Parar a reacção por lavagem da membrana em várias mudas de água destilada.
5. ELISA indireta
- Preparar o tampão de lavagem (0,002 M imidazol solução salina tamponada com 0,02% de Tween 20). Lavar a placa 3 vezes com lavagenstampão entre cada passo seguinte (protocolo 5,2-5,5).
- Prepare diluição 1:25 de sobrenadantes musculares (protocolo de 1,1-1,4) em tampão de revestimento. Bata de uma placa de 96 poços de ELISA com 100 ul sobrenadantes diluídos a 4 ° C durante a noite e bloqueá-lo com tampão (1% de BSA em PBS) de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente.
- Prepare uma diluição do Acm purificada com tampão diluído 2000 e adicionar 100 uL de mAb diluído a cada poço. Incubar a placa durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Adicionar IgG de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (1: 200 em tampão de diluição diluída) para posterior incubação.
- Adicionar substrato de peroxidase a cada poço (100 ul / cavidade) e incuba-se durante 10-15 min.
- Parar a reacção enzimática pela solução de peroxidase de paragem (100 ul / poço), quando o desenvolvimento da cor é observada.
- Leia a densidade óptica a 450 nm utilizando um espectrofotómetro de microplacas.
6. Preparação de mAb marcado com ouro coloidal Nota: A solução cor de ouro coloidal e a mistura deve ser sempre vermelho. Ajustar o pH, a concentração de mAb, a velocidade de centrifugação quando precipitado preto é notado. Passos 6.1 e 6.2 são passos de otimização.
- Adicionar purificada detectar mAb (50 ug / ml, 3 ul) a 100 ul de solução de ouro coloidal, com valores de pH variando entre 5-9. O pH mínima que mantém a cor vermelha durante duas horas é considerado como o valor óptimo do pH. Nota: Neste estudo, carbonato de potássio 0,1 M foi utilizada para ajustar o ouro coloidal (40 nm) de solução a pH 8,0 (pH óptimo).
- Adicionar várias quantidades de detectar purificados mAb (a 500 ng / ml, 1-20 ul) com 100 ul de uma solução de ouro coloidal a um pH de 8,0. Nota: A concentração óptima neste estudo é de 6 ug / ml (nenhum precipitado negro).
- De acordo com os resultados acima, adicionar 60? G de mAb purificado detectar gota a gota a 10 ml de uma solução de ouro coloidal. Emulsionar-se a mistura suavemente à temperatura ambiente durante 10 min. de Anúnciosd 2 ml de solução a 5% de BSA em PBS (pH 7,4) à mistura e emulsionar suavemente à temperatura ambiente durante 15 min para reduzir a interferência de fundo.
- Centrifugar a mistura a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Remover o sobrenadante com o anticorpo não conjugado e cuidadosamente suspender as pelotas resultantes em 4 ml de PBST contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20, e repetir centrifugação e suspensão várias vezes.
- Suspender os precipitados finais em 1 ml de PBST e armazená-lo a 4 ° C até ser utilizado.
7. Construção de Immune Faixa
Nota: A Figura 1 mostra o desenho tira imune. Preparar e montar as tiras em uma condição ambiental laboratório de baixa umidade (<20% de umidade relativa) para a vida de armazenamento prolongado (> 1 ano). As dimensões de almofadas de membrana e são: conjugado de almofada 300 mm x 10 mm, almofada absorvente 300 mm x 24 mm, amostra almofada 300 mm x 24 mm, NC membrana 300 mm x 25 mm, 300 pasteboardmm x 80 mm.
- Adicionar solução de mAb marcado com ouro coloidal a partir do passo 6.6 com uma micropipeta para saturar a almofada de conjugado e, em seguida, secar a 37 ° C durante 1 h antes da montagem.
- Distribuir o mAb (500 ug / ml) sobre a zona de teste de captura de antigénio, e de coelho anti-IgG de ratinho específico (500 ug / ml) na zona de controlo para detectar o mAb sobre a membrana de NC utilizando uma impressora pipeta ou imunotira. Manter uma distância (> 5 mm) entre as duas zonas a fim de evitar a interferência.
- Cole o pad conjugado, almofada absorvente e da membrana NC na área de trabalho com fita dupla face.
Nota: Sobreposição as almofadas de cada lado da membrana de NC por cerca de 2 mm. construção tira inapropriado resultará em um teste incompleto. - Coloque a almofada da amostra sobre a almofada de conjugado (2 mm) e colá-lo na área de trabalho.
- Criar 6 mm de tiras largas com um cortador de papel. Embalar as tiras no saco de folha de alumínio com exsicante, e armazená-las a 4 ° C até ser utilizado.
Teste 8. A reactividade cruzada
- Homogeneizar 0,03 g de amostra de músculo em bruto com 1 mL de PBS (contendo 0,1% de BSA) num tubo de centrífuga de 1,5 ml, utilizando uma vara de bambu ou de moagem haste.
- Segure a tira pela extremidade oposta às áreas de teste e mergulhe a parte da amostra pad para a amostra de 5-10 min e observar o resultado diretamente.
- Opcional: Colete 500 mL sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de centrífuga.
Nota: Este passo é sugerido se o sinal não é evidente quando a tira está directamente embebido para o sobrenadante.
- Opcional: Colete 500 mL sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de centrífuga.
- Testar várias amostras de músculo em triplicado.
Nota: Aqui nós testamos atum, frango, selo, 15 espécies de cetáceos e 5 espécies de mamíferos terrestres. - Tem cinco inspetores independentes repetir 8,3 por cinco vezes, ou seja, usar 575 faixas no total.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Características de anticorpos monoclonais
Nós desenvolvemos dois IgG 1 mAbs (CGF5H9 e CSF1H13) reconhecendo dois peptídeos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC e AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, do Mb de cetáceos, e estes foram utilizados para construir uma tira de teste imunocromatográfico do tipo sanduíche ouro coloidal para a rápida detecção de Mb de cetáceos. a Figura 2 mostra que detecta CGF5H9 cetáceos e outros mamíferos como uma única banda manchada com um peso molecular previsto de aproximadamente 17 kDa. A baleia-de-minke (Balaenoptera acutorostrata) mostra uma banda relativamente mais fracas do que as bandas de outros cetáceos. Bandas estão ausentes para o atum, galinhas e focas, enquanto observa-se uma banda a cerca de 50 kDa para os suínos. Embora existam várias bandas não específicas para suínos e atum, CSF1H13 é altamente específico porque reage somente com cetáceos e focas como uma banda com um peso molecular previsto de aproximadamente 17 kDa. Baleia Minke só mostra um forte sinal a 1:10 (dados não mostrados), com nenhum sinal observado em 1:25. A Figura 2 mostra resultados idênticos em dot blot.
A Figura 3A mostra que CGF5H9 demonstra sinal positivo para os cetáceos, coelhos, cães, cabras e vacas (valor OD> 3,0); fraco sinal positivo para suínos (valor OD = 1,5); sinal negativo para selos, galinhas e atum. Figura 3B mostra que CSF1H13 expressa alta afinidade para cetáceos e focas (valor OD> 3,0). Ambos CSF1H13 e CGF5H9 pode reagir fortemente com todas as quatro espécies de cetáceos. Estes quatro espécies são de famílias diferentes (baleia minke: Balaenopteridae; roaz: Delphinidae; cachalote-anão: Kogiidae; toninha finless: Phocoenidae), indicando a ampla reactividade às diversas espécies de cetáceos.
Para a construção de strip, CGF5H9, que reconhece tele MBs de cetáceos e outros mamíferos, é colóide e utilizado como anticorpo de detecção para se ligar a mioglobina, e CSF1H13 é revestida na linha de teste apenas para capturar os MBs de cetáceos e focas marcado com ouro. Portanto, a linha de teste é projetado para mostrar um sinal positivo quando ambos os mAbs detectar Mb de cetáceos. Uma vez que o Mb a partir de animais não-cetáceas só pode ser detectada por um destes dois mAb, a linha de teste mostra um resultado negativo quando amostras de músculo provenientes de outros animais são testados. A linha de controle mostra sempre um resultado positivo, porque IgG de coelho anti-rato liga colóide CGF5H9 marcado com ouro. Um resultado de falha na linha de controlo indica que a qualidade dos materiais sobre a tira é pobre.
tira de teste
A Figura 4 mostra as bandas de sinais tanto a linha de teste e da linha de controlo quando as amostras do músculo cetáceas são utilizados. Quando a amostra não é de cetáceos, há apenas uma única banda na linha de controlo with ausência de banda na linha de teste. Um bom resultado pode ser observado diretamente em 5-10 min após homogeneização 0,03 g do músculo com 10 ml de PBS contendo 0,1% de BSA usando uma vara de plástico ou bambu e imersão da tira na mistura. Após testar 15 espécies de cetáceos e oito espécies não-cetáceos em triplicado, especificidade (a percentagem de amostras não-cetáceos corretamente identificados) e sensibilidade (a percentagem de amostras de cetáceos corretamente identificados) são ambos 100%.
Figura 1. Desenho da tira imune. Todos os componentes são cuidadosamente em camadas sobre a placa de plástico de suporte de modo que elas se sobreponham. Isto permite que os reagentes e amostra fluir para cima através da membrana e para a almofada absorvente. T: zona de teste. C: zona de controlo. Esta figura foi reproduzida de Lo, C. et al. Rápido tira ouro coloidal imunológicopara cetáceo carne de restrição comércio ilegal e consumo:. implicações para a conservação e a saúde pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A análise de Western blot e dot blot utilizando-se os sobrenadantes de hibridoma. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Ambos os sobrenadantes de hibridoma pode detectar cetáceos como uma única banda manchado com um peso molecular previsto de aproximadamente 17 kDa. MW: baleia minke, BND: golfinho, DSW: anão cachalote, FP: boto-do-índico, PKW: baleia de assassino do pigmeu, N: PBS (controle negativo). Esta figura foi reproduzida de Lo, C. et al. Rápido imunológico tira ouro coloidal para cetacean restrição carne comércio ilegal e consumo:. implicações para a conservação e a saúde pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. ELISA Indirecto de extractos musculares de diferentes espécies, utilizando mAbs purificados. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Somente cetáceos pode produzir sinais positivos fortes em ambos os mAbs. Esta figura foi reproduzida de Lo, C. et al rápido imunológico tira ouro coloidal para a carne de cetáceos restrição comércio ilegal e consumo:.. Implicações para a conservação e a saúde pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Especificidade da tira ouro coloidal imunológico. T: linha de teste. C: linha de controle. Somente quando amostras de músculo de cetáceos são utilizados, resultados bem sucedidos (bandas de sinal, tanto a linha de teste e linha de controle) podem ser observados. (A) amostras não-cetáceos: 1: Vaca. 2: Cabra. 3: Pig. 4: Dog. 5: Coelho. 6: Tuna. 7: Chicken. 8: Selo de porto (vitulina do Phoca). (B) amostras de Cetáceos: 1: baleia-de-minke (Balaenoptera acutorostrata). 2: baleia (Balaenoptera omurai) de Omura. 3: Golfinho (Tursiops aduncus). 4: Golfinho (T. truncatus). 5: Golfinho de Fraser (Lagenodelphis hosei </ Em>). 6: Indo-Pacífico golfinho corcunda (Sousa chinensis). 7: golfinho (Grampus griseus) de Risso. 8: Pantropical golfinho malhado (Stenella attenuata). 9: golfinho-de-dentes-rugosos (Steno bredanensis). 10: pigmeu baleia assassina (Feresa attenuata). 11: baleia piloto Short-finned (Globicephala macrorhynchus). 12: baleia Melão-dirigida (Peponocephala Electra). 13: cachalote anão (Kogia sima). 14: pigmeu esperma de baleia (breviceps K.). 15: toninha Finless (phocaenoides Neophocaena). Esta figura foi reproduzida de Lo, C. et al rápido imunológico tira ouro coloidal para a carne de cetáceos restrição comércio ilegal e consumo:.. Implicações para a conservação e a saúde pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| espécies de cetáceos | Espécies não-cetáceos |
| Cachalote pigmeu (breviceps Kogia) | Selo de porto (vitulina do Phoca) |
| Cachalote-anão (Kogia sima) | Dog (familiaris Canis lupus) |
| Curto-barbatanas de baleia-piloto (Globicephala macrorhynchus) | Coelho (Oryctolagus cuniculus) |
| Golfinho-cabeça-de-melão (Peponocephala Electra) | Porco (Sus scrofa) |
| Baleia assassina pigmeu (Feresa attenuata) | Cabra (Capra hircus) |
| Pantropical golfinho malhado (Stenella attenuata) | Bovinos (Bos taurus) |
| Roaz (Tursiops truncatus) | Frango (Gallus gallus) |
| Roaz (Tursiops aduncus) | Atum albacora (Thunnus albacares) |
| Golfinho de Fraser (Lagenodelphis hosei) | |
| Indo-Pacífico golfinho corcunda (Sousa chinensis) | |
| Golfinho-de-dentes-rugosos (Steno bredanensis) | |
| Golfinho-de-risso (Grampus griseus) | |
| Toninha Finless (phocaenoides Neophocaena) | |
| Baleia-de-minke (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Baleia de Omura (Balaenoptera omura i) |
Tabela 1. As espécies das quais muscular foi colleCTED e testados neste estudo. As espécies incluem atum, frango, selo, 5 espécies de mamíferos terrestres, e 15 espécies de cetáceos (4 famílias).
| Espécies | Adesão não. |
| Baleia-de-minke (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Do pigmeu Bryde baleia (Balaenoptera edeni) | Q0KIY2 |
| Baleia jubarte (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Baleia cinzenta (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Cachalote (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Cachalote pigmeu (breviceps Kogia) | Q0KIY5 |
| Cachalote-anão (Kogia sima) | P02184 |
| Curto-beaked golfinho-comum (Delphinus Delphinus) | P68276 |
| Voador baleias-piloto (Globicephala melas) | P02174 |
| Baleia assassina (Orcinus) | P02173 |
| Golfinho-cabeça-de-melão (Peponocephala Electra) | Q0KIY3 |
| Pantropical golfinho malhado (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Roaz (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Porto toninha (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Boto (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Baleia bicuda de Longman (pacificus Indopacetus) | Q0KIY9 |
| Baleia bicuda Hubbs '(Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Baleia bicuda de Cuvier (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Selo de porto (vitulina do Phoca) | P68080 |
| Bovinos (Bos taurus) | P02192 |
| Cabra (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Cavalo (Equus caballus) | P68082 |
| Porco (Sus scrofa) | P02189 |
| Dog (familiaris Canis lupus) | P63113 |
| Frango (Gallus gallus) | P02197 |
| Avestruz (Struthio camelus) | P85077 |
| Atum albacora (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabela 2. As sequências de mioglobina utilizados neste estudo com os respectivos números de acesso GenBank. As espécies incluem atum,frango, avestruz, mamíferos domésticos, vedação e 18 espécies de cetáceos (7 famílias). Esta tabela foi reproduzida de Lo, C. et al rápido imunológico tira ouro coloidal para a carne de cetáceos restrição comércio ilegal e consumo:. Implicações para a conservação e a saúde pública PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Usando um péptido sintético conjugado com a proteína transportadora é notavelmente mais eficaz em comparação com a sua proteína cognata. Para uma técnica baseada em sanduíche, porque o mAb é desenvolvida usando epitopos com posições relativas conhecidas, os dois mAb neste estudo não são susceptíveis de interferir com a interacção do outro com o epítopo de antigénio alvo. Além disso, a reactividade entre a proteína nativa e o anticorpo de murganhos imunizados com o péptido sintético conjugado pode ser mais forte do que a reactividade entre a proteína nativa e o anticorpo produzido a partir da proteína nativa 19. Portanto, é recomendável o uso de conjugados de peptídeos sintéticos para procedimentos de imunização eficazes e geração de mAb anti-péptido apropriado.
A estrutura de uma proteína envolve, principalmente, a sequência de ácidos aminados na cadeia polipeptídica. Cada aminoácido tem a sua cadeia lateral que conduz a propriedades específicas, e alterando ligeiramente o amino acisequência d resulta em mudanças na estrutura. Porque os péptidos com um comprimento de 10-20 aminoácidos são ideais para a preparação de anticorpos, o comprimento dos péptidos sintéticos (imunogénios) na região C-terminal foi aumentada para assegurar que a região antigénica do núcleo seria reconhecida. Portanto, os resíduos de aminoácidos entre os MBs de vários animais, resultando em diferentes estruturas de epitopo poderia ser eficientemente diferenciadas. Por exemplo, a Figura 3A mostra o projeto peptídeo mencionado contribui para CGF5H9 reagir fortemente com cetáceos, mas negativamente com selos. Outro exemplo é as afinidades diferentes em relação a galinhas e cães de CGF5H9 embora a galinha tem uma sequência idêntica à do cão no sítio antigénico núcleo 2. Isto indica que a diferença de sequência na região exterior poderia levar à mudança da estrutura e, portanto, variável afinidade entre o antigénio e o anticorpo de ligação.
western blot, dot blot e ELISA indireto foram utilizados emo nosso método para o rastreio de mAbs apropriados. Western blot é amplamente utilizado para detectar proteínas específicas em extracto de tecido ou homogeneizado. Nesta técnica, electroforese em gel é usado para separar as proteínas desnaturadas por o comprimento do polipéptido. Portanto, é possível confirmar se o sinal indica que o peso molecular de proteína prevista. No entanto, o resultado de detecção (sinal positivo ou negativo, forte ou fraco) pode não ter representada a situação real do anticorpo de ligação ao antigénio, porque as proteínas desnaturadas são utilizados. Consequentemente, dot blot pode ser utilizada para o rastreio de segunda fase. Dot blot é uma técnica para detectar proteínas. Ele representa uma simplificação do método de Western blot. Em dot blot, uma mistura contendo a molécula a ser detectada é aplicada directamente sobre uma membrana como um ponto. Isso é diferente de um western blot porque as amostras de proteína não são desnaturadas. Note-se que esta técnica não oferece nenhuma informação sobre o tamanho da biomolécula alvo, e um único ponto irá aparecer se dois MOlecules de tamanhos diferentes são detectados. Finalmente, ensaio ELISA indirecto, é utilizado para um ensaio de ligação ao ligando, a fim de gerar um sinal que pode ser devidamente quantificado. Ele fornece mais informações das características mAb e, assim, facilita a construção de strip.
As concentrações de MB no músculo são variáveis dependendo do local de recolha. Por exemplo, os músculos natação (músculos axiais) em cetáceos têm um teor significativamente maior de Mb comparado com os músculos não-natação, e as amostras de jovens cetáceos teria menor concentração Mb porque a concentração Mb aumenta ao longo da vida de um animal 20. Inicialmente, CSF1H13, que só capta o Mb de cetáceos e focas, foi destinado a ser marcado com ouro coloidal e estar a detectar anticorpos e CGF5H9, que reconhece o Mb de muitas espécies, seria anticorpo de captura na linha de teste. Nossa hipótese é que o anticorpo de detecção deve ser mais específico e o anticorpo de captura deveser mais geral. No entanto, um sinal positivo fraco foi encontrada na linha de teste quando foram usadas amostras com concentrações baixas cetáceas Mb (dados não mostrados). O problema foi resolvido quando as posições dos dois mAb foram invertidos como descrito nos resultados representativos. Um bom sinal foi mostrado mesmo para um cetáceo recém-nascido (a Baleia encalhada de Omura) (Figura 4). Não está claro se as características e concentração de mAbs contribuir para este fenómeno.
Neste estudo, as amostras de músculo congelado-descongelado homogeneizados com PBS foram usadas no teste de tira. Outras condições de amostras e métodos de preparação pode afetar o resultado. Por exemplo, a proteína solúvel em sal, tal como Mb deve ser extraído utilizando PBS em vez de água pura. Caso contrário, a extracção pode ser inadequada, o que pode levar a um resultado aberrante. O tampão de extracção apropriado: rácio de amostra de carne é em parte responsável pela interpretação bem-sucedida do resultado com fita. Grande amount (0,3 g em 1 ml de tampão) de amostras de controlo (por exemplo, animais domésticos) pode causar resultado positivo e fundo desfocado. No entanto, a proporção utilizada neste estudo (1: 0,03) produziu resultados correctos. Somente amostras de músculo fresco pode ser usado para este teste tira. A proteína pode ser desnaturada ou hidrolisado após certos tratamentos (tais como cura por molho de soja e de ebulição), que podem conduzir a resultados positivos não apenas para amostras de músculo cetáceas, mas também a partir de amostras de outros animais (dados não mostrados). Portanto, sugere-se que as fontes de amostra variáveis e diferentes planos de projeto de construção deve ser usado durante o desenvolvimento de strip.
Em conclusão, este protocolo descreve o desenvolvimento de dois mAbs fortemente reativas ao Mb de cetáceos, e estes mAbs são aplicados sobre uma tira de teste rápido para diferenciar o Mb de cetáceos de vedação e outros animais. Embora a análise de DNA à base de PCR para a identificação fiável de carne cetáceo está disponível 12, o Is trabalhoso e demorado. A tira de teste é uma técnica rápida e fiável e que pode ser usado no campo para identificar cetáceas carnes, o que é altamente desejável para as agências reguladoras 21. É provável que a tira pode ser desenvolvido para a detecção de Mbs específicas a partir de animais, tais como cavalos ou porcos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
