Protocol
Etik Statement: Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med internationale retningslinjer og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) for National Chiayi University, godkendelse ID: 99022. Den hvaler brug prøve blev tilladt af Rådet for Landbrug i Taiwan (Research Permit 100M-02.1-C-99).
1. Muskel Prøveforberedelse og SDS-PAGE
Bemærk: Muskel prøver fra 23 arter, herunder 16 arter af havpattedyr, 5 arter af terrestriske pattedyr, blev tun og kylling anvendt i denne undersøgelse (tabel 1). De hvaler muskel prøver blev indhentet fra strandede enkeltpersoner, fiskeri bifangst og konfiskation. Kanin, rotte, hund og kylling muskelvæv blev opnået fra Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi University. Prøver af oksekød, svinekød, lam og tun blev indkøbt fra et lokalt supermarked. Musklen prøve af spættet sæl (Phoca vitulina
- Opbevar alle prøver ved -20 ° C indtil anvendelse.
- Pre-cool mørtel ved -20 ° C. Derefter sætte 3 g frossen muskel prøve ind i det.
- Homogenisere prøven med 10 ml koldt phosphatpufret saltvand (PBS) under anvendelse af en vævshomogenisator.
- Centrifugeres den homogeniserede prøve ved 10.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Indsamle supernatanterne og opbevare det ved -20 ° C indtil anvendelse.
- Forbered 5 ml 5% stacking gel (3,07 ml destilleret vand, 1,25 ml 4x øvre gel buffer med pH 6,8, 625 pi 40% acrylamid, 50 pi 10% ammoniumpersulfat (APS), og 5 pi tetramethylethylendiamin ( TEMED)) og 10 ml 15% adskillende gel (3,65 ml destilleret vand, 2,5 ml 4x nedre gel buffer med pH 8,8, 3,75 ml 40% acrylamid, 100 pi 10% APS,og 4 pi TEMED).
- I elektroforese celle, hæld stacking gel (5% acrylamid) oven på separerende gel (15% acrylamid) efter at dette er størknet. Indsæt en gel kam i stacking gel.
- Udfør SIDE henhold til følgende betingelser: indledende løb tilstand: 100 volt, 20 min og sidste betingelse: 120 volt, 40 min.
- Farv gelen med Coomassie brilliant blue ved stuetemperatur i 30 min, indtil gelen er ensartet blå farve.
Bemærk: Farvning er afsluttet, når gelen er ikke længere synlig i farveopløsningen. - Affarves det med eddikesyre-opløsning (10%) ved stuetemperatur i 1 time. Bands vil begynde at dukke op. Fortsæt affarvning ved 4 ° C natten over, indtil baggrunden er klar.
2. Peptide Synthesis og monoklonalt antistof
- Hent aminosyresekvenserne af Mb fra GenBank herunder tun, kylling, struds, indenlandske pattedyr, stempel og 18 arteraf hvaler (tabel 2).
- Juster sekvenserne ved hjælp ordentlig software 16:
- Start Justering Explorer ved at vælge Juster: Rediger / Byg Justering på startlinjen; Vælg Opret ny Justering og klik OK. En dialog vises som spørger "Er du opbygge en DNA eller protein sekvens alignment?"
- Klik på knappen "Protein"; Vælg Data: Åbent: Hent sekvenser fra Filer og vælge sekvens fil; vælge Edit: Vælg alt menukommando at vælge alle steder for hver sekvens i datasættet for at skabe en tilpasning multipel sekvens.
- Vælg Justering: Juster ved ClustalW fra hovedmenuen for at justere de valgte sekvenser data ved hjælp af ClustalW algoritmen; vælg "BLOSUM" som Protein Vægt Matrix klik derefter på OK.
- Analyser sekvensalignment:
- Fokus på fem antigen reaktiv sites 17: site 1 (AKVEADVA, 15-22), site 2 (KASEDLK, 56-62), sted 3 (ATKHKI, 94-99), sted 4 (HVLHSRH, 113-119) og site 5 (KYKELGY, 145- 151) og finde fragmentet konserveret blandt hvaler. En * (stjerne; konsensus symbol i tilpasningen (Protokol 2.2.3)) angiver positioner, som har et enkelt, fuldt bevaret rest. Følgende bevarede fragmenter i hvaler blev fundet: sekvens KASEDLKKHG (som omfatter site 2) og sekvensen HVLHSRHP (som omfatter sted 4).
- Syntetisere kandidat sekvensfragmenter ifølge sekvensanalyse og konjugat med et ovalbumin-protein (OVA) som bærerprotein anvendelse af kommercielle tjenester.
- Tilføj hydrofobe aminosyrer (fx methionin) til N-terminalen af antigenisk reaktivt sted for at forhindre peptidet fra nedbrydning (fx M-KASEDLKKHG).
- Forlænge C-terminalen af antigenisk reaktivt sted til eksponering kernen antigent sted til immunocytten. Endvidere conjugate peptidet med OVA ved at tilføje en cystein (Cys, C) til den C-terminale (f.eks M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulgere komplet Freunds adjuvans for immunogen 1 eller Freunds inkomplette adjuvans for immunogen 2 med et lige volumen af hver syntetisk peptid i PBS (3 ml, slutkoncentration 30-50 ug / 100 pi).
- Inokulering immunogen 1 (0,1 mg) subkutant i hver af 5 BALB / c-mus.
- Udfør subkutane booster injektioner fem gange ved hjælp af immunogen 2 med to ugers mellemrum og indsamle testsera ved hale klip sampling fra musene før hver booster.
- Bestem sera titer for den første screening.
- Opløs 100 ug fri peptid i 25 ml reaktionsbuffer og alikvot 50 pi af opløsningen i hver brønd på en plade med 96 brønde. Tilsæt 10 pi koblingsreagens opløsning til hver brønd, og bland pladen. Inkubér pladen i 2 timer ved stuetemperatur.
- Fjerne indholdet af brønden,vask hver brønd 3 gange med destilleret vand, og blokere pladen ved tilsætning af 200 pi blokeringsopløsning. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Fjern indholdet og vask hver brønd 3 gange med destilleret vand.
- Udfør indirekte ELISA (Protokol 5,1-5,7) til bestemmelse af sera titer for den første screening. Vælg musen med den højeste titer (højeste optiske densitet) for milt samling.
- Tre dage før milt indsamling, pode 0,1 mg immunogen 1 subkutant i mus indebærer den største titer.
- Indsamle miltcellerne fra de udvalgte immuniserede mus og sikring med murine myelomceller F0 (SP2 / 0-Ag14) til opnåelse hybridomaceller for mAb generation 18.
- 14 dage efter fusion, vælge de positive kloner ved screening af reaktiviteten af hybridomsupernatanter mod fri syntetisk peptid ved indirekte ELISA (protokol 5,1-5,7).
- Fortynd cellerne til et passende antal per brønd for maximizing andelen af brønde, der kun indeholder én enkelt klon (fortyndingskloning).
- Tilsæt 100 pi cellekulturmedium til alle brøndene i 96-brønds plade undtagen brønd A1, som efterlades tomt.
- Tilsæt 200 pi af cellesuspensionen til brønd A1. Så hurtigt overføre 100 pi fra A1 til B1 og bland ved forsigtigt pipettering. Gentag disse 1: 2 fortyndinger ned hele kolonnen, og derefter kassere 100 pi fra H1, så det ender med den samme volumen som brøndene ovenover.
- Tilføj yderligere 100 ul medium til kolonne 1 med en 8-kanals mikropipette. Så hurtigt overføre 100 pi fra hver af brøndene i kolonne 1, til de i kolonne 2 under anvendelse af samme pipette, og blandes ved forsigtigt at pipettere.
- Anvendelse af de samme tips, gentage disse 1: 2 fortyndinger over hele pladen. Kassér 100 pi fra hver af brøndene i den sidste kolonne.
- Bring slutvolumenet af alle brønde til 200 pi ved tilsætning af 100 pi medium til hver brønd. inkuber plate uforstyrret ved 37 ° C i en fugtig CO2-inkubator.
- Kontroller hver brønd og markere alle brønde, der indeholder blot en enkelt koloni. Der foretages to eller flere kloninger, indtil> 90% af brøndene indeholdende enkelte kloner er positive for antistof produktion.
- Screen klonerne ved Western blot og dot blot (protokol 3,1-4,6). Så subkultur kolonier fra brøndene i større skibe til at udvide celler for at opnå mAb. Normalt hver klon overføres til en enkelt brønd i en 12- eller 24-brønds plade.
- Mål affinitet mellem mAbs og muskel ekstrakter fra ko, ged, gris, hund, kanin, tun, kylling, sæl, og fire repræsentative hvalarter ved Western blot og dot blot (protokol 3,1-4,6).
- Pode udvalgte hybridomceller (op til 3 x 10 6) intraperitonealt i mus for at inducere ascites. Abdominal hævelse er typisk indlysende inden for 7-10 dage efter hybridom injektion. Indsamle fluid under anvendelse af en kanyle(Mindre end 20 gauge).
- Centrifuge ascitesvæske (10.000 x g i 10 minutter) for at fjerne celler og rester. Der filtreres gennem et 0,45 um filter. Tilsæt 1 til 20 ml af prøven, 15 ml bindende buffer og 3 til 5 ml elueringsbuffer i proteinet G Sepharose-søjlen. Opsaml elueringsfraktion indeholdende oprenset antistof fra mus ascitesvæsken.
- Bestem antistofisotypen ved hjælp af antistof isotypebestemmelse kit efter fabrikantens instruktioner.
3. Western Blot
- Forbered 2x loading buffer indeholdende β-mercaptoethanol (BME) ved blanding af 950 pi 2x Laemmli-prøvebuffer med 50 pi BME. Fortynd musklen supernatanter (protokol 1.1-1.4) i lastning buffer med passende forhold for at opnå gode signaler: 1:50 (hvaler og sæler) og 1: 5 (husdyr og tun), når der anvendes polyklonale kanin anti-human Mb antistof, og 1: 1 (gris, kanin, kylling og tun), 1: 5 (ko, ged og hund), og 1:25 (hvaler og segl), når enntibody er fra hybridomsupernatant.
- Varme prøve ved 95 ° C i 5 min. Indlæs prøver i brøndene på SDS-PAGE-gel (4% acrylamid stacking og 12% acrylamid adskillende) sammen med molekylvægtmarkører. Kør gelen i 5 minutter ved 50 V derefter øge spændingen til 150 V for at afslutte løb omkring 1 hr.
- Gelen anbringes i 1x transfer buffer i 15 min. Overfør det fraskilte protein til nitrocellulose (NC) membraner, efter at de er adskilt ved PAGE. Transfer kan gøres på 100 V i 60-90 min.
- Forbered blokeringsopløsning: 1x PBS indeholdende 0,1% Tween 20 med 5% fedtfri tørmælk. Blokere NC-membran i 25 ml blokerende opløsning ved stuetemperatur i 1 time. Der vaskes tre gange i 5 min hver med 15 ml phosphatbufret saltvand med Tween 20 (PBST).
- Inkuber membranen og primære antistof (ascitesvæske eller hybridoma supernatant) i 10 ml antistof fortyndingsbuffer fortyndet med 5% blokerende opløsning ved 4 ° C natten over.
- Vask membrane tre gange igen med PBST at rense ud overdreven antistof.
- Inkuber membranen med alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti-muse-IgG ved 1: 1.250 i blokker opløsning under forsigtig omrøring i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask membranen igen og inkuber det i 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat / p-nitroblåt tetrazoliumchlorid (BCIP / NBT) phosphatasesubstrat blandingen i 10 til 20 min, indtil farveudvikling.
- Reaktionen standses ved vask af membranen i flere hold destilleret vand.
4. Dot blot
- Fortynd musklen supernatanter (protokol 1.1-1.4) i 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBST med passende forhold for at opnå gode signaler: 1: 5 for husdyr og tun, og 1:25 til hvaler og segl. Spot 5 pi prøver onto membran. Minimer det område, at løsningen trænger (normalt mm i diameter 3-4) ved at anvende det langsomt.
- Tør membranen ved stuetemperatur (f.eks </ Em> i en laminar strømning i 30-60 min), blokere det med blokerende opløsning i petriskål i 1 time ved stuetemperatur, og vask det med PBST.
- Inkuber membranen med primært antistof (mAb fra hybridomsupernatant på 1: 10.000 eller ascitesvæsken ved 1: 100.000 fortyndet i 5% blokeringsopløsning) i 1 time ved stuetemperatur.
- Brug PBST at vaske membranen tre gange i 5 min hver at fjerne overskydende antistof og derefter inkubere det med sekundært antistof (alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti-muse-IgG ved 1: 1.250 i 5% blokeringsopløsning) i 1 time ved stuetemperatur .
- Vask membranen igen og inkuber det i BCIP / NBT phosphatasesubstrat blanding inden for 10 til 20 min, indtil farveudvikling.
- Reaktionen standses ved vask af membranen i flere hold destilleret vand.
5. Indirekte ELISA
- Forbered vaskebuffer (0,002 M imidazol saltvand med 0,02% Tween 20). Vask pladen 3 gange med vaskbuffer mellem hvert af de følgende trin (protokol 5,2-5,5).
- Forbered 1:25 fortynding af muskel supernatanter (protokol 1,1-1,4) i coating buffer. Coat en 96-brønds ELISA-plade med 100 pi fortyndede supernatanter ved 4 ° C natten over og blokere det med blokerende buffer (1% BSA i PBS) i 1 time ved stuetemperatur.
- Forberede 1: 2.000 fortynding af det oprensede mAb med fortyndet buffer, og der tilsættes 100 pi af fortyndet mAb til hver brønd. Inkubér pladen i 1 time ved stuetemperatur.
- Tilføj gede-anti-muse-IgG konjugeret med peberrodsperoxidase (1: 200 fortynding i fortyndet buffer) til yderligere inkubation.
- Tilføj peroxidasesubstrat til hver brønd (100 pl / brønd) og inkuberes i 10-15 min.
- Stop enzymreaktionen ved peroxidase stopopløsning (100 pl / brønd), når farveudvikling iagttages.
- Læs den optiske densitet ved 450 nm under anvendelse af en mikroplade-spektrofotometer.
6. Forberedelse af Kolloid Gold-mærket mAb Bemærk: Farven på kolloidt guld, og blandingen bør altid være rød. Juster pH, koncentration af mAb, centrifugehastighed når sort bundfald bemærket. Trin 6.1 og 6.2 er optimering trin.
- Tilføj oprenset påvisning mAb (50 ug / ml, 3 pi) til 100 pi af kolloidt guld opløsning med pH-værdier varierer fra 5-9. Den mindste pH, der holder farven rød i to timer betragtes som det optimale pH. Bemærk: I denne undersøgelse blev 0,1 M kaliumcarbonat bruges til at justere kolloid guld (40 nm) opløsning til pH 8,0 (optimalt pH).
- Tilføj forskellige mængder af rensede påvisning mAb (500 ug / ml, 1-20 pi) til 100 pi kolloidt guld opløsning ved pH 8,0. Bemærk: Den optimale koncentration i denne undersøgelse er 6 ug / ml (ingen sorte bundfald).
- Ifølge de ovenstående resultater, tilsættes 60 ug oprenset påvisning mAb dråbevis til 10 ml kolloid guld opløsning. Emulgere blandingen forsigtigt ved stuetemperatur i 10 min. Add 2 ml 5% BSA-opløsning i PBS (pH 7,4) til blandingen, og emulgere forsigtigt ved stuetemperatur i 15 minutter for at reducere baggrunden interferens.
- Centrifugeres blandingen ved 10.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten med ukonjugeret antistof omhyggeligt og suspendere de resulterende pellets i 4 ml PBST med 1% BSA og 0,1% Tween 20, og gentag centrifugering og suspension flere gange.
- Hæng den endelige bundfald i 1 ml PBST og opbevar det ved 4 ° C indtil brug.
7. Konstruktion af Immune Strip
Bemærk: Figur 1 viser den immun strimmel design. Forbered og samle strimlerne i en lav-luftfugtighed laboratorium miljømæssig stand (<20% relativ fugtighed) for længere holdbarhed (> 1 år). Dimensionerne af puder og membran er: konjugatpude 300 mm x 10 mm, absorberende pude 300 mm x 24 mm, sample pad 300 mm x 24 mm, NC membranen 300 mm x 25 mm, montagebordet 300mm x 80 mm.
- Tilføj kolloid guld-mærket mAb-opløsning fra trin 6.6 med en mikropipette til at mætte konjugatpuden og tør ved 37 ° C i 1 time før montering.
- Fordel det specifikke antigen-indfangning mAb (500 ug / ml) på testzonen, og kanin-anti-muse IgG (500 ug / ml) på kontrolzonen til detektering mAb på NC-membran under anvendelse af en pipette eller immunostrip printer. Opretholde afstand (> 5 mm) mellem de to zoner for at undgå interferens.
- Indsæt konjugerede pad, absorberende pude og NC-membran på montagebordet med dobbeltklæbende tape.
Bemærk: Overlap puderne på hver side af NC membranen med omkring 2 mm. Upassende strimmel konstruktion vil resultere i en ufuldstændig test. - Anbring prøven puden over konjugatpuden (2 mm) og indsætte den på montagebordet.
- Opret 6-mm-brede strimler med et papir cutter. Pak strimlerne i aluminiumsfolie pose med tørremiddel, og opbevare dem ved 4 ° C indtil anvendelse.
8. Krydsreaktivitet Test
- Homogenisere 0,03 g rå muskel prøve med 1 ml PBS (indeholdende 0,1% BSA) i et 1,5 ml centrifugerør under anvendelse af en bambus pind eller knusning stang.
- Hold strimlen ved udgangen modsat test områder og dyp prøven pad del i prøven i 5-10 min og observere resultatet direkte.
- Valgfrit: Saml 500 pi supernatant og overføre det til en ny centrifugerør.
Bemærk: Dette trin foreslået, hvis signalet ikke er indlysende, når båndet direkte gennemvædet i supernatanten.
- Valgfrit: Saml 500 pi supernatant og overføre det til en ny centrifugerør.
- Afprøve forskellige muskelgrupper prøver in triplo.
Bemærk: Her testede vi tun, kylling, sæl, 15 arter af hvaler og 5 arter af terrestriske pattedyr. - Har fem uafhængige inspektører gentage 8.3 for fem gange, dvs bruge 575 strimler i alt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monoklonale antistof-karakteristika
Vi udviklede to IgG 1 mAb'er (CGF5H9 og CSF1H13) anerkendelse to syntetiske peptider (MKASEDLKKHGNTVLC og AIIHVLHSRHPAEFGC), henholdsvis af hvaler Mb, og disse blev anvendt til konstruktion af en sandwich-typen kolloidt guld immunkromatografisk teststrimmel til hurtig påvisning af hvaler Mb. Figur 2 viser, at CGF5H9 detekterer hvaler og andre pattedyr som en enkelt farvede bånd ved en forudsagt molekylvægt på ca. 17 kDa. Den vågehval (Balaenoptera acutorostrata) viser en forholdsvis svagere bånd end bånd af andre hvaler. Bands er fraværende for tun, høns og sæler, hvorimod der observeres et bånd ved omkring 50 kDa til svin. Selv om der er flere uspecifikke bånd til svin og tun, CSF1H13 er meget specifik, fordi det reagerer kun med hvaler og sæler som et band på en forudsagt molekylvægt af ca. 17 kDa. Vågehval viser kun et stærkt signal ved 1:10 (data ikke vist) med intet signal observeret ved 1:25. Figur 2 viser ens resultater i dot blot.
Figur 3A viser, at CGF5H9 demonstrerer positivt signal for hvaler, kaniner, hunde, geder og køer (OD værdi> 3,0); svagt positivt signal for svin (OD-værdi = 1,5); negativt signal for sæler, høns og tun. Figur 3B viser, at CSF1H13 udtrykker høj affinitet over for hvaler og sæler (OD-værdi> 3,0). Både CSF1H13 og CGF5H9 kan reagere kraftigt med alle fire hvalarter. Disse fire arter er fra forskellige familier (vågehval: Balaenopteridae; øresvin: Delphinidae, dværg kaskelothval: Kogiidae; finneløst marsvin: Phocoenidae), der angiver den brede reaktivitet til forskellige hvalarter.
For strimmel konstruktion, CGF5H9, som anerkender than Mbs af hvaler og andre pattedyr, er kolloid guld-mærket og anvendt som påvisning antistof binder myoglobin, og CSF1H13 belægges på testlinjen kun at fange de Mbs af hvaler og sæler. Derfor testlinjen er designet til at vise et positivt signal, når begge mAb'er detektere hvaler Mb. Fordi Mb fra ikke-hvaler dyr kun kan påvises ved en af disse to mAb'er, testen linje viser et negativt resultat, når muskel prøver fra andre dyr testes. Styreledningen viser altid et positivt resultat, fordi kanin-anti-muse-IgG binder kolloid guld-mærket CGF5H9. En mislykket resultat i styreledningen angiver, at kvaliteten af de materialer på strip er dårlig.
Strip test
Figur 4 viser signal bands på både test linje og styreledningen når der anvendes hvaler muskel prøver. Når prøven ikke er fra hvaler, der kun et enkelt bånd på styreledningen with fraværet af bånd ved testen linje. En vellykket resultat kan observeres direkte i 5-10 min efter homogenisering 0,03 g muskel med 10 ml PBS indeholdende 0,1% BSA ved hjælp af en plastik eller bambus pind og iblødsætning strimlen i blandingen. Efter at have testet 15 hvalarter og otte ikke-hvalarter i tre eksemplarer, specificitet (procentdelen af ikke-hvaler prøver korrekt identificeret) og følsomhed (procentdelen af hvaler prøver korrekt identificeret) er begge 100%.
Figur 1. Design af immun strimmel. Alle dele er omhyggeligt lejret på til plastikbeklædning kortet, så de overlapper hinanden. Dette tillader reagenserne og prøven strømme op gennem membranen og til den absorberende pude. T: testzonen. C: kontrol zone. Dette tal er gengivet fra Lo, C. et al. Hurtig immune kolloidt guld båndfor hvaler kød fastholdende illegal handel og forbrug:. konsekvenser for bevarelse og folkesundhed PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Western blot og dot blot-analyse under anvendelse hybridomsupernatanterne. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Begge hybridomasupernatanter kan detektere hvaler som en enkelt farvede bånd ved en forudsagt molekylvægt på ca. 17 kDa. MW: vågehval, BND: øresvin, DSW: dværg kaskelothval, FP: finneløst marsvin, PKW: pygmæ spækhugger, N: PBS (negativ kontrol). Dette tal er gengivet fra Lo, C. et al. Hurtig immune kolloidt guld bånd til cetacean kød fastholdende illegal handel og forbrug:. konsekvenser for bevarelse og folkesundhed PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Indirekte ELISA af muskel ekstrakter af forskellige arter anvendelse af oprensede mAb'er. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Kun hvaler kan producere stærke positive signaler i begge mAbs. Dette tal er gengivet fra Lo, C. et al Hurtig immune kolloid guld bånd til hvaler kød fastholdende illegal handel og forbrug:.. Konsekvenser for bevarelse og folkesundhed PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10,1371 / journal.pone.0060704. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Specificitet af immun kolloidt guld strimmel T:. Test linje. C: styreledning. Kun når der anvendes hvaler muskelprøver, kan observeres vellykkede resultater (signal bands på både test linje og styreledning). (A) Ikke-hvaler prøver: 1: Cow. 2: Goat. 3: Pig. 4: Hund. 5: Kanin. 6: Tun. 7: Chicken. 8: Harbor sæl (Phoca vitulina). (B) af hvaler prøver: 1: vågehval (Balaenoptera acutorostrata). 2: Omura hval (Balaenoptera omurai). 3: Øresvin (Tursiops aduncus). 4: Øresvin (T. truncatus). 5: Frasers delfin (Lagenodelphis hosei </ Em>). 6: Indo-Pacific Humpback delfin (Sousa chinensis). 7: Rissos delfin (Grampus griseus). 8: pantropisk plettet delfin (Stenella attenuata). 9: Rutandet Delfin (Steno bredanensis). 10: Pygmy spækhugger (Feresa attenuata). 11: Tiarmet pilot whale (Globicephala macrorhynchus). 12: Melon-headed hval (Peponocephala Electra). 13: Dværg kaskelothval (Kogia sima). 14: Pygmy kaskelothval (K. breviceps). 15: finneløst marsvin (Neophocaena phocaenoides). Dette tal er gengivet fra Lo, C. et al Hurtig immune kolloid guld bånd til hvaler kød fastholdende illegal handel og forbrug:.. Konsekvenser for bevarelse og folkesundhed PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 Klik her for at se en større version af dette tal.
| hvalarter | Ikke-hvalarter |
| Pygmy kaskelothval (Kogia breviceps) | Spættet sæl (Phoca vitulina) |
| Dværg kaskelothval (Kogia sima) | Hund (Canis lupus familiaris) |
| Tiarmet pilot whale (Globicephala macrorhynchus) | Kanin (Oryctolagus cuniculus) |
| Melon-headed hval (Peponocephala Electra) | Pig (Sus scrofa) |
| Pygmy spækhugger (Feresa attenuata) | Ged (Capra hircus) |
| Pantropisk plettet delfin (Stenella attenuata) | Kvæg (Bos Taurus) |
| Øresvin (Tursiops truncatus) | Kylling (Gallus gallus) |
| Øresvin (Tursiops aduncus) | Gulfinnet tun (Thunnus albacares) |
| Frasers delfin (Lagenodelphis hosei) | |
| Indo-Pacific Humpback delfin (Sousa chinensis) | |
| Rutandet Delfin (Steno bredanensis) | |
| Rissos delfin (Grampus griseus) | |
| Finneløst marsvin (Neophocaena phocaenoides) | |
| Vågehval (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Omura hval (Balaenoptera Omura i) |
Tabel 1. De arter, hvorfra muskel var colleCTED og testet i denne undersøgelse. Arter omfatter tun, kylling, segl, 5 arter af terrestriske pattedyr og 15 arter af hvaler (4 familier).
| Arter | Accessionsnr. |
| Vågehval (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Pygmy brydeshval (Balaenoptera Edeni) | Q0KIY2 |
| Humpback whale (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Grå hval (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Sperm whale (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Pygmy kaskelothval (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| Dværg kaskelothval (Kogia sima) | P02184 |
| Short-Beaked fælles delfin (Delphinus delphis) | P68276 |
| Langfinnet grindehval (Globicephala melas) | P02174 |
| Killer whale (Orcinus orca) | P02173 |
| Melon-headed hval (Peponocephala Electra) | Q0KIY3 |
| Pantropisk plettet delfin (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Øresvin (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Marsvin (Phocoena Phocoena) | P68278 |
| Amazon Floddelfiner (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Longman næbhval (Indopacetus Pacificus) | Q0KIY9 |
| Hubbs 'næbhval (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Småhovedet hval (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Spættet sæl (Phoca vitulina) | P68080 |
| Kvæg (Bos Taurus) | P02192 |
| Ged (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Hest (Equus caballus) | P68082 |
| Pig (Sus scrofa) | P02189 |
| Hund (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Kylling (Gallus gallus) | P02197 |
| Struds (Struthio camelus) | P85077 |
| Gulfinnet tun (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabel 2. myoglobin sekvenser anvendt i denne undersøgelse med respektive GenBank accessionsnumre. Arter indbefatter tun,kylling, struds, indenlandske pattedyr, sæl og 18 arter af hvaler (7 familier). Denne tabel er gengivet fra Lo, C. et al Hurtig immune kolloid guld bånd til hvaler kød fastholdende illegal handel og forbrug:. Konsekvenser for bevarelse og folkesundhed PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10,1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelse af et syntetisk peptid konjugeret til bærerprotein er bemærkelsesværdigt mere effektive i forhold til dets beslægtede protein. For en sandwich-baseret teknik, fordi mAb'et er udviklet under anvendelse af epitoper med kendte relative placeringer, de to mAb'er i denne undersøgelse, ikke vil kunne forstyrre hinandens interaktion med mål-antigenepitop. Endvidere kan reaktiviteten mellem det native protein og antistoffet fra mus immuniseret med det syntetiske peptid-konjugat være stærkere end reaktiviteten mellem det native protein og antistoffet produceret fra det native protein 19. Anvendelsen af syntetiske peptidkonjugater anbefales derfor for effektive immuniseringsprocedurer og generering af passende anti-peptid-mAb.
Strukturen af et protein involverer hovedsagelig sekvensen af aminosyrer i polypeptidkæden. Hver aminosyre har sin sidekæde fører til specifikke egenskaber, og lidt ændre amino acid sekvens resulterer i struktur ændres. Fordi peptider med en længde på 10-20 aminosyrer er ideelle til antistofpræparat blev længden af de syntetiske peptider (immunogene) ved den C-terminale region øges for at sikre, at kernen antigene region ville blive anerkendt. Derfor aminosyreresterne blandt Mbs af forskellige dyr, hvilket resulterer i forskellig epitop strukturer effektivt kunne differentieres. F.eks Figur 3A viser den nævnte peptid design bidrager til CGF5H9 omsætning stærkt med hvaler men negativt med forseglinger. Et andet eksempel er de forskellige affiniteter mod kyllinger og hunde af CGF5H9 selvom kyllingen har en identisk sekvens med den for hunden i kernen antigene sted 2. Dette indikerer, at sekvensen forskel i det ydre område kan føre til strukturen ændring og derfor variabel bindingsaffinitet mellem antigen og antistof.
Western blot, dot blot, og indirekte ELISA blev anvendt ivores fremgangsmåde til screening af egnede mAb'er. Western blot er almindeligt anvendt til at påvise specifikke proteiner i vævsekstrakt eller homogenat. Ved denne teknik er gelelektroforese benyttes til at separere denaturerede proteiner ved længden af polypeptidet. Derfor er det muligt at bekræfte, om signalet indikerer molekylvægten forudsagt protein. Imidlertid kan detekteringsresultatet (positiv eller negativ, stærk eller svag signal) ikke have repræsenteret den reelle situation for antigen-antistof-binding, fordi der anvendes denaturerede proteiner. Følgelig kan dot blot anvendes til andet trin screening. Dot blot er en teknik til påvisning af proteiner. Den repræsenterer en forenkling af western blot metode. I dot-blot, er en blanding indeholdende molekylet, der skal påvises påført direkte på en membran som en prik. Dette adskiller sig fra en western blot fordi proteinprøver ikke denatureres. Bemærk, at denne teknik giver ikke oplysninger om størrelsen af målbiomolekylet, og en enkelt prik vises, hvis to modetekteres lecules af forskellig størrelse. Endelig er indirekte ELISA anvendes til en ligandbindende assay for at generere et signal, der kan blive ordentligt kvantificeres. Det giver mere information mAb egenskaber og dermed letter strimmel konstruktion.
Koncentrationer af Mb i musklen er variabel afhængig af indsamling placering. For eksempel svømning muskler (aksiale muskler) i hvaler har et signifikant højere indhold af Mb sammenlignet med ikke-svømning muskler, og prøver fra unge hvaler ville have lavere Mb koncentrationen fordi Mb koncentrationen stiger hele et dyrs liv 20. I første omgang CSF1H13, som kun fanger Mb af hvaler og sæler, skulle være kolloid guld-mærket og være afsløre antistof, og CGF5H9, som anerkender Mb mange arter, ville være fange antistof på test linje. Vi antager, at detektionsantistoffet bør være mere specifik og det indfangende antistof børvære mere generelt. Imidlertid blev et svagt positivt signal findes på test linje, når hvaler prøver med lave Mb koncentrationer blev anvendt (data ikke vist). Problemet blev løst, da positionerne af de to mAb'er blev tilbageført som beskrevet i de repræsentative resultater. En god signal blev endda vist for en nyfødt hvaler (et strandet Omura hval) (Figur 4). Det er uklart, om de karakteristika og koncentration af mAb'er bidrager til dette fænomen.
I denne undersøgelse blev frosset-optøet muskelprøver homogeniseret med PBS anvendes på strip test. Andre forhold sample og fremstillingsmetoder kan påvirke resultatet. For eksempel bør salt-opløseligt protein, såsom Mb ekstraheres anvendelse af PBS i stedet for rent vand. Ellers kan ekstraktionen være utilstrækkelige, hvilket kunne føre til en afvigende resultat. Den passende ekstraktionsbuffer: kødprøve forholdet er delvis ansvarlig for den vellykkede fortolkning af strimlen resultat. Stor Amount (0,3 g i 1 ml buffer) af kontrolprøver (f.eks husdyr) kan forårsage positivt resultat og sløret baggrund. Men forholdet anvendt i denne undersøgelse (1: 0,03) frembragte korrekte resultater. Kun muskelprøver friske kan anvendes til denne strimmel test. Protein kan hydrolyseres eller denatureres efter nogle behandlinger (såsom hærdning af sojasovs og kogning), som kunne forårsage positive resultater ikke kun for hvaler muskelprøver men også prøver fra andre dyr (data ikke vist). Det foreslås derfor, at variable kilder prøve og forskellige byggeri design planer bør anvendes under strimmel udvikling.
Afslutningsvis beskriver denne protokol udviklingen af to mAb'er stærkt reaktive til Mb af hvaler, og disse mAb'er anvendes på en hurtig test strimmel at differentiere Mb af hvaler fra sæl og andre dyr. Selvom pålidelig PCR-baseret DNA-analyse til identifikation af hvaler kød er tilgængelige 12, det is arbejdskrævende og tidskrævende. Den hurtige teststrimmel er en pålidelig og hurtig teknik, der kan anvendes inden for området for at identificere hvaler kød, hvilket er yderst ønskeligt for reguleringsorganer 21. Det er sandsynligt, at der kan udvikles strimlen til påvisning af specifikke Mbs fra dyr, såsom heste eller svin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
