Protocol
Ethiek Verklaring: De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met internationale richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van National Chiayi University, goedkeuring ID: 99022. De walvisachtige steekproef gebruik werd toegestaan door de Raad van Landbouw van Taiwan (Research Permit 100M-02.1-C-99).
1. Muscle Monstervoorbereiding en SDS-PAGE
Opmerking: Muscle-monsters van 23 soorten, waaronder 16 soorten zeezoogdieren, 5 soorten landzoogdieren, tonijn en kip werden gebruikt in deze studie (tabel 1). De walvisachtige spier monsters werden verkregen van gestrande personen, visserij bijvangst, en confiscatie. Konijn, ratten, honden en kippen spierweefsel werden verkregen uit Animal Disease Diagnostisch Centrum van de Nationale Chiayi University. Monsters van rundvlees, varkensvlees, lamsvlees, tonijn en werden gekocht bij een supermarkt. De spier steekproef van gewone zeehond (Phoca vitulina
- Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot gebruik.
- Pre-cool mortel bij -20 ° C. Dan zet 3 g bevroren spier monster in.
- Homogeniseer het monster met 10 ml koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een weefselhomogenisator.
- Centrifugeer het gehomogeniseerde monster bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof en het op -20 ° C tot gebruik.
- Bereid 5 ml van 5% stacking gel (3,07 ml gedestilleerd water, 1,25 ml van 4x bovenste gel buffer van pH 6,8, 625 ui 40% acrylamide, 50 ui 10% ammoniumpersulfaat (APS) en 5 gl tetramethylethyleendiamine ( TEMED)) en 10 ml 15% scheiden gel (3,65 ml gedestilleerd water, 2,5 ml van 4x lagere gel buffer van pH 8,8, 3,75 ml 40% acrylamide, 100 pl 10% APS,en 4 pl TEMED).
- In de elektroforesecel, pour stapelgel (5% acrylamide) bovenop de scheidende gel (15% acrylamide) nadat dit gestold. Plaats een gel kam in het stapelen gel.
- Voer PAGE volgens de volgende voorwaarden: eerste run conditie: 100 volt, 20 min en laatste voorwaarde: 120 volt, 40 min.
- Vlekken op de gel met Coomassie brilliant blauw bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten totdat de gel gelijkmatig blauwe kleur.
Opmerking: Kleuring is voltooid wanneer de gel niet meer zichtbaar is in de kleurstofoplossing. - Ontkleuring met azijnzuuroplossing (10%) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bands zullen beginnen te verschijnen. Doorgaan ontkleuren wordt uitgevoerd bij 4 ° C gedurende de nacht, totdat de achtergrond is duidelijk.
2. Peptide Synthese en productie van monoklonale antistoffen
- Haal de aminozuursequenties van Mb van GenBank waaronder tonijn, kip, struisvogel, gedomesticeerde zoogdieren, afdichting en 18 soortenvan walvisachtigen (tabel 2).
- Lijn de sequenties met de juiste software 16:
- Start de Alignment Explorer door de optie Align: Bewerken / Build Alignment op de startbalk; selecteer Create New Alignment en klik op OK. Er verschijnt een dialoogvenster de vraag "Bent u het bouwen van een DNA of proteïne sequence alignment? '
- Klik op de knop "Protein"; kies Data: Open: Ophalen sequenties uit bestand en selecteer volgorde file; selecteer de Edit: Kies Alle menu-opdracht om alle sites voor elke rij in de voor het creëren van een multiple sequence alignment gegevens te selecteren.
- Kies Alignment: Lijn door ClustalW in het hoofdmenu om de geselecteerde sequenties gegevens met behulp van de ClustalW algoritme af te stemmen; selecteer "BLOSUM" als de Protein Weight Matrix en klik op de knop OK.
- Analyseer de sequence alignment:
- Focus op 5 antigene reactieve sites 17: plaats 1 (AKVEADVA, 15-22), site 2 (KASEDLK, 56-62), plaats 3 (ATKHKI, 94-99), plaats 4 (HVLHSRH, 113-119) en plaats 5 (KYKELGY, 145- 151) en vind het fragment geconserveerd onder walvisachtigen. Een * (asterisk; consensus symbool in de uitlijning (Protocol 2.2.3)) geeft aan posities die een enkele, volledig geconserveerde resten te hebben. De volgende geconserveerde fragmenten in walvisachtigen werden gevonden: opeenvolging KASEDLKKHG (welke site 2 bevat) en de volgorde HVLHSRHP (welke site 4 bevat).
- Synthetiseren kandidaat sequentiefragmenten volgens de sequentieanalyse en conjugaat met ovalbumine eiwit (OVA) als dragereiwit via andere voorzieningen.
- Voeg hydrofobe aminozuren (bijvoorbeeld methionine) aan de N-terminus van antigene reactieve plaats te voorkomen dat het peptide van ontleding (bijvoorbeeld M-KASEDLKKHG).
- Verleng de C-terminus van antigene reactieve plaats voor het belichten van de belangrijkste antigene plaats op de immunocyt. Bovendien conjupoort het peptide OVA door toevoeging van een cysteïne (Cys, C) aan de C-terminale (bijvoorbeeld M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulgeren compleet Freund's adjuvans immunogeen voor 1 of incompleet Freund's adjuvans immunogeen voor 2 met een gelijk volume van elk synthetisch peptide in PBS (3 ml, eindconcentratie 30-50 ug / 100 pl).
- Inoculeren immunogeen 1 (0,1 mg) subcutaan in elk van 5 BALB / c muizen.
- Voer subcutane booster injecties vijfmaal behulp immunogeen 2 bij tussenpozen van twee weken en laat testsera door staart clip bemonstering van de muizen voor elke booster.
- Bepaal sera titer voor de eerste screening.
- Oplossen 100 ug vrij peptide in 25 ml reactiebuffer en aliquot 50 ul van de oplossing in elk putje van een 96-wells plaat. Voeg 10 ul koppelingsreagens oplossing in elk putje en meng de plaat. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Verwijder de inhoud van de put,wassen elk putje 3 keer met gedestilleerd water, en blokkeert de plaat door toevoeging van 200 ul van blokkeeroplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de inhoud en was elk putje 3 keer met gedestilleerd water.
- Voer indirecte ELISA (Protocol 5,1-5,7) voor het bepalen sera titer voor de eerste screening. Kies de muis met de hoogste titer (hoogste optische dichtheid) voor de milt collectie.
- Drie dagen vóór de milt verzamelen, enten 0,1 mg immunogeen 1 subcutaan in de muis met het hoogste titer.
- Verzamel de miltcellen van de geïmmuniseerde muizen en geselecteerde zekering murine myeloomcellen F0 (SP2 / 0-Ag14) om hybridoma cellen te verkrijgen voor mAb productie 18.
- 14 dagen na de fusie, selecteert u de positieve klonen door het screenen van de reactiviteit van hybridomasupernatanten in de richting van vrije synthetisch peptide met behulp van indirecte ELISA (Protocol 5,1-5,7).
- Verdun de cellen om een geschikt aantal per goed voor maximizing het aantal putjes dat slechts één enkele kloon (verdunning klonering) bevatten.
- Voeg 100 pi celkweekmedium alle putjes in 96-well plaat, behalve goed A1 die leeg wordt gelaten.
- Voeg 200 ul van de celsuspensie goed A1. Vervolgens snel 100 ui overbrengen van A1 naar B1 en meng door voorzichtig pipetteren. Herhaal deze 1: 2 verdunningen over de gehele kolom, en verwijder vervolgens 100 pl van H1 zodat het eindigt met hetzelfde volume als de putjes erboven.
- Een extra 100 ul medium naar kolom 1 met een 8-kanaals micropipet. Vervolgens snel overbrengen 100 gl van elk van de wells in kolom 1 die in kolom 2 met dezelfde pipet en meng door voorzichtig pipetteren.
- Met behulp van dezelfde tips, herhaalt u deze 1: 2 verdunningen over de gehele plaat. Gooi 100 gl van elk van de putten in de laatste kolom.
- Breng het uiteindelijke volume van 200 pl putten door toevoegen van 100 ul medium in elk putje. Incubate plate ongestoord bij 37 ° C in een bevochtigde CO2 incubator.
- Controleer elke goed en markeer alle putten die slechts een enkele kolonie bevatten. Voer twee of meer kloneringen totdat> 90% van de putjes die enkelvoudige klonen positief antilichaamproductie zijn.
- Zeef de klonen door western blot en dot blot (protocol 3,1-4,6). Vervolgens subcultuur kolonies van de putjes in grotere vaten cellen voor het verkrijgen mAb breiden. Meestal elke kloon overgebracht naar een enkel putje in een 12- of 24-well plaat.
- Meet de verwantschap tussen de mAb's en de spier uittreksels van koe, geit, varken, hond, konijn, tonijn, kip, seal, en vier representatieve soorten walvisachtigen door western blot en dot blot (protocol 3,1-4,6).
- Inoculeren geselecteerde hybridoma cellen (maximaal 3 x 10 6) intraperitoneaal in muizen om ascites te induceren. Zwelling van de buik is meestal duidelijk binnen 7-10 dagen na hybridoma injectie. Verzamel vloeistof met behulp van een injectienaald(Minder dan 20 gauge).
- Centrifuge ascitesvloeistof (10.000 g gedurende 10 min) om cellen en resten te verwijderen. Filtreer door een 0,45 pm filter. Voeg 1 tot 20 ml monster, 15 ml bindingsbuffer, en 3-5 ml elutiebuffer in het proteïne G Sepharose-kolom. Verzamel de elutie fractie die gezuiverd antilichaam uit muizen ascitesvloeistof.
- Bepaal het antilichaam isotype van antilichaam Isotypering Kit middels instructies van de fabrikant.
3. Western Blot
- Bereid 2x laadbuffer bevattende β-mercaptoethanol (BME) door mengen van 950 ui van 2 x Laemmli monsterbuffer met 50 pl BME. Verdun de spier supernatanten (protocol 1,1-1,4) bij het laden buffer met geschikte verhouding voor het verkrijgen van een goede signalen: 01:50 (walvisachtigen en seal) en 1: 5 (huisdieren en tonijn) bij het gebruik van polyklonaal konijn anti-humaan antilichaam Mb, en 1: 1 (varken, konijn, kip en tonijn), 1: 5 (koe, geit en hond) en 01:25 (walvisachtigen en seal) wanneer eenntibody is van hybridoma supernatant.
- Warmte monster bij 95 ° C gedurende 5 minuten. samples in de putjes van SDS-PAGE gel (4% acrylamide stapelen en 12% acrylamide scheidende) met molecuulgewicht merkers. Voer de elektroforese gedurende 5 minuten bij 50 V verhogen dan de spanning tot 150 V aan de punt af in ongeveer 1 uur.
- Plaats de gel in 1x overdracht buffer gedurende 15 min. Breng de gescheiden eiwitten naar nitrocellulose (NC) membranen nadat ze zijn gescheiden door PAGE. Transfer kan worden gedaan bij 100 V gedurende 60-90 min.
- Bereid blokkeeroplossing: 1x PBS met 0,1% Tween 20 met 5% magere melkpoeder. Blokkeer de NC membraan in 25 ml blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was driemaal gedurende 5 minuten elk met 15 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween 20 (PBST).
- Incubeer het membraan en primaire antilichaam (ascitesvloeistof of hybridoma supernatant) in 10 ml antilichaam verdunningsbuffer verdund met 5% blokkeeroplossing bij 4 ° C overnacht.
- Was de membraame driemaal opnieuw met PBST schoon te maken uit overmatige antilichaam.
- Incubeer het membraan met alkalische fosfatase geconjugeerd geit anti-muis IgG 1: 1250 in blokkerende oplossing onder zacht schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was het membraan opnieuw en incubeer in het 5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat / p-nitroblauwtetrazolium chloride (BCIP / NBT) fosfatase substraat mengsel gedurende 10 tot 20 minuten tot kleurontwikkeling.
- Stop de reactie door het wassen van het membraan verscheidene veranderingen gedestilleerd water.
4. Dot Blot
- Verdun de spier supernatanten (protocol 1.1-1.4) in 5% runderserumalbumine (BSA) in PBST met geschikte verhouding voor het verkrijgen van goede signalen: 1: 5 voor huisdieren en tonijn en 1:25 voor walvissen en afdichting. Spot 5 pl van de monsters op het membraan. Minimaliseren het gebied dat de oplossing doordringt (gewoonlijk 3-4 mm diameter) door langzaam toe te passen.
- Droog de membraan bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld </ Em> in een laminaire stroom gedurende 30-60 min), blokkeren met blokkeeroplossing petrischaal gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en wassen met PBST.
- Incubeer het membraan met primair antilichaam (mAb van hybridoma supernatant bij 1: 10.000 of ascitesvloeistof op 1: 100.000 verdund in 5% blokkeeroplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Gebruik PBST het membraan drie keer wassen gedurende 5 minuten elk om overmaat antilichaam te verwijderen en daarna geïncubeerd met secundair antilichaam (aan alkalische fosfatase geconjugeerd geit anti-muis IgG 1: 1250 in 5% blokkeeroplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd .
- Was het membraan opnieuw en incubeer in de BCIP / NBT fosfatase substraatmengsel binnen 10 tot 20 minuten tot kleurontwikkeling.
- Stop de reactie door het wassen van het membraan verscheidene veranderingen gedestilleerd water.
5. Indirecte ELISA
- Bereid wasbuffer (0,002 M imidazool gebufferde zoutoplossing met 0,02% Tween 20). Was de plaat 3 keer met het wassenbuffer tussen elke volgende stap (protocol 5,2-5,5).
- Bereid 1:25 verdunning van de spier supernatanten (protocol 1,1-1,4) in coating buffer. Coat een 96-well ELISA-plaat met 100 gl verdunde supernatant bij 4 ° C gedurende de nacht en geblokkeerd met blokkeerbuffer (1% BSA in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Bereid 1: 2000 verdunning van het gezuiverde mAb met verdunde buffer en voeg 100 pl verdund mAb aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Add geit anti-muis IgG geconjugeerd met mierikswortel peroxidase (1: 200 verdunning in buffer verdund) voor verdere incubatie.
- Voeg peroxidase substraat aan elke well (100 ul / well) en geïncubeerd gedurende 10-15 min.
- Stop de reactie door het enzym peroxidase stopoplossing (100 gl / putje) bij kleurontwikkeling waargenomen.
- Lees de optische dichtheid bij 450 nm met behulp van een microplaat spectrofotometer.
6. Bereiding van colloïdaal goud-gelabelde mAb Opmerking: De kleur van colloïdaal goud oplossing en het mengsel altijd rood. Stel de pH, concentratie van mAb, centrifuge snelheid bij het zwarte neerslag wordt opgemerkt. 6.1 en 6.2 zijn optimalisatie stappen.
- Voeg detecteren gezuiverde mAb (50 ug / ml, 3 ui) aan 100 ui colloïdaal goud oplossing met een pH variërend van 5-9. De minimale pH dat de kleur rood blijft gedurende twee uur wordt beschouwd als de optimale pH. Opmerking: In deze studie werd 0,1 M kaliumcarbonaat gebruikt colloïd goud (40 nm) tot pH 8,0 (optimale pH) passen.
- Voeg verschillende hoeveelheid gezuiverde mAb detecteren (500 ug / ml, 1-20 ul) aan 100 ui colloïdaal goud oplossing bij pH 8,0. Opmerking: De optimale concentratie in deze studie is 6 ug / ml (geen zwarte neerslag).
- Volgens de bovenstaande resultaten, voeg 60 ug gezuiverd detecteren mAb druppelsgewijs aan 10 ml colloïdale goudoplossing. Emulgeren van het mengsel langzaam bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Advertentied 2 ml 5% BSA-oplossing in PBS (pH 7,4) aan het mengsel en emulgeren voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 15 min achtergrondinterferentie verminderen.
- Centrifugeer het mengsel bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant met ongeconjugeerde antilichaam zorgvuldig en schorten de verkregen pellets in 4 ml PBST dat 1% BSA en 0,1% Tween 20, en herhaal centrifugeren en suspensie meerdere malen.
- Schorsen de laatste neerslag in 1 ml PBST en het op 4 ° C tot gebruik.
7. Bouw van Immune Strip
Opmerking: Figuur 1 toont het immuunsysteem strip ontwerp. Voorbereiden en monteren van de strips in een lage luchtvochtigheid laboratorium milieuconditie (<20% relatieve vochtigheid) voor langere houdbaarheid (> 1 jaar). De afmetingen van de pads en het membraan zijn: conjugaatpad 300 mm x 10 mm, absorberend kussen 300 mm x 24 mm, sample pad 300 mm x 24 mm, NC membraan 300 mm x 25 mm, plakbord 300mm x 80 mm.
- Add colloïdaal goud gelabelde mAb oplossing van stap 6.6 met een micropipet op het conjugatiekussentje verzadigen en vervolgens drogen bij 37 ° C gedurende 1 uur vóór montage.
- Verdeel het specifieke antigeen vangen mAb (500 ug / ml) op de testzone, en konijn anti-muis IgG (500 ug / ml) op de controlezone voor het detecteren van mAb op het NC-membraan met behulp van een pipet of immunostrip printer. Afstand bewaren (> 5 mm) tussen de twee zones om interferentie te voorkomen.
- Plak de geconjugeerde pad, absorberend en NC membraan op het plakbord met dubbelzijdig tape.
Opmerking: Overlap de elektroden aan weerszijden van het NC-membraan met ongeveer 2 mm. Ongepaste strip bouw zal leiden tot een onvolledige proef. - Het monster pad over het conjugaat pad (2 mm) en plak het op het plakbord.
- Maak 6 mm brede stroken met een papieren cutter. Verpak de stroken in de aluminium folie zak met droogmiddel en bewaar ze bij 4 ° C tot gebruik.
8. Cross-reactiviteit Test
- Homogeniseren 0,03 g ruwe spier monster met 1 ml PBS (met 0,1% BSA) in een 1,5 ml centrifugebuis met een bamboestok of malen staaf.
- Houd de strip aan het eind tegenover de testgebieden en dompel de sample pad gedeelte in het model voor 5-10 min en direct waar te nemen van het resultaat.
- Optioneel: Verzamel 500 ul supernatant en overbrengen naar een nieuwe centrifugebuis.
Opmerking: Deze stap wordt voorgesteld als het signaal niet duidelijk wanneer de strook direct geweekt in de supernatant.
- Optioneel: Verzamel 500 ul supernatant en overbrengen naar een nieuwe centrifugebuis.
- Test verschillende spier monsters in drievoud.
Opmerking: Hier hebben we getest tonijn, kip, seal, 15 soorten walvisachtigen en 5 soorten landzoogdieren. - Hebben vijf onafhankelijke inspecteurs herhalen 8.3 voor vijf keer, dat wil zeggen, gebruik maken van 575 strips in totaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monoklonaal antilichaam karakteristieken
We ontwikkelden twee IgG 1 mAb's (CGF5H9 en CSF1H13) de erkenning van twee synthetische peptiden (MKASEDLKKHGNTVLC en AIIHVLHSRHPAEFGC), respectievelijk van walvisachtigen Mb, en deze werden gebruikt om een sandwich-type colloïdaal goud immunochromatographic teststrip te construeren voor de snelle opsporing van walvisachtigen Mb. figuur 2 toont dat CGF5H9 detecteert walvissen en andere zoogdieren een bevlekt band bij een voorspeld molecuulgewicht van bij benadering 17 kDa. De dwergvinvis (Balaenoptera acutorostrata) toont een relatief zwakkere band dan de banden van andere walvisachtigen. Bands afwezig zijn voor tonijn, kippen en zeehonden, terwijl een band bij ongeveer 50 kDa waargenomen voor varkens. Hoewel er meerdere niet-specifieke banden voor varkens en tonijn, CSF1H13 zeer specifiek is, omdat het reageert alleen met walvissen en zeehonden als een band met een voorspeld molecuulgewicht van ongeveer 17 kDa. Dwergvinvis toont alleen een sterk signaal bij 1:10 (gegevens niet getoond) geen signaal waargenomen bij 01:25. Figuur 2 toont dezelfde resultaten in dot blot.
Figuur 3A toont dat CGF5H9 demonstreert positief signaal voor walvisachtigen, konijnen, honden, geiten en koeien (OD-waarde> 3,0); zwak positief signaal voor varkens (OD-waarde = 1,5); negatief signaal voor zeehonden, kippen en tonijn. Figuur 3B toont aan dat CSF1H13 uitdrukt hoge affiniteit voor walvisachtigen en afdichtingen (OD-waarde> 3,0). Zowel CSF1H13 en CGF5H9 kan sterk reageren met alle vier soorten walvisachtigen. Deze vier soorten zijn uit verschillende families (dwergvinvis: Balaenopteridae; bottlenosedolfijn: Delphinidae; dwerg potvis: Kogiidae; Indische bruinvis: Phocoenidae), met vermelding van de brede reactiviteit op diverse walvissoorten.
Voor strip bouw, CGF5H9, die t herkenthij Mbs van walvisachtigen en andere zoogdieren, is colloïdale goud gelabeld en gebruikt als de detectie antilichaam tegen myoglobine te binden, en CSF1H13 is bekleed op de test lijn alleen aan de Mbs vangen van walvissen en zeehonden. Daarom is de testlijn is ontworpen om een positief signaal wanneer beide mAbs gedetecteerd cetacean Mb tonen. Omdat de Mb van niet-walvisachtigen dieren slechts één van deze twee mAb's kunnen worden gedetecteerd, de testlijn geeft een negatief resultaat bij nemen van monsters van andere dieren worden getest. De controle-lijn geeft altijd een positief resultaat, omdat konijnen anti-muis IgG bindt colloïdaal goud gelabelde CGF5H9. Een mislukte resultaat in de controle lijn geeft aan dat de kwaliteit van de materialen op de strip is slecht.
strip-test
Figuur 4 toont de signaal bands op zowel test lijn en controle lijn als walvisachtigen spier monsters worden gebruikt. Wanneer het monster is niet van walvisachtigen, is er slechts een enkele band bij de controle lijn with de afwezigheid van de band in de test lijn. Een succesvol resultaat kan direct worden waargenomen in 5-10 minuten na homogeniseren 0,03 g spiervlees met 10 ml PBS met 0,1% BSA met een plastic of bamboe stokje en het weken van de strip in het mengsel. Na het testen van 15 soorten walvisachtigen en acht niet-walvisachtigen in drievoud, specificiteit (het percentage niet-walvisachtigen samples correct geïdentificeerd) en gevoeligheid (het percentage van de walvisachtigen monsters correct geïdentificeerd) zijn beide 100%.
Figuur 1. Ontwerp van het immuunsysteem strip. Alle componenten worden zorgvuldig gelaagd op de plastic onderlaagkaart overlappend. Hierdoor kan de reagentia en monsters boven stromen door het membraan en het absorberende kussen. T: testzone. C: controlezone. Dit cijfer is overgenomen uit Lo, C. et al. Rapid immuun colloïdaal goud stripvoor walvisachtigen vlees straatverbod illegale handel en consumptie. implicaties voor het behoud en de volksgezondheid PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Western blot en dot blot analyse met behulp van hybridoma supernatanten. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Beide hybridoomsupernatanten kan walvisachtigen als een enkele lood band op te sporen bij een voorspeld molecuulgewicht van ongeveer 17 kDa. MW: dwergvinvis, BND: dolfijn, DSW: dwerg potvis, FP: Indische bruinvis, PKW: pygmee orka, N: PBS (negatieve controle). Dit cijfer is overgenomen uit Lo, C. et al. Rapid immuun colloïdaal goud strip voor cetacean vlees straatverbod illegale handel en consumptie. implicaties voor het behoud en de volksgezondheid PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Indirecte ELISA spieren extracten van verschillende soort, volgens gezuiverde mAbs. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Alleen walvisachtigen kan sterk positieve signalen te produceren in beide mAb's. Dit cijfer is overgenomen uit Lo, C. et al Rapid immuun colloïdaal goud strip voor walvisachtigen vlees straatverbod illegale handel en consumptie:.. Implicaties voor het behoud en de volksgezondheid PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Test lijn: T Figuur 4. Specificiteit van het immuunsysteem colloïdaal goud strip.. C: controle lijn. Alleen wanneer walvisachtigen spier monsters worden gebruikt, kan succesvolle resultaten (signaal bands op zowel test lijn en de controle lijn) in acht worden genomen. (A) Niet-walvisachtigen monsters: 1: Koe. 2: Geit. 3: Pig. 4: Dog. 5: Konijn. 6: Tuna. 7: Kip. 8: Harbor zeehond (Phoca vitulina). (B) naar Walvisachtigen monsters: 1: dwergvinvis (Balaenoptera acutorostrata). 2: omurawalvis (Balaenoptera omurai). 3: Tuimelaar (Tursiops aduncus). 4: Tuimelaar (T. truncatus). 5: sarawakdolfijn (Lagenodelphis Hosei </ Em>). 6: Indo-Pacific bultrug dolfijnen (Sousa chinensis). 7: Risso's dolfijn (Grampus griseus). 8: Pantropical bevlekte dolfijn (Stenella attenuata). 9: snaveldolfijn (Steno bredanensis). 10: Pygmy orka (Feresa attenuata). 11: Short-Indische griend (Globicephala macrorhynchus). 12: Meloen-geleide walvis (Peponocephala electra). 13: Dwarf potvis (Kogia sima). 14: dwergpotvis (K. breviceps). 15: Indische bruinvis (Neophocaena phocaenoides). Dit cijfer is overgenomen uit Lo, C. et al Rapid immuun colloïdaal goud strip voor walvisachtigen vlees straatverbod illegale handel en consumptie:.. Implicaties voor het behoud en de volksgezondheid PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| soorten walvisachtigen | Non-soorten walvisachtigen |
| Dwergpotvis (Kogia breviceps) | Zeehond (Phoca vitulina) |
| Dwerg potvis (Kogia Sima) | Hond (Canis lupus familiaris) |
| Kortvinnige griend (Globicephala macrorhynchus) | Konijn (Oryctolagus cuniculus) |
| Witlipdolfijn (Peponocephala electra) | Varken (Sus scrofa) |
| Pygmy orka (Feresa attenuata) | Geit (Capra hircus) |
| Pantropical bevlekte dolfijn (Stenella attenuata) | Runderen (Bos taurus) |
| Tuimelaar (Tursiops truncatus) | Kip (Gallus gallus) |
| Tuimelaar (Tursiops aduncus) | Geelvintonijn (Thunnus albacares) |
| Sarawakdolfijn (Lagenodelphis Hosei) | |
| Indo-Pacific bultrug dolfijnen (Sousa chinensis) | |
| Snaveldolfijn (Steno bredanensis) | |
| Risso's dolfijn (Grampus griseus) | |
| Indische bruinvis (Neophocaena phocaenoides) | |
| Dwergvinvis (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Walvis Omura's (Balaenoptera omura i) |
Tabel 1. De soorten waaruit de spier was colleCTED en getest in deze studie. Species omvatten tonijn, kip, seal, 5 soorten landzoogdieren, en 15 soorten walvisachtigen (4 gezinnen).
| species | Toetreding geen. |
| Dwergvinvis (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Pygmy brydevinvis (Balaenoptera Edeni) | Q0KIY2 |
| Bultrug (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Grijze walvis (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Potvis (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Dwergpotvis (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| Dwerg potvis (Kogia Sima) | P02184 |
| Short-Beaked gewone dolfijn (Delphinus delphis) | P68276 |
| Long-Indische griend (Globicephala melas) | P02174 |
| Orka (Orcinus orca) | P02173 |
| Witlipdolfijn (Peponocephala electra) | Q0KIY3 |
| Pantropical bevlekte dolfijn (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Tuimelaar (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Bruinvis (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Orinocodolfijn (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Longman's spitssnuitdolfijn (Indopacetus pacificus) | Q0KIY9 |
| Hubbspitssnuitdolfijn (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Cuvier spitssnuitdolfijn (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Zeehond (Phoca vitulina) | P68080 |
| Runderen (Bos taurus) | P02192 |
| Geit (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Paard (Equus caballus) | P68082 |
| Varken (Sus scrofa) | P02189 |
| Hond (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Kip (Gallus gallus) | P02197 |
| Struisvogel (Struthio camelus) | P85077 |
| Geelvintonijn (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabel 2. Myoglobin sequenties die in deze studie met respectievelijk GenBank toegangsnummers. Soort omvatten tonijn,kip, struisvogel, gedomesticeerde zoogdieren, afdichting en 18 soorten walvisachtigen (7 gezinnen). Deze tabel is overgenomen uit Lo, C. et al Rapid immuun colloïdaal goud strip voor walvisachtigen vlees straatverbod illegale handel en consumptie. Implicaties voor het behoud en de volksgezondheid PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van een synthetisch peptide geconjugeerd aan dragereiwit opmerkelijk effectiever vergeleken met de verwante eiwit. Voor een sandwich gebaseerde techniek, omdat het mAb wordt ontwikkeld met behulp van epitopen met bekende relatieve locaties, beide mAbs in dit onderzoek waarschijnlijk niet interfereren met elkaar interactie met het doelantigeen epitoop. Bovendien kan de reactiviteit tussen het natieve eiwit en antilichaam van muizen geïmmuniseerd met het synthetische peptide-conjugaat sterker dan de reactiviteit tussen het natieve eiwit en het antilichaam geproduceerd uit de natieve eiwit 19 zijn. Het gebruik van synthetische peptide-conjugaten wordt daarom aanbevolen voor effectieve immunisatie procedures en generatie van gepaste anti-peptide mAb.
De structuur van een eiwit omvat in hoofdzaak de sequentie van aminozuren in de polypeptide keten. Elk aminozuur heeft een zijketen leiden tot specifieke eigenschappen en enigszins veranderen amino acid sequentie resulteert in structuur verandert. Omdat peptiden met een lengte van 10-20 aminozuren zijn geschikt voor bereiding antilichaam, werd de lengte van de synthetische peptiden (immunogeen) en het C-terminale gebied opgevoerd om te waarborgen dat de kern antigeen gebied worden herkend. Daarom kon de aminozuurresten tussen Mbps verschillende dieren die verschillende epitoop structuren efficiënt worden gedifferentieerd. Bijvoorbeeld, Figuur 3A toont de genoemde peptide ontwerp draagt bij aan CGF5H9 sterk reageren met walvisachtigen, maar negatief met zeehonden. Een ander voorbeeld is het duidelijk affiniteiten richting kippen en honden CGF5H9 hoewel de kip heeft een identieke sequentie aan die van de hond in de kern antigene plaats 2. Dit betekent dat de beelden verschil in het buitengebied kan leiden tot de structuur geworden en daardoor variabel bindingsaffiniteit tussen antigeen en antilichaam.
Western blot, dot blot, indirecte ELISA werden inonze werkwijze voor het screenen geschikt mAbs. Western blot wordt algemeen gebruikt om specifieke eiwitten in weefsel extract of homogenaat detecteren. In deze techniek wordt gebruikt gelelektroforese gedenatureerde eiwitten te scheiden door de lengte van het polypeptide. Daarom is het mogelijk om te bevestigen dat het signaal geeft de voorspelde proteïne molecuulgewicht. Echter, de detectie-resultaat (positief of negatief, sterk of zwak signaal) misschien niet de werkelijke situatie van antigeen-antilichaambinding omdat gedenatureerde eiwitten worden gebruikt vertegenwoordigd. Bijgevolg kan dot blot worden gebruikt voor de tweede fase screening. Dot blot is een techniek voor het detecteren van eiwitten. Het is een vereenvoudiging van de western blot methode. In dot blot, is een mengsel dat het molecuul te detecteren rechtstreeks op een membraan als een punt. Dit verschilt van een western blot omdat eiwitmonsters niet worden gedenatureerd. Merk op dat deze techniek geeft geen informatie over de grootte van het doelbiomolecuul, en een enkele punt wordt weergegeven als twee molecules van verschillende grootte worden gedetecteerd. Tenslotte indirecte ELISA wordt gebruikt voor een ligand bindingstest om een signaal dat goed kan worden gekwantificeerd genereren. Het geeft meer informatie van mAb kenmerken en daardoor vergemakkelijkt de strip constructie.
Concentraties van Mb in de spier zijn variabel, afhankelijk van de collectie locatie. Bijvoorbeeld, zwemmen spieren (axiale spieren) in walvisachtigen hebben een beduidend hoger gehalte aan Mb in vergelijking met niet-zwemmen spieren, en monsters van jonge walvisachtigen lager zou Mb concentratie omdat de Mb concentratie toeneemt gedurende het hele leven van een dier 20. Aanvankelijk CSF1H13, die alleen de Mb van walvisachtigen en zeehonden vangt, was bedoeld om colloïdaal-goud gelabeld zijn en het opsporen van antilichamen, en CGF5H9, die de Mb herkent van veel soorten, zou capture antilichaam op de test lijn. Onze hypothese was dat het opsporen van antilichamen specifieker moeten zijn en de vangst antilichaam moetmeer algemeen. Er werd echter een zwak positief signaal te vinden op de test lijn wanneer walvisachtige monsters met een lage Mb concentraties werden gebruikt (gegevens niet getoond). Het probleem is opgelost wanneer de posities van de twee mAbs teruggenomen zoals beschreven in de representatieve resultaten. Een goede signaal werd ook getoond voor een pasgeborene walvisachtigen (een gestrande omurawalvis) (figuur 4). Het is onduidelijk of de kenmerken en de concentratie van mAbs op dit fenomeen.
In deze studie werden bevroren-ontdooid spier monsters gehomogeniseerd met PBS gebruikt op de strooktest. Andere monster omstandigheden en bereidingsmethoden kunnen het resultaat beïnvloeden. Zo moeten zout oplosbaar eiwit zoals Mb worden geëxtraheerd door gebruik PBS in plaats van zuiver water. Anders kan de extractie onvoldoende zijn, wat kan leiden tot een afwijkend resultaat. De juiste extractiebuffer: vlees bemonsteringsverhouding is mede verantwoordelijk voor de succesvolle interpretatie van de strip resultaat. grote amount (0,3 g in 1 ml buffer) van controlemonsters (bijvoorbeeld huisdieren) kunnen positief resultaat en vage achtergrond veroorzaken. De verhouding die in deze studie (1: 0,03) die correcte uitvoer. Alleen vers spier monsters kunnen worden gebruikt voor deze strooktest. Eiwit kan worden gehydrolyseerd of gedenatureerd na bepaalde behandelingen (bijvoorbeeld uitharden van sojasaus en koken), die gunstige resultaten voor monsters walvisachtige spier maar ook monsters van andere dieren kunnen veroorzaken (gegevens niet getoond). Daarom wordt voorgesteld dat de variabele sample bronnen en verschillende constructie plannen moeten worden gebruikt tijdens de strip ontwikkeling.
Tot slot, dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee mAb's sterk reageert op de Mb van walvisachtigen, en deze mAb's worden toegepast op een snelle test strip aan de Mb differentiëren van walvisachtigen uit afdichting en andere dieren. Hoewel betrouwbare-PCR-gebaseerde DNA-analyse voor de identificatie van walvisachtigen vlees is beschikbaar in 12, is het is arbeidsintensief en tijdrovend. De snelle teststrook een betrouwbare en snelle techniek die in het veld kan worden gebruikt om walvisachtigen vlees, hetgeen zeer gewenst voor regelgevende organen 21 identificeren. Het is waarschijnlijk dat de strook kan worden ontwikkeld voor het detecteren van specifieke Mbps van dieren zoals paarden en varkens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
