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Biology

ह्वेल Myoglobin की जांच के लिए एक कोलाइडयन गोल्ड आधारित इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक परीक्षण पट्टी का विकास

Published: July 13, 2016 doi: 10.3791/53433

Protocol

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आचार कथन: अध्ययन अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) राष्ट्रीय Chiayi विश्वविद्यालय, अनुमोदन आईडी द्वारा अनुमोदित किया गया था: 99022. ह्वेल नमूना उपयोग ताइवान के कृषि परिषद (रिसर्च परमिट द्वारा अनुमति दी गई थी 100 मीटर-०२.१-सी 99)।

1. स्नायु नमूना तैयार करना और एसडीएस पृष्ठ

नोट: समुद्री स्तनधारियों की 16 प्रजातियां, स्थलीय स्तनधारियों के 5 प्रजातियों सहित 23 प्रजातियों से मांसपेशियों के नमूने, टूना और चिकन इस अध्ययन (तालिका 1) में इस्तेमाल किया गया। ह्वेल पेशी के नमूने असहाय व्यक्तियों, मत्स्य bycatch, और जब्ती से प्राप्त किया गया। खरगोश, चूहे, कुत्ते, और चिकन मांसपेशियों के ऊतकों राष्ट्रीय Chiayi विश्वविद्यालय के पशु रोग निदान केंद्र से प्राप्त किया गया। बीफ, पोर्क, भेड़, और ट्यूना के नमूने एक स्थानीय सुपरमार्केट से खरीदे गए थे। हार्बर सील (Phoca vitulina की पेशी नमूना

  1. -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक सभी नमूनों स्टोर।
  2. -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व शांत मोर्टार। फिर इसे में जमे हुए पेशी नमूना के 3 जी डाल दिया।
  3. (पीबीएस) शांत फॉस्फेट बफर खारा के 10 मिलीलीटर एक ऊतक homogenizer का उपयोग के साथ नमूना homogenize।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर homogenized नमूना अपकेंद्रित्र। supernatants लीजिए और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक दुकान।
  5. 5 में से 5% स्टैकिंग जेल (आसुत जल से 3.07 मिलीलीटर, पीएच 6.8, 40% एक्रिलामाइड के 625 μl, 10% अमोनियम persulfate (ए पी) के 50 μl, और tetramethylethylenediamine के 5 μl के 4x ऊपरी जेल बफर के 1.25 मिलीलीटर की मिलीलीटर की तैयारी ( TEMED)) और 10 से 15 मिलीलीटर% को अलग जेल (आसुत जल से 3.65 मिलीलीटर, 4x पीएच 8.8 से कम जेल बफर के 2.5 मिलीलीटर, 40% acrylamide का 3.75 मिलीग्राम, 10% की 100 μl ए पी एस,और TEMED के 4 μl)।
    1. वैद्युतकणसंचलन सेल में, अलग जेल (15% एक्रिलामाइड) के बाद उत्तरार्द्ध जम गया है के शीर्ष पर जेल (5% एक्रिलामाइड) स्टैकिंग डालना। स्टैकिंग जेल में एक जेल कंघी डालें।
  6. निम्न शर्तों के अनुसार पृष्ठ प्रदर्शन: प्रारंभिक रन हालत: 100 वोल्ट, 20 मिनट और अंतिम शर्त: 120 वोल्ट, 40 मिनट।
  7. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर Coomassie खूब नीले रंग के साथ जेल दाग जब तक जेल रंग में समान रूप से नीला है।
    नोट: धुंधला पूरा हो गया है जब जेल नहीं रह डाई समाधान में दिख रहा है।
  8. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एसिटिक एसिड समाधान (10%) के साथ यह destain। बैंड प्रकट करने के लिए शुरू हो जाएगा। 4 डिग्री सेल्सियस पर destaining रात भर जब तक पृष्ठभूमि स्पष्ट है जारी रखें।

2. पेप्टाइड संश्लेषण और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उत्पादन

  1. ट्यूना, चिकन, शुतुरमुर्ग, घरेलू स्तनधारी, सील और 18 प्रजातियों सहित GenBank से एमबी की एमिनो एसिड दृश्यों निकालतेकेटासियन की (तालिका 2)।
  2. उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 16 दृश्यों संरेखित करें:
    1. का चयन करने के लिए पंक्ति से संरेखण एक्सप्लोरर का शुभारंभ: संपादित करें / लॉन्च बार पर संरेखण निर्माण; नया संरेखण बनाएँ का चयन करें और ठीक क्लिक करें। एक संवाद पूछ दिखाई देगा "आप एक डीएनए या प्रोटीन अनुक्रम संरेखण निर्माण कर रहे हैं?"
    2. बटन लेबल "प्रोटीन" पर क्लिक करें; डेटा का चयन करें: ओपन: फ़ाइल का चयन करें और अनुक्रम फ़ाइल से दृश्यों निकालते हैं; संपादित करें का चयन करें: डेटा एक बहु अनुक्रम संरेखण बनाने के लिए सेट में हर अनुक्रम के लिए सभी साइटों का चयन करने के लिए सभी मेनू आदेश का चयन करें।
    3. संरेखण चुनें: मुख्य मेनू ClustalW कलन विधि का उपयोग कर चुना दृश्यों डेटा के लिए पंक्ति में से ClustalW से संरेखित करें; "BLOSUM" का चयन प्रोटीन वजन मैट्रिक्स के रूप में फिर ठीक बटन पर क्लिक करें।
  3. विश्लेषण अनुक्रम संरेखण:
    1. 5 प्रतिजनी प्रतिक्रियाशील si पर ध्यान देंटीईएस 17: 1 साइट (AKVEADVA, 15-22), साइट 2 (KASEDLK, 56-62), साइट 3 (ATKHKI, 94-99), साइट 4 (HVLHSRH, 113-119) और साइट 5 (KYKELGY, 145- 151) और टुकड़ा केटासियन के बीच में संरक्षित हैं। एक * (तारांकन; संरेखण में आम सहमति के प्रतीक (प्रोटोकॉल 2.2.3)) जो एक एकल, पूरी तरह से संरक्षित अवशेषों है पदों इंगित करता है। केटासियन में निम्नलिखित संरक्षित टुकड़े पाए गए: अनुक्रम KASEDLKKHG (जो साइट 2 भी शामिल है) और अनुक्रम HVLHSRHP (जो साइट 4 भी शामिल है)।
  4. अनुक्रम विश्लेषण, और एक ovalbumin प्रोटीन (OVA) वाहक प्रोटीन व्यावसायिक सेवाओं का उपयोग कर के रूप में साथ साधना के अनुसार synthesize उम्मीदवार अनुक्रम टुकड़े।
    1. अपघटन से पेप्टाइड को रोकने के लिए प्रतिजनी प्रतिक्रियाशील साइट के एन टर्मिनल के लिए हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड (जैसे, methionine) जोड़ें (जैसे, एम KASEDLKKHG)।
    2. immunocyte करने के लिए कोर प्रतिजनी साइट को प्रकाश में लाने के लिए प्रतिजनी प्रतिक्रियाशील साइट के सी टर्मिनल लंबा। इसके अलावा, conjuफाटक सी टर्मिनल के लिए एक सिस्टीन (Cys, सी) जोड़कर ओवीए साथ पेप्टाइड (जैसे, एम KASEDLKKHG-NTVL-सी)।
  5. immunogen 1 या पीबीएस में प्रत्येक सिंथेटिक पेप्टाइड के एक बराबर मात्रा (3 मिलीग्राम, अंतिम एकाग्रता 30-50 माइक्रोग्राम / 100 μl) के साथ immunogen 2 के लिए अधूरा Freund के सहायक के लिए पूरा Freund के सहायक पायसी।
  6. subcutaneously 5 महिला BALB / ग चूहों में से प्रत्येक में immunogen 1 (0.1 मिलीग्राम) टीका लगाना।
  7. दो सप्ताह के अंतराल पर चमड़े के नीचे इंजेक्शन बूस्टर immunogen 2 का उपयोग कर पांच बार प्रदर्शन और हर बूस्टर से पहले चूहों से पूंछ क्लिप नमूना द्वारा परीक्षण सीरा इकट्ठा।
  8. पहली स्क्रीनिंग के लिए सीरा अनुमापांक निर्धारित करते हैं।
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में प्रतिक्रिया बफर और समाधान के 50 μl विभाज्य के 25 मिलीलीटर में मुक्त पेप्टाइड के 100 माइक्रोग्राम प्रति भंग। प्रत्येक कुएं में 10 μl युग्मन अभिकर्मक समाधान जोड़ें और थाली मिश्रण। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
    2. , अच्छी तरह की सामग्री को निकालेंआसुत जल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो 3 बार, और अवरुद्ध समाधान के 200 μl जोड़कर प्लेट ब्लॉक। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। सामग्री निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से आसुत जल के साथ 3 बार धोएं।
    3. पहली स्क्रीनिंग के लिए सीरा अनुमापांक निर्धारण करने के लिए अप्रत्यक्ष एलिसा (प्रोटोकॉल 5.1-5.7) प्रदर्शन करना। तिल्ली संग्रह के लिए उच्चतम अनुमापांक (उच्चतम ऑप्टिकल घनत्व) के साथ माउस चुनें।
  9. तीन दिन तिल्ली संग्रह करने से पहले, subcutaneously माउस उच्चतम अनुमापांक पेश में immunogen 1 से 0.1 मिलीग्राम टीका लगाना।
  10. एमएबी पीढ़ी के लिए 18 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए चयनित प्रतिरक्षित चूहों और murine मायलोमा कोशिकाओं F0 (SP2 / 0-Ag14) के साथ फ्यूज से तिल्ली कोशिकाओं को ले लीजिए।
  11. 14 दिनों के बाद संलयन, की ओर मुक्त सिंथेटिक पेप्टाइड अप्रत्यक्ष एलिसा का उपयोग कर हाइब्रिडोमा supernatants (प्रोटोकॉल 5.1-5.7) की जेट स्क्रीनिंग द्वारा सकारात्मक क्लोन का चयन करें।
  12. maximiz के लिए अच्छी तरह से प्रति एक उचित संख्या के लिए कोशिकाओं पतलाकुओं कि केवल एक ही क्लोन (कमजोर पड़ने क्लोनिंग) होते हैं के अनुपात में हैैं।
    1. 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से A1 जो खाली छोड़ दिया है को छोड़कर सभी कुओं के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से 100 μl जोड़ें।
    2. अच्छी तरह A1 सेल निलंबन के 200 μl जोड़ें। तो जल्दी से बी 1 के लिए A1 से 100 μl हस्तांतरण और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण। संपूर्ण स्तंभ के नीचे 2 dilutions, और उसके बाद एच 1 से 100 μl त्यागने इतना है कि यह उसके ऊपर कुओं के रूप में एक ही मात्रा के साथ समाप्त होता है: ये 1 दोहराएँ।
    3. एक 8 चैनल micropipette के साथ स्तंभ 1 के लिए माध्यम की एक अतिरिक्त 100 μl जोड़ें। तो जल्दी से 100 μl कुओं में से प्रत्येक से 1 कॉलम में उन लोगों के लिए कॉलम 2 में एक ही पिपेट का उपयोग हस्तांतरण, और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण।
    4. पूरी थाली भर में 2 dilutions: एक ही सुझाव का उपयोग करना, इन 1 दोहराएँ। अंतिम स्तंभ में कुओं में से प्रत्येक से 100 μl त्यागें।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl मध्यम जोड़कर 200 μl करने के लिए सभी कुओं की अंतिम मात्रा लाओ। पीएलए सेतेते एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर undisturbed।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से जाँच करें और सभी कुओं कि सिर्फ एक ही कॉलोनी रोकने के निशान। दो या दो से अधिक clonings बाहर ले जाने के लिए जब तक एकल क्लोन युक्त कुओं की> 90% एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए सकारात्मक रहे हैं।
  13. पश्चिमी धब्बा और डॉट धब्बा (प्रोटोकॉल 3.1-4.6) द्वारा क्लोन स्क्रीन। फिर बड़े जहाजों में कुओं से उपसंस्कृति कालोनियों एमएबी प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए। आमतौर पर प्रत्येक क्लोन एक 12 या 24 अच्छी तरह से थाली में एक भी अच्छी तरह से में स्थानांतरित किया है।
  14. MABS और गाय, बकरी, सुअर, कुत्ते, खरगोश, ट्यूना, चिकन, मुहर से पेशी के अर्क, और पश्चिमी धब्बा और डॉट धब्बा (प्रोटोकॉल 3.1-4.6) द्वारा चार प्रतिनिधि ह्वेल प्रजातियों के बीच आत्मीयता के उपाय।
  15. Intraperitoneally चूहों में चयनित हाइब्रिडोमा कोशिकाओं टीका लगाना (3 एक्स 10 से 6 वर्ष) जलोदर प्रेरित करने के लिए। पेट की सूजन आम तौर पर स्पष्ट 7-10 दिनों के भीतर पोस्ट हाइब्रिडोमा इंजेक्शन है। तरल पदार्थ ले लीजिए एक चमड़े के नीचे सुई का उपयोग(कम से कम 20 गेज)।
  16. अपकेंद्रित्र जलोदर द्रव (10 मिनट के लिए 10,000 XG) कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए। एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर। प्रोटीन जी Sepharose स्तंभ में नमूने के 1 से 20 मिलीलीटर, बाध्यकारी बफर 15 मिलीलीटर, और क्षालन बफर के 3 से 5 मिलीलीटर जोड़ें। क्षालन चूहों जलोदर तरल पदार्थ से शुद्ध एंटीबॉडी युक्त अंश लीजिए।
  17. निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर एंटीबॉडी isotyping किट द्वारा एंटीबॉडी निर्धारण निर्धारित करते हैं।

3. वेस्टर्न ब्लाट

  1. बीएमई के 50 μl के साथ 2x Laemmli नमूना बफर के 950 μl मिश्रण से β-mercaptoethanol (बीएमई) युक्त 2x लोड हो रहा है बफर तैयार करें। जब पॉलीक्लोनल खरगोश विरोधी मानव एमबी एंटीबॉडी का उपयोग कर 5 (घरेलू पशुओं और ट्यूना), और: अच्छे संकेत प्राप्त करने के लिए उचित अनुपात के साथ लोड हो रहा है बफर में पेशी supernatants (प्रोटोकॉल 1.1-1.4) पतला: 01:50 (cetaceans और सील) और 1 1: 1 (सुअर, खरगोश, मुर्गी और ट्यूना), 1: 5 (गाय, बकरी और कुत्ता), और 1:25 (cetaceans और सील) जब एकntibody हाइब्रिडोमा सतह पर तैरनेवाला से है।
  2. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हीट नमूना। आणविक वजन मार्कर के साथ-साथ एसडीएस पृष्ठ जेल (4% एक्रिलामाइड स्टैकिंग और 12% एक्रिलामाइड अलग) के कुओं में लोड नमूने हैं। 50 पर 5 मिनट के लिए जेल चला वी के बारे में तो 1 घंटे में भाग समाप्त करने के लिए 150 वी करने के लिए वोल्टेज वृद्धि हुई है।
  3. 1x स्थानांतरण बफर में जेल में 15 मिनट के लिए रखें। nitrocellulose करने के लिए अलग प्रोटीन हस्तांतरण (नेकां) झिल्ली के बाद वे पृष्ठ से अलग हो रहे हैं। स्थानांतरण 60-90 मिनट के लिए 100 वी पर किया जा सकता है।
  4. अवरुद्ध समाधान तैयार: 1x पीबीएस 5% नोनफेट शुष्क दूध के साथ 0.1% बीच 20 से युक्त। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अवरुद्ध समाधान के 25 मिलीलीटर में नेकां झिल्ली ब्लॉक। बीच 20 (PBST) के साथ 15 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं।
  5. झिल्ली और 10 मिलीलीटर एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% अवरुद्ध समाधान के साथ पतला में प्राथमिक एंटीबॉडी (जलोदर द्रव या हाइब्रिडोमा सतह पर तैरनेवाला) सेते हैं।
  6. membran धोPBST के साथ फिर से ई तीन बार अत्यधिक एंटीबॉडी को साफ करने के लिए।
  7. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ अवरोधक समाधान में 1,250: 1 पर alkaline फॉस्फेट संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी के साथ झिल्ली सेते हैं।
  8. झिल्ली फिर से धो लें और 10 से 20 मिनट के लिए रंग विकास तक (BCIP / एनबीटी) फॉस्फेट सब्सट्रेट मिश्रण 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl फॉस्फेट / पी-nitroblue tetrazolium क्लोराइड में यह सेते हैं।
  9. आसुत जल से कई तरह के बदलाव में झिल्ली धोने से प्रतिक्रिया बंद करो।

4. डॉट ब्लाट

  1. केटासियन और मुहर के लिए 5 घरेलू पशुओं और ट्यूना के लिए, और 01:25: अच्छे संकेत प्राप्त करने के लिए उचित अनुपात के साथ PBST में 5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में पेशी supernatants (प्रोटोकॉल 1.1-1.4) पतला: 1। स्पॉट झिल्ली पर नमूने के 5 μl। क्षेत्र को कम कि समाधान (आमतौर पर 3-4 मिमी व्यास) प्रवेश इसे धीरे-धीरे लागू करने से।
  2. कमरे के तापमान पर (झिल्ली सूखी जैसे, </ Em> 30-60 मिनट के लिए एक लामिना का प्रवाह में), कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पेट्री डिश में समाधान को रोकने के साथ यह ब्लॉक, और PBST के साथ इसे धो लो।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते (एमएबी 1 पर हाइब्रिडोमा सतह पर तैरनेवाला से: 10,000 या जलोदर द्रव में 1: 1,00,000 5% अवरुद्ध समाधान में पतला) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए।
  4. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए: (5% अवरुद्ध समाधान में 1250 1 पर alkaline फॉस्फेट संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी) का प्रयोग करें PBST अतिरिक्त एंटीबॉडी को हटा दें, और उसके बाद माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ यह सेते करने के लिए 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार झिल्ली धोने के लिए ।
  5. झिल्ली फिर से धो लें और 10 से 20 मिनट के भीतर BCIP / एनबीटी फॉस्फेट सब्सट्रेट मिश्रण रंग विकास तक में यह सेते हैं।
  6. आसुत जल से कई तरह के बदलाव में झिल्ली धोने से प्रतिक्रिया बंद करो।

5. अप्रत्यक्ष एलिसा

  1. कपड़े धोने बफर (0.002 0.02% बीच 20 के साथ एम imidazole खारा बफर) तैयार करें। थाली धो धोने के साथ 3 बारप्रत्येक निम्नलिखित कदम (प्रोटोकॉल 5.2-5.5) के बीच बफर।
  2. कोटिंग बफर में पेशी supernatants (प्रोटोकॉल 1.1-1.4) के 1:25 कमजोर पड़ने को तैयार है। कोट एक 96 अच्छी तरह एलिसा रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 μl पतला supernatants के साथ थाली और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बफर (पीबीएस में 1% बीएसए) को रोकने के साथ यह ब्लॉक।
  3. पतला बफर के साथ शुद्ध एमएबी के 2,000 कमजोर पड़ने और अच्छी तरह से प्रत्येक को पतला एमएबी के 100 μl जोड़ें: 1 तैयार करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
  4. आगे ऊष्मायन के लिए: (200 पतला बफर में कमजोर पड़ने 1) जोड़ने बकरी विरोधी माउस आईजीजी हॉर्सरैडिश peroxidase के साथ संयुग्मित।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से (100 μl / अच्छी तरह से) के लिए peroxidase सब्सट्रेट जोड़ें और 10-15 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. peroxidase स्थान पर समाधान (100 μl / अच्छी तरह से) जब रंग विकास मनाया जाता है द्वारा एंजाइम की प्रतिक्रिया बंद करो।
  7. 450 एक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एनएम ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें।

6. कोलाइडयन गोल्ड लेबल एमएबी की तैयारी नोट: कोलाइडयन सोने समाधान और मिश्रण का रंग हमेशा लाल होना चाहिए। जब काले वेग देखा जाता है पीएच, एमएबी की एकाग्रता, सेंट्रीफ्यूज की गति समायोजित करें। 6.1 कदम और 6.2 अनुकूलन कदम उठाए हैं।

  1. 5-9 से अलग पीएच मान के साथ कोलाइडयन सोने समाधान के 100 μl को एमएबी (50 माइक्रोग्राम / एमएल, 3 μl) का पता लगाने शुद्ध जोड़ें। न्यूनतम पीएच कि दो घंटे के लिए रंग लाल रहता है इष्टतम पीएच के रूप में माना जाता है। नोट: इस अध्ययन में, 0.1 एम पोटेशियम कार्बोनेट कोलाइड सोना (40 एनएम) पीएच 8.0 (इष्टतम पीएच) का हल समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
  2. पीएच 8.0 से कोलाइडयन सोने समाधान के 100 μl को एमएबी का पता लगाने के शुद्ध के विभिन्न राशि (500 माइक्रोग्राम / एमएल, 1-20 μl) जोड़ें। नोट: इस अध्ययन में अधिकतम एकाग्रता 6 माइक्रोग्राम / एमएल (कोई काला वेग) है।
  3. ऊपर दिए गए परिणाम के अनुसार, शुद्ध पता लगाने एमएबी बूंद के लिहाज से सोने कोलाइड समाधान के 10 मिलीलीटर की 60 माइक्रोग्राम जोड़ें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे मिश्रण पायसी। विज्ञापनडी मिश्रण करने के लिए पीबीएस में 5% BSA समाधान (7.4 पीएच) के 2 मिलीलीटर और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे पायसी पृष्ठभूमि हस्तक्षेप को कम करने के लिए।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
  5. unconjugated एंटीबॉडी के साथ सतह पर तैरनेवाला ध्यान से निकालें और 4 मिलीलीटर में जिसके परिणामस्वरूप छर्रों को निलंबित PBST 1% बीएसए और 0.1% के बीच 20 से युक्त, और centrifugation और निलंबन कई बार दोहराएँ।
  6. 1 मिलीलीटर PBST में अंतिम अवक्षेप को निरस्त करने और जब तक इस्तेमाल किया 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।

7. इम्यून पट्टी का निर्माण

नोट: चित्रा 1 प्रतिरक्षा पट्टी डिजाइन से पता चलता है। तैयार है और <(1 वर्ष) लंबे समय तक भंडारण जीवन के लिए (20% सापेक्ष आर्द्रता एक कम आर्द्रता प्रयोगशाला पर्यावरण हालत में स्ट्रिप्स)> इकट्ठा। पैड और झिल्ली के आयाम हैं: साधना पैड 300 मिमी x 10 मिमी, शोषक पैड 300 मिमी x 24 मिमी, नमूना पैड 300 मिमी x 24 मिमी, नेकां झिल्ली 300 मिमी x 25 मिमी, मोटा 300मिमी x 80 मिमी।

  1. कदम 6.6 से कोलाइड सोने लेबल एमएबी समाधान के लिए एक micropipette साधना पैड तर और फिर कोडांतरण से पहले 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यह शुष्क करने के साथ जोड़ें।
  2. एक विंदुक या immunostrip प्रिंटर का उपयोग कर नेकां झिल्ली पर एमएबी का पता लगाने के लिए नियंत्रण क्षेत्र पर विशिष्ट प्रतिजन कब्जा परीक्षण क्षेत्र पर एमएबी (500 माइक्रोग्राम / एमएल), और खरगोश विरोधी माउस आईजीजी (500 माइक्रोग्राम / एमएल) बांटो। दो क्षेत्रों के बीच की दूरी (> 5 मिमी) बनाए रखने के हस्तक्षेप से बचने के लिए।
  3. संयुग्मित पैड, शोषक पैड और डबल पक्षीय टेप के साथ मोटा पर नेकां झिल्ली पेस्ट करें।
    नोट: के बारे में 2 मिमी से नेकां झिल्ली के प्रत्येक पक्ष पर पैड ओवरलैप। अनुचित पट्टी निर्माण एक अधूरी परीक्षा का परिणाम देगा।
  4. साधना पैड पर नमूना पैड (2 मिमी) प्लेस और मोटा पर पेस्ट करें।
  5. एक पेपर कटर के साथ 6 मिमी चौड़ा स्ट्रिप्स बनाएँ। शोषक के साथ एल्यूमीनियम पन्नी बैग में पैक स्ट्रिप्स, और जब तक इस्तेमाल किया 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।

8. पार जेट टेस्ट

  1. एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1 मिलीलीटर पीबीएस (युक्त 0.1% बीएसए) एक बांस की छड़ी का उपयोग कर या रॉड पीस के साथ कच्चे पेशी नमूने के 0.03 छ Homogenize।
  2. परीक्षण क्षेत्रों के अंत विपरीत द्वारा पट्टी पकड़ो और 5-10 मिनट के लिए नमूना में नमूना पैड हिस्सा डुबकी और परिणाम सीधे निरीक्षण करते हैं।
    1. वैकल्पिक: 500 μl सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण।
      नोट: यदि संकेत स्पष्ट है जब पट्टी सीधे सतह पर तैरनेवाला में लथपथ है नहीं है यह कदम सुझाव दिया है।
  3. तीन प्रतियों में विभिन्न मांसपेशियों के नमूनों का परीक्षण करें।
    नोट: यहाँ हम ट्यूना, चिकन, सील, cetaceans की 15 प्रजातियां और स्थलीय स्तनधारियों की प्रजातियों 5 का परीक्षण किया।
  4. , पांच स्वतंत्र निरीक्षकों पांच बार दोहराने 8.3, यानी कुल 575 स्ट्रिप्स का उपयोग करें।

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Representative Results

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मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशेषताओं

हम ह्वेल एमबी की क्रमश: दो आईजीजी 1 MABS (CGF5H9 और CSF1H13) दो सिंथेटिक पेप्टाइड्स (MKASEDLKKHGNTVLC और AIIHVLHSRHPAEFGC), पहचानने विकसित की है, और इन ह्वेल एमबी की तेजी से पता लगाने के लिए एक सैंडविच प्रकार कोलाइडयन सोने इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक परीक्षण पट्टी के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया। चित्रा 2 से पता चलता है कि CGF5H9 लगभग 17 केडीए के एक भविष्यवाणी की आणविक वजन पर एक भी दाग बैंड के रूप में केटासियन और अन्य स्तनधारियों का पता लगाता है। आम minke व्हेल (Balaenoptera acutorostrata) अन्य केटासियन के बैंड की तुलना में अपेक्षाकृत हल्की बैंड से पता चलता है। बैंड, ट्यूना, मुर्गियों और जवानों के लिए अनुपस्थित रहे हैं, जबकि लगभग 50 केडीए पर एक बैंड सूअरों के लिए मनाया जाता है। हालांकि सूअर और ट्यूना के लिए कई अविशिष्ट बैंड देखते हैं, CSF1H13 अति विशिष्ट है क्योंकि यह केवल अनुमानित 17 कश्मीर की एक भविष्यवाणी की आणविक वजन में केटासियन और एक बैंड के रूप में जवानों के साथ प्रतिक्रिया करता हैदा। Minke व्हेल केवल 01:10 कोई संकेत 01:25 पर मनाया के साथ (नहीं दिखाया डेटा) पर एक मजबूत संकेत से पता चलता है। चित्रा 2 डॉट धब्बा में समान परिणाम दिखाता है।

चित्रा 3A कि CGF5H9 केटासियन, खरगोश, कुत्तों, बकरियों, और गाय (आयुध डिपो मूल्य> 3.0) के लिए सकारात्मक संकेत दर्शाता पता चलता है; सूअरों के लिए कमजोर सकारात्मक संकेत (आयुध डिपो मूल्य = 1.5); जवानों, मुर्गियों और ट्यूना के लिए नकारात्मक संकेत। चित्रा 3 बी से पता चलता है कि CSF1H13 केटासियन और जवानों के प्रति उच्च आत्मीयता (आयुध डिपो मूल्य> 3.0) को व्यक्त करता है। दोनों CSF1H13 और CGF5H9 सभी चार ह्वेल प्रजातियों के साथ दृढ़ता से प्रतिक्रिया कर सकते हैं। इन चार प्रजातियों में अलग-अलग परिवारों से हैं (minke व्हेल: Balaenopteridae; बॉटलनोस डॉल्फिन: Delphinidae; बौना शुक्राणु व्हेल: Kogiidae; finless शिंशुमार: Phocoenidae), विविध ह्वेल प्रजातियों के लिए व्यापक जेट का संकेत है।

पट्टी निर्माण के लिए, CGF5H9, टी पहचानता है जोवह केटासियन और अन्य स्तनधारियों की एमबीएस है कोलाइड सोने का लेबल और मायोग्लोबिन बाध्य करने का पता लगाने के एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया, और CSF1H13 केवल केटासियन और जवानों के एमबीएस पर कब्जा करने के लिए परीक्षण लाइन पर लेपित है। इसलिए परीक्षण लाइन के लिए एक सकारात्मक संकेत है जब दोनों MABS ह्वेल एमबी का पता लगाने को दिखाने के लिए बनाया गया है। क्योंकि गैर ह्वेल जानवरों से MB केवल इन दो MABS में से एक से पता लगाया जा सकता है, परीक्षण लाइन एक नकारात्मक परिणाम जब अन्य जानवरों से पेशी के नमूने परीक्षण कर रहे हैं पता चलता है। नियंत्रण रेखा हमेशा एक सकारात्मक परिणाम से पता चलता है, क्योंकि खरगोश विरोधी माउस आईजीजी बांधता कोलाइड सोने लेबल CGF5H9। नियंत्रण रेखा में एक असफल परिणाम का संकेत है कि पट्टी पर सामग्री की गुणवत्ता खराब है।

पट्टी परीक्षण
चित्रा 4 दोनों परीक्षण लाइन और नियंत्रण रेखा पर संकेत बैंड जब ह्वेल पेशी नमूनों का इस्तेमाल कर रहे हैं पता चलता है। जब नमूना केटासियन से नहीं है, वहाँ केवल नियंत्रण रेखा वाई में एक ही बैंड हैपरीक्षण लाइन पर बैंड के अभाव वें। एक सफल परिणाम 10 मिलीलीटर पीबीएस 0.1% BSA युक्त एक प्लास्टिक या बांस की छड़ी का उपयोग कर और मिश्रण में पट्टी भिगोने के साथ पेशी के 0.03 छ homogenizing के बाद 5-10 मिनट में सीधे देखा जा सकता है। 15 ह्वेल प्रजातियों और तीन प्रतियों में आठ गैर ह्वेल प्रजातियों के परीक्षण के बाद, विशिष्टता (गैर ह्वेल के नमूनों का प्रतिशत सही ढंग से पहचान) और संवेदनशीलता (ह्वेल के नमूनों का प्रतिशत सही ढंग से पहचान) दोनों 100% कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रतिरक्षा पट्टी के डिजाइन। सभी घटकों को ध्यान प्लास्टिक समर्थन कार्ड पर बहुस्तरीय कर रहे हैं ताकि वे ओवरलैप। इस अभिकर्मकों और नमूना झिल्ली के माध्यम से और शोषक पैड करने के लिए प्रवाह की अनुमति देता। टी: परीक्षण क्षेत्र। सी: नियंत्रण क्षेत्र। यह आंकड़ा लो, सी एट अल से reproduced किया गया है। रैपिड प्रतिरक्षा कोलाइडयन सोने की पट्टी। ह्वेल मांस निरोधक अवैध व्यापार और उपभोग के लिए: संरक्षण और सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए निहितार्थ PLoS एक 8, e60704 (2013)। डोई:। 10.1371 / journal.pone.0060704 यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. पश्चिमी धब्बा और डॉट धब्बा विश्लेषण हाइब्रिडोमा supernatants इस्तेमाल करते हैं। (ए) CGF5H9, (बी) CSF1H13। दोनों हाइब्रिडोमा supernatants लगभग 17 केडीए के एक भविष्यवाणी की आणविक वजन पर एक भी दाग ​​बैंड के रूप में केटासियन पता लगा सकते हैं। मेगावाट: minke व्हेल, BND: बॉटलनोस डॉल्फिन, डीएसडब्ल्यू: बौना शुक्राणु व्हेल, एफपी: finless शिंशुमार, PKW: बौना व्हेल, एन: पीबीएस (नकारात्मक नियंत्रण)। यह आंकड़ा लो, सी एट अल से reproduced किया गया है। ग के लिए रैपिड प्रतिरक्षा कोलाइडयन सोने की पट्टीetacean मांस निरोधक अवैध व्यापार और खपत:। संरक्षण और सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए निहितार्थ PLoS एक 8, e60704 (2013)। डोई:। 10.1371 / journal.pone.0060704 यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. शुद्ध MABS का उपयोग कर विभिन्न प्रजातियों की पेशी के अर्क का अप्रत्यक्ष एलिसा। (ए) CGF5H9, (बी) CSF1H13। केवल केटासियन दोनों MABS में मजबूत सकारात्मक संकेतों का उत्पादन कर सकते हैं। यह आंकड़ा लो, सी एट अल से reproduced किया गया है ह्वेल मांस निरोधक अवैध व्यापार और उपभोग के लिए रैपिड प्रतिरक्षा कोलाइडयन सोने पट्टी:।। संरक्षण और सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए निहितार्थ PLoS एक 8, e60704 (2013)। डोई: 10.1371 / journal.pone.0060704। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिरक्षा कोलाइडयन सोने की पट्टी की विशिष्टता टी। परीक्षण लाइन। सी: नियंत्रण रेखा। केवल जब ह्वेल पेशी नमूनों का इस्तेमाल कर रहे हैं, सफल परिणाम (दोनों परीक्षण लाइन और नियंत्रण रेखा पर संकेत बैंड) मनाया जा सकता है। (ए) गैर ह्वेल नमूने: 1: गाय। 2: बकरी। 3: सुअर। 4: कुत्ता। 5: खरगोश। 6: टूना। 7: चिकन। 8: हार्बर सील (Phoca vitulina)। (बी) ह्वेल नमूने: 1: आम minke व्हेल (Balaenoptera acutorostrata)। 2: Omura व्हेल (Balaenoptera omurai)। 3: Bottlenose डॉल्फिन (Tursiops aduncus)। 4: Bottlenose डॉल्फिन (टी truncatus)। 5: फ्रेजर डॉल्फिन (Lagenodelphis hosei </ Em>)। 6: भारत-प्रशांत कुबड़ा डॉल्फिन (Sousa chinensis)। 7: Risso की डॉल्फिन (Grampus griseus)। 8: Pantropical देखा डॉल्फिन (Stenella attenuata)। 9: किसी न किसी दांतेदार डॉल्फिन (स्टेनो bredanensis)। 10: बौना व्हेल (Feresa attenuata)। 11: लघु finned पायलट व्हेल (Globicephala macrorhynchus)। 12: तरबूज की अध्यक्षता व्हेल (Peponocephala इलेक्ट्रा)। 13: बौना ह्वेल (Kogia सिमा)। 14: बौना ह्वेल (लालकृष्ण breviceps)। 15: Finless शिंशुमार (Neophocaena phocaenoides)। यह आंकड़ा लो, सी एट अल से reproduced किया गया है ह्वेल मांस निरोधक अवैध व्यापार और उपभोग के लिए रैपिड प्रतिरक्षा कोलाइडयन सोने पट्टी:।। संरक्षण और सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए निहितार्थ PLoS एक 8, e60704 (2013)। डोई:। 10.1371 / journal.pone.0060704 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

ह्वेल प्रजातियों गैर-ह्वेल प्रजातियों
बौना ह्वेल (Kogia breviceps) हार्बर सील (Phoca vitulina)
बौना ह्वेल (Kogia सिमा) कुत्ता (Canis lupus familiaris)
लघु finned पायलट व्हेल (Globicephala macrorhynchus) खरगोश (Oryctolagus cuniculus)
तरबूज की अध्यक्षता व्हेल (Peponocephala इलेक्ट्रा) सुअर (सस scrofa)
बौना व्हेल (Feresa attenuata) बकरी (काप्रा कक्षारोम)
Pantropical डॉल्फिन देखा (Stenella attenuata) मवेशी (बोस वृषभ)
Bottlenose डॉल्फिन (Tursiops truncatus) चिकन (Gallus Gallus)
Bottlenose डॉल्फिन (Tursiops aduncus) Yellowfin ट्यूना (थुन्नुस albacares)
फ्रेजर डॉल्फिन (Lagenodelphis hosei)
भारत-प्रशांत कुबड़ा डॉल्फिन (Sousa chinensis)
किसी न किसी दांतेदार डॉल्फिन (स्टेनो bredanensis)
Risso की डॉल्फिन (Grampus griseus)
Finless शिंशुमार (Neophocaena phocaenoides)
आम minke व्हेल (Balaenoptera acutorostrata)
Omura व्हेल (Balaenoptera Omura i)

तालिका 1 से प्रजातियों पेशी Colle थाcted और इस अध्ययन में परीक्षण किया। प्रजाति, स्थलीय स्तनधारियों के 5 प्रजातियों, और केटासियन की 15 प्रजातियां (4 परिवारों) ट्यूना, चिकन, मुहर शामिल हैं।

जाति परिग्रहण नहीं।
आम minke व्हेल (Balaenoptera acutorostrata) P02179
बौना Bryde व्हेल (Balaenoptera edeni) Q0KIY2
कुबड़ा व्हेल (मेगाप्टेरा novaeangliae) P02178
ग्रे व्हेल (Eschrichtius robustus) P02177
ह्वेल (Physeter macrocephalus) P02185
बौना ह्वेल (Kogia breviceps) Q0KIY5
बौना ह्वेल (Kogia सिमा) P02184
लघु beakeडी आम डॉल्फिन (Delphinus DELPHIS) P68276
लंबी finned पायलट व्हेल (Globicephala मेलों) P02174
व्हेल (ओर्किनस Orca) P02173
तरबूज की अध्यक्षता व्हेल (Peponocephala इलेक्ट्रा) Q0KIY3
Pantropical डॉल्फिन देखा (Stenella attenuata) Q0KIY6
Bottlenose डॉल्फिन (Tursiops truncatus) P68279
हार्बर शिंशुमार (Phocoena phocoena) P68278
अमेज़न नदी डॉल्फिन (Inia geoffrensis) P02181
लांगमैन का टोंटीदार व्हेल (Indopacetus pacificus) Q0KIY9
Hubbs 'टोंटीदार व्हेल (Mesoplodon carlhubbsi) P02183
कुवियर का टोंटीदार व्हेल (जिphius cavirostris) P02182
हार्बर सील (Phoca vitulina) P68080
मवेशी (बोस वृषभ) P02192
बकरी (काप्रा कक्षारोम) B7U9B5.3
हार्स (Equus caballus) P68082
सुअर (सस scrofa) P02189
कुत्ता (Canis lupus familiaris) P63113
चिकन (Gallus Gallus) P02197
शुतुरमुर्ग (Struthio camelus) P85077
Yellowfin ट्यूना (थुन्नुस albacares) P02205

तालिका 2 Myoglobin संबंधित परिग्रहण संख्या के साथ इस अध्ययन में इस्तेमाल दृश्यों। प्रजाति, ट्यूना शामिलचिकन, शुतुरमुर्ग, घरेलू स्तनधारी, सील और केटासियन की 18 प्रजातियों (7 परिवारों)। इस तालिका में लो, सी एट अल से reproduced किया गया है ह्वेल मांस निरोधक अवैध व्यापार और उपभोग के लिए रैपिड प्रतिरक्षा कोलाइडयन सोने पट्टी:।। के लिए संरक्षण और सार्वजनिक स्वास्थ्य PLoS एक 8 निहितार्थ, e60704 (2013)। डोई: 10.1371 / journal.pone.0060704।

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Discussion

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एक सिंथेटिक पेप्टाइड वाहक प्रोटीन संयुग्मित का उपयोग करते हुए अपने आत्मीय प्रोटीन की तुलना में उल्लेखनीय अधिक प्रभावी है। एक सैंडविच आधारित तकनीक के लिए, क्योंकि एमएबी जाना जाता रिश्तेदार स्थानों के साथ epitopes का उपयोग कर विकसित किया गया है, इस अध्ययन में दो MABS नहीं लक्ष्य प्रतिजन मिलान के साथ एक दूसरे के साथ बातचीत के हस्तक्षेप की संभावना है। इसके अलावा, देशी प्रोटीन और सिंथेटिक पेप्टाइड-साधना के साथ प्रतिरक्षित चूहों के एंटीबॉडी के बीच जेट मूल निवासी प्रोटीन और एंटीबॉडी मूल निवासी प्रोटीन 19 से उत्पादित के बीच जेट की तुलना में मजबूत हो सकता है। सिंथेटिक पेप्टाइड conjugates के उपयोग इसलिए प्रभावी टीकाकरण प्रक्रियाओं और उचित विरोधी पेप्टाइड एमएबी की पीढ़ी के लिए सिफारिश की है।

एक प्रोटीन की संरचना मुख्य रूप से पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में अमीनो एसिड के अनुक्रम शामिल है। प्रत्येक अमीनो एसिड अपने पक्ष श्रृंखला विशिष्ट गुण के लिए अग्रणी है, और थोड़ा अमीनो एसीआई बदल रहा हैडी अनुक्रम संरचना में परिवर्तन का परिणाम है। क्योंकि 10-20 अमीनो एसिड की लंबाई के साथ पेप्टाइड्स एंटीबॉडी तैयार करने के लिए आदर्श होते हैं, सी टर्मिनल क्षेत्र में सिंथेटिक पेप्टाइड्स (immunogen) की लंबाई सुनिश्चित करने के लिए कि कोर प्रतिजनी क्षेत्र मान्यता प्राप्त हो जाएगा वृद्धि हुई थी। इसलिए, विभिन्न विभिन्न मिलान संरचनाओं में जिसके परिणामस्वरूप पशुओं के एमबीएस के बीच अमीनो एसिड के अवशेष कुशलता से भेदभाव किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 ए उल्लेख पेप्टाइड डिजाइन योगदान देता है CGF5H9 केटासियन के साथ, लेकिन नकारात्मक जवानों के साथ जोरदार प्रतिक्रिया को दर्शाता है। एक अन्य उदाहरण मुर्गियों और CGF5H9 के कुत्तों की ओर अलग समानताएं हालांकि चिकन कोर प्रतिजनी साइट 2 में कुत्ते की है कि एक समान अनुक्रम है यह इंगित करता है कि बाहरी क्षेत्र में अनुक्रम अंतर संरचना परिवर्तन और इस प्रकार चर को जन्म दे सकता है प्रतिजन और एंटीबॉडी के बीच आत्मीयता के बंधन।

पश्चिमी धब्बा, डॉट धब्बा, और अप्रत्यक्ष एलिसा में इस्तेमाल किया गयाउपयुक्त MABS स्क्रीनिंग के लिए हमारे विधि। पश्चिमी धब्बा व्यापक रूप से ऊतक निकालने या homogenate में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक में, जेल वैद्युतकणसंचलन पॉलीपेप्टाइड की लंबाई से विकृत प्रोटीन को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इसलिए, यह संकेत करता है, तो भविष्यवाणी प्रोटीन आणविक वजन को इंगित करता है इस बात की पुष्टि करना संभव है। हालांकि, पता लगाने के परिणाम (सकारात्मक या नकारात्मक, मजबूत या कमजोर संकेत) बाध्यकारी क्योंकि विकृत प्रोटीन इस्तेमाल कर रहे हैं प्रतिजन एंटीबॉडी की वास्तविक स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है। नतीजतन, डॉट धब्बा दूसरे चरण स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। डॉट धब्बा प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक तकनीक है। यह पश्चिमी धब्बा विधि का सरलीकरण का प्रतिनिधित्व करता है। डॉट धब्बा में, अणु का पता लगाया जा करने के लिए युक्त एक मिश्रण एक बिंदु के रूप में एक झिल्ली पर सीधे लागू किया जाता है। यह एक पश्चिमी धब्बा से अलग है क्योंकि प्रोटीन के नमूने विकृत नहीं कर रहे हैं। ध्यान दें कि इस तकनीक का लक्ष्य बायोमोलिक्यूल के आकार पर कोई जानकारी प्रदान करता है, और एक एकल डॉट अगर दो मो दिखाई देंगेविभिन्न आकार के lecules पता चला रहे हैं। अंत में, अप्रत्यक्ष एलिसा के क्रम में एक संकेत है कि ठीक मात्रा निर्धारित किया जा सकता है उत्पन्न करने के लिए एक ligand बाध्यकारी परख के लिए प्रयोग किया जाता है। यह एमएबी विशेषताओं के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है और इस तरह की पट्टी निर्माण की सुविधा।

मांसपेशियों में एमबी की सांद्रता संग्रह स्थान के आधार पर चर रहे हैं। उदाहरण के लिए, स्विमिंग मांसपेशियों (अक्षीय मांसपेशियों) केटासियन में गैर तैराकी की मांसपेशियों के साथ तुलना एमबी की एक काफी उच्च सामग्री है, और युवा केटासियन से नमूने क्योंकि एक जानवर के जीवन भर 20 एमबी एकाग्रता बढ़ जाती है कम एमबी एकाग्रता होगा। प्रारंभ में, CSF1H13 है, जो केवल केटासियन और जवानों के एमबी कब्जा, कोलाइड सोने लेबल हो सकता है और एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया है, और CGF5H9 है, जो कई प्रजातियों के एमबी पहचानता है, परीक्षण लाइन पर एंटीबॉडी कब्जा होगा करने के उद्देश्य से किया गया था। हम धारणा है कि पता लगाने के एंटीबॉडी अधिक विशिष्ट होना चाहिए और कब्जा एंटीबॉडी चाहिएअधिक सामान्य हो। हालांकि, एक कमजोर सकारात्मक संकेत परीक्षण लाइन पर पाया गया था जब कम एमबी सांद्रता के साथ ह्वेल के नमूनों का इस्तेमाल किया गया (डेटा) नहीं दिखाया। समस्या यह है जब दो MABS के पदों प्रतिनिधि परिणामों में वर्णित के रूप में उलट गया था हल किया गया था। एक अच्छा संकेत भी एक नवजात ह्वेल (एक असहाय Omura व्हेल) (चित्रा 4) के लिए दिखाया गया था। यह है कि क्या विशेषताओं और MABS की एकाग्रता इस घटना के लिए योगदान स्पष्ट नहीं है।

इस अध्ययन में, पीबीएस के साथ homogenized जमे हुए thawed पेशी के नमूने पट्टी परीक्षण पर इस्तेमाल किया गया। अन्य नमूना स्थिति और तैयारी के तरीकों परिणाम को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, जैसे कि MB नमक में घुलनशील प्रोटीन शुद्ध पानी के बजाय पीबीएस का उपयोग कर निकाला जाना चाहिए। अन्यथा, निकासी अपर्याप्त हो सकती है, जो एक न्यायपालिका परिणाम के लिए ले जा सकता है। उचित निकासी बफर: मांस का नमूना अनुपात पट्टी परिणाम के सफल व्याख्या के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार है। बड़े AmouNT नियंत्रण नमूने (जैसे, घरेलू पशुओं) (1 मिलीलीटर में 0.3 ग्राम बफर) सकारात्मक परिणाम और धुंधला पृष्ठभूमि कारण बन सकता है। हालांकि, (1: 0.03) इस अध्ययन में इस्तेमाल अनुपात सही परिणाम का उत्पादन किया। केवल ताजा पेशी के नमूने इस पट्टी परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटीन hydrolyzed या है, जो सकारात्मक परिणाम न केवल अन्य जानवरों से ह्वेल पेशी के नमूने लेकिन यह भी नमूने के लिए कारण सकता है (जैसे कि सोया सॉस और उबलते द्वारा इलाज के रूप में) कुछ उपचार के बाद विकृत किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। इसलिए, यह सुझाव दिया है कि चर नमूना स्रोतों और विभिन्न निर्माण डिजाइन योजनाओं पट्टी के विकास के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

अंत में, इस प्रोटोकॉल दो MABS जोरदार केटासियन की एमबी के लिए प्रतिक्रियाशील के विकास का वर्णन है, और इन MABS सील और अन्य जानवरों से केटासियन की एमबी अंतर करने के लिए एक त्वरित परीक्षण पट्टी पर लागू कर रहे हैं। हालांकि ह्वेल मांस की पहचान के लिए विश्वसनीय पीसीआर आधारित डीएनए विश्लेषण उपलब्ध 12 है, यह मैंश्रम गहन और समय लेने। त्वरित परीक्षण पट्टी एक भरोसेमंद और तेजी से तकनीक है कि क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा सकता ह्वेल मीट, जो नियामक एजेंसियों 21 के लिए अति आवश्यक है की पहचान है। यह संभावना है कि इस तरह के पट्टी घोड़े या सूअर के रूप में जानवरों से विशिष्ट एमबीएस पता लगाने के लिए विकसित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline AMRESCO J373
Protein G HP SpinTrap  GE Healthcare 28-9031-34 spin column containing Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit Roche 11493027001 Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies
Mini Trans-Blot Bio-Rad 170-3935
Nitrocellulose membrane Whatman Z613630
Antibody blocker solution  LTK BioLaboratories To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples
BCIP/NBT phosphatase substrate  KPL 50-81-00
Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse KPL 54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate Thermo Fisher Scientific EW-01928-08
Multiskan EX ELISA reader  Thermo Electron Corporation 51118170
Colloid gold (40 nm) solution  REGA biotechnology Inc. 40-50 nm is appropriate for immunostrip
Bovine serum albumin Gibco 15561-020
Rapid test immno-strip printer REGA biotechnology Inc. AGISMART RP-1000  Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes
Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) REGA biotechnology Inc.
Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant  Sigma-Aldrich F5881, F5506 Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens
Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED)  Protech Gel preparation for SDS-PAGE
Coomassie brilliant blue R-250 Bio-Rad 1610436 Protein staining in SDS-PAGE gels
Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol Bio-Rad 1610737, 1610710 Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels

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References

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ह्वेल Myoglobin की जांच के लिए एक कोलाइडयन गोल्ड आधारित इम्यूनोक्रोमैटोग्राफिक परीक्षण पट्टी का विकास
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Chan, K. W., Lo, C., Chu, C. S., Chin, L. T., Wang, Y. T., Yang, W. C. Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin. J. Vis. Exp. (113), e53433, doi:10.3791/53433 (2016).More

Chan, K. W., Lo, C., Chu, C. S., Chin, L. T., Wang, Y. T., Yang, W. C. Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin. J. Vis. Exp. (113), e53433, doi:10.3791/53433 (2016).

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