Protocol
Etica Dichiarazione: Lo studio è stato eseguito in conformità con le linee guida internazionali e approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali (IACUC) della Nazionale Chiayi University, ID di approvazione: 99022. L'utilizzo di esempio cetaceo è stato consentito dal Consiglio Agricoltura di Taiwan (Research Permesso 100M-02.1-C-99).
1. muscolare preparazione del campione e SDS-PAGE
Nota: I campioni muscolari provenienti da 23 specie, tra cui 16 specie di mammiferi marini, 5 specie di mammiferi terrestri, tonno e pollo sono stati utilizzati in questo studio (Tabella 1). I campioni di muscolo di cetacei sono stati ottenuti da individui bloccati, catture accessorie della pesca, e la confisca. Coniglio, ratto, cane e tessuti muscolari pollo sono stati ottenuti da animali diagnostico Centro Nazionale Chiayi University. I campioni di carne di manzo, maiale, agnello, e il tonno sono stati acquistati da un supermercato locale. Il campione di muscolo di Seal Harbor (Phoca vitulina
- Conservare tutti i campioni a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Pre-cool malta a -20 ° C. Poi mettere 3 g di campione muscolare congelato in esso.
- Omogeneizzare il campione con 10 ml di freddo fosfato salino (PBS) utilizzando un omogeneizzatore tessuto.
- Centrifugare il campione omogeneizzato a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservarlo a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare 5 ml di 5% stacking gel (3,07 ml di acqua distillata, 1,25 ml di 4x tampone di gel superiore pH 6,8, 625 ml di 40% acrilammide, 50 ml di 10% ammonio persolfato (APS), e 5 ml di tetrametiletilendiammina ( TEMED)) e 10 ml di 15% gel di separazione (3,65 ml di acqua distillata, 2,5 ml di tampone di 4x inferiore gel a pH 8.8, 3.75 ml di 40% acrilammide, 100 ml di 10% APS,e 4 ml di TEMED).
- Nella cella elettroforesi, versare stacking gel (5% acrilammide) sulla parte superiore del gel di separazione (15% acrilammide) alla quale è solidificato. Inserire un pettine gel nel gel di impilamento.
- Eseguire pagina in base alle seguenti condizioni: condizione corsa iniziale: 100 volt, 20 min e condizione finale: 120 volt, 40 min.
- Macchia il gel con Coomassie Brilliant Blue a temperatura ambiente per 30 minuti fino a quando il gel è uniformemente colore blu.
Nota: La colorazione è completa quando il gel è più visibile nella soluzione colorante. - Decolorare con soluzione di acido acetico (10%) a temperatura ambiente per 1 ora. Bande inizieranno ad apparire. Continuare la decolorazione a 4 ° C durante la notte fino a quando lo sfondo è chiaro.
2. Peptide Synthesis e monoclonale di produzione
- Recuperare le sequenze di amminoacidi di Mb da GenBank tra cui il tonno, pollo, struzzo, mammiferi domestici, di tenuta e di 18 speciedei cetacei (Tabella 2).
- Allineare le sequenze utilizzando una corretta software 16:
- Lanciare l'allineamento Explorer selezionando l'Align: Modifica / Crea allineamento sulla barra di avvio; selezionare Crea nuovo allineamento e fare clic su OK. Apparirà una finestra di dialogo che chiede "State voi costruendo un allineamento di sequenze di DNA o proteine?"
- Fare clic sul pulsante "Protein"; selezionare Data: Open: Recupero sequenze di selezionare il file di sequenza di file e; selezionare l'Edit: Seleziona tutto il comando di menu per selezionare tutti i siti per ogni sequenza nel set di dati per la creazione di un allineamento di sequenze multiple.
- Selezionare Allineamento: Allinea dal ClustalW dal menu principale per allineare i dati di sequenze selezionate utilizzando l'algoritmo ClustalW; selezionare "BLOSUM" come proteine Peso Matrix quindi fare clic sul pulsante OK.
- Analizzare l'allineamento di sequenze:
- Focus su 5 antigenica si reattivaTES 17: 1 sito (AKVEADVA, 15-22), sito 2 (KASEDLK, 56-62), sito 3 (ATKHKI, 94-99), sito 4 (HVLHSRH, 113-119) e il sito 5 (KYKELGY, 145- 151) e trovare il frammento conservato tra i cetacei. Un * (asterisco, simbolo consenso nella allineamento (protocollo 2.2.3)) indica le posizioni che hanno un singolo residuo, completamente conservato. I seguenti frammenti conservati nei cetacei sono stati trovati: sequenza KASEDLKKHG (che include posto 2) e la sequenza HVLHSRHP (che include posto 4).
- Sintetizzare frammenti di sequenze candidate secondo l'analisi di sequenza, e coniugato con una proteina ovalbumina (OVA) come proteina carrier utilizzando servizi commerciali.
- Aggiungere amminoacidi idrofobici (ad esempio, metionina) al N-terminale di antigenico sito reattivo per impedire il peptide dalla decomposizione (ad esempio, M-KASEDLKKHG).
- Prolungare il C-terminale della antigenico sito reattivo per esporre il sito antigenico nucleo al immunocyte. Inoltre, conjucancello il peptide OVA con l'aggiunta di una cisteina (Cys, C) al C-terminale (ad esempio, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulsionare adiuvante completo di Freund per immunogeno 1 o adiuvante incompleto di Freund per immunogeno 2 con un uguale volume di ciascun peptide sintetico in PBS (3 ml, concentrazione finale 30-50 mg / 100 ml).
- Seminare immunogeno 1 (0,1 mg) per via sottocutanea in ciascuna delle 5 femmine topi BALB / c.
- Eseguire iniezioni di richiamo sottocutanee cinque volte utilizzando immunogeno 2 a intervalli di due settimane e raccogliere i sieri a campione clip di coda dei topi prima di ogni richiamo.
- Determinare titolo sieri per la prima proiezione.
- Sciogliere 100 mg di peptide libera in 25 ml di tampone di reazione e un'aliquota di 50 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 ml soluzione di accoppiamento di reagente in ogni pozzetto e mescolare il piatto. Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere il contenuto del pozzo,lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata, e bloccare la piastra aggiungendo 200 ml di soluzione bloccante. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il contenuto e lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata.
- Eseguire indiretta ELISA (Protocollo 5,1-5,7) per la determinazione sieri titolo per la prima proiezione. Scegliere il mouse con il più alto titolo (più alta densità ottica) per la raccolta della milza.
- Tre giorni prima della raccolta della milza, inoculare 0,1 mg di immunogeno 1 per via sottocutanea nel mouse che presenta il più alto titolo.
- Raccogliere le cellule della milza di topi immunizzati selezionati e si fondono con cellule murine mieloma F0 (SP2 / 0-AG14) per ottenere cellule ibridomi per la generazione di mAb 18.
- 14 giorni dopo la fusione, selezionare i cloni positivi per lo screening della reattività dei surnatanti ibridomi verso peptide sintetico gratuitamente utilizzando ELISA indiretto (Protocollo 5,1-5,7).
- Diluire le cellule di un numero adeguato per bene per maximizzione della percentuale di pozzi che contengono solo un singolo clone (diluizione clonazione).
- Aggiungere 100 ml di terreno di coltura cellulare a tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti tranne pozzetto A1 che viene lasciato vuoto.
- Aggiungere 200 ml di sospensione cellulare per pozzetto A1. Poi trasferire rapidamente 100 ml da A1 a B1 e mescolare pipettando delicatamente. Ripetere questi 1: 2 diluizioni lungo l'intera colonna, e poi scarta 100 microlitri da H1 modo che finisce con lo stesso volume pozzetti sopra di esso.
- Aggiungere ulteriori 100 ml di medio-colonna 1 con una micropipetta a 8 canali. Poi trasferire rapidamente 100 microlitri da ogni pozzetto della colonna 1 a quelle nella colonna 2 utilizzando la stessa pipetta, e mescolare pipettando delicatamente.
- Utilizzando le stesse punte, ripetere questi 1: 2 diluizioni attraverso l'intero piatto. Scartare 100 ml da ciascuno dei pozzi nell'ultima colonna.
- Portare il volume finale di ciascun pozzetto a 200 microlitri aggiungendo 100 microlitri medio in ciascun pozzetto. incubare plate indisturbato a 37 ° C in un umidificata CO 2 incubatore.
- Controllare ogni bene e segnare tutti i pozzetti che contengono solo una singola colonia. Effettuare due o più clonazioni fino> 90% dei pozzetti contenenti singoli cloni sono positivi per la produzione di anticorpi.
- Schermo i cloni di western blot e dot blot (protocollo 3,1-4,6). Poi colonie sottocultura dai pozzetti in vasi più grandi per espandere le cellule per ottenere il mAb. Di solito ogni clone viene trasferito in un unico bene in una piastra a 12 o 24 pozzetti.
- Misurare l'affinità tra i mAbs e gli estratti del muscolo di vacca, capra, maiale, cane, coniglio, tonno, pollo, sigillo, e quattro specie di cetacei rappresentativi di western blot e dot blot (protocollo 3,1-4,6).
- Seminare cellule di ibridoma selezionati (fino a 3 x 10 6) per via intraperitoneale in topi per indurre ascite. gonfiore addominale è in genere manifesta entro 7-10 giorni dopo l'iniezione di ibridomi. Raccogliere fluido usando un ago ipodermico(Meno di 20 gauge).
- asciti Centrifuga (10.000 xg per 10 min) per rimuovere le cellule e detriti. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Aggiungere 1 a 20 ml del campione, 15 ml di tampone di legame, e da 3 a 5 ml di tampone di eluizione in colonna G Sepharose proteina. Raccogliere la frazione di eluizione contenente anticorpo purificato dal liquido ascitico topi.
- Determinare la isotipo anticorpale dal kit isotyping anticorpi utilizzando le istruzioni del produttore.
3. Western Blot
- Preparare tampone di caricamento 2x contenente β-mercaptoetanolo (BME) mescolando 950 ml di tampone campione 2x Laemmli con 50 ml di BME. Diluire il surnatante muscolari (protocollo 1.1-1.4) in tampone di caricamento con rapporto adeguato per ottenere buoni segnali: 1:50 (cetacei e foche) e 1: 5 (animali domestici e tonno) quando si utilizza l'anticorpo Mb policlonale di coniglio anti-umano, e 1: 1 (maiale, coniglio, pollo e tonno), 1: 5 (di mucca, capra e cane), e 1:25 (cetacei e il sigillo) quando unntibody è da ibridoma surnatante.
- campione di calore a 95 ° C per 5 min. Caricare i campioni nei pozzetti di gel SDS-PAGE (4% acrilammide impilamento e il 12% di acrilammide separazione) insieme con marcatori di peso molecolare. Eseguire il gel per 5 minuti a 50 V quindi aumentare la tensione di 150 V per terminare la corsa in circa 1 ora.
- Porre il gel in tampone di trasferimento 1x per 15 min. Trasferire la proteina separato per nitrocellulosa (NC) membrane dopo che sono separate da PAGE. Il trasferimento può essere fatto a 100 V per 60-90 min.
- Preparare la soluzione bloccante: 1x PBS contenente 0,1% di Tween 20 con 5% latte in polvere senza grassi. Bloccare la membrana NC in 25 ml di soluzione bloccante a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato con Tween 20 (PBST).
- Incubare la membrana e anticorpo primario (asciti o ibridoma surnatante) in 10 ml di tampone di diluizione anticorpo diluito con soluzione di saturazione 5% a 4 ° C durante la notte.
- Lavare il membrane tre volte ancora con PBST per pulire anticorpi eccessivo.
- Incubare la membrana con fosfatasi alcalina di capra coniugato anti-IgG di topo a 1: 1.250 in soluzione bloccante con agitazione per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare la membrana ancora e incubare in cloruro di fosfato / p-nitroblu tetrazolio 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP / NBT) fosfatasi miscela substrato per 10 a 20 minuti fino a quando lo sviluppo del colore.
- Arrestare la reazione lavando la membrana in numerosi cambi di acqua distillata.
4. Dot Blot
- Diluire il surnatante muscolari (protocollo 1.1-1.4) in 5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBST con rapporto adeguato per ottenere buoni segnali: 1: 5 per gli animali domestici e tonno, e 1:25 per i cetacei e di tenuta. Spot 5 ml di campioni su una membrana. Minimizzare la zona che la soluzione penetri (solitamente 3-4 mm di diametro) applicando lentamente.
- Essiccare la membrana a temperatura ambiente (ad esempio, </ Em> in un flusso laminare per 30-60 min), bloccarlo con soluzione bloccante in piastra di Petri per 1 ora a temperatura ambiente, e lavarlo con PBST.
- Incubare la membrana con l'anticorpo primario (mAb da ibridoma supernatante a 1: 10.000 o asciti a 1: 100.000 diluito in soluzione di saturazione 5%) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Utilizzare PBST per lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuno per rimuovere l'eccesso di anticorpi, e poi incubare con anticorpo secondario (alcalina capra fosfatasi-coniugato anti-IgG di topo a 1: 1.250 in 5% soluzione di saturazione) per 1 ora a temperatura ambiente .
- Lavare nuovamente la membrana e incubare nella miscela di substrato per la fosfatasi BCIP / NBT entro 10 a 20 minuti fino a quando lo sviluppo del colore.
- Arrestare la reazione lavando la membrana in numerosi cambi di acqua distillata.
5. ELISA indiretto
- Preparare tampone di lavaggio (0,002 M imidazolo salina tamponata con 0,02% Tween 20). Lavare la piastra 3 volte con il lavaggiocuscinetto tra ogni passo successivo (protocollo 5,2-5,5).
- Preparare 01:25 diluizione supernatanti muscolari (protocollo 1.1-1.4) in tampone di rivestimento. Coat un 96-pozzetti ELISA con 100 microlitri supernatanti diluiti a 4 ° C durante la notte e bloccarlo con tampone di bloccaggio (1% BSA in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Preparare 1: 2.000 diluizione del mAb purificata con tampone diluito e aggiungere 100 ml di diluito mAb in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
- Aggiungere capra anti-IgG di topo coniugato con perossidasi di rafano (diluizione 1: 200 in tampone diluito) per ulteriore incubazione.
- Aggiungere substrato perossidasi a ciascun pozzetto (100 microlitri / pozzetto) e incubare per 10-15 min.
- Arrestare la reazione enzimatica dalla soluzione di arresto perossidasi (100 l / pozzetto) quando si osserva lo sviluppo del colore.
- Leggere la densità ottica a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.
6. Preparazione di oro colloidale marcato mAb Nota: Il colore della soluzione di oro colloidale, e la miscela deve sempre essere rosso. Regolare il pH, la concentrazione di mAb, velocità di centrifuga quando precipitato nero è notato. I passi 6.1 e 6.2 sono passaggi di ottimizzazione.
- Aggiungere purificato rilevare mAb (50 ug / ml, 3 ml) a 100 ml di soluzione di oro colloidale con valori di pH variabili da 5-9. Il pH minima che mantiene il colore rosso per due ore è considerato come il pH ottimale. Nota: In questo studio, 0,1 M carbonato di potassio è stato usato per regolare la soluzione a pH 8,0 (pH ottimale) oro colloidale (40 nm).
- Aggiungere varia quantità di purificati rilevare mAb (500 ug / ml, 1-20 microlitri) a 100 ml di soluzione di oro colloidale a pH 8,0. Nota: la concentrazione ottimale in questo studio è di 6 mg / ml (senza precipitato nero).
- Secondo i risultati di cui sopra, aggiungere 60 mg di rilevare purificato mAb goccia a goccia a 10 ml di soluzione di oro colloidale. Emulsionare il composto delicatamente a temperatura ambiente per 10 min. Anno Dominid 2 ml di soluzione al 5% di BSA in PBS (pH 7,4) alla miscela e emulsionare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti per ridurre l'interferenza sfondo.
- Centrifugare la miscela a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante con l'anticorpo coniugato con attenzione e sospendere il pellet risultanti in 4 ml di PBST contenente 1% di BSA e 0,1% Tween 20, e ripetere centrifugazione e sospensioni più volte.
- Sospendere i precipitati finali in 1 ml PBST e conservarlo a 4 ° C fino all'uso.
7. Costruzione di Immune Striscia
Nota: la figura 1 mostra la struttura della striscia immunitario. Preparare e assemblare le strisce in un basso di umidità laboratorio condizione ambientale (<20% di umidità relativa) per la durata di conservazione prolungata (> 1 anno). Le dimensioni del pad e membrana sono: coniugato pad 300 mm x 10 mm, tampone assorbente 300 mm x 24 mm, pad campione di 300 mm x 24 mm, NC membrana 300 mm x 25 millimetri, cartone 300mm x 80 mm.
- Aggiungere la soluzione mAb marcato con oro colloidale dal punto 6.6 con una micropipetta per saturare il pad coniugato e poi asciugare a 37 ° C per 1 ora prima del montaggio.
- Distribuire specifico antigene cattura mAb (500 mcg / ml) sulla zona di test, e coniglio anti-topo IgG (500 mcg / ml) sulla zona di controllo per rilevare mAb sulla membrana NC utilizzando una stampante pipetta o immunostrip. Mantenere la distanza (> 5 mm) tra le due zone per evitare interferenze.
- Incollare il tampone coniugato, tampone assorbente e la membrana NC sul tavolo di montaggio con nastro biadesivo.
Nota: Sovrapporre le pastiglie su ciascun lato della membrana NC di circa 2 mm. costruzione striscia inappropriato si tradurrà in una prova incompleta. - Posizionare il tampone campione sul tampone coniugato (2 mm) e incollarlo sul tavolo di montaggio.
- Creare strisce larghe 6 mm con un taglierino. Imballare le strisce nel sacchetto di alluminio con essiccante, e conservarli a 4 ° C fino all'uso.
Prova 8. cross-reattività
- Omogeneizzare 0,03 g di campione muscolo crudo con 1 ml di PBS (contenente 0,1% BSA) in una provetta da 1,5 ml centrifuga con un bastone di bambù o di rettifica asta.
- Tenere la striscia dalla parte opposta alle aree test e immergere la parte pad campione nel campione per 5-10 min ed osservare direttamente il risultato.
- Opzionale: Raccogliere 500 microlitri surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga.
Nota: questo passaggio è suggerito se il segnale non è evidente quando la striscia viene direttamente impregnato nel supernatante.
- Opzionale: Raccogliere 500 microlitri surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga.
- Testare vari campioni di muscolo in triplice copia.
Nota: Qui abbiamo testato il tonno, pollo, sigillo, 15 specie di cetacei e 5 specie di mammiferi terrestri. - Hanno cinque ispettori indipendenti ripetono 8.3 per cinque volte, vale a dire, utilizzare 575 strisce in totale.
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Representative Results
Caratteristiche anticorpo monoclonale
Abbiamo sviluppato due IgG 1 anticorpi monoclonali (CGF5H9 e CSF1H13) riconoscere due peptidi sintetici (MKASEDLKKHGNTVLC e AIIHVLHSRHPAEFGC), rispettivamente, di cetacei Mb, e questi sono stati utilizzati per la costruzione di un panino di tipo striscia reattiva immunocromatografico oro colloidale per la rapida individuazione di Mb di cetacei. la Figura 2 mostra che CGF5H9 rileva cetacei e altri mammiferi come una singola banda macchiato con un peso molecolare previsto di approssimativa 17 kDa. La balena minke comune (Balaenoptera acutorostrata) mostra una banda relativamente più debole rispetto alle bande di altri cetacei. Bande sono assenti per tonno, polli e foche, mentre una banda di circa 50 kDa si osserva per i suini. Anche se ci sono più bande non specifici per i suini e il tonno, CSF1H13 è altamente specifico perché reagisce solo con i cetacei e foche come una band con un peso molecolare previsto di approssimativa 17 kDa. Balenottera minore solo mostra un forte segnale a 1:10 (dati non mostrati) in assenza di segnale osservato alle 1:25. La figura 2 mostra risultati identici a Dot Blot.
La figura 3A mostra che CGF5H9 dimostra segnale positivo per i cetacei, conigli, cani, capre e mucche (valore OD> 3.0); segnale debole positivo per i suini (valore OD = 1.5); segnale negativo per le foche, polli e tonni. La figura 3B mostra che CSF1H13 esprime ad alta affinità verso i cetacei e foche (valore di OD> 3.0). Sia CSF1H13 e CGF5H9 possono reagire fortemente con tutte e quattro le specie di cetacei. Questi quattro specie sono da diverse famiglie (Balenottera minore: Balenotteridi; tursiope: Delphinidae; nano capodoglio: Kogiidae; focena senza derive: Phocoenidae), che indica l'ampia reattività di diverse specie di cetacei.
Per la costruzione della striscia, CGF5H9, che riconosce tegli Mbs di cetacei e di altri mammiferi, è oro colloidale-etichettati e usato come anticorpo di rilevazione di legare mioglobina, e CSF1H13 è rivestito sulla linea di prova solo per catturare le Mbs dei cetacei e foche. Pertanto la linea di test è stato progettato per mostrare un segnale positivo quando entrambi anticorpi monoclonali rilevano Mb di cetacei. Poiché il Mb da animali non cetacei può essere rilevata solo da uno di questi due anticorpi monoclonali, la linea di test mostra un risultato negativo quando i campioni di muscolo provenienti da altri animali sono stati testati. La linea di controllo mostra sempre un risultato positivo, perché coniglio anti-IgG di topo lega oro colloidale marcato CGF5H9. Un risultato fallito nella linea di controllo indica che la qualità dei materiali sulla striscia è scarsa.
Test Strip
La figura 4 mostra le bande di segnale sia a linea di test e la linea di controllo quando sono utilizzati campioni di muscolo di cetacei. Se il campione non è da cetacei, c'è solo una singola banda alla condotta di comando with l'assenza di banda sulla linea di prova. Un risultato positivo può essere osservato direttamente in 5-10 minuti dopo omogeneizzazione 0,03 g di muscolo con 10 ml di PBS contenente 0,1% BSA utilizzando un bastoncino di plastica o bambù e ammollo la striscia nella miscela. Dopo aver testato 15 specie di cetacei e otto specie non cetacei, in triplice copia, la specificità (la percentuale di campioni non cetacei correttamente identificato) e sensibilità (la percentuale di campioni di cetacei correttamente identificati) sono entrambi al 100%.
Figura 1. Progettazione della striscia immunitario. Tutti i componenti sono accuratamente stratificato al carta di supporto di plastica in modo che si sovrappongano. Questo permette ai reagenti e campioni fluiscono attraverso la membrana e il tampone assorbente. T: zona di test. C: zona di controllo. Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al. Rapid striscia oro colloidale immunitarioper la carne dei cetacei restrittivo commercio illegale e il consumo:. implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Western Blot e l'analisi dot blot utilizzando il surnatante ibridoma. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Entrambi i sovranatanti di ibridoma possono rilevare cetacei come una singola banda macchiato con un peso molecolare previsto di approssimativa 17 kDa. MW: balenottera minore, BND: tursiope, DSW: nano capodoglio, FP: focena senza derive, PKW: feresa attenuata, N: PBS (controllo negativo). Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al. Rapid striscia oro colloidale immunitario per ccarne etacean restrittivo commercio illegale e il consumo:. implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. ELISA indiretto di estratti muscolari di specie diverse utilizzando anticorpi monoclonali purificati. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Solo i cetacei possono produrre forti segnali positivi in entrambi anticorpi monoclonali. Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al Rapid immunitario striscia di oro colloidale per la carne dei cetacei restrittivo commercio e il consumo illegale:.. Implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Specificità della striscia di oro colloidale immunitario T:. Linea di test. C: linea di controllo. Solo quando sono utilizzati campioni di muscolo di cetacei, i risultati di successo (bande di segnale sia a linea di test e la linea di controllo) possono essere osservati. (A) i campioni non cetacei: 1: Cow. 2: Capra. 3: Pig. 4: Dog. 5: Coniglio. 6: Tuna. 7: pollo. 8: Guarnizione di porto (Phoca vitulina). (B) i campioni Cetacei: 1: Balenottera minore comune (Balaenoptera acutorostrata). 2: di Omura balena (Balaenoptera omurai). 3: Tursiope (Tursiops aduncus). 4: Tursiope (T. truncatus). 5: delfino di Fraser (Lagenodelphis Hosei </ Em>). 6: Indo-Pacifico delfino megattere (Sousa chinensis). 7: Grampo (Grampus griseus). 8: Pantropical Delfino (Stenella attenuata). 9: Steno Bredanensis (bredanensis Steno). 10: feresa attenuata (Feresa attenuata). 11: pilota a pinne corte balena (Globicephala macrorhynchus). 12: Peponocephala Electra (Peponocephala electra). 13: Nano capodoglio (Kogia sima). 14: pigmeo capodoglio (breviceps K.). 15: neophocaena phocaenoides (phocaenoides Neophocaena). Questo dato è stato riprodotto da Lo, C. et al Rapid immunitario striscia di oro colloidale per la carne dei cetacei restrittivo commercio e il consumo illegale:.. Implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| specie di cetacei | Le specie non cetacei |
| Pigmeo capodoglio (breviceps Kogia) | Harbor Seal (Phoca vitulina) |
| Nano capodoglio (Kogia sima) | Dog (Canis lupus familiaris) |
| Pinne corte Balena pilota (Globicephala macrorhynchus) | Coniglio (Oryctolagus cuniculus) |
| Peponocephala Electra (Peponocephala electra) | Pig (Sus scrofa) |
| Feresa attenuata (Feresa attenuata) | Capra (Capra hircus) |
| Pantropical Delfino (Stenella attenuata) | Bovini (Bos taurus) |
| Tursiope (Tursiops truncatus) | Di pollo (Gallus gallus) |
| Tursiope (Tursiops aduncus) | Tonno pinna gialla (Thunnus albacares) |
| Delfino di Fraser (Lagenodelphis Hosei) | |
| Indo-Pacifico delfino megattere (Sousa chinensis) | |
| Steno Bredanensis (bredanensis Steno) | |
| Grampo (Grampus griseus) | |
| Focena senza derive (phocaenoides Neophocaena) | |
| Balenottera minore comune (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Balena di Omura (Balaenoptera Omura i) |
Tabella 1. Le specie da cui il muscolo era ColleCTED e testato in questo studio. Specie includono il tonno, pollo, sigillo, 5 specie di mammiferi terrestri e 15 specie di cetacei (4 famiglie).
| Specie | Adesione no. |
| Balenottera minore comune (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Balena di pigmeo Bryde (Balaenoptera Edeni) | Q0KIY2 |
| Megattera (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Balena grigia (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Capodoglio (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Pigmeo capodoglio (breviceps Kogia) | Q0KIY5 |
| Nano capodoglio (Kogia sima) | P02184 |
| Short-beaked delfino comune (Delphinus delphis) | P68276 |
| Pilota con pinne lunghe balena (Globicephala melas) | P02174 |
| Killer whale (Orcinus orca) | P02173 |
| Peponocephala Electra (Peponocephala electra) | Q0KIY3 |
| Pantropical Delfino (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Tursiope (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Focene (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Amazon delfino di fiume (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Ziphiidae di Longman (Indopacetus pacificus) | Q0KIY9 |
| Hubbs 'ziphiidae (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Zifio (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Harbor Seal (Phoca vitulina) | P68080 |
| Bovini (Bos taurus) | P02192 |
| Capra (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Cavallo (Equus caballus) | P68082 |
| Pig (Sus scrofa) | P02189 |
| Dog (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Di pollo (Gallus gallus) | P02197 |
| Struzzo (Struthio camelus) | P85077 |
| Tonno pinna gialla (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabella 2. sequenze mioglobina utilizzati in questo studio con i relativi numeri di accesso GenBank. Specie includono il tonno,pollo, struzzo, mammiferi domestici, di tenuta e 18 specie di cetacei (7 famiglie). Questa tabella è stata riprodotta da Lo, C. et al Rapid immunitario striscia di oro colloidale per la carne dei cetacei restrittivo commercio e il consumo illegale:. Implicazioni per la conservazione e la salute pubblica PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.
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Discussion
Utilizzo di un peptide sintetico coniugato alla proteina carrier è notevolmente più efficace rispetto alla sua proteina cognate. Per una tecnica sandwich base, perché il mAb è sviluppato utilizzando epitopi con posizioni relative note, le due mAbs in questo studio non possono interferire con reciproca interazione con l'epitopo antigene bersaglio. Inoltre, la reattività tra proteina nativa e l'anticorpo di topi immunizzati con il peptide sintetico-coniugato potrebbe essere più forte della reattività tra proteina nativa e l'anticorpo prodotto dalla proteina nativa 19. L'uso di coniugati peptide sintetico è quindi consigliato per le procedure di vaccinazione efficaci e la generazione di adeguata mAb anti-peptide.
La struttura di una proteina consiste essenzialmente la sequenza di amminoacidi nella catena polipeptidica. Ogni amminoacido ha la sua catena laterale che porta a proprietà specifiche, e cambiando leggermente l'aci amminod sequenza si traduce in cambiamenti della struttura. Poiché peptidi con una lunghezza di 10-20 aminoacidi sono ideali per la preparazione di anticorpi, la lunghezza dei peptidi sintetici (immunogeno) alla regione C-terminale è stato aumentato, per garantire che la regione antigenica nucleo sarebbe riconosciuto. Pertanto, i residui di amminoacidi tra Mbs di vari animali risultanti in diverse strutture epitopi possono essere efficientemente differenziati. Ad esempio, la Figura 3A mostra la struttura peptide menzionato contribuisce a CGF5H9 reagire con forza con i cetacei, ma negativamente con guarnizioni. Un altro esempio è l'affinità distinti verso polli e cani di CGF5H9 sebbene il pollo ha una sequenza identica a quella del cane nel sito antigenico nucleo 2. Ciò indica che la differenza di sequenza nella regione esterna potrebbe portare alla modifica struttura e quindi variabile affinità tra antigene e anticorpo vincolanti.
Western Blot, macchia di punti, ed ELISA indiretta sono stati utilizzati inil nostro metodo per lo screening anticorpi monoclonali adatti. Western Blot è ampiamente utilizzato per rilevare proteine specifiche in estratto di tessuti o omogeneizzato. In questa tecnica, gel elettroforesi viene usata per separare le proteine denaturate dalla lunghezza del polipeptide. Pertanto, è possibile confermare se il segnale indica il peso molecolare prevedeva proteina. Tuttavia, il risultato di rilevamento (segnale positivo o negativo, forte o debole), non può aver rappresentato la situazione reale di antigene-anticorpo vincolanti poiché sono stati utilizzati proteine denaturate. Di conseguenza, dot blot può essere utilizzato per lo screening di secondo stadio. Dot blot è una tecnica per rilevare le proteine. Esso rappresenta una semplificazione del metodo di Western Blot. In dot blot, una miscela contenente la molecola da rilevare è applicato direttamente su una membrana con un punto. Questo differisce da una macchia occidentale perché campioni di proteine non sono denaturate. Si noti che questa tecnica offre alcuna informazione sulle dimensioni della biomolecola bersaglio, e un singolo punto comparirà se due movengono rilevati lecules di diverse dimensioni. Infine, ELISA indiretto viene utilizzato per un saggio di legame ligando-per generare un segnale che può essere adeguatamente quantificata. Esso fornisce ulteriori informazioni su caratteristiche mAb e facilita in tal modo la costruzione di striscia.
Le concentrazioni di Mb nel muscolo sono variabili a seconda della posizione di raccolta. Ad esempio, i muscoli di nuoto (muscoli assiali) in cetacei hanno un contenuto significativamente maggiore di Mb rispetto ai muscoli non nuoto, e campioni provenienti da giovani cetacei avrebbero più bassa concentrazione Mb perché all'aumentare della concentrazione di Mb per tutta la vita di un animale 20. Inizialmente, CSF1H13, che cattura solo il Mb di cetacei e foche, era destinato ad essere oro colloidale marcato ed essere il rilevamento degli anticorpi, e CGF5H9, che riconosce il Mb di molte specie, sarebbe anticorpo di cattura sulla linea di prova. Abbiamo ipotizzato che l'anticorpo di rilevamento dovrebbe essere più specifico e l'anticorpo di cattura dovrà seguireessere più generale. Tuttavia, un segnale positivo debole, è stato trovato sulla linea del test, quando sono stati utilizzati campioni di cetacei con basse concentrazioni di Mb (dati non riportati). Il problema è stato risolto quando sono state invertite le posizioni dei due mAbs come descritto nei risultati rappresentativi. Un buon segnale è stato anche mostrato per un cetaceo neonato (un filamento balena di Omura) (Figura 4). Non è chiaro se le caratteristiche e la concentrazione di anticorpi monoclonali contribuiscono a questo fenomeno.
In questo studio, i campioni di muscolo congelati-scongelati omogeneizzati con PBS sono stati utilizzati nel test strip. Altre condizioni di campionamento e metodi di preparazione possono influenzare il risultato. Ad esempio, il sale solubile proteine come Mb dovrebbe essere estratto usando PBS piuttosto che l'acqua pura. Altrimenti, l'estrazione può essere insufficiente, che potrebbe portare ad un risultato aberrante. Il tampone di estrazione appropriata: il rapporto campione di carne è in parte responsabile per l'interpretazione di successo del risultato striscia. Grande amount (0,3 g in 1 ml di tampone) dei campioni di controllo (ad esempio, gli animali domestici) potrebbe causare risultato positivo e sfondo sfocato. Tuttavia, il rapporto utilizzato in questo studio (1: 0,03) ha prodotto risultati corretti. Solo campioni di muscolo fresche possono essere utilizzati per questo test strip. Proteina potrebbe essere idrolizzato o denaturare dopo alcuni trattamenti (come indurimento da salsa di soia e di ebollizione), che potrebbero causare risultati positivi non solo per campioni muscolari cetacei ma anche campioni provenienti da altri animali (dati non mostrati). Pertanto, si suggerisce che le fonti di campioni variabili e diversi piani di progettazione di costruzione devono essere utilizzati durante lo sviluppo della striscia.
In conclusione, questo protocollo descrive lo sviluppo di due anticorpi monoclonali fortemente reattivi al Mb di cetacei, e questi anticorpi monoclonali vengono applicati su una striscia rapido test per differenziare il Mb di cetacei di tenuta e di altri animali. Sebbene affidabile analisi del DNA basato sulla PCR per l'identificazione di carne cetacei è disponibile 12 ma is laborioso e richiede tempo. La striscia di prova pratica è una tecnica affidabile e rapido che può essere utilizzato nel campo per identificare carni cetacei, che è altamente desiderabile per agenzie di regolazione 21. E 'probabile che la striscia può essere sviluppato per rilevare Mbs specifici da animali come cavalli o suini.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
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