Protocol
倫理に関する声明：本研究は、国立嘉義大学、承認IDの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって国際的なガイドラインに従って行われ、承認されました：鯨類のサンプル使用は、台湾の農業委員会（研究許可証によって許可された99022. 100M-02.1-C-99）。
1.筋肉サンプル調製し、SDS-PAGE
注：海洋哺乳類の16種、陸生哺乳類の5種を含む23種から筋肉サンプルは、マグロや鶏肉は、この試験（ 表1）で使用しました。鯨類の筋肉サンプルは二本鎖個人、漁業の混獲、および没収から入手しました。ウサギ、ラット、イヌ、およびニワトリ筋組織は、国立嘉義大学の動物疾病診断センターから入手しました。牛肉、豚肉、羊肉、マグロのサンプルは地元のスーパーマーケットから購入しました。港シール（ ゴマフアザラシ属のvitulinaの筋肉サンプル
- 使用するまで-20℃ですべてのサンプルを保管してください。
- -20℃でプレクールモルタル。そして、その中に凍結された筋肉サンプルの3グラムを入れました。
- 組織ホモジナイザーを使用して冷たいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで試料を均質化。
- 4℃で10分間万×gで均質化したサンプルを遠心。上清を収集し、使用するまで-20℃で保存。
- 5％の5mlをゲル（蒸留水3.07 mlであり、pHが6.8の4倍上部ゲル緩衝液1.25mlの40％アクリルアミド、10％の過硫酸アンモニウム（APS）を50μl、およびテトラメチルエチレンジアミンを5μlの625μLを（積層調製TEMED））および15％分離ゲルの10ミリリットル（40％アクリルアミドの蒸留水3.65ミリリットル、pHが8.8の4倍より低いゲル緩衝液の2.5ミリリットル、3.75ミリリットル、10％APS100μlの、そして、TEMEDの4μL）。
- 後者が固化した後、電気泳動セルでは、分離ゲル（15％アクリルアミド）の上にゲル（5％アクリルアミド）を積層注ぎます。スタッキングゲル中のゲルコームを挿入します。
- 以下の条件に応じてページを実行します。最初の実行条件：100ボルト、20分と最終条件：120ボルト、40分。
- ゲルの色が均一に青になるまで30分間、室温でクマシーブリリアントブルーでゲルを染色します。
注：ゲルはもはや色素溶液に表示されない場合に染色が完了しました。 - 1時間室温で酢酸溶液（10％）として脱色。バンドが表示されるようになります。背景が透明になるまで4℃で一晩脱色続けます。
2.ペプチド合成およびモノクローナル抗体産生
- マグロ、鶏、ダチョウ、家畜哺乳類、シールと18種を含むのGenBankからメガビットのアミノ酸配列を取得します鯨類（ 表2）。
- 適切なソフトウェア16を使用して配列を整列させます：
- 整列を選択することにより、アライメントExplorerを起動します 。 編集/起動バー上のアライメントを構築します 。 新しいアラインメントを作成 ] を選択し、[OK]をクリックします。ダイアログが尋ねる表示されます。「あなたは、DNAやタンパク質配列アラインメントを構築していますか？」
- 「 タンパク質 」というボタンをクリックします。 オープン：データを選択し、ファイルを選択し、シーケンスファイルからの配列を取得します 。 [編集]を選択します 。複数の配列アラインメントを作成するためのデータセット内のすべてのシーケンスのすべてのサイトを選択するために、 すべてのメニューコマンドを選択します 。
- 選択配向：のClustalWアルゴリズムを用いて選択された配列データを整列するために、メインメニューからのClustalWによって揃え 。ウェイトマトリックスプロテインとして「BLOSUM」を選択し、[OK]ボタンをクリックします。
- 配列アラインメントを分析します。
- 5抗原反応性のsiに焦点を当てますTES 17：サイト1（AKVEADVA、15-22）、サイト2（KASEDLK、56-62）、サイト3（ATKHKI、94-99）、サイト4（HVLHSRH、113-119）、サイト5（KYKELGY、145- 151）と鯨類間で保存断片を見つけます。 *（アスタリスク;アライメント（プロトコル2.2.3）でのコンセンサス記号）は、単一の、完全に保存された残基を持っている位置を示しています。鯨類の以下の保存された断片が発見された：（サイト2を含みます）シーケンスKASEDLKKHGとシーケンスHVLHSRHP（サイト4を含みます）。
- 配列分析によると候補配列の断片を合成し、商業サービスを使用して、担体タンパク質として卵白アルブミンタンパク質（OVA）とコンジュゲート。
- 分解（ 例えば 、M-KASEDLKKHG）からペプチドを防止するための抗原反応性部位のN末端 に疎水性アミノ酸（ 例えば 、メチオニン）を加えます。
- 免疫細胞にコア抗原部位を露出させるための抗原反応性部位のC末端側を長く。また、conjuゲートC末端にシステイン（Cysを、C）を添加することにより、OVAを有するペプチド（ 例えば 、M-KASEDLKKHG-NTVL-C）。
- 免疫原1またはPBS中の各合成ペプチドの等量の（3ミリリットル、最終濃度30〜50μgの/100μl）を持つ免疫原2のための不完全フロイントアジュバントのために完全フロイントアジュバントを乳化。
- 皮下に5匹の雌BALB / cマウスの各々に、免疫原1（0.1 mg）を接種します。
- 2週間間隔で免疫原2を使用して皮下のブースター注射を5回実行し、すべての追加免疫前のマウスから尾クリップサンプリングによって試験血清を収集します。
- 最初のスクリーニングのための血清力価を決定します。
- 96ウェルプレートの各ウェルに、反応バッファ、アリコート25mlの溶液50μl中の遊離ペプチドの100μgのを溶かします。各ウェルに10μlのカップリング試薬溶液を加え、プレートを混ぜます。室温で2時間静置します。
- ウェルの内容を削除し、蒸留水で各ウェルを3回洗浄し、ブロッキング溶液を200μlを添加することによりプレートをブロックします。室温で1時間インキュベートします。コンテンツを削除し、蒸留水で各ウェルを3回洗浄します。
- 最初のスクリーニングのための血清力価を決定するための間接ELISA（プロトコル5.1から5.7）を実行します。脾臓収集のための最高力価（最高光学密度）を有するマウスを選択してください。
- 3日前脾臓コレクションに、皮下最高力価を提示するマウスに免疫原1の0.1 mgの接種。
- モノクローナル抗体の生成18のためのハイブリドーマ細胞を得るために、マウス骨髄腫細胞F0（SP2 / 0-AG14）との選択免疫したマウスとヒューズからの脾臓細胞を収集します。
- 14日融合後、間接ELISA（プロトコル5.1から5.7）を用いて遊離合成ペプチドに向かってハイブリドーマ上清の反応性をスクリーニングすることにより陽性クローンを選択します。
- maximizウェル毎に適切な数に細胞を希釈ただ1つのクローン（希釈クローニング）を含有するウェルの割合をる。
- 空のままにされたウェルA1を除いて、96ウェルプレート内のすべてのウェルに細胞培養培地100μlを加えます。
- よくA1に200μlの細胞懸濁液を追加します。その後すぐにB1にA1から100μlのを転送し、穏やかにピペッティングして混ぜます。列全体ダウン2希釈液、およびそれはそれ以上の井戸と同じボリュームで終わるように、H1から100μLを捨てる：これらの1を繰り返します。
- 8チャンネルのマイクロピペットを用いてカラム1に培地の追加の100μlのを追加します。その後すぐに同じピペットを用いてカラム2のものに列1の各ウェルから100μlのを転送し、穏やかにピペッティングして混ぜます。
- プレート全体を横切る2希釈液：同じチップを使用して、これらの1を繰り返します。最後の列に各ウェルから100μlを廃棄してください。
- 各ウェルに100μlの培地を添加することによって200μlにすべてのウェルの最終容量をもたらします。ナンプラーをインキュベートteの加湿CO 2インキュベーター中、37℃で邪魔されず。
- 各ウェルをチェックして、ちょうど単一コロニーを含むすべてのウェルをマーク。単一クローンを含むウェルの> 90％が抗体産生について陽性であるまで、二つ以上のクローニングを行います。
- ウェスタンブロット、ドットブロット（プロトコル3.1から4.6）によりクローンをスクリーニングします。次に、モノクローナル抗体を得るために細胞を拡大するために、より大きな容器にウェルからコロニーを継代培養。通常、各クローンは、12または24ウェルプレート中で単一のウェルに移します。
- ウェスタンブロット、ドットブロット（プロトコル3.1から4.6）によってmAbおよび牛、ヤギ、ブタ、イヌ、ウサギ、マグロ、鶏肉、シール、および4つの代表鯨類から筋肉抽出物との親和性を測定します。
- 腹水を誘導するためにマウスの腹腔内に（3×10 6まで）選択されたハイブリドーマ細胞を接種します。腹部の腫れは7-10日以内に一般的に明らかであるハイブリドーマ注射後。皮下注射針を使用して流体を収集（未満20ゲージ）。
- 遠心分離機腹水（10分間万XG）は、細胞および破片を除去します。 0.45μmのフィルターを通して濾過。プロテインGセファロースカラムへのサンプルの1〜20ミリリットル、結合緩衝液15ミリリットル、および溶出バッファーの3〜5ミリリットルを追加します。マウス腹水から精製された抗体を含む溶出画分を収集します。
- 製造元の指示を用いて抗体アイソタイピングキットによって抗体のアイソタイプを決定します。
3.ウエスタンブロット
- BME50μlの2×Laemmliサンプルバッファーの950μLを混合することにより、βメルカプトエタノール（BME）を含む2×ローディングバッファーを準備します。良好な信号を得るための適切な比率でローディングバッファーで筋肉上清（プロトコル1.1から1.4）を希釈：1：50（鯨類とシール）と1：5（家畜やマグロ）ポリクローナルウサギ抗ヒトMbの抗体を使用した場合、および1：1（ブタ、ウサギ、ニワトリやマグロ）、1：5（牛、ヤギ、犬）、および1時25分（鯨類とシール）時ntibodyは、ハイブリドーマ上清からです。
- 5分間95℃で加熱試料。分子量マーカーと一緒にSDS-PAGEゲル（4％アクリルアミドスタッキングおよび12％アクリルアミド分離）のウェルにロードしたサンプル。約1時間に実行を完了するために150 Vに電圧を増加させる、その後50 Vで5分間ゲルを実行します。
- 15分間、1×転写バッファーでゲルを置きます。彼らはPAGEによって分離された後、ニトロセルロース（NC）膜に分離されたタンパク質を転送します。転送は、60〜90分間、100Vで行うことができます。
- ブロッキング溶液を準備します：1×PBS、5％脱脂粉乳、0.1％Tween 20を含みます。室温で1時間ブロッキング溶液25mlにNC膜をブロックします。トゥイーン20（PBST）で15ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で5分間ずつ3回洗浄します。
- 抗体希釈緩衝液を4℃で一晩5％ブロッキング溶液で希釈して10ml中膜と一次抗体（腹水またはハイブリドーマ上清）をインキュベートします。
- membranを洗います過剰な抗体をきれいにするPBSTで再び電子三回。
- 1でアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgGで膜をインキュベートする：ブロッカー溶液中1,250室温で1時間穏やかに撹拌しながら。
- 再度、膜を洗浄し、発色するまで10〜20分間、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ P-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（BCIP / NBT）ホスファターゼ基質混合物中でインキュベートします。
- 蒸留水のいくつかの変更で膜を洗浄することにより反応を停止します。
4.ドットブロット
- 家畜およびマグロ5、及び鯨類及びシールのための1時25分：1：良好な信号を得るために適切な比率でPBST中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）で筋肉上清（プロトコル1.1〜1.4）で希釈します。スポット膜上のサンプル5μlの。溶液をゆっくりそれを適用することで（通常は3〜4ミリメートルの直径）を貫通すること面積を最小限に抑えます。
- 室温（ 例えば、<で膜を乾燥させ30~60分間の層流中/ EM>）、室温で1時間、ペトリ皿中のブロッキング溶液でそれをブロックし、PBSTでそれを洗浄します。
- （1：10,000または腹水：1でハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の5％ブロッキング溶液中に希釈10万）一次抗体で膜をインキュベートし、室温で1時間。
- 使用PBST過剰な抗体を除去し、次いで二次抗体と一緒にインキュベートし、膜を5分間、3回ずつ洗浄する（1におけるアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG：5％のブロッキング溶液中で1,250）を室温で1時間。
- 再び膜を洗浄し、発色するまで10〜20分以内にBCIP / NBTホスファターゼ基質混合物でそれをインキュベートします。
- 蒸留水のいくつかの変更で膜を洗浄することにより反応を停止します。
5.間接ELISA
- 洗浄バッファー（0.02％Tween 20で0.002 Mイミダゾール緩衝生理食塩水）を準備します。洗濯でプレートを3回洗浄各次のステップ（プロトコル5.2から5.5）の間にバッファ。
- コーティング緩衝液中の筋肉上清（プロトコル1.1から1.4）の午前1時25希釈を準備します。一晩4℃で上清を希釈し、室温で1時間、緩衝液（PBS中1％BSA）でブロッキングを阻止する100μlのコート96ウェルELISAプレート。
- 希釈した緩衝液を用いて精製されたmAbの2000希釈し、各ウェルに希釈されたmAbの100μlを添加する：1を準備します。室温で1時間静置します。
- さらなるインキュベーションのため：（希釈緩衝液中に200倍希釈）、ヤギ抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲート追加します。
- 各ウェルにペルオキシダーゼ基質を加える（100μl/ウェル）、10〜15分間インキュベートします。
- 発色が観察されたときに（100μl/ウェル）ペルオキシダーゼ停止溶液により、酵素反応を停止させます。
- マイクロプレート分光光度計を用いて450nmでの光学密度を読みます。
金コロイド標識mAbの6準備注：金コロイド溶液と混合物の色は常に赤でなければなりません。黒色の沈殿物が注目されているときのpH、mAbの濃度、遠心分離速度を調整します。 6.1と6.2は、最適化のステップであるステップ。
- 5-9からの様々なpH値を有する金コロイド溶液100μlにモノクローナル抗体（50μg/ mlの、3μl）を検出、精製を追加します。 2時間赤色を維持最小pHは至適pHとみなされます。注：この研究では、0.1 Mの炭酸カリウムをpH 8.0（至適pH）にコロイド金（40 nm）の溶液を調整するために使用しました。
- pH8.0で金コロイド溶液100μlにモノクローナル抗体を検出精製の様々な量（500 / mlの、1から20μl）を追加します。注意：本研究における最適濃度は、6 / mlの（なし黒色の沈殿物）です。
- 以上の結果によれば、精製された検出のmAb滴下コロイド金溶液を10mlの60μgのを加えます。 10分間、室温で穏やかに混合物を乳化します。広告D混合物にPBS中の5％BSA液（pH7.4）2mlのバックグラウンド干渉を減少させるために室温で15分間穏やかに乳化します。
- 4℃で30分間万×gで混合物を遠心分離します。
- 慎重に非結合抗体で上清を除去し、1％BSAおよび0.1％Tween 20を含む4ミリリットルPBSTで得られたペレットを懸濁し、遠心分離とサスペンションを数回繰り返します。
- 1ミリリットルPBST中で、最終的な沈殿物を一時停止し、使用するまで4℃で保管してください。
免疫ストリップの7建設
注： 図1は、免疫ストリップ設計を示 しています。 <（1年）、長期貯蔵寿命のために（20％相対湿度、低湿度の実験室環境条件でストリップを）>準備し、組み立てます。パッドと膜の寸法は、コンジュゲートパッド300ミリメートル×10ミリメートル、吸収パッド300ミリメートル×24ミリメートル、サンプルパッド300ミリメートル×24ミリメートル、NC膜のx 25ミリメートル300ミリメートル、300をペーストボードミリメートルは、80ミリメートルのxは。
- コンジュゲートパッドを飽和させ、その後、組み立てる前に、37℃で1時間、それを乾燥させるためにマイクロピペットでステップ6.6から金コロイド標識MAb溶液を追加します。
- ピペットまたはイムノプリンタを使用してNC膜上のmAbを検出するための制御ゾーンに特異的な抗原捕捉試験ゾーンでのmAb（500μgの/ ml）を、ウサギ抗マウスIgG（500μgの/ ml）を分配します。干渉を回避するために、2つのゾーン間の距離（> 5 mm）を維持します。
- 両面テープでのペーストボード上の共役パッド、吸収パッドとNC膜を貼り付けます。
注：約2mmによってNC膜の両側のパッドを重ねます。不適切なストリップ構造が不完全なテストになります。 - コンジュゲートパッド（2ミリメートル）の上にサンプルパッドを配置し、ペーストボードに貼り付けます。
- ペーパーカッター付き6ミリメートル幅のストリップを作成します。乾燥剤とアルミ箔袋にストリップをパックし、使用するまで4℃で保管してください。
8.交差反応性試験
- 竹の棒を使用して、又はロッド研削1.5 mlの遠心チューブに1mlのPBS（0.1％BSAを含む）で生の筋肉試料0.03 gで均質化します。
- テスト領域と反対側の端部によってストリップを持ち、5〜10分間、試験片にサンプルパッド部分を浸漬し、結果を直接観察します。
- オプション：500μlの上清を収集し、新しい遠心チューブに移します。
注：ストリップが直接上清に浸漬されたときに信号が明らかでない場合は、このステップが示唆されました。
- オプション：500μlの上清を収集し、新しい遠心チューブに移します。
- 三重で様々な筋肉のサンプルをテストします。
注：ここでは、マグロ、鶏肉、シール、鯨類の15種と陸生哺乳類の5種をテストしました。 - 5つの独立した検査官は、合計で575ストリップを使用し、 すなわち 、5回8.3を繰り返しています。
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Representative Results
モノクローナル抗体の特性
私たちは、鯨類のMBの、それぞれ2合成ペプチド（MKASEDLKKHGNTVLCとAIIHVLHSRHPAEFGC）を、認識2のIgG 1モノクローナル抗体（CGF5H9とCSF1H13）を開発し、これらはクジラMbのを迅速に検出するためのサンドイッチ型金コロイドイムノクロマト法テストストリップを構築するために使用しました。 図2は CGF5H9はおおよそ17キロダルトンの予測分子量で、単一の染色バンドとして鯨類および他の哺乳動物を検出することを示しています。ミンククジラ（ ミンクacutorostrata）は、他のクジラ類のバンドよりも比較的暗いバンドを示しています。約50キロダルトンのバンドが豚のために観察されるのに対し、バンドは、マグロ、鶏やシールのために存在しません。豚やマグロのための複数の非特異的なバンドがありますが、それはおおよそ17 kの予想分子量のバンドとしての鯨類やアザラシにのみ反応するため、CSF1H13は、非常に特異的ですダ。ミンククジラは、唯一の1時25分で観察された無信号で（データは示していない）1時10分に強いシグナルを示している。 図2は、ドットブロットで同一の結果を示しているクジラ。
図3Aは、CGF5H9は鯨類、ウサギ、イヌ、ヤギ、および牛（OD値> 3.0）のための陽性シグナルを示していることを示しています。豚のための弱い正のシグナル（OD値= 1.5）。シール、鶏やマグロのための負の信号。 図3Bは CSF1H13は、鯨類とシール（OD値> 3.0）の方に高い親和性を発現することを示しています。 CSF1H13とCGF5H9の両方がすべての4つの鯨類と強く反応することができます。多様な鯨類に広い反応性を示し、これらの4種が異なるファミリー（ネズミイルカ科：;：マイルカ;：;ドワーフマッコウクジラスナメリKogiidaeバンドウイルカナガスクジラ科ミンククジラ）からのものです。
ストリップ構築のために、CGF5H9は、トンを認識する彼鯨類および他の哺乳動物のMBS、コロイド金標識され、ミオグロビンに結合する検出抗体として使用し、CSF1H13のみ鯨類及びシールのMBを捕捉するために、テストライン上にコーティングされています。したがって、テストラインは、両方のmAbが鯨類Mbの検出正の信号を表示するように設計されています。非鯨類動物からMbが唯一のこれらの二つのmAbのいずれかによって検出することができるので、検査ラインは、他の動物からの筋肉試料を試験する陰性の結果を示しています。ウサギ抗マウスIgGコロイド金標識CGF5H9に結合するための制御線は、常に肯定的な結果を示しています。コントロールラインで失敗した結果は、ストリップ上の材料の品質が劣悪であることを示しています。
ストリップテスト
鯨類筋肉試料を使用した場合、図4は、テストラインおよびコントロールラインの双方の信号帯域を示す図です。サンプルは鯨類からのものではない場合には、制御線のwiで唯一の単一のバンドがありますテストラインでのバンドの不在番目。成功した結果を、10mlのPBSは、プラスチックまたは竹の棒を使用して、0.1％BSAを含有する混合物中にストリップを浸漬して筋肉0.03gの均質化した後、5〜10分で直接観察することができます。 15鯨類と三連で8非鯨類をテストした後、特異性（非鯨類のサンプルの割合が正しく識別）と感度（正しく識別鯨類標本の割合）は、両方の100％です。
免疫ストリップの 図1. デザイン。彼らが重なるようにすべてのコンポーネントはプラスチック製のバッキングカード上に慎重に積層されています。これは、試薬およびサンプルが膜を通過して吸収パッドまで流れることができます。 T：テストゾーン。 C：コントロールゾーン。この図は、ロー、C. らから再生されました。迅速な免疫金コロイドストリップ鯨類の肉抑制のための違法取引と消費：保全と公衆衛生のための含意するPLoS ONE 8、e60704（2013）。 DOI：10.1371 / journal.pone.0060704 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2ハイブリドーマ上清を用いたウェスタンブロットおよびドットブロット分析（A）CGF5H9、（B）CSF1H13。両方のハイブリドーマ上清は、おおよそ17キロダルトンの予測分子量で、単一の染色バンドとして鯨類を検出することができます。 MW：ミンククジラ、BND：バンドウイルカ、DSW：ドワーフマッコウクジラ、FP：スナメリ、PKW：ユメゴンドウ、N：PBS（ネガティブコントロール）。この図は、ロー、C. らから再生されている。cに対する迅速な免疫金コロイドストリップetacean肉拘束違法取引と消費：保全と公衆衛生のための含意するPLoS ONE 8、e60704（2013）。 DOI：10.1371 / journal.pone.0060704 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 間接精製したモノクローナル抗体を用いて、異なる種の筋肉抽出物のELISA。（A）CGF5H9、（B）CSF1H13。唯一の鯨類は、両方のmAbに強い陽性シグナルを生成することができます。この図は、ロー、C. らから再生されたクジラ肉拘束違法取引と消費のための迅速な免疫金コロイドストリップ：保全と公衆衛生のための含意するPLoS ONE 8、e60704（2013）。 DOI：10.1371 / journal.pone.0060704。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
免疫金コロイドストリップの 図4. 特異T：テストライン。 C：コントロールライン。鯨類筋肉試料が使用される場合にのみ、成功した結果（テストラインおよびコントロールラインの双方の信号帯域）を観察することができます。 （A）非鯨類のサンプル：1：牛。 2：ヤギ。 3：豚。 4：犬。 5：ウサギ。 6：マグロ。 7：チキン。 8：ハーバーシール（ ゴマフアザラシ属のvitulina）。 （B）日本鯨類のサンプル：1：ミンククジラ（ ミンクacutorostrata）。 2：ツノシマクジラ（ ミンクomurai）。 3：ハンドウイルカ（ ハンドウイルカ属のaduncus）。 4：イルカ（T.のtruncatus）。 5：サラワクイルカ（Lagenodelphis法政大学</ em>の）。 6：インド太平洋のザトウクジライルカ（ スーザキネンシス ）。 7：ハナゴンドウ（ ハナゴンドウ ）。 8：Pantropicalはイルカ（Stenellaのattenuata）を見つけました。 9：シワハイルカ（ ステノbredanensis）。 10：ピグミーのシャチ（Feresa attenuata）。 11：コビレゴンドウクジラ（Globicephalaのmacrorhynchus）。 12：カズハゴンドウ（Peponocephalaエレクトラ ）。 13：ドワーフマッコウクジラ（Kogiaシマ ）。 14：ピグミーマッコウクジラ（K.のbreviceps）。 15：スナメリ（Neophocaenaのphocaenoides）。この図は、ロー、C. らから再生されたクジラ肉拘束違法取引と消費のための迅速な免疫金コロイドストリップ：保全と公衆衛生のための含意するPLoS ONE 8、e60704（2013）。 DOI：10.1371 / journal.pone.0060704 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。。
| 鯨類 | 非鯨類 |
| ピグミーのマッコウクジラ（Kogiaのbreviceps） | ハーバーシール（ ゴマフアザラシ属のvitulina） |
| ドワーフマッコウクジラ（Kogiaシマ ） | 犬（ オオカミfamiliaris） |
| コビレゴンドウクジラ（Globicephalaのmacrorhynchus） | ウサギ（Oryctolagusのカイウサギ ） |
| カズハゴンドウ（Peponocephalaエレクトラ ） | 豚（ イノシシ ） |
| ピグミーのシャチ（Feresa attenuata） | ヤギ（ ヒマラヤ山羊 ） |
| Pantropicalは、（Stenella attenuata）イルカを発見しました | 牛（Bosの牡牛座 ） |
| バンドウイルカ（ 火rsiops truncatus） | チキン（ ガルスガルス ） |
| イルカ（ ハンドウイルカ属のaduncus） | キハダマグロ（ キハダマグロ ） |
| サラワクイルカ（Lagenodelphis法政大学 ） | |
| インド太平洋のザトウクジライルカ（ スーザキネンシス ） | |
| シワハイルカ（ ステノbredanensis） | |
| ハナゴンドウ（ グランパスグリセウス ） | |
| スナメリ（Neophocaenaのphocaenoides） | |
| ミンククジラ（ ミンクacutorostrata） | |
| ツノシマクジラ（ ミンク大村 ⅰ） |
筋肉はコレだったから種1.表この研究でCTEDとテストされています。種はマグロ、鶏肉、シール、陸生哺乳類の5種、および鯨類（4家族）の15種を含みます。
| 種 | ノーアク。 |
| ミンククジラ（ ミンクacutorostrata） | P02179 |
| ピグミーニタリクジラ（ ミンクedeni） | Q0KIY2 |
| ザトウクジラ（ ザトウクジラ ） | P02178 |
| コククジラ（ コククジラ ） | P02177 |
| マッコウクジラ（ マッコウクジラ属の大頭 ） | P02185 |
| ピグミーのマッコウクジラ（Kogiaのbreviceps） | Q0KIY5 |
| ドワーフマッコウクジラ（Kogiaシマ ） | P02184 |
| 短期beakeD共通のイルカ（ マイルカ ） | P68276 |
| ヒレナガゴンドウ（GlobicephalaのMELAS） | P02174 |
| シャチ（ 鯱、シャチ ） | P02173 |
| カズハゴンドウ（Peponocephalaエレクトラ ） | Q0KIY3 |
| Pantropicalは、（Stenella attenuata）イルカを発見しました | Q0KIY6 |
| ハンドウイルカ（ バンドウイルカ ） | P68279 |
| ネズミイルカ（ ネズミイルカ ） | P68278 |
| アマゾンカワイルカ（ アマゾンカワイルカ ） | P02181 |
| ロングマンのオオギハクジラ（Indopacetusのpacificus） | Q0KIY9 |
| ハッブスオウギハクジラ（Mesoplodon carlhubbsi） | P02183 |
| キュビエ歯クジラ（ 紫phius cavirostris） | P02182 |
| ハーバーシール（ ゴマフアザラシ属のvitulina） | P68080 |
| 牛（Bosの牡牛座 ） | P02192 |
| ヤギ（ ヒマラヤ山羊 ） | B7U9B5.3 |
| 馬（ ウマ ） | P68082 |
| 豚（ イノシシ ） | P02189 |
| 犬（ オオカミfamiliaris） | P63113 |
| チキン（ ガルスガルス ） | P02197 |
| オーストリッチ（ ダチョウ ） | P85077 |
| キハダマグロ（ キハダマグロ ） | P02205 |
それぞれGenBankアクセッション番号を有する本研究で使用し、表2ミオグロビン配列は、種は、マグロを含みます鶏、ダチョウ、家畜哺乳類、シールと鯨類の18種（7家族）。このテーブルはロー、C. らから再生されたクジラ肉拘束違法取引と消費のための迅速な免疫金コロイドストリップ：保全と公衆衛生PLoSのONE 8のための含意、e60704（2013）。 DOI：10.1371 / journal.pone.0060704。
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Discussion
担体タンパク質にコンジュゲートした合成ペプチドを使用することにより、その同族タンパク質と比較して著しくより効果的です。 mAbは既知の相対位置を有するエピトープを使用して開発されているので、サンドイッチに基づく技術については、本研究では2 mAbは、標的抗原エピトープとの互いの相互作用を妨害する可能性はありません。また、天然のタンパク質との反応性及び合成ペプチドコンジュゲートで免疫したマウスの抗体は、天然タンパク質19から製造天然タンパク質と抗体との反応性よりも強いかもしれません。合成ペプチド複合体の使用は、したがって、効果的な免疫手順や適切な抗ペプチドモノクローナル抗体の生成のために推奨されます。
タンパク質の構造は、主にポリペプチド鎖中のアミノ酸の配列を含みます。各アミノ酸は、特定の特性をもたらす、その側鎖を有しており、わずかにアミノACIを変更しますD配列は、構造変化をもたらします。 10〜20アミノ酸長を有するペプチドは、抗体調製のための理想的であるので、C末端領域における合成ペプチド（免疫原）の長さは、コア抗原性領域が認識されることを確実にするために増加しました。したがって、異なるエピトープ構造をもたらす様々な動物のMbpsの間のアミノ酸残基を効率的に区別することができます。例えば、 図3（a）は、上記のペプチド設計は、シール付きマイナスの鯨類が、と強く反応しCGF5H9に貢献示しています。別の例としては、ニワトリ、コア抗原部位2の犬のものと同一の配列を有しているがこれは外側の領域中の配列の違いは構造変化につながるため、可変なかったことを示しCGF5H9の鶏や犬に向かって明確な親和性であります抗原と抗体との間の結合親和性。
ウエスタンブロット、ドットブロット、および間接ELISAはで使用されていました適切なモノクローナル抗体をスクリーニングするための手法。ウェスタンブロットは、広く、組織抽出物またはホモジネート中の特定のタンパク質を検出するために使用されます。この技術では、ゲル電気泳動は、ポリペプチドの長さによって変性タンパク質を分離するために使用されます。したがって、信号は、予測されたタンパク質の分子量を示しているかどうかを確認することが可能です。変性タンパク質を使用するためしかし、検出結果（正または負の、強いまたは弱い信号）は、抗原 - 抗体結合の実際の状況を表していない可能性があります。その結果、ドットブロットは二段目のスクリーニングのために使用することができます。ドットブロットは、タンパク質を検出するための技術です。これは、ウェスタンブロット法の単純化を表します。ドットブロット法では、検出される分子を含む混合物は、ドットなどの膜上に直接塗布されます。タンパク質試料は変性されていないので、これはウェスタンブロットは異なります。この技術は、標的生体分子の大きさについての情報を提供していないことに注意してください、そして単一のドットは2カ月あれば表示されます。異なるサイズのleculesが検出されます。最後に、間接ELISAを適切に定量化することができる信号を生成するために、リガンド結合アッセイのために使用されます。これは、mAbの特性のより多くの情報を提供し、それによってストリップの建設を促進します。
筋肉中のMbの濃度は、収集場所に応じて可変です。例えば、鯨類における水泳筋肉（軸の筋肉）は非水泳筋肉と比較しメガビットの有意に高い含有量を有し、そして若い鯨類からのサンプルは、動物の生活20を通じてMbの濃度が増加するため、より低いMbの濃度を持っているでしょう。当初、唯一の鯨類やシールのMbのをキャプチャCSF1H13は、コロイド金標識および抗体を検出することを意図していた、と多くの種のMbのを認識しCGF5H9は、テストライン上の捕捉抗体であろう。私たちは、検出抗体がより具体的であることを仮定し、捕捉抗体はすべきより一般的です。低Mbの濃度を有する鯨サンプルを使用した場合しかし、弱い陽性シグナルは、テストライン上で発見された（データは示さず）。代表的な結果で説明したように、2つのmAbの位置が逆転したときに問題が解決されました。良好な信号であっても新生児鯨類（本鎖ツノシマクジラ）（ 図4）のために示されました。 mAbの特性および濃度は、この現象に寄与するかどうかは不明です。
この研究では、PBSを用いて均質化凍結融解筋肉サンプルは、ストリップ試験で使用しました。他のサンプル状態と調製方法は、結果に影響を与え得ます。たとえば、Mbのような塩溶性タンパク質を純水ではなく、PBSを用いて抽出する必要があります。そうでなければ、抽出は異常な結果を招く可能性があり、不十分な場合があります。適切な抽出バッファー：肉のサンプル比は、ストリップ結果の成功の解釈のために部分的に責任があります。大amou対照試料（ 例えば、家畜）のヌクレオチド（1ミリリットルバッファ内の0.3グラム）が陽性の結果とぼやけた背景を引き起こす可能性があります。しかし、（1：0.03）この研究で使用割合は、正しい結果が得られました。唯一の新鮮な筋肉サンプルは、このストリップテストのために使用することができます。タンパク質を加水分解または他の動物からの鯨類の筋肉のサンプルもサンプルのためだけでなく、肯定的な結果を引き起こす可能性があり、（そのような醤油と沸騰による硬化など）特定の処理の後に変性することができた（データは示さず）。したがって、可変サンプル・ソースと異なる構造設計計画はストリップの開発中に使用されるべきであることが示唆されています。
結論として、このプロトコルは、鯨類のMBに強く反応する2 mAbの開発を説明し、これらのmAbは、シールや他の動物から鯨類のMbのを区別するために簡単なテストストリップに適用されます。鯨肉を同定するための信頼性のあるPCRベースのDNA分析は、利用可能な12であるが、それは私sの労働集約的で、時間がかかります。簡単なテストストリップは、規制機関21のために非常に望ましい鯨肉を識別するためにフィールドで使用することができ、信頼性と迅速な手法です。ストリップは、ウマまたはブタなどの動物の特定のMBを検出するために開発することができる可能性があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
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