Protocol
Declaración de Ética: El estudio se realizó de acuerdo con las directrices internacionales y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad Nacional de Chiayi, aprobación ID: 99022. El uso de la muestra de cetáceos fue permitido por el Consejo de Agricultura de Taiwán (Permiso de Investigación 100M-02.1-C-99).
1. Preparación de la muestra del músculo y SDS-PAGE
Nota: Las muestras de músculo de 23 especies, incluyendo 16 especies de mamíferos marinos, 5 especies de mamíferos terrestres, el atún y el pollo se utilizaron en este estudio (Tabla 1). Las muestras de músculo de cetáceos se obtuvieron de individuos varados, la captura incidental de la pesca, y la confiscación. Conejo, rata, perro, y los tejidos musculares de pollo se obtuvieron a partir del Centro de Diagnóstico de Enfermedades Animales de la Universidad Nacional de Chiayi. Las muestras de carne de res, cerdo, cordero, y el atún se adquirieron en un supermercado local. La muestra de músculo de foca común (Phoca vitulina
- Almacenar todas las muestras a -20 ° C hasta su uso.
- Mortero pre-enfriamiento a -20 ° C. A continuación, poner 3 g de muestra de músculo congelado en él.
- Homogeneizar la muestra con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría utilizando un homogeneizador de tejidos.
- Centrifugar la muestra homogeneizada a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recoger los sobrenadantes y almacenarla a -20 ° C hasta su uso.
- Preparar 5 ml de 5% gel de apilamiento (3,07 ml de agua destilada, 1,25 ml de tampón de gel superior 4x de pH 6,8, 625 l de 40% de acrilamida, 50 l de 10% de persulfato de amonio (APS), y 5 l de tetrametiletilendiamina ( TEMED)) y 10 ml de 15% de gel de separación (3,65 ml de agua destilada, 2,5 ml de 4x inferior tampón de gel de pH 8,8, 3,75 ml de 40% de acrilamida, 100 l de 10% de APS,y 4 l de TEMED).
- En la celda de electroforesis, se vierte gel de apilamiento (5% de acrilamida) en la parte superior del gel de separación (15% de acrilamida) después de que éste se haya solidificado. Inserte un peine de gel en el gel de apilamiento.
- Realizar PAGE de acuerdo con las siguientes condiciones: condición inicial de ejecución: 100 voltios, 20 min y la condición final: 120 voltios, 40 min.
- Tinción del gel con azul brillante de Coomassie a temperatura ambiente durante 30 min hasta que el gel es uniformemente de color azul.
Nota: La tinción se completa cuando el gel ya no es visible en la solución de colorante. - Destain con solución de ácido acético (10%) a temperatura ambiente durante 1 hr. Bandas comenzarán a aparecer. Continuar la decoloración se deben a 4 ° C durante la noche hasta que el fondo es claro.
2. Síntesis de péptidos y Producción de anticuerpos monoclonales
- Recuperar las secuencias de aminoácidos de Mb de GenBank incluyendo el atún, pollo, avestruz, mamíferos domésticos, sello y 18 especiesde los cetáceos (Tabla 2).
- Alinear las secuencias utilizando el software adecuado 16:
- Iniciar el explorador de alineación seleccionando la Align: Editar / Construir alineación en la barra de inicio; seleccione Crear nueva alineación y haga clic en OK. Aparecerá un cuadro de diálogo preguntando "¿Está construyendo un alineamiento de secuencias de ADN o proteínas?"
- Haga clic en el botón "proteína"; seleccione Datos: Open: Recuperar secuencias de archivo y seleccione el archivo de secuencias; seleccione Editar: Seleccionar todo comando de menú para seleccionar todos los sitios para cada secuencia en el conjunto de datos para crear un alineamiento de secuencias múltiples.
- Seleccione Alineación: Alinear por ClustalW en el menú principal para alinear las secuencias de datos seleccionados utilizando el algoritmo ClustalW; seleccione "BLOSUM" como el peso de proteínas de matriz a continuación, haga clic en el botón OK.
- Analizar la alineación de la secuencia:
- Concéntrese en 5 SI reactivo antigénicoTES 17: 1 sitio (AKVEADVA, 15-22), el sitio 2 (KASEDLK, 56-62), el sitio 3 (ATKHKI, 94-99), el sitio 4 (HVLHSRH, 113-119) y el sitio 5 (KYKELGY, 145- 151) y encontrar el fragmento conservado entre los cetáceos. Un * (asterisco; símbolo de consenso en la alineación (Protocolo 2.2.3)) indica las posiciones que tienen un único residuo, totalmente conservada. Se encontraron las siguientes fragmentos conservados en los cetáceos: secuencia KASEDLKKHG (que incluye el sitio 2) y la secuencia HVLHSRHP (que incluye el sitio 4).
- Sintetizar fragmentos de secuencia candidatos de acuerdo con el análisis de la secuencia, y el conjugado con una proteína de ovoalbúmina (OVA) como proteína portadora usando servicios comerciales.
- Añadir aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, metionina) a la N-terminal de sitio reactivo antigénico para prevenir el péptido de la descomposición (por ejemplo, M-KASEDLKKHG).
- Alargar el C-terminal de sitio reactivo antigénico para exponer el sitio antigénico núcleo a la de inmunocitos. Además, conjupuerta del péptido con OVA mediante la adición de una cisteína (Cys, C) a la C-terminal (por ejemplo, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulsionar adyuvante completo de Freund para inmunógeno 1 o adyuvante incompleto de Freund para inmunógeno 2 con un volumen igual de cada péptido sintético en PBS (3 ml, concentración final de 30 a 50 g / 100 l).
- Inocular inmunógeno 1 (0,1 mg) por vía subcutánea en cada uno de los ratones 5 hembras BALB / c.
- Realizar inyecciones de refuerzo subcutáneas cinco veces usando inmunógeno 2 en intervalos de dos semanas y recoger los sueros de ensayo por muestreo clip de la cola de los ratones antes de cada refuerzo.
- Determinar el título de los sueros para la primera proyección.
- Disolver 100 g de péptido libre en 25 ml de tampón de reacción y parte alícuota de 50 l de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Añadir solución de reactivo de acoplamiento 10 l en cada pocillo y mezclar la placa. Incubar la placa durante 2 horas a temperatura ambiente.
- Retire el contenido del pozo,lavar cada pocillo 3 veces con agua destilada, y bloquear la placa mediante la adición de 200 l de solución de bloqueo. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Retire el contenido y lavar cada pocillo 3 veces con agua destilada.
- Realizar ELISA indirecto (Protocolo de 5.1 a 5.7) para determinar el título de los sueros para la primera proyección. Elige el ratón con el título más alto (el más alto de la densidad óptica) para la recolección del bazo.
- Tres días antes de la recolección del bazo, inocular 0,1 mg de inmunógeno 1 por vía subcutánea en el ratón presentar el título más alto.
- Recoger las células del bazo de los ratones inmunizados seleccionados y se fusionan con células de mieloma murino F0 (SP2 / 0-Ag14) para obtener células de hibridoma para la generación de mAb 18.
- 14 días después de la fusión, seleccionar los clones positivos mediante el cribado de la reactividad de los sobrenadantes de hibridoma hacia péptido sintético sin el uso de ELISA indirecto (Protocolo de 05.01 a 05.07).
- Diluir las células con un número apropiado por pocillo durante maximizing la proporción de los pozos que contienen sólo un clon único (clonación de dilución).
- Añadir 100 l de medio de cultivo celular a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos, excepto A1 así que se deja vacía.
- Añadir 200 l de la suspensión celular a bien A1. A continuación, traslado rápido 100 l de A1 a B1 y mezclar suavemente con la pipeta. Repita estos 1: 2 diluciones por toda la columna, y luego descarta 100 l de H1 de manera que termina con el mismo volumen que los pozos por encima de ella.
- Añadir un 100 l adicionales de medio a la columna 1 con una micropipeta de 8 canales. Entonces transferir rápidamente 100 l de cada uno de los pocillos de la columna 1 a los de la columna 2 utilizando la misma pipeta, y se mezcla pipeteando suavemente.
- Con las mismas puntas, repita estos 1: 2 diluciones en toda la placa. Desechar 100 l de cada uno de los pocillos en la última columna.
- Llevar el volumen final de todos los pozos a 200 l mediante la adición de 100 l de medio a cada pocillo. incubar plate reposo a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado.
- Compruebe cada pocillo y marcar todos los pocillos que contienen sólo una sola colonia. Llevar a cabo dos o más clonaciones hasta> 90% de los pocillos que contienen clones individuales son positivos para la producción de anticuerpos.
- Se tamizan los clones mediante western blot y dot blot (protocolo de 3.1 a 4.6). A continuación, las colonias de subcultivo de los pozos en los vasos más grandes para expandir las células para la obtención del MAB. Por lo general, cada clon se transfiere en un solo pocillo en una placa de 12 o 24 pocillos.
- Medir la afinidad entre los anticuerpos monoclonales y los extractos de músculo de vaca, cabra, cerdo, perro, conejo, atún, pollo, sello, y cuatro especies de cetáceos representativos de western blot y dot blot (protocolo de 03.01 a 04.06).
- Inocular células de hibridoma seleccionadas (hasta 3 x 10 6) por vía intraperitoneal en ratones para inducir la ascitis. hinchazón abdominal suele ser evidente dentro de los 7-10 días después de la inyección de hibridoma. Recoger líquido mediante una aguja hipodérmica(Menos de 20 gauge).
- fluido de ascitis Se centrifuga (10.000 xg durante 10 min) para eliminar las células y los desechos. Filtrar a través de un filtro de 0,45 micras. Añadir 1 a 20 ml de la muestra de tampón de unión, 15 ml, y de 3 a 5 ml de tampón de elución en la columna G Sepharose la proteína. Recoger la fracción de elución que contiene el anticuerpo se purificó del fluido ascítico de ratones.
- Determinar el isotipo de anticuerpos por kit Isotipificación de anticuerpos utilizando las instrucciones del fabricante.
3. Western Blot
- Preparar tampón de carga 2x que contiene β-mercaptoetanol (BME) mediante la mezcla de 950 l de tampón de muestra 2x Laemmli con 50 l de BME. Diluir los sobrenadantes musculares (protocolo de 1/1 a 1/4) en tampón de carga con una relación adecuada para la obtención de buenas señales: 1:50 (cetáceos y sello) y 1: 5 (animales domésticos y de atún) utilizando anticuerpo Mb policlonal de conejo anti-humano, y 1: 1 (cerdo, conejo, pollo y atún), 1: 5 (vaca, cabra y el perro) y 1:25 (cetáceos y el sello) cuando unantibody es de sobrenadante de hibridoma.
- muestra de calor a 95 ° C durante 5 min. Cargar las muestras en los pocillos de gel SDS-PAGE (4% de apilamiento de acrilamida y 12% de separación de acrilamida), junto con marcadores de peso molecular. Ejecutar el gel durante 5 min a 50 V a continuación, aumentar el voltaje a 150 V para terminar la carrera en aproximadamente 1 hr.
- Colocar el gel en tampón de transferencia 1x durante 15 minutos. Transferir la proteína separada a nitrocelulosa (NC) membranas después de que se separaron mediante PAGE. Puede realizar la transferencia a 100 V durante 60 a 90 min.
- Preparar la solución de bloqueo: 1x PBS que contiene 0,1% de Tween 20 con leche descremada en polvo 5%. Bloquear la membrana NC en 25 ml de solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Lavar tres veces durante 5 minutos cada uno con 15 ml de solución salina tamponada con fosfato con Tween 20 (PBST).
- Incubar la membrana y el anticuerpo primario (líquido ascítico o sobrenadante de hibridoma) en 10 ml de tampón de dilución de anticuerpo diluido con solución de bloqueo 5% a 4 ° C durante la noche.
- Lavar el Membranase nuevo tres veces con PBST para limpiar anticuerpo excesiva.
- Incubar la membrana con alcalina de cabra conjugada con fosfatasa anti-IgG de ratón a 1: 1250 en solución bloqueante con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Se lava la membrana de nuevo y se incuba en el cloruro de fosfato / p-nitroazul tetrazolio 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP / NBT) fosfatasa mezcla de sustrato para 10 a 20 min hasta que el desarrollo de color.
- Detener la reacción por lavado de la membrana en varios cambios de agua destilada.
4. Dot Blot
- Diluir los sobrenadantes musculares (protocolo de 1.1 a 1.4) en 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBST con relación apropiada para la obtención de buenas señales: 1: 5 para los animales domésticos y el atún, y 01:25 para los cetáceos y sello. Punto 5 l de las muestras sobre una membrana. Reducir al mínimo el área que la solución penetra (por lo general 3-4 mm de diámetro) mediante la aplicación lentamente.
- Secar la membrana a temperatura ambiente (por ejemplo, </ Em> en un flujo laminar de 30 a 60 min), bloquearla con la solución en una placa de Petri de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lava con PBST.
- Incubar la membrana con anticuerpo primario (mAb de sobrenadante de hibridoma en 1: 10.000 o fluido de ascitis en 1: 100 000 diluido en solución de bloqueo 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Uso PBST para lavar la membrana tres veces durante 5 minutos cada uno para eliminar el exceso de anticuerpo, y luego se incuba con el anticuerpo secundario (alcalina de cabra conjugada con fosfatasa anti-IgG de ratón a 1: 1250 en 5% de solución de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente .
- Se lava la membrana de nuevo y se incuba en la mezcla de sustrato de fosfatasa BCIP / NBT dentro de 10 a 20 min hasta que el desarrollo de color.
- Detener la reacción por lavado de la membrana en varios cambios de agua destilada.
5. ELISA indirecto
- Preparar tampón de lavado (0,002 M imidazol solución salina tamponada con 0,02% de Tween 20). Lavar la placa 3 veces con el lavadoamortiguador entre cada paso siguiente (protocolo 5.2-5.5).
- Preparar una dilución 1:25 de sobrenadantes musculares (protocolo 1.1-1.4) en tampón de recubrimiento. Escudo una placa de ELISA de 96 pocillos con 100 l sobrenadantes diluidos en 4 ° C durante la noche y bloquear con tampón de bloqueo (1% BSA en PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente.
- Preparar una dilución 1: 2000 del mAb purificado con tampón diluido y añadir 100 l de mAb diluido a cada pocillo. Incubar la placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Agregar de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1: 200 en tampón diluido) para una incubación adicional.
- Añadir sustrato de peroxidasa a cada pocillo (100 l / pocillo) y se incuba durante 10 a 15 min.
- Detener la reacción enzimática por la solución de parada peroxidasa (100 l / pocillo), cuando se observa el desarrollo de color.
- Leer la densidad óptica a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas.
6. Preparación del anticuerpo monoclonal marcado con oro coloidal Nota: El color de la solución de oro coloidal y la mezcla siempre debe ser de color rojo. Ajustar el pH, la concentración de mAb, la velocidad centrífuga cuando se observa precipitado negro. Los pasos 6.1 y 6.2 son pasos de optimización.
- Añadir purificada detección de mAb (50 mg / ml, 3 l) a 100 l de solución de oro coloidal con valores de pH que varían de 5-9. El pH mínimo que mantiene el color rojo durante dos horas se considera como el pH óptimo. Nota: En este estudio, se utilizó 0,1 M de carbonato de potasio para ajustar el oro coloidal (40 nm) solución a pH 8,0 (pH óptimo).
- Añadir diversas cantidades de purificados detección de mAb (500 g / ml, 1 a 20 l) a 100 l de solución de oro coloidal a un pH de 8,0. Nota: La concentración óptima en este estudio es de 6 g / ml (sin precipitado negro).
- De acuerdo con los resultados anteriores, añadir 60 g de la detección de mAb purificado gota a gota a 10 ml de solución de oro coloidal. Emulsionar la mezcla suavemente a temperatura ambiente durante 10 min. Anunciod 2 ml de solución de 5% de BSA en PBS (pH 7,4) a la mezcla y emulsionar suavemente a temperatura ambiente durante 15 min para reducir la interferencia de fondo.
- Se centrifuga la mezcla a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante con anticuerpo no conjugado con cuidado y suspender los sedimentos resultantes en 4 ml de PBST que contenía 1% de BSA y 0,1% de Tween 20, y repetir la centrifugación y la suspensión varias veces.
- Suspender los precipitados finales en 1 ml de PBST y almacenarla a 4 ° C hasta su utilización.
7. Construcción de Inmune Strip
Nota: La Figura 1 muestra el diseño de la tira inmune. Preparar y montar las tiras en un laboratorio las condiciones ambientales de humedad baja (<20% de humedad relativa) durante el período de conservación prolongado (> 1 año). Las dimensiones de las almohadillas y membranas son: compresa de conjugado 300 mm x 10 mm, 300 mm almohadilla absorbente x 24 mm, 300 mm almohadilla de la muestra x 24 mm, Carolina del Norte membrana de 300 mm x 25 mm, mesa de trabajo 300mm x 80 mm.
- Añadir la solución coloidal marcado con oro mAb desde el paso 6.6 con una micropipeta para saturar la almohadilla de conjugado y luego se seca a 37 ° C durante 1 hora antes de montar.
- Distribuir el antígeno específico de captura de mAb (500 g / ml) en la zona de ensayo, y de conejo anti-IgG de ratón (500 mg / ml) en la zona de control para la detección de mAb sobre la membrana NC utilizando una impresora pipeta o immunostrip. Mantener una distancia (> 5 mm) entre las dos zonas para evitar interferencias.
- Pegar la almohadilla conjugada, almohadilla absorbente y la membrana de Carolina del Norte en la mesa de trabajo con cinta de doble cara.
Nota: La superposición de las pastillas en cada lado de la membrana de NC en alrededor de 2 mm. construcción tira inapropiado resultará en una prueba incompleta. - Coloque la almohadilla de la muestra sobre la almohadilla de conjugado (2 mm) y pegarlo en el área de trabajo.
- Crear tiras de 6 mm de ancho con un cortador de papel. Empacar las tiras en la bolsa de papel de aluminio con desecante, y almacenar a 4 ° C hasta su utilización.
8. Prueba de reactividad cruzada
- Homogeneizar 0,03 g de muestra de músculo crudo con 1 ml de PBS (que contiene 0,1% de BSA) en un tubo de centrífuga de 1.5 ml utilizando una vara de bambú o de molienda varilla.
- Mantenga la tira por el extremo opuesto a las áreas de prueba y sumergir la parte de la almohadilla de la muestra en la muestra durante 5-10 minutos y observar el resultado directamente.
- Opcional: Recoger 500 l sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo de centrífuga.
Nota: Este paso se sugiere si la señal no es obvia cuando la tira se sumerge directamente en el sobrenadante.
- Opcional: Recoger 500 l sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo de centrífuga.
- Probar varias muestras de músculo por triplicado.
Nota: Aquí hemos probado el atún, pollo, sello, 15 especies de cetáceos y 5 especies de mamíferos terrestres. - Tienen cinco inspectores independientes repiten 8,3 por cinco veces, es decir, utilizan tiras 575 en total.
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Representative Results
Características de anticuerpos monoclonales
Hemos desarrollado dos IgG 1 mAb (CGF5H9 y CSF1H13) que reconocen dos péptidos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC y AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, de los cetáceos Mb, y éstos se utilizaron para construir una tira de prueba inmunocromatográfica de oro coloidal de tipo sándwich para la detección rápida de Mb de cetáceos. Figura 2 muestra que CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una sola banda teñida a un peso molecular predicho de aproximadamente 17 kDa. La ballena minke común (Balaenoptera acutorostrata) muestra una banda comparativamente más débil que las bandas de otros cetáceos. Bandas están ausentes de atún, los pollos y los sellos, mientras que una banda de aproximadamente 50 kDa se observa para los cerdos. Aunque existen múltiples bandas no específicas para cerdos y atún, CSF1H13 es altamente específico, ya que reacciona solamente con los cetáceos y focas como una banda con un peso molecular previsto de aproximadamente 17 kDa. Ballena pequeña sólo muestra una fuerte señal a las 1:10 (datos no mostrados), sin señal observada a las 1:25. La figura 2 muestra los resultados idénticos en transferencia de puntos.
La figura 3A muestra que demuestra CGF5H9 señal positiva para los cetáceos, conejos, perros, cabras y vacas (valor OD> 3,0); débil señal positiva para los cerdos (valor de DO = 1,5); señal negativa para los sellos, las gallinas y el atún. Figura 3B muestra que expresa CSF1H13 alta afinidad hacia los cetáceos y focas (valor de DO> 3,0). Tanto CSF1H13 y CGF5H9 pueden reaccionar fuertemente con las cuatro especies de cetáceos. Estas cuatro especies son de diferentes familias (ballena minke: Balaenopteridae; delfín nariz de botella: Delphinidae; cachalote enano: KOGIIDAE; marsopa sin aleta: Phocoenidae), lo que indica la amplia reactividad a diversas especies de cetáceos.
Para la construcción de la tira, CGF5H9, que reconoce tque Mbs de cetáceos y otros mamíferos, es coloide marcado con oro y se utiliza como anticuerpo de detección de obligar a la mioglobina, y CSF1H13 está revestida en la línea de prueba sólo para capturar los Mbs de los cetáceos y focas. Por lo tanto la línea de prueba está diseñada para mostrar una señal positiva cuando ambos anticuerpos monoclonales detectan Mb de cetáceos. Debido a que el Mb de animales no cetáceos sólo puede ser detectado por uno de estos dos mAbs, la línea de prueba muestra un resultado negativo cuando se prueban las muestras de músculo de otros animales. La línea de control siempre muestra un resultado positivo porque conejo anti-IgG de ratón se une coloide CGF5H9 marcado con oro. Un resultado fallido en la línea de control indica que la calidad de los materiales en la tira es pobre.
tira de prueba
La figura 4 muestra las bandas de señal, tanto en la línea de prueba y la línea de control cuando se utilizan muestras de músculo de cetáceos. Cuando la muestra no es de cetáceos, sólo hay una única banda en la línea de control with la ausencia de banda en la línea de prueba. Un resultado exitoso se puede observar directamente en 5-10 min después de la homogeneización de 0,03 g de músculo con 10 ml de PBS que contenía 0,1% de BSA usando un palo de plástico o de bambú y absorbiendo la tira en la mezcla. Después de probar 15 especies de cetáceos y las ocho especies que no son de cetáceos, por triplicado, especificidad (el porcentaje de muestras no identificó correctamente cetáceos) y sensibilidad (el porcentaje de muestras de cetáceos correctamente identificados) son a la vez 100%.
Figura 1. Diseño de la tira inmune. Todos los componentes se colocan en capas cuidadosamente sobre a la tarjeta de respaldo de plástico de modo que se superponen. Esto permite que los reactivos y la muestra fluyen a través de la membrana y a la almohadilla absorbente. T: zona de prueba. C: zona de control. Esta cifra se ha reproducido de Lo, C. et al. Rápido tira de oro coloidal inmunológicode cetáceos de restricción carne comercio ilegal y el consumo:. implicaciones para la conservación y la salud pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Western blot y análisis de transferencia puntual usando los sobrenadantes de hibridoma. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Ambos sobrenadantes de hibridoma pueden detectar cetáceos como una sola banda teñida a un peso molecular predicho de aproximadamente 17 kDa. MW: ballena minke, BND: delfín nariz de botella, DSW: ballena enana esperma, FP: marsopa sin aleta, PKW: orca pigmea, N: PBS (control negativo). Esta cifra se ha reproducido de Lo, C. et al. Franja de oro coloidal inmune rápida para cetacean restricción carne comercio ilegal y el consumo:. implicaciones para la conservación y la salud pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. ELISA indirecto de extractos musculares de diferentes especies utilizando mAbs purificados. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Solamente los cetáceos pueden producir fuertes señales positivas en ambos mAb. Esta cifra se ha reproducido de Lo, C. y col franja de oro coloidal inmunológico rápido para la restricción de la carne de cetáceos comercio y el consumo ilegal:.. Implicaciones para la conservación y la salud pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Especificidad de la tira de oro coloidal inmunológico. T: línea de prueba. C: línea de control. Sólo cuando se utilizan muestras de músculo de cetáceos, se pueden observar resultados exitosos (bandas de señal, tanto en la línea de prueba y la línea de control). (A) Las muestras no cetáceos: 1: Vaca. 2: Cabra. 3: Cerdo. 4: el perro. 5: Conejo. 6: El atún. 7: Pollo. 8: Sello de puerto (Phoca vitulina). (B) muestras de cetáceos: 1: ballena minke (Balaenoptera acutorostrata). 2: ballena (Balaenoptera omurai) de Omura. 3: delfín nariz de botella (Tursiops aduncus). 4: delfín nariz de botella (T. truncatus). 5: delfín de Fraser (Lagenodelphis hosei </ Em>). 6: Indo-Pacífico delfín jorobado (Sousa chinensis). 7: El delfín de Risso (Grampus griseus). 8: delfines moteados (Stenella attenuata). 9: delfín de dientes rugosos (Steno bredanensis). 10: enano orca (Feresa attenuata). 11: ballena piloto de aleta corta (Globicephala macrorhynchus). 12: ballena de cabeza de melón (Peponocephala Electra). 13: cachalote enano (Kogia sima). 14: cachalote enano (K. breviceps). 15: marsopa sin aleta (phocaenoides Neophocaena). Esta cifra se ha reproducido de Lo, C. y col franja de oro coloidal inmunológico rápido para la restricción de la carne de cetáceos comercio y el consumo ilegal:.. Implicaciones para la conservación y la salud pública PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Las especies de cetáceos | Especies que no son de cetáceos |
| Cachalote pigmeo (Kogia breviceps) | Sello de puerto (Phoca vitulina) |
| Cachalote enano (Kogia sima) | Perro (Canis lupus familiaris) |
| De aleta corta calderón (Globicephala macrorhynchus) | Conejo (Oryctolagus cuniculus) |
| Ballena cabeza de melón (Peponocephala Electra) | El cerdo (Sus scrofa) |
| Orca pigmea (Feresa attenuata) | Cabra (Capra hircus) |
| Delfín moteado (Stenella attenuata) | El ganado (Bos Taurus) |
| Delfín nariz de botella (Tursiops truncatus) | Pollo (Gallus gallus) |
| Delfín nariz de botella (Tursiops aduncus) | El atún aleta amarilla (Thunnus albacares) |
| Delfín de Fraser (Lagenodelphis hosei) | |
| Indo-Pacífico delfín jorobado (Sousa chinensis) | |
| Delfines rugosa dentada (bredanensis Steno) | |
| El delfín de Risso (Grampus griseus) | |
| Marsopa sin aleta (phocaenoides Neophocaena) | |
| Ballena minke común (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Ballena de Omura (Balaenoptera omura i) |
Tabla 1. Las especies de las que el músculo era Collected y probados en este estudio. Las especies incluyen el atún, pollo, sello, 5 especies de mamíferos terrestres, y 15 especies de cetáceos (4 familias).
| Especies | No la adhesión. |
| Ballena minke común (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| De Bryde pigmeo ballena (Balaenoptera edeni) | Q0KIY2 |
| Ballena jorobada (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Ballena gris (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Cachalote (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Cachalote pigmeo (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| Cachalote enano (Kogia sima) | P02184 |
| Short-Beaked delfín común (Delphinus delphis) | P68276 |
| De aleta larga calderón (Globicephala melas) | P02174 |
| Orca (Orcinus orca) | P02173 |
| Ballena cabeza de melón (Peponocephala Electra) | Q0KIY3 |
| Delfín moteado (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Delfín nariz de botella (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Marsopa común (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Delfín del río Amazonas (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Ballena picuda de Longman (pacificus Indopacetus) | Q0KIY9 |
| La ballena picuda Hubbs (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Ballena picuda de Cuvier (ZiPHIUS cavirostris) | P02182 |
| Sello de puerto (Phoca vitulina) | P68080 |
| El ganado (Bos Taurus) | P02192 |
| Cabra (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Caballo (Equus caballus) | P68082 |
| El cerdo (Sus scrofa) | P02189 |
| Perro (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Pollo (Gallus gallus) | P02197 |
| Avestruz (Struthio camelus) | P85077 |
| El atún aleta amarilla (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabla 2. Secuencias de mioglobina utilizados en este estudio con los respectivos números de acceso de GenBank. Las especies incluyen el atún,pollo, avestruz, mamíferos domésticos, sello y 18 especies de cetáceos (7 familias). Esta tabla se ha reproducido de Lo, C. y col franja de oro coloidal inmunológico rápido para la restricción de la carne de cetáceos comercio y el consumo ilegal:. Implicaciones para la conservación y la salud pública PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.
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Discussion
El uso de un péptido sintético conjugado con la proteína portadora es notablemente más eficaz en comparación con su proteína afín. Para una técnica basada en sándwich, debido a que el MAB se desarrolla utilizando epítopos con ubicaciones relativas conocidas, los dos anticuerpos monoclonales en este estudio no pueden interferir con la interacción de cada uno con el epítopo del antígeno diana. Además, la reactividad entre la proteína nativa y el anticuerpo de ratones inmunizados con el conjugado de péptido sintético puede ser más fuerte que la reactividad entre la proteína nativa y el anticuerpo producido a partir de la proteína nativa 19. por lo tanto, se recomienda el uso de conjugados de péptidos sintéticos para los procedimientos de inmunización eficaces y la generación de mAb anti-péptido apropiado.
La estructura de una proteína implica principalmente la secuencia de aminoácidos en la cadena polipeptídica. Cada aminoácido tiene su cadena lateral que conduce a propiedades específicas, y cambiando ligeramente la aci aminod secuencia da lugar a cambios en la estructura. Debido a péptidos con una longitud de 10-20 aminoácidos son ideales para la preparación de anticuerpos, se aumentó la longitud de los péptidos sintéticos (inmunógeno) en la región C-terminal para garantizar que se reconoció la región antigénica núcleo. Por lo tanto, los residuos de aminoácidos entre Mbs de varios animales resultantes en diferentes estructuras de epítopos podrían diferenciarse eficientemente. Por ejemplo, la Figura 3A muestra el diseño del péptido mencionado contribuye a CGF5H9 reaccionar fuertemente con los cetáceos, pero negativamente con los sellos. Otro ejemplo es las afinidades distintas hacia los pollos y los perros de CGF5H9 aunque el pollo tiene una secuencia idéntica a la del perro en el sitio 2. antigénico núcleo Esto indica que la diferencia en la secuencia en la región exterior podría dar lugar al cambio de la estructura y por lo tanto la variable afinidad entre el antígeno y el anticuerpo de unión.
Western blot, dot blot y ELISA indirecto se utilizaron ennuestro método para seleccionar mAbs adecuados. Western blot se utiliza ampliamente para detectar proteínas específicas en extracto de tejido homogeneizado o. En esta técnica, la electroforesis en gel se utiliza para separar las proteínas desnaturalizadas por la longitud del polipéptido. Por lo tanto, es posible confirmar si la señal indica el peso molecular proteína predicha. Sin embargo, el resultado de la detección (señal positiva o negativa, fuerte o débil) no puede haber representado la situación real de la unión antígeno-anticuerpo, porque se utilizan las proteínas desnaturalizadas. En consecuencia, transferencia de puntos se puede utilizar para el cribado de la segunda etapa. Dot blot es una técnica para la detección de proteínas. Representa una simplificación del método de transferencia de western. En transferencia de puntos, una mezcla que contiene la molécula a detectar se aplica directamente sobre una membrana como un punto. Esto difiere de una transferencia western porque las muestras de proteínas no se desnaturalizan. Tenga en cuenta que esta técnica no ofrece ninguna información sobre el tamaño de la biomolécula diana, y un solo punto aparecerá si dos mose detectan lecules de diferentes tamaños. Finalmente, ELISA indirecto se utiliza para un ensayo de unión a ligando con el fin de generar una señal que se puede cuantificar correctamente. Se proporciona más información de las características del MAB y con ello facilita la construcción tira.
Las concentraciones de Mb en el músculo son variables en función del lugar de recogida. Por ejemplo, los músculos de natación (músculos axiales) en cetáceos tener un contenido significativamente mayor de Mb en comparación con los músculos no de natación, y muestras de cetáceos jóvenes tendrían menor concentración Mb porque la concentración aumenta Mb largo de la vida de un animal 20. Inicialmente, CSF1H13, que sólo captura el Mb de cetáceos y focas, estaba destinado a ser etiquetados de oro coloidal y estar detección de anticuerpos, y CGF5H9, que reconoce el Mb de muchas especies, sería anticuerpo de captura en la línea de prueba. La hipótesis de que el anticuerpo de detección debe ser más específico y el anticuerpo de captura deberíaser más general. Sin embargo, se encontró una débil señal positiva en la línea de prueba cuando se utilizaron muestras de cetáceos con bajas concentraciones Mb (datos no mostrados). El problema se resolvió cuando las posiciones de los dos mAbs se invirtieron como se describe en los resultados representativos. Una buena señal se presenta incluso para un cetáceo recién nacido (una ballena varada de Omura) (Figura 4). No está claro si las características y concentración de mAbs contribuyen a este fenómeno.
En este estudio, las muestras de músculo congelado-descongelado homogeneizados con PBS se utilizaron en la prueba de la tira. Otras condiciones de la muestra y métodos de preparación pueden afectar el resultado. Por ejemplo, la proteína de sal soluble tal como Mb debe ser extraído por medio de PBS en lugar de agua pura. De lo contrario, la extracción puede ser inadecuada, lo que podría conducir a un resultado aberrante. El tampón de extracción apropiado: relación de muestra de carne es en parte responsable de la correcta interpretación de los resultados tira. gran amount (0,3 g en 1 ml de tampón) de muestras de control (por ejemplo, los animales domésticos) podría dar un resultado positivo y fondo borroso. Sin embargo, la relación utilizada en este estudio (1: 0,03) produjo resultados correctos. Sólo las muestras de músculo fresco se pueden utilizar para este análisis con la tira. Proteína podría ser hidrolizado o desnaturaliza después de ciertos tratamientos (como curado por salsa de soja y de ebullición), lo que podría causar que los resultados positivos no sólo para las muestras de músculo de cetáceos, sino también muestras de otros animales (datos no mostrados). Por lo tanto, se sugiere que las fuentes de muestra variables y diferentes planes de diseño de construcción deben usarse durante el desarrollo de la franja.
En conclusión, este protocolo se describe el desarrollo de dos anticuerpos monoclonales reactivos fuertemente a la Mb de cetáceos, y estos mAb se aplica en una tira de prueba rápida para diferenciar el Mb de cetáceos del sello y otros animales. Aunque el análisis de ADN basado en PCR para la identificación fiable de la carne de cetáceo está disponible 12, se is mucha mano de obra y consume mucho tiempo. La tira de prueba rápida es una técnica fiable y rápido que se puede utilizar en el campo para identificar las carnes de cetáceos, lo cual es altamente deseable para las agencias reguladoras 21. Es probable que la tira se puede desarrollar para la detección de Mbs específicos de animales tales como caballos o cerdos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
