Protocol
Déclaration éthique: L'étude a été réalisée conformément aux directives internationales et approuvé par le Comité institutionnel des soins aux animaux et de l' utilisation (IACUC) de l' Université Nationale Chiayi, l' approbation ID: 99022. L'utilisation de l' échantillon cétacé a été autorisé par le Conseil de l' agriculture de Taiwan (permis de recherche 100M-02.1-C-99).
1. Muscle Préparation de l'échantillon et SDS-PAGE
Note: Les échantillons de muscle de 23 espèces dont 16 espèces de mammifères marins, 5 espèces de mammifères terrestres, le thon et le poulet ont été utilisés dans cette étude (tableau 1). Les échantillons de muscles de cétacés ont été obtenus à partir d'individus échoués, la pêche, les prises accessoires et à la confiscation. Lapin, le rat, le chien et les tissus musculaires de poulet ont été obtenus à partir de la maladie Centre de diagnostic animal de l'Université Nationale Chiayi. Des échantillons de boeuf, de porc, de l'agneau, et le thon ont été achetés dans un supermarché local. L'échantillon musculaire du phoque (Phoca vitulina
- Conservez tous les échantillons à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- mortier pré-cool à -20 ° C. Ensuite, mettre 3 g de l'échantillon de muscle congelé en elle.
- Homogénéiser l'échantillon avec 10 ml d'une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant un homogénéiseur de tissu.
- Centrifuger l'échantillon homogénéisé à 10.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Collecter les surnageants et le stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer 5 ml de 5% de gel d'empilement (3,07 ml d'eau distillée, 1,25 ml de tampon de gel supérieure 4x pH 6,8, 625 ul de 40% d'acrylamide, 50 pl de 10% de persulfate d'ammonium (APS), et 5 ul de la tétraméthyléthylènediamine ( TEMED)) et 10 ml de 15% de gel de séparation (3,65 ml d'eau distillée, 2,5 ml de 4x tampon de gel inférieur à pH 8,8, 3,75 ml de 40% d'acrylamide, 100 ul de 10% d'APS,et 4 ul de TEMED).
- Dans la cellule d'électrophorèse, verser gel d'empilement (5% d'acrylamide) sur le dessus du gel de séparation (15% d'acrylamide) après que celle-ci soit solidifiée. Insérer un peigne de gel dans le gel d'empilement.
- Effectuer PAGE selon les conditions suivantes: état de fonctionnement initial: 100 volts, 20 min et dernière condition: 120 volts, 40 min.
- Colorer le gel avec du bleu brillant Coomassie à la température ambiante pendant 30 minutes jusqu'à ce que le gel est uniformément de couleur bleue.
Remarque: La coloration est terminée lorsque le gel est plus visible dans la solution de colorant. - Décolorer avec une solution d'acide acétique (10%) à la température ambiante pendant 1 h. Les bandes commencent à apparaître. Continuer détachage à 4 ° C pendant la nuit jusqu'à ce fond est clair.
2. Peptide Synthèse et Production d'anticorps monoclonaux
- Récupérez les séquences d'acides aminés de Mb de GenBank y compris le thon, le poulet, l'autruche, les mammifères domestiques, le phoque et 18 espècesdes cétacés (tableau 2).
- Alignez les séquences en utilisant un logiciel approprié 16:
- Lancez l'alignement Explorer en sélectionnant Aligner: Modifier / Construire l' alignement sur la barre de lancement; sélectionnez Créer un nouveau alignement , puis cliquez sur OK. Une boîte de dialogue apparaîtra vous demandant «Êtes-vous construire un alignement de séquences d'ADN ou de protéines?"
- Cliquez sur le bouton "Protein"; sélectionnez Données: Open: Récupérer des séquences de fichiers et fichier de séquence de sélection; sélectionnez Edit: Tout sélectionner la commande de menu pour sélectionner tous les sites pour chaque séquence dans l'ensemble pour créer un alignement de séquences multiples données.
- Sélectionnez Alignement: Alignez par ClustalW dans le menu principal pour aligner les séquences données sélectionnées en utilisant l'algorithme ClustalW; sélectionnez "BLOSUM" comme la protéine Poids Matrice puis cliquez sur le bouton OK.
- Analyser l'alignement de la séquence:
- Focus sur 5 si réactif antigéniquetes 17: site 1 (AKVEADVA, 15-22), le site 2 (KASEDLK, 56-62), le site 3 (ATKHKI, 94-99), le site 4 (HVLHSRH, 113-119) et le site 5 (KYKELGY, 145- 151) et de trouver le fragment conservé parmi les cétacés. Un astérisque (*; symbole de consensus dans l'alignement (Protocole 2.2.3)) indique les positions qui ont un seul résidu, entièrement conservé. Les fragments conservés suivants dans les cétacés ont été trouvés: séquence KASEDLKKHG (qui comprend le site 2) et la séquence HVLHSRHP (qui comprend le site 4).
- Synthétiser des fragments de séquences candidates en fonction de l'analyse de la séquence et le conjugué avec une protéine d'ovalbumine (OVA) comme protéine porteuse en utilisant les services commerciaux.
- Ajouter des acides aminés hydrophobes (par exemple methionine) à l' extrémité N-terminale du site réactif antigénique pour empêcher le peptide provenant de la décomposition (par exemple, M-KASEDLKKHG).
- Allonger le C-terminal du site réactif antigénique pour exposer le site antigénique de base à l'immunocytes. En outre, Conjuporte le peptide avec de l' OVA par addition d' une cysteine (Cys, C) , à l' extrémité C-terminale (par exemple, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Émulsifier l'adjuvant complet de Freund pour immunogène 1 ou l'adjuvant incomplet de Freund pour les deux immunogene avec un volume égal de chaque peptide synthétique dans du PBS (3 ml, concentration finale de 30-50 ug / 100 ul).
- Inoculer immunogene 1 (0,1 mg) par voie sous- cutanée dans chacune des souris BALB / c 5 femelle.
- Effectuer des injections de rappel sous-cutanée cinq fois à l'aide de 2 immunogène à des intervalles de deux semaines et de recueillir des sérums de test en queue de clip échantillonnage des souris avant chaque booster.
- Déterminer les sérums titre pour la première projection.
- Dissoudre 100 pg de peptide libre dans 25 ml de tampon de réaction et aliquote de 50 ul de la solution dans chaque puits d'une plaque à 96 puits. Ajouter une solution de réactif de couplage de 10 pi dans chaque puits et mélanger la plaque. Incuber la plaque pendant 2 h à température ambiante.
- Supprimez le contenu du puits,laver chaque puits 3 fois avec de l'eau distillée, et bloquer la plaque en ajoutant 200 pi de solution de blocage. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Retirer le contenu et laver chaque puits 3 fois avec de l'eau distillée.
- Effectuer ELISA indirect (Protocole 5.1-5.7) pour déterminer les sérums titre pour la première projection. Choisissez la souris avec le titre le plus élevé (la plus haute densité optique) pour la collecte de la rate.
- Trois jours avant la collecte de la rate, ensemencer 0,1 mg d'immunogène 1 voie sous-cutanée dans la souris présentant le titre le plus élevé.
- Recueillir les cellules de rate des souris immunisées choisies et fusionner avec des cellules de myélome murin F0 (sp2 / 0-Ag14) pour obtenir des cellules d'hybridome pour la production de mAb 18.
- 14 jours après la fusion, sélectionnez les clones positifs par criblage de la réactivité des surnageants d'hybridome vers peptide synthétique libre en utilisant ELISA indirect (Protocole 5.1-5.7).
- Diluer les cellules à un nombre approprié par puits pour maximizment la proportion des puits qui ne contiennent qu'un seul clone unique (dilution de clonage).
- Ajouter 100 ul de milieu de culture cellulaire à tous les puits de la plaque de 96 puits, sauf A1 et qui est laissé vide.
- Ajouter 200 ul de la suspension cellulaire dans le puits A1. Puis transférer rapidement 100 pi de A1 à B1 et mélanger par pipetage. Répétez ces 1: 2 dilutions en bas de la colonne entière, puis jetez 100 pi de H1 de sorte qu'il se retrouve avec le même volume que les puits au-dessus.
- Ajouter une 100 ul supplémentaires de support à la colonne 1 avec une micro-pipette à 8 canaux. Transférer ensuite rapidement 100 ul de chacun des puits dans la colonne 1 à ceux de la colonne 2, en utilisant la même pipette et mélanger doucement par pipetage.
- En utilisant les mêmes conseils, répéter ces 1: 2 dilutions dans l'ensemble de la plaque. Jeter les 100 ul de chacun des puits dans la dernière colonne.
- Amener le volume final de chaque puits à 200 ul par addition de 100 ul de milieu à chaque puits. Incuber plate undisturbed à 37 ° C dans un incubateur à CO2 humidifié.
- Vérifiez chaque puits et marquer tous les puits qui contiennent une seule colonie. Réaliser deux ou plusieurs clonages jusqu'à ce que> 90% des puits contenant des clones uniques sont positifs pour la production d'anticorps.
- Tamiser les clones par western blot et dot blot (protocole 03.01 à 04.06). Puis colonies de sous-culture des puits dans les grands navires pour développer des cellules pour obtenir des mAb. Habituellement, chaque clone est transféré dans un seul puits dans une plaque de 12 ou 24 puits.
- Mesurer l'affinité entre les mAb et les extraits de muscle de vache, de chèvre, de porc, chien, lapin, le thon, le poulet, le phoque, et quatre espèces de cétacés représentatives par western blot et dot blot (protocole 03.01 à 04.06).
- Inoculer les cellules d'hybridome sélectionnées (jusqu'à 3 x 10 6) intrapéritonéale à des souris pour induire ascite. gonflement abdominal est généralement apparente dans les 7-10 jours après l'injection d'hybridome. Collecter fluide à l'aide d'une aiguille hypodermique(Moins de 20 gauge).
- un fluide d'ascites centrifuge (10 000 x g pendant 10 min) pour éliminer les cellules et les débris. Filtrer à travers un filtre de 0,45 um. Ajouter 1 à 20 ml de l'échantillon, 15 ml de tampon de liaison, et de 3 à 5 ml de tampon d'élution dans la colonne de protéine G-Sepharose. Recueillir la fraction d'élution contenant l'anticorps purifié à partir du liquide d'ascite de souris.
- Déterminer l'isotype d'anticorps par kit isotypage d'anticorps en utilisant les instructions du fabricant.
3. Western Blot
- Préparer un tampon de charge 2x contenant du β-mercaptoéthanol (BME) en mélangeant 950 pi de tampon d'échantillon de Laemmli 2x avec 50 ul de BME. Diluer les surnageants musculaires (protocole 1.1-1.4) dans un tampon de chargement avec un rapport approprié pour l'obtention de bons signaux: 1:50 (cétacés et phoques) et 1: 5 (les animaux domestiques et le thon) lors de l'utilisation d'anticorps Mb polyclonal de lapin anti-humaine, et 1: 1 (porc, lapin, poulet et thon), 1: 5 (vache, chèvre et le chien), et 1:25 (cétacés et phoques) quand unntibody est de surnageant d'hybridome.
- Chauffer l'échantillon à 95 ° C pendant 5 min. Charger les échantillons dans les puits d'un gel SDS-PAGE (acrylamide à 4% d'empilage et 12% d'acrylamide de séparation) ainsi que des marqueurs de poids moléculaire. Exécutez le gel pendant 5 min à 50 V augmente alors la tension à 150 V pour terminer la course dans environ 1 h.
- Placer le gel dans un tampon de transfert 1x pendant 15 min. Transférer la protéine séparée de nitrocellulose (NC) membranes après ils sont séparés par PAGE. Le transfert peut être fait à 100 V pendant 60-90 min.
- Préparer une solution de blocage: 1x PBS contenant 0,1% de Tween 20 avec 5% de lait écrémé en poudre. Bloquer la membrane NC dans 25 ml de solution à la température ambiante de blocage pendant 1 h. Laver trois fois pendant 5 minutes à chaque fois avec 15 ml de tampon phosphate salin avec du Tween 20 (PBST).
- Incuber la membrane et de l'anticorps primaire (liquide d'ascite ou le surnageant d'hybridome) dans 10 ml de tampon de dilution d'anticorps dilué avec une solution de blocage de 5% à 4 ° C pendant une nuit.
- Laver le Membrane nouveau trois fois avec PBST pour nettoyer anticorps excessive.
- Incuber la membrane avec alcaline de chèvre conjugué à la phosphatase IgG anti-souris à 1: 1250 dans une solution de blocage avec une légère agitation pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver la membrane et on incube à nouveau dans le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate de chlorure / p-nitrobleu de tétrazolium (BCIP / NBT) du mélange de substrat de phosphatase 10 à 20 min jusqu'à ce que le développement de la couleur.
- Arrêter la réaction en lavant la membrane plusieurs changements d'eau distillée.
4. Dot Blot
- Diluer les surnageants musculaires (protocole 1.1-1.4) dans 5% de sérum albumine bovine (BSA) dans du PBST avec un rapport approprié pour l'obtention de bons signaux: 1: 5 pour les animaux domestiques et le thon, et 1h25 pour les cétacés et phoques. Spot 5 pi d'échantillons sur une membrane. Minimiser la zone que la solution pénètre (habituellement 3-4 mm de diamètre) en appliquant lentement.
- Sécher la membrane à la température ambiante (par exemple, </ Em> dans un flux laminaire pendant 30-60 min), la bloquer avec une solution en boîte de Pétri de blocage pendant 1 h à température ambiante, et le laver avec du PBST.
- Incuber la membrane avec l'anticorps primaire (mAb de surnageant d'hybridome à 1: 10 000 ou fluide ascitique à 1: 100 000 dilué dans une solution de blocage de 5%) pendant 1 h à température ambiante.
- L'utilisation du PBST pour laver la membrane à trois reprises pendant 5 min à chaque fois pour éliminer l'excès d'anticorps, puis incuber avec un anticorps secondaire (alcaline de chèvre conjugué à la phosphatase IgG anti-souris à 1: 1250 dans 5% de solution de blocage) pendant 1 heure à la température ambiante, .
- Laver la membrane et on incube à nouveau dans le mélange de substrat de phosphatase BCIP / NBT à l'intérieur de 10 à 20 min jusqu'à ce que le développement de la couleur.
- Arrêter la réaction en lavant la membrane plusieurs changements d'eau distillée.
5. ELISA indirect
- Préparer un tampon de lavage (imidazole 0,002 M de solution saline tamponnée avec 0,02% de Tween 20). Laver la plaque 3 fois avec lavetampon entre chaque étape suivante (protocole 5,2-5,5).
- Préparer une dilution 1:25 du surnageant de muscle (protocole de 1,1 à 1,4) dans un tampon de revêtement. Enduire une plaque à 96 puits ELISA avec 100 pi surnageants dilués à 4 ° C pendant la nuit et le bloquer avec un tampon de blocage (1% de BSA dans du PBS) pendant 1 heure à température ambiante.
- Préparer 1: 2000 dilution de l'anticorps monoclonal purifié avec du tampon dilué et ajouter 100 pi de mAb dilué à chaque puits. Incuber la plaque pendant 1 heure à température ambiante.
- Ajouter un anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué avec de la peroxydase de raifort (dilution 1: 200 dans un tampon de dilution) pour une incubation supplémentaire.
- Ajouter le substrat de la peroxydase dans chaque puits (100 pl / puits) et incuber pendant 10 à 15 min.
- Arrêter la réaction enzymatique par la solution d'arrêt de la peroxydase (100 pl / puits) lorsque le développement de la couleur est observée.
- Lire la densité optique à 450 nm en utilisant un spectrophotomètre de microplaque.
6. Préparation de l'or colloïdal marqué mAb Remarque: La couleur de la solution d'or colloïdal et le mélange doit toujours être rouge. Ajuster le pH, la concentration de mAb, la vitesse de la centrifugeuse lorsque précipité noir est remarqué. Les étapes 6.1 et 6.2 sont des étapes d'optimisation.
- Ajouter la détection Acm purifié (50 pg / ml, 3 ul) à 100 ul d'une solution d'or colloïdal avec des valeurs de pH variant de 5-9. Le pH minimum qui maintient la couleur rouge pendant deux heures est considérée comme le pH optimal. Nota: Dans cette étude, 0,1 M de carbonate de potassium a été utilisé pour ajuster l'or colloïdal (40 nm) de la solution à pH 8,0 (pH optimum).
- Ajouter diverses quantités de mAb purifiés de détection (500 pg / ml, de 1 à 20 ul) à 100 ul d'une solution d'or colloïdal à un pH de 8,0. Note: La concentration optimale dans cette étude est de 6 pg / ml (pas précipité noir).
- D'après les résultats ci-dessus, ajouter 60 pg d'Acm purifié détection de goutte à goutte à 10 ml d'une solution d'or colloïdal. Émulsionner le mélange doucement à température ambiante pendant 10 min. Un dd 2 ml d'une solution à 5% de BSA dans du PBS (pH 7,4) au mélange et émulsionner doucement à la température ambiante pendant 15 minutes afin de réduire les interférences de fond.
- Centrifuger le mélange à 10.000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant avec un anticorps non conjugué et soigneusement en suspension les culots obtenus dans 4 ml de PBST contenant 1% de BSA et 0,1% de Tween 20, et de répéter la centrifugation et de suspension à plusieurs reprises.
- Suspendre les précipités finaux dans 1 ml de PBST et de le stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.
7. Construction d'Immune Strip
Remarque: La figure 1 montre la conception de la bande immunitaire. Préparer et assembler les bandes dans un laboratoire état environnemental faible humidité (<20% d'humidité relative) pour la durée de conservation prolongée (> 1 an). Les dimensions des plaquettes et de la membrane sont: conjugué pad 300 mm x 10 mm, tampon absorbant 300 mm x 24 mm, pad d'échantillon de 300 mm x 24 mm, NC membrane 300 mm x 25 mm, 300 pasteboardmm x 80 mm.
- Ajouter colloïde solution d'or marqué mAb de l'étape 6.6 avec une micropipette pour saturer le tampon conjugué puis sécher à 37 ° C pendant 1 heure avant l'assemblage.
- Distribuer l'antigène de capture d'anticorps monoclonal (500 pg / d'ml) sur la zone d'essai et de lapin anti-IgG de souris spécifique (500 ug / d'ml) sur la zone de contrôle pour détecter mAb sur la membrane NC en utilisant une pipette ou immunostrip imprimante. Maintenir la distance (> 5 mm) entre les deux zones pour éviter les interférences.
- Coller le tampon conjugué, tampon absorbant et la membrane NC sur le carton avec du ruban adhésif double face.
Remarque: Superposer les plots de chaque côté de la membrane NC d'environ 2 mm. la construction de la bande inappropriée entraînera un test incomplet. - Placez le tampon de l'échantillon sur le tampon conjugué (2 mm) et le coller sur la table de montage.
- Créer de 6 mm de large bandes avec un coupe-papier. Emballer les bandes dans le sachet en feuille d'aluminium avec déshydratant, et les stocker à 4 ° C jusqu'à leur utilisation.
8. La réactivité croisée de test
- Homogénéiser 0,03 g d'échantillon de muscle brut avec 1 ml de PBS (contenant 0,1% de BSA) dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse à l'aide d'un bâton de bambou ou d'une tige de meulage.
- Maintenez la bande par l'extrémité opposée aux zones de test et de tremper la partie du tampon d'échantillon dans l'échantillon pendant 5-10 minutes et observer le résultat directement.
- Facultatif: Collectez 500 ul surnageant et le transférer dans un nouveau tube de centrifugeuse.
Remarque: Cette étape est suggéré si le signal est pas évident lorsque la bande est directement trempé dans le surnageant.
- Facultatif: Collectez 500 ul surnageant et le transférer dans un nouveau tube de centrifugeuse.
- Testez différents échantillons de muscle en triple.
Note: Ici, nous avons testé le thon, le poulet, le phoque, 15 espèces de cétacés et 5 espèces de mammifères terrestres. - Avoir cinq inspecteurs indépendants répètent 8.3 pour cinq fois, à savoir, utiliser 575 bandes au total.
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Representative Results
Caractéristiques des anticorps monoclonaux
Nous avons développé deux IgG 1 mAb (CGF5H9 et CSF1H13) reconnaissant deux peptides synthétiques (MKASEDLKKHGNTVLC et AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivement, de cétacé Mb, et ceux - ci ont été utilisés pour construire un or colloïdal bande de test immunochromatographique de type sandwich pour la détection rapide de Mb cétacé. la figure 2 montre que CGF5H9 détecte cétacés et autres mammifères comme une seule bande colorée à un poids moléculaire prédit de environ 17 kDa. Le petit rorqual commun (Balaenoptera acutorostrata) montre une bande relativement plus faible que les bandes d'autres cétacés. Les bandes sont absents pour le thon, les poulets et les phoques, alors qu'une bande à environ 50 kDa est observée pour les porcs. Bien qu'il existe plusieurs bandes non spécifiques pour les porcs et le thon, CSF1H13 est très spécifique car il ne réagit qu'avec les cétacés et les phoques comme une bande à un poids moléculaire prédit d'environ 17 kDa. Petit rorqual montre seulement un signal fort à 1:10 (données non présentées) sans signal observé à 01h25. La figure 2 montre des résultats identiques en dot blot.
La figure 3A montre que CGF5H9 démontre un signal positif pour les cétacés, les lapins, les chiens, les chèvres et les vaches (valeur de DO> 3.0); faible signal positif pour les porcs (valeur de DO = 1,5); signal négatif pour les phoques, les poulets et le thon. La figure 3B montre que CSF1H13 exprime une forte affinité envers les cétacés et les phoques (valeur de DO> 3.0). Les deux CSF1H13 et CGF5H9 peuvent réagir fortement avec les quatre espèces de cétacés. Ces quatre espèces sont de familles différentes (minke whale: Balaenopteridae; dauphin: Delphinidae; cachalot nain: Kogiidae; marsouin aptère: Phocoenidae), ce qui indique la grande réactivité aux espèces de cétacés diverses.
Pour la construction de la bande, CGF5H9, qui reconnaît til Mbs de cétacés et d'autres mammifères, est colloïde or marqué et utilisé comme anticorps de détection pour lier myoglobine et CSF1H13 est enduit sur la ligne de test uniquement pour capturer les Mbs des cétacés et des phoques. Par conséquent, la ligne de test est conçu pour montrer un signal positif lorsque les deux mAb détectent Mb cétacé. Parce que le Mb à partir d'animaux non-cétacé ne peut être détectée par l'un de ces deux mAb, la ligne de test montre un résultat négatif lorsque les échantillons musculaires provenant d'autres animaux sont testés. La ligne de commande affiche toujours un résultat positif parce lapin anti-IgG de souris se lie colloïde CGF5H9 d'or marqué. Un résultat a échoué dans la ligne de commande indique que la qualité des matériaux sur la bande est pauvre.
Test Strip
La figure 4 montre les bandes de signaux à la fois la ligne d'essai et la ligne de commande lorsque des échantillons de muscles cétacés sont utilisés. Lorsque l'échantillon est pas de cétacés, il n'y a qu'une seule bande à la ligne de commande with l'absence de bande à la ligne d'essai. Un résultat positif peut être observé directement en 5-10 min après homogénéisant 0,03 g de muscle avec 10 ml de PBS contenant 0,1% de BSA en utilisant un bâton en plastique ou en bambou et tremper la bande dans le mélange. Après avoir testé 15 espèces de cétacés et huit espèces non-cétacé en triple exemplaire, la spécificité (le pourcentage d'échantillons non-cétacé correctement identifié) et la sensibilité (le pourcentage d'échantillons de cétacés correctement identifiés) sont à la fois 100%.
Figure 1. Conception de la bande immunitaire. Tous les composants sont soigneusement posés sur la carte en plastique de support de sorte qu'ils se chevauchent. Ceci permet aux réactifs et l'échantillon circulent à travers la membrane et le tampon absorbant. T: zone de test. C: zone de contrôle. Ce chiffre a été reproduit à partir de Lo, C. et al. Bande rapide de l' or colloïdal immunitairepour retenir la viande cétacé commerce illicite et la consommation:. implications pour la conservation et la santé publique PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Analyse par Western blot et dot blot en utilisant les surnageants d'hybridome (A) . CGF5H9, (B) CSF1H13. Les deux surnageants d'hybridome peuvent détecter les cétacés comme une seule bande colorée à un poids moléculaire prédit de environ 17 kDa. MW: petit rorqual, BND: dauphin, DSW: cachalot nain, FP: marsouin aptère, PKW: pygmée épaulard, N: PBS (contrôle négatif). Ce chiffre a été reproduit à partir de Lo, C. et al. Bande d'or rapide immunitaire colloïdal pour cinterdiction de la viande etacean commerce illicite et la consommation:. implications pour la conservation et la santé publique PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 3. ELISA indirect d'extraits musculaires de différentes espèces en utilisant des Acm purifiés. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Seuls les cétacés peuvent produire des signaux positifs forts dans les deux mAb. Ce chiffre a été reproduit à partir de Lo, C. et al bande d'or rapide immunitaire colloïdal pour retenir la viande de cétacés commerce et la consommation illégale:.. Implications pour la conservation et la santé publique PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Spécificité de la bande de l' or colloïdal immunitaire. T: ligne d'essai. C: la ligne de commande. Seulement lorsque des échantillons de muscle cétacé sont utilisés, de bons résultats (bandes de signal à la fois la ligne d'essai et de la ligne de commande) peuvent être observés. (A) d'échantillons non-cétacé: 1: Cow. 2: Goat. 3: Pig. 4: Chien. 5: Rabbit. 6: Tuna. 7: Poulet. 8: joint Harbor (Phoca vitulina). (B) échantillons Cétacés: 1: rorqual commun (Balaenoptera acutorostrata). 2: baleine (Balaenoptera omurai) de Omura. 3: dauphin (Tursiops aduncus). 4: dauphin (T. truncatus). 5: le dauphin de Fraser (Lagenodelphis hosei </ Em>). 6: Indo-Pacifique dauphins à bosse (Sousa chinensis). 7: dauphin (Grampus griseus) Risso. 8: Pantropical dauphin tacheté (Stenella attenuata). 9: Steno Bredanensis (bredanensis Steno). 10: Pygmy épaulard (Feresa attenuata). 11: globicéphale à nageoires courtes (Globicephala macrorhynchus). 12: baleine Melon-tête (Peponocephala electra). 13: Dwarf cachalot (Kogia sima). 14: Cachalot pygmée (K. breviceps). 15: marsouin Finless (Neophocaena phocaenoides). Ce chiffre a été reproduit à partir de Lo, C. et al bande d'or rapide immunitaire colloïdal pour retenir la viande de cétacés commerce et la consommation illégale:.. Implications pour la conservation et la santé publique PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| espèces de cétacés | Les espèces non cétacés |
| Cachalot pygmée (breviceps Kogia) | Joint Harbor (Phoca vitulina) |
| Dwarf cachalot (Kogia sima) | Chien (Canis lupus familiaris) |
| Court-finned globicéphale (Globicephala macrorhynchus) | Lapin (Oryctolagus cuniculus) |
| Baleine Melon-tête (Peponocephala electra) | Pig (Sus scrofa) |
| Pygmy épaulard (Feresa attenuata) | Chèvre (Capra hircus) |
| Pantropical dauphin tacheté (Stenella attenuata) | Bovins (Bos Taurus) |
| Dauphin (Tursiops truncatus) | Poulet (Gallus gallus) |
| Dauphin (Tursiops aduncus) | Albacore (Thunnus albacares) |
| Dauphin de Fraser (Lagenodelphis hosei) | |
| Indo-Pacifique dauphins à bosse (Sousa chinensis) | |
| Steno Bredanensis (bredanensis Steno) | |
| Dauphin de Risso (Grampus griseus) | |
| Marsouin Finless (phocaenoides Neophocaena) | |
| Rorqual commun (Balaenoptera acutorostrata) | |
| La baleine de Omura (Balaenoptera omura i) |
Tableau 1. Les espèces dont le muscle était COLLECTED et testés dans cette étude. Les espèces incluent le thon, le poulet, le phoque, 5 espèces de mammifères terrestres et 15 espèces de cétacés (4 familles).
| Espèce | Adhésion pas. |
| Rorqual commun (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| De Pygmy Bryde de baleine (Balaenoptera edeni) | Q0KIY2 |
| Baleine à bosse (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Baleine grise (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Cachalot (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Cachalot pygmée (breviceps Kogia) | Q0KIY5 |
| Dwarf cachalot (Kogia sima) | P02184 |
| Court-Beaked dauphin commun (Delphinus delphis) | P68276 |
| Globicephala Melas (Globicephala melas) | P02174 |
| Épaulard (Orcinus orca) | P02173 |
| Baleine Melon-tête (Peponocephala electra) | Q0KIY3 |
| Pantropical dauphin tacheté (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Dauphin (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Port marsouin (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Boto (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Baleine à bec de Longman (Indopacetus pacificus) | Q0KIY9 |
| Baleine à bec de Hubbs (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Baleine à bec de Cuvier (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Joint Harbor (Phoca vitulina) | P68080 |
| Bovins (Bos Taurus) | P02192 |
| Chèvre (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Cheval (Equus caballus) | P68082 |
| Pig (Sus scrofa) | P02189 |
| Chien (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Poulet (Gallus gallus) | P02197 |
| Autruche (Struthio camelus) | P85077 |
| Albacore (Thunnus albacares) | P02205 |
Tableau 2. Les séquences de myoglobine utilisées dans cette étude avec les numéros d'accession GenBank respectives. Les espèces incluent le thon,poulet, autruche, mammifères domestiques, le phoque et 18 espèces de cétacés (7 familles). Ce tableau a été reproduit à partir de Lo, C. et al bande d'or rapide immunitaire colloïdal pour retenir la viande de cétacés commerce et la consommation illégale:. Implications pour la conservation et la santé publique PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.
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Discussion
En utilisant un peptide synthétique conjugué à la protéine porteuse est remarquablement plus efficace par rapport à sa protéine apparentée. Pour une technique fondée sandwich, parce que l'anticorps monoclonal est développé en utilisant des épitopes avec des emplacements relatifs connus, les deux mAb dans cette étude ne sont pas susceptibles d'interférer avec l'interaction mutuelle avec l'épitope de l'antigène cible. En outre, la réactivité entre la protéine native et l'anticorps de souris immunisées avec le peptide synthétique conjugué peut être plus forte que la réactivité entre la protéine native et l'anticorps produit à partir de la 19 protéine native. L'utilisation de conjugués de peptides synthétiques est donc recommandé pour les procédures de vaccination efficaces et la génération de mAb anti-peptide approprié.
La structure d'une protéine consiste principalement à la séquence d'acides aminés dans la chaîne polypeptidique. Chaque acide aminé a sa chaîne latérale qui conduit à des propriétés spécifiques et en modifiant légèrement l'extrémité amino-aciséquence d entraîne des modifications de structure. Étant donné que les peptides ayant une longueur de 10-20 acides aminés sont idéales pour la préparation d'anticorps, la longueur des peptides synthétiques (immunogène) dans la région C-terminale a été augmentée pour assurer que la région antigénique noyau serait reconnue. Par conséquent, les résidus d'acides aminés parmi Mbs de divers animaux issus de différentes structures d'épitopes peuvent être efficacement différenciés. Par exemple, la figure 3A montre la conception du peptide mentionné contribue à CGF5H9 réagir fortement avec les cétacés , mais négativement avec les phoques. Un autre exemple est les affinités distinctes envers les poulets et les chiens de CGF5H9 bien que le poulet a une séquence identique à celle du chien dans le site antigénique de base 2. Ceci indique que la différence de séquence dans la région extérieure peut conduire à la modification de la structure et donc variable affinité entre l'antigène et anticorps se liant.
Western blot, dot blot et ELISA indirecte ont été utilisés dansnotre méthode de criblage mAb appropriés. Western blot est largement utilisé pour détecter les protéines spécifiques dans un extrait de tissu ou homogénat. Dans cette technique, l'électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer les protéines dénaturées par la longueur du polypeptide. Par conséquent, il est possible de vérifier si le signal indique que le poids moléculaire de la protéine prédite. Toutefois, le résultat de détection (signal positif ou négatif, forte ou faible) peut ne pas avoir représenté la situation réelle de l'antigène-anticorps se liant parce que les protéines dénaturées sont utilisées. Par conséquent, dot blot peut être utilisé pour le dépistage de deuxième étape. Dot blot est une technique pour détecter les protéines. Elle représente une simplification de la méthode de Western blot. En dot blot, un mélange contenant la molécule à détecter est appliquée directement sur une membrane en un point. Cela diffère d'un Western Blot, car les échantillons de protéines ne sont pas dénaturées. Notez que cette technique offre aucune information sur la taille de la biomolécule cible, et un seul point apparaît si deux molaires organiques de différentes tailles sont détectées. Enfin, le test ELISA indirect est utilisé pour un dosage de liaison de ligand afin de générer un signal qui peut être convenablement quantifiés. Il fournit plus d'informations de caractéristiques mAb et facilite ainsi la construction de la bande.
Les concentrations de Mo dans le muscle sont variables en fonction de l'emplacement de la collection. Par exemple, les muscles de natation (muscles axiaux) chez les cétacés ont une teneur nettement plus élevée de Mo par rapport aux muscles non-natation, et des échantillons de jeunes cétacés auraient concentration Mb plus faible parce que la concentration augmente Mb tout au long de la vie d'un animal 20. Dans un premier temps, CSF1H13, qui ne capte le Mb des cétacés et des phoques, était destiné à être colloïde marqué à l'or et être la détection d'anticorps, et CGF5H9, qui reconnaît le Mb de nombreuses espèces, serait anticorps de capture sur la ligne d'essai. Nous émettons l'hypothèse que l'anticorps de détection doit être plus spécifique et l'anticorps de capture doitêtre plus général. Cependant, un signal positif faible a été trouvé sur la ligne d'essai lorsque des échantillons de cétacés avec de faibles concentrations Mb ont été utilisés (données non présentées). Le problème a été résolu lorsque les positions des deux mAb ont été inversés comme décrit dans les résultats représentatifs. Un bon signal a même été montré pour un cétacé nouveau - né (une baleine de Omura brin) (figure 4). On ne sait pas si les caractéristiques et la concentration des mAb contribuent à ce phénomène.
Dans cette étude, des échantillons de muscle décongelés homogénéisées avec du PBS ont été utilisés sur le test de la bande. D'autres conditions de l'échantillon et les méthodes de préparation peuvent affecter le résultat. Par exemple, la protéine de sel soluble tel que Mo doit être extraite en utilisant PBS plutôt que de l'eau pure. Dans le cas contraire, l'extraction peut être inadéquate, ce qui pourrait conduire à un résultat aberrant. Le tampon d'extraction appropriée: rapport d'échantillonnage de la viande est en partie responsable de l'interprétation réussie du résultat de la bande. Grand amount (0,3 g dans 1 ml de tampon) d'échantillons de contrôle (par exemple, les animaux domestiques) pourrait causer des résultats positifs et arrière - plan flou. Cependant, le rapport utilisé dans cette étude (1: 0,03) a produit des résultats corrects. Seuls les échantillons de muscle frais peuvent être utilisés pour ce test de bande. Protein pourrait être hydrolyse ou dénaturé après certains traitements (tels que le durcissement par la sauce de soja et l'ébullition), ce qui pourrait provoquer des résultats positifs non seulement pour les échantillons de muscle cétacé, mais aussi des échantillons provenant d'autres animaux (données non présentées). Par conséquent, il est suggéré que les sources d'échantillonnage variables et différents plans de conception de construction devraient être utilisés au cours du développement de la bande.
En conclusion, ce protocole décrit le développement de deux mAb fortement réactifs à la Mb des cétacés, et ces mAb sont appliqués sur une bande de test rapide pour différencier le Mb des cétacés de phoques et d'autres animaux. Bien que des analyses d'ADN fiables à base de PCR pour l'identification de la viande de cétacés est disponible 12, il is de travail et de temps. La bande de test rapide est une technique fiable et rapide qui peut être utilisé sur le terrain pour identifier les viandes de cétacés, ce qui est hautement souhaitable pour les organismes de réglementation 21. Il est probable que la bande peut être mis au point pour détecter Mbs spécifiques provenant d'animaux tels que les chevaux et les porcs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
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