Protocol
Ethik - Statement: Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien durchgeführt und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der Nationalen Chiayi University, Zulassung ID: 99022. Die cetacean Probe Verwendung durch den Rat für Landwirtschaft von Taiwan (Research Erlaubnis erlaubt wurde 100M-02.1-C-99).
1. Muskel-Probenvorbereitung und SDS-PAGE
Hinweis: Muskelproben von 23 Arten , darunter 16 Arten von Meeressäugetieren, 5 Arten von Landsäugetieren, Thunfisch und Huhn wurden in dieser Studie (Tabelle 1). Die cetacean Muskelproben wurden aus gestrandeten Personen, Fischerei Beifang und die Einziehung erhalten. Kaninchen, Ratte, Hund und Huhn Muskelgewebe wurden von Animal Disease Diagnostic Center of National Chiayi Universität erhalten. Proben von Rind, Schwein, Lamm und Thunfisch wurden von einem lokalen Supermarkt gekauft. Die Muskelprobe der Seehund (Phoca vitulina
- Speichern Sie alle Proben bei -20 ° C bis zur Verwendung.
- Pre-kühlen Mörtel bei -20 ° C. Dann legte 3 g gefrorene Muskelprobe hinein.
- Homogenisieren der Probe mit 10 ml kaltem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einem Gewebe-Homogenisator.
- Zentrifugieren Sie die homogenisierte Probe bei 10.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie die Überstände und lagern Sie es bei -20 ° C bis zur Verwendung.
- Bereiten 5 ml 5% Sammelgel (3,07 ml destilliertes Wasser, 1,25 ml 4x oberen Gel Puffer von pH 6,8, 625 & mgr; l 40% -iges Acrylamid, 50 ul 10% Ammoniumpersulfat (APS) und 5 ul Tetramethylethylendiamin ( TEMED)) und 10 ml 15% Trenngel (3,65 ml destilliertem Wasser, 2,5 ml 4-fach niedriger Gel Puffer von pH 8,8, 3,75 ml 40% Acrylamid, 100 & mgr; l 10% APS,und 4 & mgr; l TEMED).
- In der Elektrophorese-Zelle, gieße Sammelgel (5% Acrylamid) auf der Oberseite des Trenn Gel (15% Acrylamid), nachdem diese erstarrt ist. Legen Sie eine Gelkamm in Stapel Gel.
- Führen Sie PAGE gemäß den folgenden Bedingungen: Anfangslaufzustand: 100 Volt, 20 min und Endzustand: 120 Volt, 40 min.
- Stain das Gel mit Coomassie-Brilliantblau bei Raumtemperatur für 30 Minuten, bis das Gel in der Farbe gleichmäßig blau ist.
Anmerkung: Die Färbung abgeschlossen ist, wenn das Gel in der Farbstofflösung nicht mehr sichtbar ist. - Entfärben sie mit der Lösung Essigsäure (10%) bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Bands beginnen zu erscheinen. Weiter bei 4 ° C über Nacht Entfärben bis Hintergrund ist klar.
2. Peptid-Synthese und die Produktion monoklonaler Antikörper
- Rufen Sie die Aminosäuresequenzen von Mb von GenBank einschließlich Thunfisch, Huhn, Strauß, Haussäugetiere, Dichtung und 18 Artenvon Walen (Tabelle 2).
- Richten Sie die Sequenzen unter Verwendung geeigneter Software 16:
- Starten Sie den Alignment Explorer , indem Sie das Ausrichten: Bearbeiten / Build Ausrichtung in der Startleiste; wählen Sie Neue Ausrichtung erstellen und klicken Sie auf OK. Es erscheint ein Dialog zu fragen: "Sind Sie mit der Erstellung eines DNA-oder Protein-Ausrichtungs-Sequenz?"
- Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung "Protein"; wählen Sie Daten: Open: Abrufen von Sequenzen aus Datei , und wählen Sie Sequenzdatei; Bearbeiten: Alles Menübefehl Alle Site wählen für jede Folge in den Daten für die Erstellung eines multiplen Sequenz - Alignment - Set auszuwählen.
- Wählen Sie Ausrichtung: Richten von ClustalW aus dem Hauptmenü die ausgewählten Sequenzen Daten unter Verwendung des ClustalW Algorithmus auszurichten; wählen Sie "BLOSUM" als Protein Gewicht Matrix dann auf die Schaltfläche OK klicken.
- Analysieren Sie den Sequenzabgleich:
- Konzentrieren Sie sich auf 5 Antigen-reaktiven sites 17: Seite 1 (AKVEADVA, 15-22), Seite 2 (KASEDLK, 56-62), Seite 3 (ATKHKI, 94-99), Seite 4 (HVLHSRH, 113-119) und Site - 5 (KYKELGY, 145- 151) und das Fragment unter Walen konserviert finden. Ein * (Sternchen; Konsens-Symbol in der Ausrichtung (Protokoll 2.2.3)) gibt an Positionen, die einen einzigen, vollständig konservierten Rest haben. Die folgenden konservierte Fragmente in Walen wurden gefunden: Sequenz KASEDLKKHG und Sequenz HVLHSRHP (die Seite 2 enthält) (einschließlich Standort 4).
- Synthetisieren Kandidatensequenzfragmente nach der Sequenzanalyse und das Konjugat mit einem Protein Ovalbumin (OVA) als Trägerprotein unter Verwendung von kommerziellen Diensten.
- Hinzufügen hydrophoben Aminosäuren (zB Methionin) an das N-terminale antigener reaktiven Stelle zur Verhinderung der Zersetzung von Peptid (zB M-KASEDLKKHG).
- Verlängerung der C-terminalen antigener reaktive Stelle für die Kernantigenstelle an die Immunozyten auszusetzen. Des Weiteren conjuGate das Peptid mit OVA durch einen Cystein - Zugabe (Cys, C) an die C-terminale (zB M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- Emulgieren komplettem Freund'schem Adjuvans für Immunogen 1 oder unvollständiges Freund'sches Adjuvans für Immunogen 2 mit einem gleichen Volumen jedes synthetische Peptid in PBS (3 ml, Endkonzentration von 30-50 & mgr; g / 100 & mgr; l).
- Beimpfen von Immunogen 1 (0,1 mg) subkutan in die jeweils 5 weiblichen BALB / c Mäusen.
- Führen Sie subkutanen Booster-Injektionen fünfmal unter Verwendung von Immunogen 2 in zweiwöchigen Intervallen und sammeln Testseren durch Schwanzclip Probenahme aus den Mäusen vor jedem Booster.
- Bestimmen Sie sera Titer für das erste Screening.
- Man löst 100 & mgr; g freies Peptid in 25 ml Reaktionspuffer und 50 & mgr; l Aliquot der Lösung in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen. In 10 ul Kupplungsreagenz Lösung in jede Vertiefung und die Platte mischen. Inkubiere die Platte für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Inhalt des Brunnens,Waschen jeder Vertiefung 3 mal mit destilliertem Wasser, und blockieren die Platte durch Zugabe von 200 ul Lösung blockiert. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Inhalt und waschen jeder Vertiefung 3 mal mit destilliertem Wasser.
- Führen indirekte ELISA (Protokoll 5,1-5,7) für sera Titer für das erste Screening zu bestimmen. Wählen Sie die Maus mit dem höchsten Titer (höchste optische Dichte) für Milz Sammlung.
- Drei Tage vor der Milz Sammlung, impfen 0,1 mg Immunogen 1 subkutan in die Maus, um den höchsten Titer präsentiert.
- Sammle die Milzzellen aus den immunisierten Mäusen ausgewählt und verschmelzen mit murinen Myelomzellen F0 (sp2 / 0-Ag14) Hybridom - Zellen für die Erzeugung mAb 18 zu erhalten.
- 14 Tage nach der Fusion, wählen Sie die positiven Klone durch die Reaktivität von Hybridomaüberständen Screening gegenüber freien synthetisches Peptid mit der indirekten ELISA (Protokoll 5,1-5,7).
- Verdünne die Zellen zu einer entsprechenden Anzahl pro Vertiefung für maximizing der Anteil an Vertiefungen, die nur einen einzigen Klon (Verdünnungsklonierung) enthalten.
- 100 l Zellkulturmedium zu allen Vertiefungen in der 96-Well-Platte mit Ausnahme gut A1, die leer gelassen wird.
- In 200 ul der Zellsuspension zu gut A1. Dann Transfer schnell 100 ul von A1 bis B1 und mischen durch vorsichtiges Pipettieren. Wiederholen Sie diese 1: 2-Verdünnungen nach unten die gesamte Spalte, und dann wurden 100 & mgr; l von H1 zu verwerfen, so dass es mit dem gleichen Volumen wie die Vertiefungen darüber endet.
- Fügen Sie weitere 100 ul Medium zu Säule 1 mit einer 8-Kanal Mikropipette. Dann Transfer schnell 100 & mgr; l aus jeder der Vertiefungen in Spalte 1 zu den in Spalte 2 die gleiche Pipette und mischen durch vorsichtiges Pipettieren.
- Mit den gleichen Spitzen, wiederholen Sie diese 1: 2-Verdünnungen über die gesamte Platte. Verwerfen 100 ul aus jeder der Vertiefungen in der letzten Spalte.
- Bringt den Endvolumen von allen Vertiefungen zu 200 & mgr; l durch Zugabe von 100 & mgr; l Medium zu jeder Vertiefung. inkubieren plate ungestört bei 37 ° C in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator.
- Überprüfen Sie jede gut und markieren Sie alle Brunnen, die nur eine einzige Kolonie enthalten. Führen Sie zwei oder mehr Klonierungen bis> 90% der Vertiefungen, die einzelne Klone positiv sind für die Antikörperproduktion.
- Bildschirm, um die Klone durch Western-Blot und Dot-Blot (Protokoll 3,1-4,6). Dann Subkultur Kolonien aus den Vertiefungen in größere Gefäße Zellen zur Gewinnung von mAb zu erweitern. Normalerweise jeder Klon in einem einzigen gut übertragen in einem 12- oder 24-Well-Platte.
- Messen Sie die Affinität zwischen den mAb und den Muskelextrakten von Kuh, Ziege, Schwein, Hund, Kaninchen, Thunfisch, Huhn, Dichtung und vier repräsentative Walarten durch Western-Blot und Dot-Blot (Protokoll 3,1-4,6).
- Beimpfen ausgewählten Hybridomzellen (bis zu 3 x 10 6) intraperitoneal in Mäuse - Aszites zu induzieren. Abdominal Schwellung ist in der Regel offensichtlich innerhalb von 7-10 Tagen Hybridom Injektion. Sammeln Flüssigkeit mit einer Injektionsnadel mit(Weniger als 20 gauge).
- Zentrifuge Aszitesflüssigkeit (10.000 xg für 10 min) Zellen und Trümmer zu entfernen. Man filtriert durch ein 0,45 um-Filter. Hinzufügen von 1 zu 20 ml der Probe, 15 ml Bindungspuffer, und 3 bis 5 ml Elutionspuffer in das Protein G-Sepharose-Säule. Sammeln Sie die Elutionsfraktion enthält gereinigter Antikörper aus den Mäusen Ascites-Flüssigkeit.
- Bestimmen Sie den Antikörperisotyp durch Antikörper Isotypisierungskits der Verwendung der Herstelleranweisungen.
3. Western Blot
- Bereiten 2x Beladungspuffer, enthaltend β-Mercaptoethanol (BME), indem sie mit 50 ul BME 950 ul 2x Laemmli Probenpuffer vermischt werden. Verdünnen Sie die Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in Ladepuffer mit geeigneten Verhältnis zum Erhalt gute Signale: 1:50 (Walen und Dichtung) und 1: 5 (Haustieren und Thunfisch), wenn polyklonalen Kaninchen-Anti-Human-Mb Antikörper verwendet, und 1: 1 (Schwein, Kaninchen, Huhn und Thunfisch), 1: 5 (Kuh, Ziege und Hund) und 01.25 (Walen und Dichtung), wenn einntibody ist aus Hybridom-Überstand.
- Wärme Probe bei 95 ° C für 5 min. Last Proben in die Vertiefungen von SDS-PAGE-Gel (4% Acrylamid Stapelung und 12% Acrylamid Trenn) zusammen mit Molekulargewichtsmarkern. Führen Sie das Gel für 5 min bei 50 V erhöhen Sie die Spannung bis 150 V, um den Lauf in etwa 1 Stunde zu beenden.
- Legen Sie das Gel in 1x Transferpuffer für 15 min. Transfer des abgetrennten Protein auf Nitrocellulose (NC) -Membranen, nachdem sie durch PAGE getrennt. Transfer kann bei 100 V für 60 bis 90 min durchgeführt werden.
- Bereiten Blockierungslösung: 1x PBS, enthaltend 0,1% Tween 20 mit 5% fettfreier Trockenmilch. Blockieren die NC-Membran in 25 ml für 1 Stunde Lösung bei Raumtemperatur blockiert. Waschen dreimal 5 min mit je 15 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST).
- Inkubieren der Membran und primärem Antikörper (Aszites-Flüssigkeit oder Hybridom-Überstand) in 10 ml Antikörperverdünnungspuffer über Nacht bei 4 ° C mit 5% Blockierungslösung verdünnt.
- Waschen Sie die Membrane dreimal wieder mit PBST übermäßige Antikörper zu reinigen.
- Inkubieren der Membran mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG bei 1: 1250 in Blockierlösung unter leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen der Membran wieder und inkubieren es in der 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat / p-Nitroblautetrazoliumchlorid (BCIP / NBT) Phosphatase-Substratmischung für 10 bis 20 min, bis die Farbentwicklung.
- Die Reaktion durch die Membran in mehrere Änderungen von destilliertem Wasser zu waschen.
4. Dot Blot
- Verdünnen Sie die Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST mit geeigneten Verhältnis zum Erhalt gute Signale: 1: 5 für Haustiere und Thunfisch und 01.25 für Walen und Dichtung. Spot 5 & mgr; l Proben auf Membran. Minimieren Sie den Bereich, dass die Lösung (in der Regel 3-4 mm Durchmesser) dringt durch sie langsam Anwendung.
- Trocknen der Membran bei Raumtemperatur (zB </ Em> in einer laminaren Strömung für 30-60 min), blockieren Lösung in Petrischale für 1 Stunde bei Raumtemperatur, und waschen Sie es mit PBST mit blockieren.
- Inkubieren der Membran mit primärem Antikörper (mAb aus Hybridom-Überstand bei 1: 10.000 oder Aszitesflüssigkeit bei 1: 100.000 in 5% Blockierungslösung verdünnt) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Verwendung PBST die Membran dreimal 5 min jeweils zu waschen überschüssigen Antikörper zu entfernen, und dann (anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-konjugiertem Ziege auf 1: 1.250 in 5% Blockierungslösung) mit sekundärem Antikörper inkubiert für 1 Stunde bei Raumtemperatur .
- Waschen der Membran wieder und inkubiere in der BCIP / NBT-Phosphatase-Substratmischung innerhalb 10 bis 20 min, bis die Farbentwicklung.
- Die Reaktion durch die Membran in mehrere Änderungen von destilliertem Wasser zu waschen.
5. Indirekte ELISA
- Bereiten Waschpuffer (0,002 M Imidazol-gepufferte Salzlösung mit 0,02% Tween 20). Waschen Sie die Platte 3-mal mit WaschPuffer zwischen jedem folgenden Schritt (Protokoll 5,2-5,5).
- Bereiten 01.25 Verdünnung von Muskelüberstand (Protokoll 1,1-1,4) in Beschichtungspuffer. Mantel eine 96-Well-ELISA-Platte mit 100 & mgr; l verdünnte Überstand bei 4 ° C über Nacht und Blockieren mit Blockierungspuffer (1% BSA in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 1: 2000 Verdünnung des gereinigten mAb mit verdünnter Puffer und fügen 100 ul verdünnt mAb in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Hinzufügen anti-Maus-Ziegen-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (1: 200-Verdünnung in Puffer verdünnt) für die weitere Inkubation.
- In Peroxidase Substrat in jede Vertiefung (100 ul / Vertiefung) und Inkubation für 10-15 min.
- Stoppen Sie die Enzymreaktion durch die Peroxidase-Stop-Lösung (100 ul / Vertiefung), wenn die Farbentwicklung zu beobachten ist.
- Lesen Sie die optische Dichte bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Spektralphotometer.
6. Herstellung von kolloidalem Gold markiertem mAb Hinweis: Die Farbe der kolloidalen Goldlösung, und die Mischung sollte immer rot sein. Der pH-Wert, Konzentration von mAb, Zentrifugengeschwindigkeit, wenn schwarzer Niederschlag bemerkt wird. Die Schritte 6.1 und 6.2 sind Optimierungsschritte.
- Hinzufügen gereinigter Erfassungs mAb (50 ug / ml, 3 & mgr; l) zu 100 & mgr; l von kolloidalen Goldlösung mit pH-Werten von 5 bis 9 variierende. Die minimale pH-Wert, die Farbe Rot zwei Stunden lang hält, ist als der optimale pH-Wert betrachtet. Hinweis: In dieser Studie wurden 0,1 M Kaliumcarbonat verwendet wurde Kolloidgold einzustellen (40 nm) Lösung pH 8.0 (pH-Optimum).
- Fügen verschiedene Menge an gereinigtem mAb Erfassen (500 ug / ml, 1-20 ul) zu 100 ul von kolloidalen Goldlösung bei pH 8,0. Anmerkung: Die optimale Konzentration in dieser Studie beträgt 6 & mgr; g / ml (kein schwarzer Niederschlag).
- Nach den obigen Ergebnissen, mit 60 ug gereinigtem Nachweis mAb tropfenweise zu 10 ml Kolloid Goldlösung. Emulgieren der Mischung vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 min. Anzeiged 2 ml 5% BSA-Lösung in PBS (pH 7,4) zu dem Gemisch gegeben und für 15 min bei Raumtemperatur leicht emulgieren, um Hintergrundstörungen zu reduzieren.
- Zentrifugieren der Mischung bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand mit nicht-konjugierten Antikörper sorgfältig und setzt die resultierenden Pellets in 4 ml PBST mit 1% BSA und 0,1% Tween 20, und wiederholen Zentrifugation und Suspension mehrere Male.
- Suspend die letzten Niederschläge in 1 ml PBST und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
7. Konstruktion von Immun-Streifen
Hinweis: Abbildung 1 zeigt die Immunstreifendesign. Bereiten Sie und die Streifen in einer feuchtigkeitsarmen Laborumgebungsbedingungen (<20% relative Luftfeuchtigkeit) für eine längere Haltbarkeit (> 1 Jahr) montieren. Die Abmessungen des Pads und Membran sind: Konjugat-Pad 300 mm x 10 mm, absorbierendes Kissen 300 mm x 24 mm, Probenkissen 300 mm x 24 mm, NC-Membran 300 mm x 25 mm, Pappe 300mm x 80 mm.
- Hinzufügen Kolloidgold-markiertem mAb-Lösung aus Schritt 6.6 mit einer Mikropipette, die das Konjugat-Pad zu sättigen und dann für 1 h bei 37 ° C Trocknen vor der Montage.
- Verteilen das spezifische Antigen-Einfangen mAb (500 ug / ml) auf die Testzone und Kaninchen-anti-Maus-IgG (500 & mgr; g / ml) auf der Steuerzone mAb auf der NC-Membran mit einer Pipette oder immunostrip Drucker zu erfassen. Pflegen Abstand (> 5 mm) zwischen den beiden Zonen Interferenzen zu vermeiden.
- Fügen Sie das konjugierte Polster, absorbierende Kissen und NC-Membran auf der Montagefläche mit doppelseitigem Klebeband.
Hinweis: overlap die Pads auf jeder Seite der NC-Membran um ca. 2 mm. Unangemessen Streifen Konstruktion wird in einer unvollständigen Prüfung zur Folge haben. - Legen Sie das Probenkissen über das Konjugat-Pad (2 mm) und fügen Sie ihn auf der Montagefläche.
- Erstellen Sie 6 mm breiten Streifen mit einem Papierschneider. Packen Sie die Streifen in der Aluminiumfolienbeutel mit Trockenmittel, und lagern Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung.
8. Kreuzreaktivität-Test
- Homogenisieren 0,03 g der rohen Muskelprobe mit 1 ml PBS (enthaltend 0,1% BSA) in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen einen Bambusstab verwendet oder Stangenschleifen.
- Halten Sie den Streifen am Ende gegenüber den Testbereichen und tauchen Sie das Probenkissen Teil in die Probe für 5-10 Minuten und das Ergebnis direkt zu beobachten.
- Optional: Sammeln Sie 500 ul Überstand und überträgt es auf ein neues Zentrifugenröhrchen.
Anmerkung: Dieser Schritt wird vorgeschlagen, wenn das Signal nicht offensichtlich ist, wenn das Band direkt in den Überstand getränkt ist.
- Optional: Sammeln Sie 500 ul Überstand und überträgt es auf ein neues Zentrifugenröhrchen.
- Testen Sie verschiedene Muskelproben in dreifacher Ausfertigung.
Hinweis: Hier haben wir getestet Thunfisch, Huhn, Siegel, 15 Arten von Walen und 5 Arten von Landsäugetieren. - Haben fünf unabhängige Inspektoren 8.3 für fünfmal wiederholen, das heißt, verwenden Sie 575 Streifen insgesamt.
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Representative Results
Monoklonaler Antikörper Merkmale
Wir entwickelten zwei IgG - 1 - mAb (CGF5H9 und CSF1H13) die Anerkennung von zwei synthetischen Peptiden (MKASEDLKKHGNTVLC und AIIHVLHSRHPAEFGC) jeweils von cetacean Mb, und diese wurden verwendet , um ein Sandwich-Typ mit kolloidalem Gold immunochromatographic Teststreifen für die schnelle Detektion von Walen Mb zu konstruieren. 2 zeigt , dass CGF5H9 erkennt Walen und anderen Säugetieren als einzelne gefärbte Bande bei einem vorhergesagten Molekulargewicht von annähernd 17 kDa. Der Zwergwal (Balaenoptera acutorostrata) zeigt eine vergleichsweise schwächere Bande als die Bands von anderen Walen. Bands fehlen für Thunfisch, Hühner und Dichtungen, während eine Bande bei etwa 50 kDa bei Schweinen beobachtet wird. Zwar gibt es mehrere nicht-spezifische Banden für Schweine und Thunfisch sind, ist CSF1H13 sehr spezifisch, da sie nur mit Walen und Robben als Band bei einem vorhergesagten Molekulargewicht von annähernd 17 k reagiertDa. Zwergwal nur ein starkes Signal bei 01.10 (Daten nicht gezeigt) zeigt kein Signal , um 1:25 beobachtet. Abbildung 2 identische Ergebnisse in Dot - Blot zeigt.
3A zeigt , dass CGF5H9 zeigt positives Signal für Walen, Kaninchen, Hunde, Ziegen und Kühe (OD - Wert> 3,0); schwach positives Signal für Schweine (OD-Wert = 1,5); negatives Signal für Dichtungen, Hühner und Thunfisch. 3B zeigt , dass CSF1H13 hohe Affinität zu Walen und Robben (OD - Wert> 3,0) zum Ausdruck bringt. Sowohl CSF1H13 und CGF5H9 kann mit allen vier Walarten stark reagieren. Diese vier Arten sind aus verschiedenen Familien (Zwergwal: Balaenopteridae; Tümmler: Delphinidae; Kleiner Pottwal: Kogiidae; Kleinwals: Phocoenidae), was auf die breite Reaktivität zu unterschiedlichen Walarten.
Für Streifenkonstruktion, CGF5H9, die erkennt ter Mbs von Walen und anderen Säugetieren ist Kolloid Gold-markierte und als Nachweis-Antikörper verwendet Myoglobin zu binden und CSF1H13 wird auf der Testlinie beschichtet nur die Mbs von Walen und Robben zu erfassen. Deshalb ist die Testlinie ein positives Signal zu zeigen, entwickelt, wenn beide mAbs cetacean Mb erkennen. Da die Mb aus Nicht-cetacean Tiere können nur von einer dieser beiden mAb erkannt werden, zeigt die Testlinie ein negatives Ergebnis, wenn Muskelproben von anderen Tieren getestet werden. Die Steuerleitung zeigt immer ein positives Ergebnis, da Kaninchen-anti-Maus-IgG bindet Kolloidgold-markiertem CGF5H9. Ein ausgefallenes Ergebnis in der Steuerleitung zeigt an, dass die Qualität der Materialien auf dem Streifen schlecht ist.
Streifentest
Abbildung 4 zeigt die Signalbänder an beiden Testlinie und Kontrolllinie , wenn cetacean Muskelproben verwendet werden. Wenn die Probe nicht von Walen ist, gibt es nur eine einzelne Bande bei der Steuerleitung with das Fehlen der Bande bei der Testlinie. Ein erfolgreiches Ergebnis kann direkt mit 10 ml PBS, enthaltend 0,1% BSA mit einem Kunststoff oder Bambusstab und Einweichen des Streifens in der Mischung nach Homogenisierung 0,03 g Muskel in 5-10 min zu beobachten. Nach der Prüfung 15 Walarten und acht nicht Walarten in dreifacher Ausfertigung, Spezifität (der Anteil der Nicht-cetacean Proben korrekt identifiziert) und Empfindlichkeit (der Prozentsatz der cetacean Proben korrekt identifiziert) beide 100%.
Abbildung 1. Aufbau des Immunsystems Streifen. Alle Komponenten sind sorgfältig auf die Kunststoffträgerkarte geschichtet , so dass sie sich überlappen. Dies ermöglicht es die Reagenzien und Probe durch die Membran fließen und zu dem absorbierenden Kissen. T: Testzone. C: Kontrollzone. Diese Zahl wurde von Lo, C. et al. Rasche Immun kolloidalem Gold Streifen reproduziertfür cetacean Fleisch Halte illegalen Handel und Konsum. Auswirkungen auf die Erhaltung und die öffentliche Gesundheit PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Western Blot und Dot - Blot - Analyse unter Verwendung der Hybridomaüberständen. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Beide Hybridomaüberständen können an einem vorhergesagten Molekulargewicht von annähernd 17 kDa Walen als einzelne gefärbte Bande erkennen. MW: Zwergwal, BND: Tümmler, DSW: Kleiner Pottwal, FP: Kleinwals, PKW: Zwerggrindwal, N: PBS (Negativkontrolle). Diese Zahl wurde von Lo, C. et al. Rasche Immun kolloidalem Gold Streifen für c reproduziertetacean Fleisch Halte illegalen Handel und Konsum. Auswirkungen auf die Erhaltung und die öffentliche Gesundheit PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Indirekter ELISA von Muskelextrakten verschiedener Arten unter Verwendung von gereinigten mAbs. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Nur Walen können starke positive Signale in beiden mAb produzieren. .. Auswirkungen auf die Erhaltung und die öffentliche Gesundheit PLoS ONE 8, e60704 (2013): Diese Zahl wurde von Lo, C. et al Rapid - Immun mit kolloidalem Gold Streifen für cetacean Fleisch Halte illegalen Handel und Konsum reproduziert. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Spezifität der Immun kolloidalem Gold Streifen T:. Testlinie. C: Steuerleitung. Nur wenn cetacean Muskelproben verwendet werden, erfolgreiche Ergebnisse (Signalbänder an beiden Testleitung und Steuerleitung) beobachtet werden kann. (A) Nicht-cetacean Proben: 1: Kuh. 2: Ziege. 3: Schwein. 4: Hund. 5: Kaninchen. 6: Thunfisch. 7: Huhn. 8: Seehund (Phoca vitulina). (B) Cetacean Proben: 1: Zwergwal (Balaenoptera acutorostrata). 2: Omurawal (Balaenoptera omurai). 3: Tümmler (Tursiops aduncus). 4: Tümmler (T. truncatus). 5: Frasers Delphin (Lagenodelphis hosei </ Em>). 6: Indo-Pacific Buckel Delfin (Sousa chinensis). 7: Rundkopfdelfin (Grampus griseus). 8: Schlankdelfin (Stenella attenuata). 9: Rauzahndelfin (Steno bredanensis). 10: Zwerggrindwal (Feresa attenuata). 11: Kurzflossen-Grindwal (Globicephala macrorhynchus). 12: Melon köpfiger Wal (Peponocephala electra). 13: Dwarf Pottwal (Kogia sima). 14: Pygmy Pottwal (K. breviceps). 15: Kleinwals (Neophocaena phocaenoides). .. Auswirkungen auf die Erhaltung und die öffentliche Gesundheit PLoS ONE 8, e60704 (2013): Diese Zahl wurde von Lo, C. et al Rapid - Immun mit kolloidalem Gold Streifen für cetacean Fleisch Halte illegalen Handel und Konsum reproduziert. doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 Bitte klicken hier , um eine größere Version dieser Figur.
| Walarten | Nicht Walarten |
| Pygmy Pottwal (Kogia breviceps) | Seehund (Phoca vitulina) |
| Dwarf Pottwal (Kogia sima) | Hund (Canis lupus familiaris) |
| Kurzflossen-Grindwal (Globicephala macrorhynchus) | Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) |
| Melon köpfiger Wal (Peponocephala electra) | Schwein (Sus scrofa) |
| Zwerggrindwal (Feresa attenuata) | Ziege (Capra hircus) |
| Schlankdelfin (Stenella attenuata) | Rinder (Bos taurus) |
| Tümmler (Tursiops truncatus) | Huhn (Gallus gallus) |
| Tümmler (Tursiops aduncus) | Yellowfin Thunfisch (Thunnus albacares) |
| Frasers Delphin (Lagenodelphis hosei) | |
| Indo-Pacific Buckel Delfin (Sousa chinensis) | |
| Rauzahndelfin (Steno bredanensis) | |
| Rundkopfdelfin (Grampus griseus) | |
| Kleinwals (Neophocaena phocaenoides) | |
| Zwergwal (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Omurawal (Balaenoptera omura i) |
Tabelle 1. Die Art , von der Muskel war collected und in dieser Studie getestet. Spezies gehören Thunfisch, Huhn, Dichtung, 5 Arten von Landsäugetieren, und 15 Arten von Walen (4 Familien).
| Spezies | Beitritt nicht. |
| Zwergwal (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Pygmy Brydewal (Balaenoptera edeni) | Q0KIY2 |
| Buckelwal (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Grauwal (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Pottwal (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Pygmy Pottwal (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| Dwarf Pottwal (Kogia sima) | P02184 |
| Kurz beaked Gemeine Delfin (Delphinus delphis) | P68276 |
| Grindwal (Globicephala melas) | P02174 |
| Schwertwal (Orcinus orca) | P02173 |
| Melon köpfiger Wal (Peponocephala electra) | Q0KIY3 |
| Schlankdelfin (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| Tümmler (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Schweinswal (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Amazonasdelfin (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Longman Schnabelwal (Indopacetus pacificus) | Q0KIY9 |
| Hubbs-Schnabelwal (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Cuvier-Schnabelwal (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Seehund (Phoca vitulina) | P68080 |
| Rinder (Bos taurus) | P02192 |
| Ziege (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| Pferd (Equus caballus) | P68082 |
| Schwein (Sus scrofa) | P02189 |
| Hund (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Huhn (Gallus gallus) | P02197 |
| Strauß (Struthio Camelus) | P85077 |
| Yellowfin Thunfisch (Thunnus albacares) | P02205 |
Tabelle 2. Myoglobin - Sequenzen in dieser Studie mit entsprechenden GenBank - Zugangsnummern verwendet. Spezies gehören Thunfisch,Huhn, Strauß, Haussäugetiere, Dichtung und 18 Arten von Walen (7 Familien). . Auswirkungen auf die Erhaltung und die öffentliche Gesundheit PLoS ONE 8, e60704 (2013). Diese Tabelle wurde von Lo, C. et al Rapid - Immun mit kolloidalem Gold Streifen für cetacean Fleisch Halte illegalen Handel und Konsum reproduziert. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.
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Discussion
ein synthetisches Peptid zu Trägerprotein konjugiert unter Verwendung bemerkenswert effektiver im Vergleich zu sein verwandtes Protein. Für ein Sandwich-basierte Technik, weil der mAb unter Verwendung von Epitopen mit bekannten relativen Stellen entwickelt wird, die beiden mAbs in dieser Studie sind nicht geeignet, mit dem jeweils anderen Wechselwirkung mit dem Zielantigen-Epitop zu interferieren. Außerdem kann stärker als die Reaktivität zwischen dem nativen Protein sein , die Reaktivität zwischen dem nativen Protein und dem Antikörper von Mäusen , die mit dem synthetischen Peptid-Konjugat immunisiert und den Antikörper aus dem nativen Protein produziert 19. Die Verwendung von synthetischen Peptid-Konjugate ist daher für eine wirksame Immunisierungsverfahren und der Erzeugung von geeigneten Anti-Peptid-mAb empfohlen.
Die Struktur eines Proteins beinhaltet im Wesentlichen die Sequenz der Aminosäuren in der Polypeptidkette. Jede Aminosäure hat seine Seitenkette zu spezifischen Eigenschaften führt und leicht verändern die Amino-acid Sequenz führt zu Strukturänderungen. Da Peptide mit einer Länge von 10-20 Aminosäuren ideal für die Antikörperpräparation sind, wurde die Länge der synthetischen Peptide (Immunogen) an der C-terminalen Region zu gewährleisten, erhöht wird, dass der Kern antigenische Region würde erkannt werden. Daher werden die Aminosäurereste unter Mbs verschiedener Tiere was zu unterschiedlichen Epitop-Strukturen konnte effizient unterschieden. Zum Beispiel zeigt 3A das genannte Peptid - Design trägt zur CGF5H9 stark mit Walen reagieren aber negativ mit Dichtungen. Ein weiteres Beispiel ist die unterschiedliche Affinitäten zu Hühnern und Hunden CGF5H9 obwohl das Huhn eine identische Sequenz zu der des Hundes im Kernantigenstelle hat 2. Dies zeigt, dass die Sequenzunterschied in dem äußeren Bereich der Struktur Änderung führen könnte und damit variable Bindungsaffinität zwischen Antigen und Antikörper.
Western-Blot, Dot-Blot und indirekten ELISA wurden verwendet inunser Verfahren für geeignete mAb Screening. Western-Blot ist weithin zu erkennen, spezifische Proteine in Gewebeextrakt oder Homogenat verwendet. In dieser Technik wird der Gelelektrophorese verwendet denaturierten Proteine durch die Länge des Polypeptids zu trennen. Daher ist es möglich, zu bestätigen, ob das Signal des vorhergesagten Protein-Molekulargewicht anzeigt. Doch das Erfassungsergebnis (positiv oder negativ, stark oder schwach Signal) möglicherweise nicht die tatsächliche Situation der Antigen-Antikörper-Bindung repräsentiert, weil denaturierte Proteine verwendet werden. Folglich kann Dot-Blot für die zweite Stufe Screening verwendet werden. Dot-Blot ist eine Technik zur Detektion von Proteinen. Es stellt eine Vereinfachung der Western-Blot-Verfahren. In Dot-Blot wurde eine Mischung, die das Molekül enthält, wird zu detektierenden direkt auf einer Membran als Punkt aufgetragen. Dies unterscheidet sich von einem Western-Blot, weil Proteinproben nicht denaturiert werden. Beachten Sie, dass diese Technik auf der Größe des Ziel-Biomolekül keine Information bietet, und ein einzelner Punkt, wenn zwei mo erscheintlen mit unterschiedlicher Größe erfaßt. Schließlich wird indirekten ELISA für einen Liganden-Bindungsassay verwendet, um ein Signal zu erzeugen, die richtig quantifiziert werden kann. Es bietet mehr Informationen von mAb Eigenschaften und erleichtert dadurch den Streifen Aufbau.
Die Konzentrationen von Mb im Muskel sind variabel in Abhängigkeit von der Sammelstelle. Zum Beispiel Schwimmen Muskeln (axiale Muskeln) in Walen haben einen deutlich höheren Gehalt an Mb im Vergleich zu nicht-Schwimmen Muskeln und Proben von jungen Walen haben würden niedrigere Mb Konzentration , weil die Mb - Konzentration steigt während ihrer gesamten Lebensdauer des Tieres 20. Anfänglich CSF1H13, der nur die Mb von Walen und Dichtungen erfasst wurde bestimmt Kolloidgold-markiertem zu sein, und Antikörper sein Detektieren und CGF5H9, die die Mb vieler Arten erkennt, würde Einfang-Antikörper auf der Testlinie sein. Wir vermuten, dass der Nachweis-Antikörper spezifischer sein sollte und der Capture-Antikörper solltesein allgemeiner. Es wurde jedoch ein schwaches positives Signal auf der Testlinie gefunden, wenn cetacean Proben mit niedrigen Mb Konzentrationen verwendet wurden (Daten nicht gezeigt). Das Problem gelöst wurde, als die Positionen der beiden mAbs umgekehrt wurden, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. Ein gutes Signal wurde auch für ein neugeborenes cetacean (a stranded Omurawal) (Abbildung 4). Es ist unklar, ob die Merkmale und die Konzentration von mAbs zu diesem Phänomen beitragen.
In dieser Studie wurden auf dem Teststreifen aufgetauten Muskelproben homogenisiert mit PBS verwendet. Andere Probenbedingungen und Herstellungsverfahren kann das Ergebnis beeinflussen. Zum Beispiel Salz-lösliches Protein wie Mb sollte PBS extrahiert werden unter Verwendung anstelle von reinem Wasser. Anderenfalls kann die Extraktion unzureichend sein, was zu einer abweichenden Ergebnis führen könnten. Der entsprechende Extraktionspuffer: Fleischprobe Verhältnis ist zum Teil verantwortlich für die erfolgreiche Interpretation des Streifens Ergebnis. Große amount (0,3 g in 1 ml Puffer) von Kontrollproben (zB Haustieren) konnten positive Ergebnis und unscharfen Hintergrund verursachen. Jedoch verwendet das Verhältnis in dieser Studie (1: 0,03) hergestellt korrekte Ergebnisse. Nur frische Muskelproben können für diesen Teststreifen verwendet werden. Protein kann nach bestimmten Behandlungen hydrolysiert oder denaturiert werden (wie zum Beispiel durch Aushärten Sojasoße und Sieden), die positive Ergebnisse verursachen könnte nicht nur für cetacean Muskelproben, aber auch Proben von anderen Tieren (Daten nicht gezeigt). Daher wird vorgeschlagen, dass die variable Quellen und andere Konstruktion Konstruktionspläne sollten während der Streifenentwicklung verwendet werden.
Abschließend beschreibt dieses Protokoll die Entwicklung von zwei mAbs stark reaktiv auf die Mb von Walen, und diese mAbs auf einem schnellen Teststreifen aufgebracht, die Mb von Walen aus Dichtung und anderen Tieren zu unterscheiden. Obwohl zuverlässige PCR-basierten DNA - Analyse zur Identifizierung von cetacean Fleisch 12 vorhanden, es is arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Die Schnellteststreifen ist eine zuverlässige und schnelle Technik , die auf dem Gebiet verwendet werden können cetacean Fleisch zu identifizieren, die für die Regulierungsbehörden 21 höchst wünschenswert ist. Es ist wahrscheinlich, dass der Streifen für den Nachweis spezifischer Mbs von Tieren wie Pferden oder Schweinen entwickelt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
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