Protocol
משפט ואתיקה: המחקר בוצע בהתאם להנחיות בינלאומיות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש (IACUC) של לאום Chiayi אונ' מזהה אישור: 99022. שימוש מדגם cetacean הותר על ידי מועצת החקלאות של טייוואן (הרשאת מחקר 100M-02.1-C-99).
1. הכנת שרירים לדוגמא SDS-PAGE
הערה: דגימות שריר מ -23 מינים, כולל 16 מינים של יונקים ימיים, 5 מינים של יונקים יבשתיים, טונה עוף שימשו במחקר זה (טבלה 1). דגימות שריר cetacean התקבלו מיחידים מפותלים bycatch דוגה, והחרמה. שפן, חולדה, כלב, ורקמות השריר עוף התקבלו מרכז לאבחון מחלות בעלי חיים של לאומי Chiayi האוניברסיטה. דוגמאות של בשר בקר, חזיר, כבש, וטונה נרכשו מסופרמרקט מקומי. מדגם השרירים של חותם נמל (Phoca vitulina
- אחסן את כל דגימות ב -20 ° C עד השימוש.
- טרום מגניב מרגמה ב -20 ° C. ואז לשים 3 גרם של מדגם שרירים קפוא לתוכו.
- Homogenize המדגם עם 10 מ"ל של בופר פוספט מגניב (PBS) באמצעות homogenizer רקמות.
- צנטריפוגה מדגם הומוגני ב XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 °. אסוף את supernatants ולאחסן אותו ב -20 ° C עד השימוש.
- הכן 5 מ"ל של 5% לערום ג'ל (3.07 מ"ל של מים מזוקקים, 1.25 מ"ל של חיץ ג'ל העליון 4x של pH 6.8, 625 μl של acrylamide 40%, 50 μl של persulfate אמוניום 10% (APS), ו -5 μl של tetramethylethylenediamine ( TEMED)) ו -10 מ"ל של ג'ל המפריד 15% (3.65 מ"ל של מים מזוקקים, 2.5 מ"ל של 4x חיץ ג'ל נמוך של 8.8 pH, 3.75 מ"ל של acrylamide 40%, 100 μl של APS 10%,ו -4 μl של TEMED).
- בתא אלקטרופורזה, יוצקים לערום ג'ל (acrylamide 5%) על גבי הג'ל הפרדה (acrylamide 15%), לאחר שזו התגבשה. הכנס מסרק ג'ל הג'ל הערימה.
- בצע עמוד פי התנאים הבאים: מצב הריצה הראשונית: 100 וולט, 20 דקות ו מצב סופי: 120 וולט, 40 דק '.
- הכתם ג'ל עם כחול מבריק Coomassie בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עד ג'ל הוא כחול אחיד בצבע.
הערה: המכתים יושלם כאשר הג'ל אינו גלוי הפתרון לצבוע. - Destain זה עם פתרון חומצה אצטית (10%) בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. להקות תתחלנה להופיע. המשך destaining ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עד רקע ברור.
סינתזת פפטיד 2. חד-שבטי ייצור נוגדנים
- תחזר את רצף חומצות האמינו של Mb מ GenBank כולל טונה, עוף, יען, יונקים מקומיים, חותם ו -18 מיניםשל יונקים ימיים (טבלה 2).
- יישר את הרצפים באמצעות תוכנה נכונה 16:
- הפעל את סייר המערך על ידי בחירת יישר: הערוך / בניית מערך על סרגל הפתיחה; בחר צור חדש מערך ולחץ על אישור. תיבת דו-שיח תופיע שואל "אתה בונה יישור רצף DNA או חלבון?"
- לחץ על הלחצן שכותרתו "חלבון"; בחר נתונים: פתוח: תחזרו רצפים מקובצים לקובץ רצף בחר; בחר עריכה: בחר הכל פקודת התפריט כדי לבחור את כל האתרים על כל רצף בנתונים להגדיר ליצירת יישור רצף מרובה.
- מערך בחר: יישר ידי ClustalW מהתפריט הראשי כדי ליישר את נתוני רצפים שנבחרו באמצעות אלגוריתם ClustalW; בחר "BLOSUM" כמו חלבון מטריקס משקל ולאחר מכן לחץ על הלחצן אישור.
- ניתוח יישור רצף:
- דגש על 5 סי תגובתי אנטיגניtes 17: אתר 1 (AKVEADVA, 15-22), אתר 2 (KASEDLK, 56-62), אתר 3 (ATKHKI, 94-99), אתר 4 (HVLHSRH, 113-119) והאתר 5 (KYKELGY, 145- 151) ולמצוא את השבר נשמר בקרב יונקים ימיים. ב- * (כוכבית; סמל קונסנסוס היישור (פרוטוקול 2.2.3)) מציינת מיקומים בם יש שאריות יחידות, משומר במלואו. שברי משומר הבאים יונקים ימיים נמצאו: רצף KASEDLKKHG (הכולל אתר 2) ורצף HVLHSRHP (הכולל אתר 4).
- לסנתז שברי רצף מועמד על פי ניתוח רצף, ו המצומד עם חלבון ovalbumin (OVA) כמו חלבון המוביל באמצעות שירותים מסחריים.
- הוספת חומצות אמינו הידרופוביות (למשל, מתיונין) אל N-terminal של האתר תגובתי אנטיגני למניעת הפפטיד מן הפירוק (למשל, M-KASEDLKKHG).
- להאריך את בטרמינל C-אתר תגובתי אנטיגני על חשיפת אתר אנטיגני ליבת immunocyte. יתר על כן, conjuהשער הפפטיד עם OVA ידי הוספת ציסטאין (Cys, ג) C-terminal (למשל, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- ת חלב adjuvant של פרוינד המלא ל אימונוגן 1 או משלים של פרוינד שלם עבור אימונוגן 2 עם נפח שווה של כל פפטיד סינתטי ב PBS (3 מ"ל, μl ריכוז 30-50 הסופי מיקרוגרם / 100).
- לחסן אימונוגן 1 (0.1 מ"ג) מתחת לעור לתוך כל אחד העכברים 5 נקבה BALB / ג.
- בצע זריקות המאיץ תת עורית חמש פעמים באמצעות אימונוגן 2 במרווחים של שבועות ולאסוף מבחן סר על ידי דגימת קליפ זנב של עכברים לפני כל מגבר.
- לקבוע כייל סר להקרנה הראשונה.
- ממיסים 100 מיקרוגרם של הפפטיד חופשית 25 מ"ל של חיץ התגובה aliquot 50 μl של פתרון זה לתוך זה גם צלחת 96-היטב. הוסף פתרון מגיב צימוד 10 μl לבאר כל ומערבבים הצלחת. דגירה את הצלחת למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- הסר את התוכן של הבאר,לשטוף היטב כל 3 פעמים עם מים מזוקקים, ולחסום את הצלחת על ידי הוספת 200 μl של פתרון לחסימה. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. הסר את התוכן ולשטוף היטב כל 3 פעמים עם מים מזוקקים.
- בצע ELISA העקיף (פרוטוקול 5.1-5.7) לקביעת כייל סר להקרנה הראשונה. בחר את העכבר עם כייל הגבוה ביותר (הצפיפות האופטית הגבוהה ביותר) לאיסוף טחול.
- שלושה ימים לפני לאוסף טחול, לחסן 0.1 מ"ג אימונוגן 1 מתחת לעור לתוך עכבר הצגת כייל הגבוה ביותר.
- אוספים את התאים הטחול מן העכברים שחוסנו נבחרים בנתיך F0 תאי מיאלומה בעכברים (SP2 / 0-Ag14) להשיג תאים hybridoma עבור הדור מב 18.
- 14 ימים לאחר ההיתוך, בחר שיבוטים החיוביים על ידי הקרנת תגובתיות של supernatants hybridoma לקראת פפטיד הסינטטי בחינם באמצעות ELISA העקיף (פרוטוקול 5.1-5.7).
- לדלל את תאי מספר מתאים לכל טוב עבור maximizing שיעור בארות המכילות רק שיבוט אחד אחד (שיבוט דילול).
- הוספת 100 μl של מדיום תרבית תאים לכל הבארות בצלחת 96-טובה, למעט A1 היטב אשר נותר ריק.
- הוסף 200 μl של ההשעיה התא היטב A1. ואז במהירות להעביר 100 μl מ- A1 ל- B1 ומערבבים ידי pipetting בעדינות. חזור על 1 הבא: דילולים 2 לאורך הטור כולו, ולאחר מכן למחוק 100 μl מ H1 כך זה מסתיים עם אותו הנפח כמו הבארות מעליו.
- הוסף 100 μl נוסף של מדיום לעמודה 1 עם micropipette 8 ערוצים. ואז במהירות להעביר 100 μl מכל אחת הבארות בטור 1 לאלה בטור 2 באמצעות פיפטה אותו, ומערבבים על ידי pipetting בעדינות.
- באמצעות הטיפים אותו, חזור 1 הבא: דילולים 2 על פני הצלחת כולה. מחק 100 μl מכל אחת הבארות בעמודה האחרונה.
- תביאו את הנפח הסופי של כל בארות 200 μl ידי הוספת 100 בינוני μl היטב כל אחד. דגירת PLAte באין מפריע על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור humidified.
- בדקו היטב כל ולסמן כל הבארות המכילות רק מושבה אחת. לבצע שתיים או יותר clonings עד> 90% מהבארות המכילות שיבוטים יחידים הם חיוביים עבור ייצור נוגדנים.
- מסך שיבוטים על ידי כתם המערבי כתם נקודה (פרוטוקול 3.1-4.6). אז מושבות תת מבאר לתוך כלי גדול יותר כדי להרחיב את התאים לקבלת מב. בדרך כלל כל שיבוט מועבר לתוך באר אחד בצלחת 12 או 24 גם.
- מדוד את הזיקה בין מבז ואת תמציות שריר פרה, עז, חזיר, כלב, ארנב, טונה, עוף, חותם, וארבעה מינים cetacean מייצג על ידי כתם המערבי כתם נקודה (פרוטוקול 3.1-4.6).
- לחסן תאים hybridoma שנבחרו (עד 3 x 10 6) intraperitoneally לעכברים לגרום מיימת. נפיחות בטן היא בדרך כלל ברורות בתוך 7-10 ימים שלאחר הזרקת hybridoma. אסוף נוזל באמצעות מחט מזרק(פחות מ 20 מד).
- נוזל מיימת צנטריפוגה (10,000 XG במשך 10 דקות) כדי להסיר תאים ופסולת. סינון דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. להוסיף 1 עד 20 מ"ל של המדגם, 15 מ"ל חיץ מחייב, ו 3 עד 5 מ"ל של חיץ elution לתוך הטור חלבון G Sepharose. אסוף את שבריר elution המכיל נוגדנים מטוהרים מן נוזל מיימת עכברים.
- קבע את אלוטיפ נוגדנים על ידי ערכת isotyping נוגדן באמצעות הוראות היצרן.
3. כתם המערבי
- הכן חיץ טעינת 2x המכיל mercaptoethanol β (BME) על ידי ערבוב 950 μl של חיץ מדגם 2x Laemmli עם 50 μl של BME. לדלל את supernatants השריר (פרוטוקול 1.1-1.4) במאגר טעינה עם יחס מתאים לקבלת קליטה טובה: 01:50 (יונקים ימיים חותם) ו -1: 5 (חיות בית וטונה) בעת שימוש ארנב polyclonal נוגדן Mb אנטי אנושי, ו 1: 1 (חזיר, ארנבת, עוף וטונה), 1: 5 (פרה, עז וכלב), ו 01:25 (יונקים ימיים ואת החותם) כאשרntibody הוא מ- supernatant hybridoma.
- מדגם מחמם על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דגימות טען לתוך הבארות של ג'ל SDS-PAGE (לערום acrylamide 4% ומפריד acrylamide 12%) יחד עם סמנים משקל מולקולרי. הרץ את הג'ל במשך 5 דקות ב 50 V ואז להגביר את המתח ל -150 V כדי לסיים את הריצה ב כ -1 שעה.
- מניחים את הג'ל במאגר העברת 1x במשך 15 דקות. מעביר את החלבון המופרד כדי ניטרוצלולוזה (NC) ממברנות לאחר שהם מופרדים על ידי עמוד. העברה ניתן לעשות זאת ב -100 V עבור 60-90 דקות.
- כן פתרון לחסימה: 1x PBS המכיל 0.1% Tween 20 עם 5% חלב יבש ללא שומן. חסום את הממברנה NC ב 25 מ"ל של חסימת פתרון בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 15 מ"ל תמיסת מלח פוספט שנאגרו עם Tween 20 (PBST).
- דגירה הממברנה נוגדן ראשוני (נוזל מיימת או supernatant hybridoma) ב 10 מ"ל מדולל חיץ דילול נוגדן עם פתרון חסימת 5% ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- שטפו את membranדואר שלוש פעמים שוב עם PBST לנקות את הנוגדן מוגזם.
- דגירה הממברנה עם IgG אנטי עכבר עז phosphatase מצומדות אלקליין ב 1: 1,250 בתמיסה חוסם עם תסיסה עדינה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הממברנה שוב דגירה אותו כלוריד 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט / p-nitroblue tetrazolium תערובת המצע phosphatase (BCIP / NBT) במשך 10 עד 20 דקות עד ופיתוח צבע.
- עצור את התגובה על ידי שטיפת הממברנה בכמה שינויים של מים מזוקקים.
4. דוט כתם
- לדלל את supernatants שריר (פרוטוקול 1.1-1.4) ב אלבומין 5% שור (BSA) ב PBST עם יחס מתאים לקבלת קליטה טובה: 1: 5 חיות בית וטונה, ו 01:25 עבור יונקים ימיים ואוטמים. ספוט 5 μl של דגימות על הממברנה. לצמצם את השטח שהפתרון חודר (בדרך כלל 3-4 מ"מ קוטר) על ידי יישום זה לאט.
- לייבש את הממברנה בטמפרטורת החדר (למשל, </ Em> בזרימה למינרית במשך 30-60 דקות), לחסום אותו עם פתרון חסימת בצלחת פטרי עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר, לשטוף אותו עם PBST.
- דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני (מב מ supernatant hybridoma ב 1: 10,000 או נוזל מיימת ב 1: 100,000 מדולל פתרון חסימת 5%) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- השתמש PBST כדי לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 5 דקות כל להסיר נוגדן עודף ולאחר מכן דגירה אותו עם נוגדנים משני (אלקליין פוספטאז מצומדות העז IgG אנטי עכבר בבית 1: 1,250 ב 5% פתרון חוסם) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר .
- לשטוף את הממברנה שוב דגירה אותו בתערובת המצע phosphatase BCIP / NBT בתוך 10 עד 20 דקות עד ופיתוח צבע.
- עצור את התגובה על ידי שטיפת הממברנה בכמה שינויים של מים מזוקקים.
5. עקיפה ELISA
- הכן חיץ כביסה (0.002 M בופר imidazole עם 0.02% Tween 20). לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם כביסהחיץ בין כל שלב הבא (פרוטוקול 5.2-5.5).
- כן 01:25 דילול של supernatants שריר (פרוטוקול 1.1-1.4) במאגר ציפוי. מעיל צלחת ELISA 96-היטב עם 100 μl supernatants מדולל ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולחסום אותו עם חיץ חסימת (BSA 1% ב PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- כן 1: 2,000 דילול של מב מטוהר עם חיץ מדולל ולהוסיף 100 μl של בדילול מב היטב כל אחד. דגירה את הצלחת עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- הוסף עז נגד העכבר IgG מצומדות עם peroxidase חזרת (1: 200 דילול חיץ בדילול) עבור הדגירה נוספת.
- הוסף מצע peroxidase היטב כל (100 μl / טוב) ו דגירה של 10-15 דקות.
- עצור את תגובת האנזים ידי פתרון peroxidase stop (100 μl / טוב) כאשר פיתוח צבע הוא ציין.
- קראו את הצפיפות האופטית ב 450 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate.
6. הכנת קולואיד זהב שכותרתו מב הערה: הצבע של פתרון זהב colloidal ואת התערובת צריך תמיד להיות אדום. התאם את ה- pH, ריכוז של מב, מהירות צנטריפוגות כאשר משקע שחור לב. צעדים 6.1 ו 6.2 הם צעדים אופטימיזציה.
- להוסיף מטוהרים גילוי מב (50 מיקרוגרם / מ"ל, 3 μl) 100 μl של פתרון זהב colloidal עם ערכי pH הנעים בין 5-9. ה- pH המינימום שמחזיק את הצבע האדום למשך שעות נחשב pH האופטימלי. הערה: במחקר זה, 0.1 M אשלגן פחמתי שימש להתאים זהב קולואיד (40 ננומטר) הפתרון 8.0 pH (pH אופטימלי).
- להוסיף סכום שונה של גילוי מטוהר מב (500 מיקרוגרם / מיליליטר, 1-20 μl) 100 μl של פתרון זהב colloidal ב- pH 8.0. הערה: הריכוז האופטימלי במחקר זה הוא 6 מיקרוגרם / מיליליטר (ללא משקע שחור).
- על פי התוצאות הנ"ל, להוסיף 60 מיקרוגרם של גילוי טיפה חכמה מב מטוהר 10 מיליליטר של תמיסת זהב קולואיד. חלב את התערובת בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוֹדָעָהד 2 מ"ל של תמיסת BSA 5% ב PBS (pH 7.4) לתערובת ו ת חלב בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי להפחית הפרעות רקע.
- צנטריפוגה את התערובת על XG 10,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C..
- הסר את supernatant עם נוגדן unconjugated בזהירות להשעות את כדורי וכתוצאה מכך 4 מ"ל PBST המכיל% BSA 1% ו -0.1 Tween 20, וחזור פעמים צנטריפוגה ההשעיה כמה.
- להשעות את המשקעים הסופיים ב 1 מיליליטר PBST ולאחסן אותו ב 4 ° C עד בשימוש.
7. בניית רצועת החיסון
הערה: איור 1 מציג את עיצוב רצועה החיסוני. הכן ולהרכיב את הרצועות במצב סביבת מעבדה נמוכה לחות (<20% לחות יחסית) לכל חי אחסון ממושכים (> yr 1). מידות של רפידות הממברנה הם: 300 כרית המצומד מ"מ x 10 מ"מ, משטח סופג 300 מ"מ x 24 מ"מ, כרית מדגם 300 מ"מ x 24 מ"מ, קרום NC 300 מ"מ x 25 מ"מ, קרטון 300מ"מ x 80 מ"מ.
- הוסף פתרון מב זהב שכותרתו קולואיד משלב 6.6 עם micropipette כדי להרוות את כרית המצומד ולאחר מכן לייבש אותו על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לפני הרכבה.
- הפץ את מב הספציפי לכיד אנטיגן (500 מיקרוגרם / מיליליטר) על אזור הבדיקה, ארנב IgG אנטי העכבר (500 מיקרוגרם / מיליליטר) על האזור המלא לאיתור מב על הממברנה NC באמצעות מדפסת פיפטה או immunostrip. שמירה על מרחק (> 5 מ"מ) בין שני האזורים כדי למנוע הפרעה.
- הדבק את כרית מצומדות, כרית ספיגה NC קרום על קרטון עם דבק דו-צדדי.
הערה: חופף את הרפידות בכל צד של הממברנה NC בכ -2 מ"מ. בניית רצועה מתאימה תגרום מבחן שלם. - מניח את משטח המדגם על המשטח המצומד (2 מ"מ) ולהדביק אותו על הקרטון.
- צור רצועות ברוחב 6 מ"מ עם חותך נייר. ארוז את הרצועות בשקית נייר האלומיניום עם יבוש, ולאחסן אותם ב 4 ° C עד בשימוש.
מבחן חוצה תגובתיות 8.
- Homogenize 0.03 גרם של המדגם שרירים גלם עם 1 מ"ל PBS (המכיל BSA 0.1%) בצינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות בעזרת מקל במבוק או שחיקה מוט.
- החזק את הרצועה ידי ההפך קץ באזורי הבדיקה טובל את חלק כרית מדגם לתוך הדגימה למשך 5-10 דקות ולבחון את התוצאה ישירות.
- אופציונלי: לאסוף 500 μl supernatant ולהעביר אותו צינור צנטריפוגות חדשות.
הערה: שלב זה הוא הציע אם האות אינה מובנת מאליה כאשר רצועת ספוג ישירות לתוך supernatant.
- אופציונלי: לאסוף 500 μl supernatant ולהעביר אותו צינור צנטריפוגות חדשות.
- בחן דגימות שריר שונות בשלושה עותקים.
הערה: כאן בדקנו טונה, עוף, חותם, 15 מינים של יונקים ימיים ו -5 מינים של יונקים יבשתיים. - יש חמישה פקחים עצמאיים לחזור 8.3 במשך חמש פעמים, כלומר, להשתמש 575 רצועות בסך הכל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מאפיינים חד-שבטיים נוגדנים
פיתחנו שני מבז IgG 1 (CGF5H9 ו CSF1H13) הכרה שני פפטידים סינתטיים (MKASEDLKKHGNTVLC ו AIIHVLHSRHPAEFGC), בהתאמה, של cetacean Mb, ואלה שימשו לבניית פס הבדיקה immunochromatographic זהב colloidal כריך סוג עבור איתור מהיר של Mb cetacean. איור 2 מראה כי CGF5H9 מזהה יונקים ימיים ויונקים אחרים כלהקה צבעונית אחת בכל משקל מולקולרי החזוי של 17 kDa למידע. הלווייתן מהינקי המשותף (acutorostrata Balaenoptera) מציג להקה יחסית חלשה יותר הלהקות של יונקים ימיים אחרים. להקות נעדרות עבור טונה, תרנגולות וחותמות, בעוד להקה בסביבות 50 kDa הוא ציינה לחזירים. אמנם יש להקות ספציפיות מרובות לחזירים וטונה, CSF1H13 היא ספציפית מאוד, כי הוא מגיב רק עם יונקים ימיים וחותם כלהקה במשקל מולקולרי חזוי של 17 משוער kדא. מינקה whale רק מראה איתות חזק בשעה 1:10 (מידע לא מוצג) ללא האות נצפתה בשעה 1:25. איור 2 מראה תוצאות זהות כתם נקודה.
3A איור מראה כי CGF5H9 מדגים איתות חיובי עבור יונקים ימיים, ארנבים, כלבים, עזים, פרות (ערך OD> 3.0); איתות חיובית חלשה לחזירים (ערך OD = 1.5); איתות שלילי עבור חותמות, תרנגולות וטונה. איור 3 ב מציג כי CSF1H13 מבטא זיקה גבוהה כלפי יונקים ימיים ודחיסות (ערך OD> 3.0). שניהם CSF1H13 ו CGF5H9 יכול להגיב בחריפות עם כל ארבעת המינים cetacean. מינים אלה הם ארבעה ממשפחות שונות (לווייתן מינקי: Balaenopteridae; דולפינן: Delphinidae; ראשתן גמד: Kogiidae; פוקנה הודית: Phocoenidae), המציין את תגובתיות רחבה למינים cetacean מגוונים.
לבניית רצועה, CGF5H9, מכיר tהוא MBS של יונקים ימיים ויונקים אחרים, הוא קולואיד שכותרתו זהב משמש נוגדן זיהוי להיקשר מיוגלובין, ו CSF1H13 מצופה על פס הבדיקה רק כדי ללכוד את MBS של יונקים ימיים וכלבי ים. לכן פס הבדיקה נועד להציג איתות חיובית כאשר הן מבז לזהות Mb cetacean. מכיוון Mb מחיות הלא cetacean ניתן לאבחון רק על ידי אחד משני מבז אלה, פס הבדיקה מראה תוצאה שלילית כאשר דגימות שריר מבעלי חיים אחרים נבדקות. פס הבקרה תמיד מראה תוצאה חיובית בגלל ארנב אנטי עכבר IgG נקשר שכותרתו זהב קולואיד CGF5H9. תוצאה נכשלה פס הבקרה מציינת כי איכות החומרים על הרצועה הוא עני.
מבחן רצועה
איור 4 מראה את להקות האות בשני קו בדיקת פס בקרה כאשר דגימות שריר cetacean משמשות. כאשר המדגם אינו יכול לבוא מן יונקים ימיים, שם היא להקה אחת בלבד על wi פקד הקוth בהעדר הלהקה ב פס הבדיקה. תוצאה מוצלחת ניתן לצפות ישירות 5-10 דקות לאחר שמאחד 0.03 גרם של שריר עם 10 מיליליטר PBS המכיל BSA 0.1% בעזרת מקל פלסטיק או במבוק השריית הרצועה לתוך התערובת. לאחר בדיקת 15 מיני cetacean ושמונה מינים שאינם cetacean בשלושה עותקים, הסגולי (אחוז דגימות הלא cetacean זיהה) ורגישות (אחוז דגימות cetacean זיהה) הם 100%.
עיצוב באיור 1. הרצועה החיסונית. כל הרכיבים בשכבות על בקפידה לכרטיס הכיסוי הפלסטי, כך שהם חופפים. זה מאפשר ריאגנטים מדגם לזרום דרך הממברנה לרפד סופג. T: אזור הבדיקה. C: אזור שליטה. נתון זה שוחזר מן Lo, ג et al. רצועת זהב colloidal ראפיד החיסוניתעבור הרחקת בשר לווייתן כבד סחר לא חוקי וצריכים:. השלכות לשימור בריאות ציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. כתם המערבי וניתוח כתם נקודה באמצעות supernatants hybridoma. (א) CGF5H9, (B) CSF1H13. שניהם supernatants hybridoma יכול לזהות יונקים ימיים כלהקה צבעונית אחת בכל משקל מולקולרי חזוי של 17 kDa למידע. MW: לווייתן מינקי, BND: דולפינן, DSW: ראשתן גמד, FP: פוקנה הודית, PKW: לויתן של רוצח פיגמי, N: PBS (שליטה שלילי). נתון זה שוחזר מן Lo, ג et al. רצועת זהב colloidal החיסונית ראפיד עבור גבשר etacean הרחקת סחר לא חוקי וצריך:. השלכות לשימור בריאות ציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ELISA העקיף של תמציות שרירות של מינים שונים באמצעות מבז מטוהר. (א) CGF5H9, (B) CSF1H13. יונקים ימיים בלבד יכולים לייצר אותות חיוביים חזקים בשני מהבז. נתון זה שוחזר מן Lo, ג ואח רצועת זהב colloidal ראפיד החיסונית למסחר וצריכה בלתי חוקית הרחקה בשר לווייתן כבד:.. ההשלכות לשימור בריאות הציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10.1371 / journal.pone.0060704. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הספציפיות של רצועת זהב colloidal החיסונית T:. קו הבדיקה. C: קו שליט. רק כאשר דגימות שריר cetacean משמשות, תוצאות מוצלחות (להקות אות בשני קו בדיקת פס בקרה) ניתן לצפות. (א) ללא cetacean דגימות: 1: פרה. 2: עיזים. 3: חזיר. 4: כלב. 5: ארנב. 6: טונה. 7: עוף. 8: חותם הארבור (Phoca vitulina). (ב) דגימות cetacean: 1: לווייתן מינקי גראונד (acutorostrata Balaenoptera). 2: לוויתן של אומורה (omurai Balaenoptera). 3: דולפינן (aduncus Tursiops). 4: דולפינן (ט truncatus). 5: דולפין של פרייזר (Lagenodelphis hosei </ Em>). 6: הודו פסיפיק דולפין גבן (chinensis סוזה). 7: (griseus Grampus) גרמפוס אפור. 8: Pantropical הבחין דולפין (attenuata Stenella). 9: סטנו תלום שן (bredanensis סטנו). 10: לויתן של רוצח פיגמי (Feresa attenuata). 11: גלובי שחור קצר סנפירים (Globicephala macrorhynchus). 12: לווייתן Melon ראשים (אלקטרה Peponocephala). 13: ראשתן הגמד (Kogia סימה). 14: ראשתן פיגמי (ק breviceps). 15: פוקנה הודית (Neophocaena phocaenoides). נתון זה שוחזר מן Lo, ג ואח רצועת זהב colloidal ראפיד החיסונית למסחר וצריכה בלתי חוקית הרחקה בשר לווייתן כבד:.. ההשלכות לשימור בריאות הציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10.1371 / journal.pone.0060704 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מיני cetacean | מינים ללא cetacean |
| ראשתן פיגמי (Kogia breviceps) | הרבור חותם (Phoca vitulina) |
| ראשתן הגמד (Kogia סימה) | כלב (familiaris זאבת Canis) |
| קצר סנפירים גלובי שחור (Globicephala macrorhynchus) | ארנב (Oryctolagus cuniculus) |
| מלון ראשי הלווייתן (Peponocephala אלקטרה) | חזיר (Sus scrofa) |
| לויתן של רוצח פיגמי (Feresa attenuata) | עיזים (קפרה hircus) |
| Pantropical הבחין דולפין (Stenella attenuata) | בקר (שור Bos) |
| דולפינן (ט"וrsiops truncatus) | עוף (גאלוס גאלוס) |
| דולפינן (Tursiops aduncus) | טונה צהובה (Thunnus דגים) |
| הדולפין של פרייזר (Lagenodelphis hosei) | |
| Indo-Pacific דולפין גבן (chinensis סוזה) | |
| סטנו תלום שן (bredanensis סטנו) | |
| גרמפוס אפור (Grampus griseus) | |
| פוקנה הודית (Neophocaena phocaenoides) | |
| לווייתן מינקי גראונד (acutorostrata Balaenoptera) | |
| לוויתן של אומורה (Balaenoptera אומורה i) |
טבלת 1. הזנים שמהם השריר היה Collected ונבדק במחקר זה. מינים כוללים טונה, עוף, חותם, 5 מינים של יונקים יבשתיים, ו -15 מינים של יונקים ימיים (4 משפחות).
| מִין | ההצטרפות לא. |
| לווייתן מינקי גראונד (acutorostrata Balaenoptera) | P02179 |
| של לוויתן פיגמי Bryde (edeni Balaenoptera) | Q0KIY2 |
| לווייתן גדול סנפיר (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| לוויתן אפור (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| זרע לווייתן (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| ראשתן פיגמי (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| ראשתן הגמד (Kogia סימה) | P02184 |
| קצר beakeדולפין ד המשותף (delphis דולפין) | P68276 |
| ארוך סנפירים גלובי שחור (Melas Globicephala) | P02174 |
| לויתן של רוצח (orca Orcinus) | P02173 |
| מלון ראשי הלווייתן (Peponocephala אלקטרה) | Q0KIY3 |
| Pantropical הבחין דולפין (Stenella attenuata) | Q0KIY6 |
| דולפינן (Tursiops truncatus) | P68279 |
| הרבור דולפין (Phocoena phocoena) | P68278 |
| דולפין נהר האמזונס (INIA geoffrensis) | P02181 |
| לווייתני מקור של לונגמן (Indopacetus פקיפיקוס) | Q0KIY9 |
| לווייתני מקור 'Hubbs (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| לווייתני המקור של קיביה (דזהphius cavirostris) | P02182 |
| הרבור חותם (Phoca vitulina) | P68080 |
| בקר (שור Bos) | P02192 |
| עיזים (קפרה hircus) | B7U9B5.3 |
| סוס (Equus caballus) | P68082 |
| חזיר (Sus scrofa) | P02189 |
| כלב (familiaris זאבת Canis) | P63113 |
| עוף (גאלוס גאלוס) | P02197 |
| יען (Struthio camelus) | P85077 |
| טונה צהובה (Thunnus דגים) | P02205 |
רצפי מיוגלובין טבלת 2. השתמשו במחקר זה עם מספרי הצטרפות בהתאמה GenBank. מינים כוללים טונה,עוף, יען, יונקים מקומיים, חותם ו -18 מינים של יונקים ימיים (7 משפחות). טבלה זו שוחזרה מ Lo, ג ואח רצועת זהב colloidal חיסונית ראפיד למסחר וצריך בלתי חוקיים הרחקת בשר לווייתן כבד:. השלכות לשימור בריאות ציבור PLoS ONE 8, e60704 (2013).. doi: 10.1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות פפטיד סינטטי מצומדות לחלבון מוביל להפליא יעיל יותר בהשוואה לחלבון מאותו המקור שלה. עבור טכניקת כריך מבוסס, כי מב מפותחת באמצעות אפיטופים עם מיקומים יחסיים ידועים, שני מהבז במחקר זה אינו צפוי להפריע זה אינטראקציה של אחרים עם epitope אנטיגן היעד. יתר על כן, תגובתיות בין חלבון יליד הנוגדן של עכברים שחוסנו עם פפטיד סינתטי המצומד עשוי להיות חזק יותר תגובתיות בין חלבון יליד הנוגדן המופק חלבון יליד 19. השימוש conjugates פפטיד סינתטי מומלץ ולכן לפרוצדורות חיסון יעיל דור מב אנטי-פפטיד המתאים.
המבנה של חלבון בעיקר כרוך רצף של חומצות אמינו בשרשרת פוליפפטיד. יש שרשרת צידו כל חומצת אמינו המוביל מאפיינים ספציפיים, ומעט שינוי ACI אמינורצף ד תוצאת שינויים במבנה. בגלל פפטידים עם אורך של 10-20 חומצות אמינו הם אידיאליים עבור שמכינה את הנוגדנים, אורך פפטידים סינתטיים (אימונוגן) בשעה באזור C-terminal הוגדל כדי להבטיח שהאזור אנטיגני הליבה יוכר. לכן, שאריות חומצת אמינו בין MBS של בעלי חיים שונים וכתוצאה מכך מבנים epitope שונים יכולים להיות מובחן ביעילות. לדוגמא, איור 3 א מציג את עיצוב פפטיד ציין תורם CGF5H9 מגיב חזק עם יונקים ימיים, אבל באופן שלילי עם חותמות. דוגמא נוספת היא הזיקות המובחנות כלפי תרנגולות וכלבים של CGF5H9 למרות העוף יש רצף זהה לזה של הכלב באתר אנטיגני הליבה 2. זה מצביע על כך את ההבדל רצף באזור החיצוני עלול להוביל לשינוי המבנה ובכך משתנה מחייב זיקה בין אנטיגן נוגדן.
כתם המערבי, כתם נקודה, ובעקיפין ELISA שימשוהשיטה שלנו לסינון מבז מתאים. כתם המערבי נעשה שימוש נרחב כדי לזהות חלבונים ספציפיים תמצית רקמות או homogenate. בטכניקה זו, ג'ל אלקטרופורזה משמש להפריד חלבונים מפוגל לפי אורך של פוליפפטיד. לכן, אפשר לאשר אם האות מציין את המשקל המולקולרי חלבון חזה. עם זאת, תוצאת זיהוי (חיובית או שלילית, חזקה או חלשה אות) לא יכולה הייתה לייצג את המצב האמיתי של נוגדנים לאנטיגן מחייב כי חלבונים מפוגלים משמשים. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש כתם נקודה להקרנת שלב שני. Dot הכתם הוא טכניקה לזיהוי חלבונים. היא מייצגת פישוט שיטת כתם המערבי. בשנת כתם נקודה, תערובת המכילה המולקולה כדי להתגלות מוחל ישירות על קרום כנקודה. זאת בשונה כתם מערבי כי דגימות חלבון אינן מפוגלות. לציין כי טכניקה זו מציעה שום מידע על הגודל של biomolecule היעד, ונקודה אחת תופיע אם שני מוlecules בגדלים שונים מזוהה. לבסוף, עקיף ELISA משמש עבור assay מחייב ליגנד כדי ליצור אות כי ניתן לכמת כראוי. הוא מספק מידע נוסף מאפיינים מב ובכך מקל על בניית הרצועה.
ריכוזים של Mb בשריר משתנים בהתאם למיקום האוסף. לדוגמא, שרירים שחיו (שרירים ציריים) ב יונקים ימיים בעלי תכולה גבוהה משמעותי של Mb לעומת שרירים הלא שחייה, דגימות מן היונקים ימיים צעירים היו מוכנות לקבל ריכוז Mb נמוך משום שעולה הריכוז Mb לאורך של בעל חי 20. בתחילה, CSF1H13, אשר רק לוכד את Mb של יונקים ימיים וכלבי ים, נועד להיות קולואיד שכותרתו זהב ולהיות גילוי נוגדנים, ו CGF5H9, מכיר Mb של מינים רבים, יהיה נוגדן ללכוד על פס הבדיקה. החוקרים שיערו כי נוגדנים גילוי צריך להיות ספציפי יותר הנוגדן ללכוד צריךלהיות כללי יותר. עם זאת, איתות חיובית חלשה נמצאת על קו הבדיקה כאשר דגימות cetacean עם ריכוזים נמוכים Mb שמשו (מידע לא מוצג). הבעיה נפתרה כאשר עמדות שני מהבז התהפכו כמתואר תוצאות הנציג. איתות טובה גם הוצגה במשך cetacean יילוד (לווייתן של אומורה תקוע) (איור 4). לא ברור האם המאפיינים וריכוז מבזים לתרום לתופעה זו.
במחקר זה, דגימות שריר קפוא מופשר הומוגני עם PBS שימשו על רצועת הבדיקה. תנאי מדגם אחרים ושיטות כנות עשויים להשפיע על התוצאה. לדוגמה, חלבון מלח מסיס כגון Mb צריך להיות חילוץ באמצעות PBS ולא מים טהורים. אחרת, החילוץ עלול להיות לקוי, אשר עלול להוביל לתוצאה בלתי סוטה. מאגר החילוץ המתאים: יחס מדגם הבשר הוא אחראי במידה מסוימת על הפרשנות המוצלחת של תוצאת הרצועה. amou גדולNT (0.3 גרם ב 1 מ"ל חיץ) של דגימות בקרה (למשל, חיות בית) יכול לגרום תוצאה חיובית והרקע מטושטש. עם זאת, היחס ששימשו במחקר זה (1: 0.03) הפיק תוצאות נכונות. רק דגימות שריר טריות יכולות לשמש מבחן ברצועה זו. חלבון יכול להיות הידרוליזה או מפוגל לאחר טיפולים מסוימים (כגון ריפוי על ידי סויה רתיחה), אשר עשוי לגרום לתוצאות חיוביות לא רק עבור דגימות שריר cetacean אלא גם דגימות מבעלי חיים אחרים (מידע לא מוצג). לכן, הוא הציע מקורות מדגם משתנים ותוכניות עיצוב בנייה שונות אמורים לשמש במהלך פיתוח רצועה.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את ההתפתחות שני מבז תגובתי בחריפות Mb של יונקים ימיים, ו מבזים אלה חלים על רצועת בדיקה מהירה כדי לבדל את Mb של יונקים ימיים מן החותם וחיות אחרות. למרות ניתוח דנ"א אמין מבוסס PCR לזיהוי של בשר לווייתן כבד הוא 12 זמין, זה אניs עבודה רב אינטנסיבי וזמן. רצועת הבדיקה המהירה היא טכניקה שאפשר לסמוך עליו ומהירה שניתן להשתמש בם בתחום לזהות בשרי cetacean, אשר נחוץ מאוד רשויות רגולטוריות 21. סביר להניח כי הרצועה ניתן לפתח לאיתור MBS הספציפי מחיות כגון סוסים או חזירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
