Protocol
윤리 정책 : 연구는 국립 자이 대학, 승인 ID의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 국제 가이드 라인에 따라 수행 및 승인 된 다음 고래류 샘플 사용은 대만 농업위원회 (연구 허가에 의해 허용 된 99022. 100M-02.1-C-99).
1. 근육 샘플 준비 및 SDS-PAGE
참고 : 해양 포유류 16 종, 육상 포유류 5 종을 포함한 23 종에서 근육 샘플, 참치와 닭이 연구 (표 1)에 사용되었다. 고래류 근육 샘플은 좌초 개인, 어업 잡어 및 몰수로부터 얻었다. 토끼, 쥐, 개, 닭 근육 조직은 국립 자이 대학의 동물 질병 진단 센터에서 얻었다. 쇠고기, 돼지 고기, 양고기, 참치의 샘플은 로컬 슈퍼마켓에서 구입 하였다. 항구 인감 (Phoca vitulina는의 근육 샘플
- 사용할 때까지 -20 ° C에서 모든 샘플을 저장합니다.
- -20 ° C에서 사전 멋진 박격포. 그 다음에 냉동 근육 시료 3g을 넣어.
- 조직 균질기를 이용하여 차가운 인산 완충 식염수 10 ㎖ (PBS) 시료 균질화.
- 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 XG에서 균질 샘플을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관합니다.
- (5 ㎖ % 스태킹 겔 (3.07 ml의 증류수, pH가 6.8, 40 % 아크릴 아미드 625 μL, 10 %의과 황산 암모늄 (APS)의 50 μL 및 테트라 메틸 에틸렌 디아민의 5 μL의 4X 상부 겔 완충액 1.25 mL의 (5)의 준비 TEMED)) 및 10 ml의 15 % 분리 겔 (증류수 3.65 ㎖, pH가 8.8 배 낮은 겔 완충액 2.5 ㎖, 40 % 아크릴 아미드 3.75 ㎖, 10 %, 100 ㎕ APS,와 TEMED의 4 μL).
- 전기 영동 셀에서, 후자는 고화 후에 분리 겔 (15 % 아크릴 아미드) 위에 겔 (5 % 아크릴 아미드)을 적층 붓는다. 스태킹 겔에서 젤 빗를 삽입합니다.
- 다음 조건에 따라 PAGE를 수행하여 초기 실행 조건 : 100 볼트, 20 분 및 최종 조건 : 120 볼트, 40 분.
- 겔 색상 균일 청색이 될 때까지 30 분 동안 실온에서 쿠마시 브릴리언트 블루로 겔을 염색.
주 : 겔 더이상 염료 용액에서 볼 수없는 경우 염색이 완료된다. - 1 시간 동안 실온에서 아세트산 용액 (10 %)와 함께 Destain. 밴드가 나타나기 시작합니다. 배경이 선명해질 때까지 밤새 4 ° C에서 탈색 계속합니다.
2. 펩타이드 합성 및 단일 클론 항체 생산
- 참치, 닭, 타조, 국내 포유류 시일 18 종을 포함하여 GenBank에서 메가의 아미노산 서열을 검색고래의 (표 2).
- 적절한 소프트웨어 (16)를 사용하여 시퀀스를 정렬 :
- 정렬을 선택하여 정렬 Explorer를 실행하십시오 실행 표시 줄에 정렬을 작성 / 편집; 새로운 정렬 생성을 선택하고 확인을 클릭합니다. 묻는 대화 상자가 나타납니다 "당신은 DNA 또는 단백질 서열 정렬을 구축하고 있습니까?"
- "단백질"로 표시된 버튼을 클릭; 열기 : 데이터를 선택하여 파일을 선택 시퀀스 파일의 시퀀스를 검색; 편집을 선택 다중 서열 정렬을 만드는 데이터 세트의 모든 시퀀스에 대한 모든 사이트를 선택하는 모든 메뉴 명령을 선택합니다.
- 선택 정렬 다음 ClustalW에 알고리즘을 이용하여 상기 선택된 시퀀스 데이터를 정렬하기 위해 메인 메뉴로 ClustalW에 맞추고; 후 OK 버튼을 클릭 단백질 무게 매트릭스로 "BLOSUM"를 선택합니다.
- 순서 정렬을 분석 :
- 5 항원 반응시에 초점TES 17 : 사이트 1 (AKVEADVA, 15-22), 사이트 2 (KASEDLK, 56-62) 사이트 3 (ATKHKI, 94-99) 사이트 4 (HVLHSRH, 113-119) 및 사이트 5 (KYKELGY, 145- 151)과 고래 사이에 보존 조각을 찾을 수 있습니다. * (별표, 정렬에 합의 기호 (프로토콜 2.2.3)) 하나의 완전히 보존 된 잔류 물을 위치를 나타냅니다. 고래의 다음 보존 조각이 발견되었다 (사이트 2 포함) 순서 KASEDLKKHG 시퀀스 HVLHSRHP를 (이 사이트 4 포함).
- 상용 서비스를 이용하여 담체 단백질과 같은 단백질 알부민 (OVA)로 서열 분석, 공액에 따른 후보 서열 단편을 합성한다.
- 분해 펩타이드 방지 항원 반응성 부위의 N- 말단에 소수성 아미노산 (예를 들어, 메티오닌)를 첨가 (예, M-KASEDLKKHG).
- 면역 세포에 항원 코어 사이트를 노출 항원 반응성 부위의 C- 말단을 연장. 또한, conju게이트 C 말단에 시스테인 (Cys 또는 C)를 첨가함으로써과 OVA 펩티드 (예, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- 면역원 1 또는 PBS의 각 합성 펩티드의 동일한 부피 (3 ml의 최종 농도가 30 ~ 50 μg의 / 100 μL)와 면역원 2 불완전 프로 인트 보조제에 대한 완전한 프로 인트 보조제를 유화.
- 피하 5 여성 BALB / c 마우스의 각으로 면역원 1 (0.1 mg)을 접종한다.
- 2 주 간격으로 피하 주사를 접종이 면역원을 사용하여 다섯 번 수행하고 모든 접종 전에 마우스의 꼬리 클립 샘플링하여 시험 혈청을 수집한다.
- 첫 번째 심사에 대한 혈청 역가를 결정합니다.
- 96 웰 플레이트의 각 웰에 반응 완충액 및 분취 용액 50 μl를 25 ml의 자유 펩티드 100㎍을 녹인다. 각 웰에 10 μl의 커플 링 시약 솔루션을 추가하고 판을 섞는다. 실온에서 2 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
- 상기 웰의 내용물을 제거증류수로 각 웰을 3 회 세척하고, 차단 용액 200 μl를 첨가함으로써 플레이트를 차단. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 내용물을 제거하고, 증류수로 각 웰을 3 회 세척 하였다.
- 첫 번째 심사에 대한 혈청 역가를 결정하는 간접 ELISA (프로토콜 5.1-5.7)을 수행합니다. 비장 모음의 가장 높은 역가 (가장 높은 광학 밀도)와 마우스를 선택합니다.
- 사흘 전에 비장 컬렉션, 피하 가장 높은 역가를 제시 마우스로 면역원 일 0.1 mg의 접종.
- 단클론 항체 생성 (18) 하이 브리 도마 세포를 얻기 위해 뮤린 골수종 세포 F0 (SP2 / 0-Ag14)를 선택한 면역화 된 마우스 퓨즈로부터 비장 세포를 수집한다.
- 십사일 융합 한 후, 간접 ELISA를 사용하여 무료 합성 펩티드를 향해 하이 브리 도마 상층 액 (프로토콜 5.1-5.7)의 반응성을 선별하여 양성 클론을 선택합니다.
- maximiz 대해 웰 당 적당한 개수로 세포를 희석하나의 단일 클론 (희석 복제)를 포함 우물의 비율을 보내고.
- 비어 아니라 A1 제외하고 96 웰 플레이트의 모든 웰에 세포 배양 배지 100 μl를 추가합니다.
- 잘 A1에 세포 현탁액 200 μl를 추가합니다. 신속 B1에 A1에서 100 μl를 전송하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다. 전체 열 아래 2 희석하고,이 위에있는 우물 같은 볼륨 끝 있도록 다음 H1에서 100 μl를 폐기 이러한 일을 반복합니다.
- 8 채널 마이크로 피펫으로 1 열 중간의 추가 100 μl를 추가합니다. 그리고 신속하게 같은 피펫을 사용하여 열이 이들에 열 1의 우물에서 각각 100 μl를 전송하고 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다.
- 전체 판에 걸쳐 2 희석 : 같은 팁을 사용하여 이러한 일을 반복합니다. 마지막 열에있는 각 웰로부터 100 ㎕를 폐기.
- 각 웰에 100 ㎕의 매체를 추가하여 200 ㎕를 모든 웰의 최종 볼륨을 가져와. 괞 찮아을 품어TE는 가습 CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 흐트러.
- 각 웰을 확인하고 단 하나의 식민지를 포함하는 모든 우물을 표시합니다. 단일 클론을 포함하는 웰의> 90 %가 항체 생산에 긍정적까지 둘 이상의 스크랩을 수행한다.
- 웨스턴 블롯 및 도트 오 (프로토콜 3.1-4.6)에 의해 클론을 화면. 그런 다음 큰 용기에 우물에서 하위 문화 식민지은 단클론 항체를 얻기위한 세포를 확장합니다. 일반적으로 각 클론은 12 또는 24 웰 플레이트에 하나의 우물에 전달된다.
- 모노클로 날 항체와 소, 염소, 돼지, 개, 토끼, 참치, 닭고기, 인감에서 근육 추출물, 서양 오 점과 점 오 (프로토콜 3.1-4.6)에 의해 사 대표 고래류 종 사이의 친화도를 측정한다.
- 복수를 유도하도록 마우스에 복강 내 (최대 3 × 106 행) 선택 하이 브리 도마 세포를 접종한다. 복부 팽창 7-10 일 하이 브리 도마 주입 게시 내의 통상적 명백하다. 피하 주사 바늘을 사용하여 유체를 수집(이하 20 게이지).
- 원심 분리기 복수의 유체 (10 분 동안 10,000 XG)는 세포와 이물질을 제거합니다. 0.45 μm의 필터를 통해 필터링합니다. 단백질 G 세 파로스 컬럼에 샘플 1 내지 20 ml의 결합 완충액 15 ㎖, 용출 완충액의 3 내지 5를 가하여. 쥐의 복수 액으로부터 정제 된 항체를 함유하는 용출 분획을 수집한다.
- 제조업체의 지침을 사용하여 항체 isotyping 키트에 의한 항체 이소 타입을 결정합니다.
3. 서양 얼룩
- BME의 50 μL와 배 램 믈리 샘플 버퍼의 950 μl를 혼합하여 β-머 캅토 에탄올 (BME)를 포함 2 배 로딩 버퍼를 준비합니다. 폴리 클로 날 토끼 항 - 인간 메가 항체를 사용하는 경우 5 (가축 참치)과 : 1시 50분 (고래류 날인) 및 1 : 좋은 신호를 획득하기 위해 적절한 비율로 로딩 버퍼 근육 상청액 (프로토콜 1.1 ~ 1.4)을 희석 1 : 1 (돼지, 토끼, 닭고기, 참치), 1 : 5 (소, 염소와 개), 및 1시 25분 (고래와 물개) 때ntibody는 하이 브리 도마 상층 액에서입니다.
- 5 분 동안 95 ℃에서 가열 샘플. 분자량 마커와 함께 SDS-PAGE 젤 (4 % 아크릴 아미드 스태킹 및 12 % 아크릴 아미드의 분리)의 우물에로드 샘플. V 후 약 1 시간에 실행을 완료 150 V의 전압을 증가 50에서 5 분 동안 젤을 실행합니다.
- 15 분 동안 1X 전송 버퍼에서 젤을 놓는다. 니트로 셀룰로오스로 분리 된 단백질을 이동 (NC) 막 그들이 PAGE에 의해 분리 된 후. 전송은 60 ~ 90 분 동안 100 V에서 수행 할 수 있습니다.
- 차단 솔루션을 준비 : 1X PBS 5 % 탈지 분유 0.1 % 트윈 20을 포함. 실온에서 1 시간 동안 차단 용액 25 ㎖의 상기 NC 멤브레인 차단. 트윈 20 (PBST) 15 ml의 인산 완충 식염수로 5 분마다 세 번 씻으십시오.
- 항체 희석액 밤새 4 ℃에서 5 %의 블로킹 용액으로 희석하여 10 ㎖의 막과 차 항체 (복수 액 또는 하이 브리 도마 상청액)을 인큐베이션.
- membran을 씻으십시오다시 PBST와 전자 세 번 과도한 항체를 청소합니다.
- 1 알칼리성 포스파타제 결합 염소 항 - 마우스 IgG와 함께 막을 인큐베이션 : 1250을 실온에서 1 시간 동안 교반과 함께 차단기 용액.
- 다시 막을 세척하고, 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 인산염 / P-nitroblue 테트라 졸륨 클로라이드를 부화 (BCIP / NBT) 포스파타제 기질 혼합물을 10 분 내지 20에 대한 발색까지.
- 증류수 여러 변화 막을 세척하여 반응을 정지.
4. 도트 오
- 좋은 신호를 획득하기위한 적절한 비 PBST 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 근육 상청액 (프로토콜 1.1 ~ 1.4)을 희석 1 : 가축 참치 5, 1:25 및 고래와 씰. 스팟 막 상에 샘플의 5 μL. 용액을 천천히 가하여 (대개 3-4mm 직경)를 관통하는 면적을 최소화한다.
- 실온 (에서 막을 건조 예를 들어, <30-60 분 동안 층류 인 / EM>)을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양 접시에서 차단 용액으로 차단 한 PBST로 씻는다.
- 일차 항체와 함께 막을 인큐베이션 (1 단클론 항체 하이 브리 도마의 상등액으로부터 10,000 또는 복수 액을 1 : 5 %의 블로킹 용액으로 희석 100,000)을 실온에서 1 시간 동안.
- 실온에서 1 시간 동안 (5 % 블로킹 용액 1250 1 알칼라인 포스파타제 결합 염소 항 마우스 IgG)를 사용하여 PBST 과량의 항체를 제거한 다음, 이차 항체와 함께 배양 5 분마다 막 세 번 씻어 .
- 다시 막을 세척 및 색상 개발 될 때까지 10 분 ~ 20 내 BCIP / NBT 포스 기판 혼합물을 품어.
- 증류수 여러 변화 막을 세척하여 반응을 정지.
5. 간접 ELISA
- 세척 완충액 (0.02 % 트윈 20과 0.002 M 이미 다졸 완충 식염수)을 준비합니다. 플레이트를 세척 3 회 반복한다각각의 다음 단계 (프로토콜 5.2-5.5) 사이에 버퍼.
- 코팅 버퍼에 근육 상층 액 (프로토콜 1.1-1.4)의 1시 25분 희석을 준비합니다. 코팅 96 웰 ELISA 밤새 4 ℃에서 100 ㎕의 희석 상등액 접시 실온에서 1 시간 동안 완충액 (PBS에 1 % BSA)을 차단하여이를 차단.
- 희석 완충액으로 정제 된 단클론 항체의 2,000 희석 및 각 웰에 희석 된 단클론 항체의 100 μl를 추가 : 1을 준비합니다. 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 인큐베이션.
- 더 배양 용 : (희석 버퍼 (200) 희석 1) 염소 항 - 마우스 IgG는 고추 냉이 과산화 효소와 결합 추가.
- 각 웰 (100 μL / 웰)에 퍼 옥시 다제 기판을 추가하고 10 ~ 15 분 동안 품어.
- 발색은 관찰 퍼 옥시다아제 정지 용액 (100 μL / 웰)하여 효소 반응을 정지.
- 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 읽는다.
콜로이드 골드 표지 단클론 항체 6. 준비 주 : 금 콜로이드 용액을 첨가하고, 혼합물의 색이 항상 적색한다. 검은 침전물이 발견 될 때 pH를, 단클론 항체의 농도, 원심 분리 속도를 조정합니다. 6.1 단계 6.2는 최적화 단계입니다.
- 5-9에서 다양한 pH 값과 금 콜로이드 용액 100 ㎕에 단클론 항체 (50 μg의 / ㎖, 3 μL)를 검출 추가 정제. 2 시간 동안 붉은 색을 유지 최소의 pH를 최적의 pH로 간주됩니다. 참고 : 본 연구에서는 0.1 M 탄산 칼륨은 콜로이드 금 (40 ㎚)의 pH 8.0 (최적의 pH)에 솔루션을 조정하는 데 사용되었다.
- pH가 8.0에서 콜로이드 금 용액 100 μL에 단클론 항체를 검출하는 정제의 다양한 양 (500 μg의 / ㎖, 1-20 μL)를 추가합니다. 참고 :이 연구에서 최적 농도는 6 μg의 / ㎖ (아니 검은 침전물)입니다.
- 상기 결과에 따르면, 정제 된 단클론 적가 금 콜로이드 용액 10 ㎖로 60 μg의 검출을 추가한다. 실온에서 10 분간 부드럽게 혼합 유화. 광고혼합물을 PBS 중 5 % BSA 용액 (PH 7.4) 2 ㎖의 15 분 동안 실온에서 부드럽게 유화 D 배경 간섭을 감소시킨다.
- 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기.
- 신중하게 접합 항체 상층 액을 제거하고 1 % BSA와 0.1 % 트윈 20을 포함하는 PBST 4 ml의 결과 펠렛을 일시 중단하고, 원심 분리 및 서스펜션 여러 번 반복합니다.
- 1 ml의 PBST에서 최종 침전물을 일시 중단하고 사용까지 4 ° C에서 보관합니다.
면역 스트립 7. 건설
참고도 1은 면역 스트립 디자인을 보여준다. 준비하고 <(1 년) 장기 저장 수명 (20 % 상대 습도가 낮은 습도 실험실 환경 조건에서 스트립)> 조립한다. 패드와 멤브레인의 치수는 다음과 같습니다 콘쥬 게이트 패드 300mm X 10mm, 흡수 패드는 300mm X 24mm, 샘플 패드 300mm X 24mm가, NC 막 300mm X 25mm가, 300 판지mm 80 mm를 X.
- 공액 패드를 포화 한 후 조립 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 그것을 건조 마이크로 피펫으로 단계 6.6에서 콜로이드 금 표지 단클론 항체 솔루션을 추가합니다.
- 피펫 또는 immunostrip 프린터를 이용하여 NC 막에서 단클론 항체를 검출하기위한 제어 영역에 특이 적 항원 - 캡처 테스트 영역에서 단클론 항체 (500 μg의 / ㎖), 토끼 항 - 마우스 IgG (500 μg의 / ml)에 배포한다. 간섭을 피하기 위해 두 영역 사이의 거리 (> 5mm)를 유지한다.
- 양면 테이프로 대지에 공액 패드, 흡수 패드 및 NC 막을 붙여 넣습니다.
주 : 약 2mm하여 NC 막의 양쪽 패드 중첩된다. 부적절한 스트립 구조는 불완전한 테스트가 발생합니다. - 공액 패드를 통해 샘플 패드 (2 mm)를 놓고 대지에 붙여 넣습니다.
- 종이 커터와 6 mm 전체 스트립을 만듭니다. 건조제와 함께 알루미늄 호일 가방에 스트립을 포장하고, 사용까지 4 ° C에 저장합니다.
제 교차 반응성 시험
- 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 1 ml의 PBS (포함 0.1 % BSA) 대나무 스틱을 사용하거나로드 연삭와 원시 근육 샘플 0.03 g을 균질화.
- 테스트 영역의 대향 단부가 상기 스트립을 잡고 50-10 분 동안 시료에 샘플 패드 부분을 찍어 직접 결과를 관찰한다.
- 옵션 : 500 μl의 상층 액을 수집하고 새로운 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
참고 : 스트립이 직접 상층 액에 담가 때 신호가 분명하지 않은 경우이 단계는 좋습니다.
- 옵션 : 500 μl의 상층 액을 수집하고 새로운 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 세중의 다양한 근육 샘플을 테스트합니다.
참고 : 여기에 우리가 참치, 닭고기, 물개, 고래 15 종과 지상파 포유류 5 종을 테스트했다. - 다섯 독립적 인 검사관 즉, 다섯 번 8.3 반복이 총 575 스트립을 사용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
단일 클론 항체 특성
우리는 고래류 메가의 각각 두 개의 합성 펩티드 (MKASEDLKKHGNTVLC 및 AIIHVLHSRHPAEFGC를) 인식이 IgG를 1 단클론 항체 (CGF5H9 및 CSF1H13)을 개발,이는 고래류 메가의 신속한 검출을위한 샌드위치 형 콜로이드 금 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립을 구성하는 데 사용되었다. 그림 2는 CGF5H9은 대략 17 kDa의의 예측 분자량에서 하나의 스테인드 밴드 고래와 다른 포유 동물을 감지 보여줍니다. 일반적인 밍크 고래 (대왕 고래 속을 acutorostrata는) 다른 고래류의 대역보다 상대적으로 희미한 밴드를 보여줍니다. 약 50 kDa의에서 밴드가 돼지 관찰되는 반면, 밴드, 참치, 닭과 물개 결석입니다. 돼지와 참치 여러 비특이적 밴드가 있지만 그것은 단지 대략 17 K의 예측 분자량의 밴드로 고래와 물개와 반응하기 때문에, CSF1H13는 매우 다릅니다다. 밍크는. 단 1:25에서 관찰 신호가 없으면 1시 10분 (도시되지 않은 데이터)에서 강한 신호를 보여줍니다 고래 2 점 오 점에서 동일한 결과를 보여줍니다.
도 3a는 CGF5H9는 고래, 토끼, 개, 염소, 소 (OD 값> 3.0)에 대한 긍정적 인 신호를 보여줍니다 보여줍니다; 돼지 용 약한 긍정적 인 신호 (OD 값 = 1.5); 물개, 닭과 참치에 대한 부정적인 신호. 그림 3b는 CSF1H13은 고래와 물개 대한 선호도가 높은 (OD 값> 3.0)을 표현하는 것을 알 수있다. CSF1H13 및 CGF5H9 모두 네 개의 고래류 종과 강하게 반응 할 수있다. 이 네 종은 서로 다른 가정 출신 (밍크 고래 : Balaenopteridae, 병코 돌고래 : Delphinidae, 난쟁이 향유 고래 : Kogiidae을, 상괭이 : Phocoenidae), 다양한 고래류 종의 다양한 반응을 나타내는.
스트립 건설, CGF5H9는 t을 인식하는그 고래 및 기타 포유류 MBS 인 금 콜로이드 표지와 미오글로빈에 결합하는 검출 항체로서 사용하고 CSF1H13 만 고래류 씰의 MBS를 캡처 테스트 라인 상에 코팅된다. 따라서 테스트 라인은 모두 모노클로 날 항체는 고래류 메가를 감지 긍정적 인 신호를 표시하도록 설계되었습니다. 비 고래류 동물 메가 바이트 만이 두 모노클로 날 항체 중 하나에 의해 검출 될 수 있기 때문에, 시험 라인은 다른 동물에서 근육 샘플 시험 부정 결과를 나타낸다. 토끼 항 - 마우스 IgG는 콜로이드 금 - 표지 CGF5H9 결합 때문에 제어 선이 항상 긍정적 인 결과를 나타낸다. 제어 선에 실패한 결과는 스트립 재료의 품질이 좋지 있음을 나타냅니다.
스트립 테스트
고래류 근육 시료를 사용하는 경우도 4는 테스트 라인 및 제어 라인 모두에서의 신호 대역을 도시한다. 시료는 고래로부터가 아닌 경우, 제어 라인 (WI)에서 단일 밴드가테스트 라인에서 밴드의 부재를 토륨. 성공적인 결과는 10 mL의 PBS가 플라스틱이나 대나무 막대기를 사용하여 0.1 % BSA를 함유하는 상기 혼합물에 상기 스트립을 침지하여 근육 0.03 g을 균질화 한 후 50-10 분에서 직접 관찰 할 수있다. 15 고래류 종 중으로 여덟 비 고래류 종을 테스트 한 결과, 특이성 (비 고래류 시료의 비율은 정확하게 식별) 및 민감도 (정확하게 식별 고래류 샘플의 비율)은 모두 100 %이다.
그들은 겹치도록 면역 스트립의 그림 1. 디자인. 모든 구성 요소는 조심스럽게 플라스틱 받침 카드에 적층된다. 이 시약과 시료가 막을 통해 상기 흡수 패드까지 흐를 수있다. T : 테스트 존. C : 제어 영역. 이 수치는 소호, C. 등에서 재현 할 수 있습니다. 빠른 면역 콜로이드 골드 스트립. 고래류 고기 억제 불법 거래와 소비 : 보전 및 공중 보건에 대한 영향 PLoS의 ONE 8 e60704 (2013). 도이 :. 10.1371 / journal.pone.0060704 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 웨스턴 블롯 및 하이 브리 도마 상청액을 이용하여 도트 블롯 분석. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. 두 하이 브리 도마 상층 액은 대략 17 kDa의의 예측 분자량에 하나의 스테인드 밴드로 고래를 검색 할 수 있습니다. MW : 밍크 고래, BND : 병코 돌고래, DSW : 난쟁이 향유 고래, FP : 상괭이, PKW : 들고양이 고래, N : PBS (음성 대조군). 이 수치는 소호, C. 등에서 재현 할 수 있습니다. C에 대한 신속한 면역 콜로이드 골드 스트립etacean 고기 억제 불법 거래 및 소비 :. 보전 및 공중 보건에 대한 영향 PLoS의 ONE 8 e60704 (2013). 도이 :. 10.1371 / journal.pone.0060704 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정제 된 모노클로 날 항체를 사용하여 상이한 종류의 근육 추출물도 3 간접 ELISA. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. 만 고래류는 모두 모노클로 날 항체에 강한 긍정적 인 신호를 생성 할 수 있습니다. 이 수치는 소호, C. 등으로부터 재생 된 고래류 고기 억제 불법 거래 및 소비에 대한 신속한 면역 콜로이드 골드 스트립 :.. 보전 및 공중 보건에 대한 영향 PLoS의 ONE 8 e60704 (2013). 도이 : 10.1371 / journal.pone.0060704입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
면역 콜로이드 골드 스트립의 그림 4. 특이 T :. 테스트 라인. C : 제어 선. 고래류 근육 시료를 사용하는 경우에만, 성공적인 결과 (시험 라인 및 제어 라인 모두에서 신호 대역)을 관찰 할 수있다. (A) 비 고래류 샘플 : 1 : 암소. 2 : 염소. 3 : 돼지입니다. 4 개입니다. 5 : 토끼. 6 : 참치. 7 : 닭. 8 : 하버 인감 (Phoca vitulina는). (B) 고래 샘플 : 1 : 밍크 고래 (대왕 고래 속을 acutorostrata). 2 : 오 무라의 고래 (대왕 고래 속을 omurai). 3 : 청백 돌고래 (Tursiops의 aduncus). 4 : 청백 돌고래 (T.의 truncatus). 5 : 프레이저의 돌고래 (Lagenodelphis 호세 </ EM>). 6 : 인도 - 태평양 혹등 돌고래 (소우 꽃). 7 : 큰코 돌고래 (그램 퍼스 griseus의). 8 : Pantropical 돌고래 (Stenella의 attenuata)를 발견했다. 9 : 거친 이빨 돌고래 (스테 노 bredanensis). 10 : 피그미 킬러 고래 (Feresa attenuata). 11 : 짧은 지느러미 파일럿 고래 (Globicephala의 macrorhynchus). 12 : 고양이 고래 (Peponocephala의 일렉트라). 13 : 드워프 향유 고래 (Kogia 시마). 14 : 피그미 향유 고래 (K.의 breviceps). 15 : 상괭이 (Neophocaena의 phocaenoides). 이 수치는 소호, C. 등으로부터 재생 된 고래류 고기 억제 불법 거래 및 소비에 대한 신속한 면역 콜로이드 골드 스트립 :.. 보전 및 공중 보건에 대한 영향 PLoS의 ONE 8 e60704 (2013). 도이 :. 10.1371 / journal.pone.0060704는 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
| 고래 종 | 비 고래류 종 |
| 피그미 향유 고래 (Kogia의 breviceps) | 하버 인감 (Phoca vitulina는) |
| 난쟁이 향유 고래 (Kogia 시마) | 개 (큰 개자리 lupus familiaris) 품종 |
| 짧은 지느러미 파일럿 고래 (Globicephala의 macrorhynchus) | 토끼 (Oryctolagus의 cuniculus) |
| 고양이 고래 (Peponocephala 일렉트라) | 돼지 (이랑 scrofa) |
| 애기 킬러 고래 (Feresa attenuata) | 염소 (카프라의 hircus) |
| Pantropical은 (Stenella attenuata) 돌고래 발견 | 가축 (보스 황소 자리) |
| 병코 돌고래 (화rsiops truncatus) | 치킨 (갈 루스 갈 루스) |
| 병코 돌고래 (Tursiops의 aduncus) | 황 다랑어 (Thunnus의 albacares) |
| 프레이저의 돌고래 (Lagenodelphis 호세) | |
| 인도 - 태평양 혹등 돌고래 (소우 꽃) | |
| - 뱀 머리 돌고래 (스테 노 bredanensis) | |
| 큰코 돌고래 (그램 퍼스 griseus의) | |
| 상괭이 (Neophocaena의 phocaenoides) | |
| 밍크 고래 (대왕 고래 속을 acutorostrata) | |
| 오 무라의 고래 (대왕 고래 속 오 무라 전) |
근육은 이거였다 종있는 표 1cted 본 연구에서 시험입니다. 종, 육상 포유 동물 5 종과 고래 15 종 (4 가족) 참치, 닭고기, 인감 등이 있습니다.
| 종 | 아니 가입. |
| 밍크 고래 (대왕 고래 속을 acutorostrata) | P02179 |
| 애기 브라이드 고래 (대왕 고래 속을 edeni) | Q0KIY2 |
| 향유 고래 (Megaptera의 novaeangliae) | P02178 |
| 회색 고래 (Eschrichtius robustus의) | P02177 |
| 향유 고래 (Physeter의 macrocephalus) | P02185 |
| 피그미 향유 고래 (Kogia의 breviceps) | Q0KIY5 |
| 난쟁이 향유 고래 (Kogia 시마) | P02184 |
| 단기 beakeD 일반적인 돌고래 (돌고래의 delphis) | P68276 |
| 참 거두 고래 (Globicephala의 MELAS) | P02174 |
| 킬러 고래 (Orcinus 오카) | P02173 |
| 고양이 고래 (Peponocephala 일렉트라) | Q0KIY3 |
| Pantropical은 (Stenella attenuata) 돌고래 발견 | Q0KIY6 |
| 병코 돌고래 (Tursiops truncatus) | P68279 |
| 쇠 돌고래 (쇠 돌고래 속에서 쇠 돌고래 속) | P68278 |
| 아마존 강 돌고래 ((IN1a)을의 geoffrensis) | P02181 |
| 롱맨의 부리 고래 (Indopacetus의 pacificus) | Q0KIY9 |
| 허브 부리 고래 (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| 민 부리 고래 (닫아phius cavirostris) | P02182 |
| 하버 인감 (Phoca vitulina는) | P68080 |
| 가축 (보스 황소 자리) | P02192 |
| 염소 (카프라의 hircus) | B7U9B5.3 |
| 말 (에 쿠 스 caballus) | P68082 |
| 돼지 (이랑 scrofa) | P02189 |
| 개 (큰 개자리 lupus familiaris) 품종 | P63113 |
| 치킨 (갈 루스 갈 루스) | P02197 |
| 타조 (Struthio의 camelus) | P85077 |
| 황 다랑어 (Thunnus의 albacares) | P02205 |
각각의 GenBank 수탁 번호 본 연구에서 사용 된 표 2 마이오글로빈 서열. 종 참치 포함닭, 타조, 국내 포유 동물, 물개와 고래 18 종 (7 가정). 이 테이블은 소호, C. 등으로부터 재생 된 고래류 고기 억제 불법 거래 및 소비에 대한 신속한 면역 콜로이드 골드 스트립 :.. 보전 및 공중 보건 PLoS의 ONE (8)를위한 관련 e60704 (2013). 도이 : 10.1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
캐리어 단백질에 접합 된 합성 펩티드를 사용하여 동종 단백질에 비해 현저하게 더욱 효과적이다. 단클론 항체는 공지 된 상대 위치와 항원을 사용하여 개발되어 있기 때문에 샌드위치 기반 기술의 경우, 본 연구에서 두 개의 단클론 항체는 표적 항원 에피토프와의 상호 작용을 방해 할 가능성이 없다. 또한, 천연 단백질, 합성 펩티드 복합체로 면역화 된 쥐의 항체의 반응성은 천연 단백질 및 천연 단백질 (19)로부터 생성 된 항체의 반응성을보다 강하게 할 수있다. 합성 펩타이드 복합체의 사용은 따라서 적절한 항 펩타이드 단클론 항체의 효과적인 예방 접종 절차 및 생성하는 것이 좋습니다.
단백질의 구조는 주로 폴리펩티드 사슬 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 아미노산은 곁사슬 특정 속성을 선도하고, 약간 아미노산 ACI 변경이D 시퀀스 구조의 변경을 초래한다. 10-20 아미노산 길이의 펩티드 항체 제조에 적합하기 때문에, C 말단 영역의 합성 펩티드 (면역원)의 길이는 코어 항원 영역을 인식 할 수 있도록 증가 하였다. 따라서, 상이한 에피토프 구조체 결과 다양한 동물 MBS 중 아미노산 잔기를 효율적으로 분화 될 수있다. 예를 들어, 그림 3a는 CGF5H9이 고래와 함께하지만, 부정적인 씰 강하게 반응에 언급 된 펩타이드 설계에 기여 보여줍니다. 닭은 코어 항원 부위 2의 도그의 것과 동일한 서열을 보유하고 있지만, 또 다른 예는이 외부 영역의 서열 차이는 구조 변화에 따라서 가변으로 이어질 수있는 것을 나타낸다 CGF5H9의 닭 개 향해 별개 동질성이고 항원과 항체 사이의 결합 친화.
웨스턴 블롯, 도트 오, 간접 ELISA를 사용 하였다적절한 모노클로 날 항체를 스크리닝하는 우리의 방법. 웨스턴 블롯 널리 조직 추출액 또는 파쇄 특정 단백질을 검출하기 위해 사용된다. 이 기술에서, 전기 영동을 폴리 펩타이드의 길이에 의해 변성 된 단백질을 분리하는 데 사용된다. 따라서, 신호가 예측 된 단백질의 분자량을 나타내는 경우, 확인할 수있다. 그러나, 그 검출 결과 (양 또는 음, 강하거나 약한 신호) 변성 단백질이 사용되기 때문에 항원 결합 항체의 실제 상황을 표시하지 않을 수있다. 따라서, 도트 블롯 2 단 스크리닝에 사용될 수있다. 도트 블롯의 단백질을 검출하는 기법이다. 그것은 웨스턴 블롯 방법의 단순화를 나타냅니다. 도트 블롯에서 검출 될 수있는 분자를 함유하는 혼합물을 점으로 멤브레인 상에 직접 도포된다. 단백질 시료는 변성되지 않기 때문 웨스턴 블롯 다르다. 이 기술은 표적 생체 분자의 크기에 관한 정보를 제공하고 있음을 유의하고, 하나의 도트는 두 MO 경우 나타날 것서로 다른 크기의 lecules이 검출된다. 마지막으로, 간접 ELISA 적절하게 정량화 될 수있는 신호를 생성하기 위해 리간드 결합 분석에 사용된다. 이는 단클론 항체 특성의 추가 정보를 제공하여 스트립 구성을 용이하게한다.
근육의 메가의 농도는 컬렉션의 위치에 따라 다양하다. 예를 들어, 고래류 수영 근육 (축 근육) 비 - 수영 근육에 비하여 메가 비트의 상당히 높은 콘텐츠를 갖고, 청소년 고래로부터 샘플 때문에 메가 농도 증가 동물의 수명 (20)에 걸쳐 낮은 메가 농도를 가질 것이다. 처음에는 단지 고래와 물개의 메가를 캡처 CSF1H13는, 콜로이드 금 표지하고 항체를 검출하는 수 많은 종의 메가 인식 CGF5H9는, 테스트 라인에 캡처 항체 것이다하도록 구성되었다. 우리는 검출 항체 구체적한다고 가정하고 포획 항체해야보다 일반적인합니다. 메가 낮은 농도 고래류 샘플을 사용한 경우에는, 약한 양성 신호가 테스트 라인에서 발견되었다 (데이터는 미도시). 문제는 두 개의 단클론 항체의 위치는 대표적인 결과에 기재된 바와 같이 반전 때 해결 하였다. 좋은 신호는 심지어 신생아 고래류 (좌초 오 무라의 고래) (그림 4)에 대해 도시 하였다. 이 특성과 모노클로 날 항체의 농도는 이러한 현상에 기여하는 것인지 불분명하다.
본 연구에서는, PBS 균질화 냉동 - 해동 근육 샘플 스트립 시험에서 사용 하였다. 다른 시료 조건 및 제조 방법은 결과에 영향을 미칠 수있다. 예를 들어, 메가 같은 염 - 가용성 단백질 순수 대신 PBS를 사용하여 추출한다. 그렇지 않으면, 추출은 비정상적인 결과로 이어질 수있는, 불충분 할 수있다. 적절한 추출 완충액 : 고기 샘플 비율은 스트립의 성공적인 결과 해석에 부분적으로 책임이있다. 큰 아모NT를 제어 샘플 (예를 들어, 가축)의 (0.3 g 1 용액에 버퍼) 긍정적 인 결과와 배경을 흐리게의 원인이 될 수 있습니다. 그러나, (1 : 0.03)이 연구에서 사용 된 비율은 정확한 결과를 생성했다. 전용 신선한 근육 샘플 스트립이 시험을 위해 사용될 수있다. 단백질 가수 분해 나 다른 동물 고래류 근육 샘플뿐만 아니라 샘플뿐만 아니라 양성 결과를 초래할 수있다 (예 간장 비등에 의한 경화와 같은) 특정한 치료 후 변성 될 수있다 (데이터는 보이지 않음). 따라서, 가변 샘플 소스와 다른 건축 디자인 계획 지구 개발 과정에서 사용하는 것을 권장합니다.
결론적으로,이 프로토콜은 고래의 메가에 강하게 반응이 단클론 항체의 개발을 설명하고, 이러한 모노클로 날 항체는 인감과 다른 동물에서 고래의 메가 차별화 빠른 테스트 스트립에 적용됩니다. 고래류 고기를 식별하기위한 신뢰할 수있는 기반 DNA PCR 분석 가능한 12이지만, 전의 노동 집약적이고 시간이 소요. 빠른 테스트 스트립은 규제 기관 (21)에 매우 바람직하다 고래류 고기를 식별하는 필드에 사용될 수있는 신뢰할 수있는 신속한 방법이다. 이 스트립은 말 또는 돼지 등 동물의 특정 MBS를 검출하기 위해 개발 될 수 있다는 가능성이있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
